CN104232779A

CN104232779A - 一种检测人类y染色体微缺失的试剂盒

Info

Publication number: CN104232779A
Application number: CN201410489611.7A
Authority: CN
Inventors: 滕乐; 林斯里; 田洁
Original assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Current assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Priority date: 2014-09-23
Filing date: 2014-09-23
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2034-09-23
Also published as: CN104232779B

Abstract

本发明涉及染色体缺失检测领域，具体涉及一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其包括PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、PCR反应液Ⅲ；所述PCR反应液Ⅰ包括：特异性扩增ZFX/Y、sY254、sY134和SRY位点的引物和荧光探针；所述PCR反应液Ⅱ包括：特异性扩增ZFX/Y、sY84和Y127位点的引物和荧光探针；所述PCR反应液Ⅲ包括：特异性扩增ZFX/Y、sY255和sY86位点的引物和荧光探针；本发明试剂盒通过设计不同STS的特异性荧光探针，并优化组合3管反应体系，实现一次试验即可检测Y染色体的微缺失类型，并通过ZFX/Y对不同反应体系进行有效监控。

Description

一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒

技术领域

本发明涉及染色体缺失检测领域，具体涉及一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒。

背景技术

人类Y染色体长臂上存在与精子生成密切相关的无精子因子(Azoospermiafactor，AZF)，无精子因子发生微小的DNA片段缺失称之为Y染色体微缺失。发生Y染色体微缺失，会引起精子生成障碍，导致少、弱、畸形精子症甚至无精子症。据WHO统计，男性原发性无精子症与少精子症患者中约10％-15％存在Y染色体微缺失。在精子生成障碍引起的男性不育患者中，Y染色体微缺失的发生率是居于第二位的遗传因素。

目前，AZF被划分为3个区，即AZFa、AZFb和AZFc，这些区域的任何一个或多个缺失都将导致精子发生障碍，造成少、弱、畸形精子症甚至无精子症，最终导致不育。在AZF的3个区中，每个区域均有明确的序列标签位点(Sequencetagged site，STS)可供识别；每个区域的缺失机理和缺失的断裂点均已明确。由欧洲男科协会(European Academy of Andrology，EAA)和欧洲分子遗传质控网(European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)联合发布的1999版、2004版和2013版《Y染色体微缺失分子诊断实践指南》均推荐使用多重PCR-琼脂糖凝胶检测STS的方法来检测Y染色体的微缺失。同时，指南推荐每个区域检测2个STS，分别为AZFa检测sY84和sY86，AZFb检测sY127和sY134，AZFc检测sY254和sY255，若每个区域的2个STS同时发生缺失时，则代表该区域发生缺失；并指出通过以上6个STS可以检测出几乎所有临床相关的微缺失或95％文献报道的AZF微缺失，足以满足常规诊断。

现有的产品均能检测指南推荐的6个STS，即：sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255，但现有包含ZFX/Y和SRY双内控的产品均是不同管内扩增不同的内控。在进行多管多重PCR扩增时，要对每一管反应体系的正常扩增进行监控，而不同内控不能有效地监控多管反应体系检测的稳定性和可靠性。

另外，现有产品采用的技术平台也具有局限性。

1)多重PCR-琼脂糖凝胶电泳。首先，琼脂糖凝胶电泳的检测方法，检测灵敏度低，产物量(上样量)较少时条带不易判别，难以区分弱阳性与阴性，容易造成假阳性或假阴性；其次，该方法的分辨率低，扩增片段之间必须达到30bp以上，才能较好区分；再者，琼脂糖凝胶电泳从制胶、上样到信号读取，均需人工操作，工作量大。

2)其他平台，如北京阅微(CN102912028A)采用测序仪进行检测，北京海斯特(CN103571957A)采用DHPLC进行检测。测序仪和HPLC价格昂贵，仪器操作和结果判读专业性要求高，不利于推广。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种在一次试验中所有PCR反应体系采用同一个内控ZFX/Y进行监测，能方便、快速、可靠地检测人类Y染色体微缺失的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，包括PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、PCR反应液Ⅲ；

所述PCR反应液Ⅰ包括：

特异性扩增ZFX/Y位点的引物，序列如：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；ZFX/Y位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：3；

特异性扩增Y染色体sY254位点的引物，序列如：SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5所示；sY254位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：6；

特异性扩增Y染色体sY134位点的引物，序列如：SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8所示；sY134位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：9；

特异性扩增Y染色体SRY位点的引物，序列如：SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；SRY位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：12；

所述PCR反应液Ⅱ包括：

特异性扩增sY84位点的引物，序列如：SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示sY84位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：15；

特异性扩增sY127位点的引物，序列如：SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示；sY127位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：18；

所述PCR反应液Ⅲ包括：

特异性扩增sY255位点的引物，序列如：SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示；sY255位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：21；

特异性扩增sY86位点的引物，序列如：SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示；sY86位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：24。

本发明有益效果：目前，市场上的现有产品虽然符合EAA/EMQN指南的检测要求，但不是所有产品都包含ZFX/Y和SRY双内控，而包含双内控的产品均是不同管内扩增不同的内控。本发明在进行多管多重荧光PCR扩增时，对每一管反应体系的正常扩增进行内部控制，采用ZFX/Y作为每一管反应体系的内控，有效地监控多管反应体系检测的稳定性和可靠性。且本发明试剂盒通过设计不同STS的特异性荧光探针，优化组合3管反应体系，实现一次试验即可检测Y染色体的微缺失类型，并能保证对不同反应体系的有效监控，从而避免实验过程中的假阴性现象，使用本发明试剂盒，还可以有效地减少操作人员的工作量，降低污染风险。

附图说明

图1为本发明试剂盒第Ⅰ管正常男性DNA样本检测图；

图2为本发明试剂盒第Ⅱ管正常男性DNA样本检测图；

图3为本发明试剂盒第Ⅲ管正常男性DNA样本检测图；

图4为本发明试剂盒第Ⅰ管AZFc区缺失样本检测图；

图5为本发明试剂盒第Ⅱ管AZFc区缺失样本检测图；

图6为本发明试剂盒第Ⅲ管AZFc区缺失样本检测图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

本发明最关键的构思在于：在每个PCR反应体系采用同一个内控ZFX/Y进行监测，并实现一次试验即可检测Y染色体的微缺失类型，方便、快速、结果可靠。

ZFX/Y是位于性染色体上的锌指蛋白基因，在X、Y染色体上均有其同源序列，该位点在男性和女性样本中都可以正常扩增。选择ZFX/Y基因作为每个PCR反应体系的内控，可以同时监控PCR反应体系的扩增效果，避免操作误差造成的假阴性现象。本发明采用多重多色荧光PCR技术，每个反应体系中多增加1个检测位点，就会增加反应体系的扩增难度，对整个反应体系的有效扩增产生较大的影响。但本发明通过对ZFX/Y基因引物和探针的设计、筛选，优化每个反应体系的扩增条件，实现每个PCR反应体系采用同一个内控ZFX/Y进行监测，确保每个反应体系检测的稳定性和可靠性。

实施例1

1、技术基础

1.1利用已知的Y染色体微缺失及STS的研究成果进行多重PCR反应液的设计和实施。

其主要研究内容包括：根据1999版、2004版和2013版EAA/EMQN指南的要求和推荐的STS，设计不同荧光标记的STS检测探针；根据不同区域STS的特点和探针标记基团，分别设计3管PCR反应体系，每管反应体系用相应的STS扩增引物和探针进行多重荧光PCR扩增，特异性地检测不同的STS。每管反应体系均用人类锌指蛋白基因ZFX/Y作为实验内控，第Ⅰ管反应体系同时扩增雄性性别决定基因(Sex-determine Region of Y—Chromosome，SRY)作为性别异常对照。

1.2利用实时荧光PCR仪进行多重荧光PCR扩增的检测

实时荧光PCR(real-time PCR，RT-PCR)，是一种以荧光化学染料为发光基团，通过PCR扩增，以及探针与目的片段的杂交来对整个PCR扩增过程进行实时检测的技术。与传统的PCR方法相比，实时荧光PCR可以实现高效、快速、实时的自动化检测。

将3管PCR反应体系加入模板DNA后，置于实时荧光PCR仪(AppliedBiosystems 7500)中，设定PCR反应程序，即可完成对样本的检测和分析。

2、具体技术实施方案

2.1 STS和内控的引物、探针设计

根据EAA/EMQN指南的要求，选择指南推荐的STS和内控位点，在NCBI(National Center of Biotechnology Information)上查找各个位点的扩增片段和扩增引物序列，根据引物和扩增片段的位置关系设计相应的Taqman荧光探针序列，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。序列合成完毕后由公司人员核对，然后根据需要稀释成所需浓度。通过各STS的扩增检测，验证引物、探针的扩增特异性。根据EAA/EMQN指南的推荐，本发明试剂和选择的位点的引物、探针序列见表1。

表1

名称	碱基序列和标记基团
		ZFX/Y-F(SEQ ID NO：1)	5′-ACCRCTGTACTGACTGTGATTACAC-3′
ZFX/Y-R(SEQ ID NO：2)	5′-GCACYTCTTTGGTATCYGAGAAAGT-3′
		ZFX/Y-P(SEQ ID NO：3)	5′-FAM-AAGACAAATGTCACACTTGAATGGCATC-BHQ1-3′
sY254-F(SEQ ID NO：4)	5′-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3′
		sY254-R(SEQ ID NO：5)	5′-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3′
sY254-P(SEQ ID NO：6)	5′-HEX-TCGTGCCAAACACTGTTTTTGTTGG-BHQ1-3′
		sY134-F(SEQ ID NO：7)	5′-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3′
sY134-R(SEQ ID NO：8)	5′-ACCACTGCCAAAACTTTCAA-3′
		sY134-P(SEQ ID NO：9)	5′-ROX-TCTTTTAGAGGAATAGTACAGGTCAAAGGA-BHQ2-3′
SRY-F(SEQ ID NO：10)	5′-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3′
		SRY-R(SEQ ID NO：11)	5′-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3′
SRY-P(SEQ ID NO：12)	5′-CY5-CTCTTCCTTCCTTTGCACTGAAAGC-BHQ3-3′
		sY84-F(SEQ ID NO：13)	5′-AGAAGGGTCCTGAAAGCAGGT-3′
sY84-R(SEQ ID NO：14)	5′-GCCTACTACCTGGAGGCTTC-3′

sY84-P(SEQ ID NO：15)	5′-HEX-TTGAAAGGAGTTAGCCAGCTTGCA-BHQ1-3′
		sY127-F(SEQ ID NO：16)	5′-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3′
sY127-R(SEQ ID NO：17)	5′-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3′
		sY127-P(SEQ ID NO：18)	5′-ROX-ATAGCACCCACTGGAATCTACCAAAG-BHQ2-3′
sY255-F(SEQ ID NO：19)	5′-GTTACAGGATTCGGCGTGAT-3′
		sY255-R(SEQ ID NO：20)	5′-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3′
sY255-P(SEQ ID NO：21)	5′-HEX-CTGCAGGTAGGTTTCAGTGTTTGGA-BHQ1-3′
		sY86-F(SEQ ID NO：22)	5′-GTGACACACAGACTATGCTTC-3′
sY86-R(SEQ ID NO：23)	5′-ACACACAGAGGGACAACCCT-3′
		sY86-P(SEQ ID NO：24)	5′-ROX-TCTGTCTGGGCCCAAGACACATT-BHQ2-3′

2.2本发明试剂盒多重荧光PCR扩增体系的设计和确定

根据表1所列的6个STS和2个内控进行设计，将6个STS分配到3管反应液中进行多重荧光PCR扩增，每管反应液中均用ZFX/Y作为实验内控，第Ⅰ管反应体系同时扩增SRY作为性别异常对照。通过大量试验对比优化，确定最优的STS分布(见表2)及PCR扩增体系(见表3)。改变STS在各管中的分布或改变任一管反应体系中的组份浓度，均会影响检测结果的特异性和灵敏度，表2为本发明的STS分布，表3中为本发明PCR扩增体系。

表2各管多重荧光PCR检测的STS分布

表3本发明试剂盒各管多重荧光PCR反应液配方

2.3本发明试剂盒PCR反应条件

经过大量试验的对比优化，确定的最佳PCR扩增反应条件见表4。

表4PCR扩增反应条件

退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，上述条件优化结果显示退火温度偏低会有非特异性扩增信号导致假阳性结果；温度偏高扩增效率偏低，灵敏度下降。本实验通过控制退火温度和退火时间可以做到特异性好，扩增效率高，灵敏度可达0.5ng/μL。

实施例2本发明试剂盒的使用

一、临床适应症背景：

本发明实施例1所述试剂盒用于体外定性检测人类Y染色体上影响精子生成的无精子因子(Azoospermia factor，AZF)区域的片段微缺失。包括检测AZF三个区域(AZFa、AZFb、AZFc)与发生微小DNA片段缺失密切相关的6个序列标签位点(Sequence-tagged site，STS)，即sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255。

本试剂盒仅用于Y染色体AZF区域微缺失基因检测，可作为男性不育原因查找的分子检查手段，其结果不能直接作为男性不育的最终诊断依据。

二、检验原理

本试剂盒产品采用多重PCR结合多色Taqman荧光探针技术。

多重PCR：根据NCBI上公布的AZF区域STS序列，参考欧洲男科学会EAA和欧洲分子质控网EMQN颁布的《Y染色体微缺失分子诊断实验室指南》，选择与男性不育高度相关的6个STS序列片段，根据AZF区域的基因序列特点，设计高度特异的引物和探针，分3管进行多重PCR检测。其中AZFa区有2个STS(sY84、sY86)，AZFb区有2个STS(sY127、sY134)，AZFc区有2个STS(sY254、sY255)；同时检测人类男性Y染色体短臂上的雄性性别决定基因(Sex-determine Regionof Y Chromosome，SRY)作为性别异常对照以及人类锌指蛋白基因ZFX/Y作为实验内控。

多色Taqman荧光探针：针对每个扩增子设计特异的Taqman探针。探针5’端标记报告荧光基团(R)，3’端标记淬灭荧光基团(Q)BHQ；当两种荧光基团同时标记在探针上时，报告基团发出的荧光被淬灭基团淬灭。当反应体系中有与探针碱基序列互补配对的模板出现时，探针与模板特异杂交，在每个PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶利用其5’-3’外切酶活性切断探针，报告基团与淬灭基团分开后发出特征性荧光信号。通过收集和分析特定的荧光信号，判断反应体系中是否存在特定的扩增靶标，从而判断特定的STS是否发生缺失。

如表5所示为本发明检测人类Y染色体微缺失的试剂盒的组成。

表5

说明：试剂盒中不同批号的组份可以互换使用。

储存条件：试剂盒置于-18℃以下保存；

有效期：12个月；

PCR基因扩增仪：Real-Time PCR System 7500，Life Technologies HoldingsPte Ltd。

三、样本要求

本试剂盒样本来源为人(男性)外周全血基因组DNA，DNA浓度在0.5ng/μL以上，纯度A260/A280在1.6-2.5之间。

样本保存：DNA样本在室温(18-28℃)放置不超过24小时，2-8℃保存不超过一周，-18℃以下保存不超过两年，-70℃可长期保存；冷冻保存的样本，反复冻融不宜超过6次。

样本运输：DNA样本在运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，应保证冰袋不化冻，且在途时限不宜超过72小时。

四、检验方法

1、样本基因组DNA的准备：

本试剂盒对人基因组DNA的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法(酚-氯仿抽提法)或试剂盒提取人基因组DNA，试剂盒推荐使用亚能公司的全血DNA快速提取试剂盒或QIAGEN公司的全血DNA提取试剂盒。

取适量EDTA-K2或枸橼酸钠抗凝的人外周全血并提取人基因组DNA。所提取的DNA样本须满足上述样本要求。

2、反应液配制

从试剂盒中取出所有组分置于室温融化并振荡混匀，低速离心数秒。

设所需要的PCR反应体系人份数为n，n＝待检样本数+1管正常男性DNA+1管正常女性DNA+1管空白对照；每人份反应体系的配制如下表6。

表6

3、加样

取待测DNA样品各5μL，分别加到相应的PCR反应液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ管中，盖紧管盖，短暂离心后置于荧光PCR仪中并记录样本摆放顺序。

4、PCR扩增：

按表4设置PCR扩增参数。

5、结果分析条件设定

根据分析后图像调节基线(Baseline)：start＝3，end＝18-24；

调节阈值(Threshold)：3.0e+004-1.0e+005，确保阈值线超过正常女性DNA除FAM通道以外的其它扩增曲线的最高点。

6、质控标准如表7所属。

表7

7、结果判读

多重多通道荧光PCR检测结果包含AZF三个区的6个STS，雄性性别决定基因SRY用CY5标记的探针检测，AZFa区的sY86和AZFb区的2个STS(sY127、sY134)分别用ROX标记的探针检测，AZFa区的sY84和AZFc区的2个STS(sY254、sY255)分别用HEX标记的探针检测；实验内控基因ZFX/Y用FAM标记的探针检测。

根据设置的基线和阈值，仪器自动显示检测Ct值，通过Ct值即可进行结果判读，具体如表8所示。

表8

注：当内控的Ct值＞38时，提示试验失败，应重新提取人基因组DNA重新扩增。

检验结果的解释：

1)、反应体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均以扩增ZFX/Y作为内控，在满足质控标准的前提下，只有当内控(ZFX/Y、SRY)扩增曲线满足Ct值≤38，才能根据各位点特异性扩增曲线的Ct值进行结果判读。

2)、待测样本反应体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中只有ZFX/Y内控基因扩增正常，SRY内控的Ct值＞42或无Ct值时，建议进行染色体核型分析测定。

3)、如果待测样本反应体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中个别管内ZFX/Y内控基因Ct值＞38或无Ct值，提示扩增异常，可能是样本DNA质量不佳，建议重新提取样本DNA或者经测定后作相应的处理，如纯化、浓缩或者稀释。

请参阅图1为本发明试剂盒第Ⅰ管正常男性DNA样本检测图；

请参阅图2为本发明试剂盒第Ⅱ管正常男性DNA样本检测图；

请参阅图3为本发明试剂盒第Ⅲ管正常男性DNA样本检测图；

请参阅图4为本发明试剂盒第Ⅰ管AZFc区缺失样本检测图；

请参阅图5为本发明试剂盒第Ⅱ管AZFc区缺失样本检测图；

请参阅图6为本发明试剂盒第Ⅲ管AZFc区缺失样本检测图。

8、产品性能指标

1)测定准确性

对5种已知缺失型样本(每种类型3个样本)和3种已知阴性样本(每种类型3个样本)，每个样本均选择高、中、低3个浓度，每个浓度重复3次，分别用3批产品检测进行准确性分析，产品阳性符合率45/45，阴性符合率均为27/27。

2)分析灵敏度

选择5种常见缺失型样本和1份正常样本进行灵敏度分析，每种类型包含3个样本，每个样本包含7个浓度梯度，分别用3批产品检测进行灵敏度分析，本品能稳定检出人类基因组DNA的最低浓度为0.5ng/μL。

3)分析特异性

(1)干扰评价：

当采用的商品化核酸提取仪或提取试剂盒具有DNA纯化能力，即采用磁珠法或硅胶离心柱法，对甘油三酯、胆红素和血红蛋白内源性干扰物质进行筛查试验，分别用3批产品检测进行干扰评价试验，发现通过磁珠或离心柱纯化后，以上三种物质不是本试剂盒的干扰物质。

肝素钠是本品的外源性干扰物质，按照15IU肝素钠抗凝1mL血液比例处理的全血样本不适用于本试剂盒，本试剂盒适用于EDTA-K2和枸橼酸钠抗凝剂制备的全血样本。

(2)交叉反应评价：

分别用3批产品检测进行交叉反应评价，本品所包含的所有STS之间无交叉扩增；另选择6例非Y染色体AZF区域微缺失导致少精或无精的临床样本(由精索静脉曲张、隐睾、生殖系统感染、内分泌紊乱或免疫反应异常等原因造成)进行交叉反应评价，结果无交叉反应。

4)重复性

选择正常男性DNA样本(两个浓度为0.5ng/μL与5ng/μL)进行检测，分别用3批产品检测进行重复性评价，不同人(2人)操作，一天做2次，共做2天，每次试验每个样本重复3次检测。在不同实验条件下检测结果完全一致，所有位点均有检测峰。

5)稳定性

三批试剂稳定性研究如下：

实时稳定性研究，结果显示产品在-18℃以下避光储存14个月质量合格，确定有效期为12个月。

试剂盒在37℃保存96小时内质量合格，在室温(18-28℃)下自然光照8小时内质量合格。

试剂盒开瓶后-18℃以下储存，有效期为12个月；开瓶后2-8℃储存，有效期为30天。

试剂盒内的PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、PCR反应液Ⅲ和PCR反应液Ⅳ反复冻融避免超过10次；正常男性DNA和正常女性DNA反复冻融避免超过10次。

试剂盒在低温保存运输且终点温度不超过11℃时，在途时限为96小时。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ和PCR反应液Ⅲ；

所述PCR反应液Ⅰ包括：

所述PCR反应液Ⅱ包括：

所述PCR反应液Ⅲ包括：

2.根据权利要求1所述的检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述ZFX/Y位点荧光探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ；

所述sY254位点荧光探针5’端标记HEX，3’端标记BHQ1；

所述sY134位点荧光探针5’端标记ROX，3’端标记BHQ2；

所述SRY位点荧光探针5’端标记CY5，3’端标记BHQ3；

所述sY84位点荧光探针5’端标记HEX，3’端标记BHQ1；

所述sY127位点荧光探针5’端标记ROX，3’端标记BHQ2；

所述sY255位点荧光探针5’端标记HEX，3’端标记BHQ1；

所述sY86位点荧光探针5’端标记ROX，3’端标记BHQ2。

3.根据权利要求1所述的检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的每个PCR反应液还分别包括：10×PCR Buffer，5×Q Solution，25mM MgCl₂，25mM dNTP，1U/μL UNG酶，HotStart Taq。

4.根据权利要求3所述的检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的每个PCR反应液中每条引物和荧光探针的起始浓度为100μM。