CN105087571B - 一种筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的分子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的分子检测方法。本发明提供了一种鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的竞争性等位基因特异性PCR成套引物，为如下1)或2)：1)由引物1、引物2和引物3组成；2)由引物4、引物5和引物3组成；所述引物1的核苷酸序列为序列1；所述引物2的核苷酸序列为序列2；所述引物3的核苷酸序列为序列3；所述引物4的核苷酸序列为序列4；所述引物5的核苷酸序列为序列5。本发明利用KASP技术，通过设计一组针对CVM突变位点的引物，进行反应，经过约1.5小时后通过配套的软件进行简单识别分析，即可准确获得所有待测样品的基因型，从而实现筛查CVM携带者的目的。

Description

一种筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的分子检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的分子检测方法。

背景技术

荷斯坦奶牛是提供人类乳品的重要家畜品种，经高度的选育与良好的饲养管理，生产大量鲜乳供应我们食物的需求。由于遗传育种与人工授精技术的卓越成果，有潜力的优良公牛被用于制作大量冷冻精液，供给很多母牛配种使用，其优良遗传性能可以迅速地传播至世界各地。如果追溯全世界荷斯坦奶牛的系谱，其亲缘大都密集地来自几个特定的公牛家族。然而，人工授精技术的应用使得遗传缺陷的传播也更加快速，影响层面也更加宽广。

遗传缺陷指会藉由亲代传给子代的缺陷，是由特定基因所引起的生化功能丧失或不正常的表型。体细胞遗传缺陷可分为显性遗传缺陷与隐性遗传缺陷两种。遗传缺陷若是显性且外发于身体畸型或残缺，一般会比较容易被察觉，但是大部分的遗传缺陷却都是隐性的。若是隐性遗传缺陷，则杂合型个体虽带有一个异常等位基因，外表却看不出来。必需带有二个隐性致病基因(aa)的个体才会发生异常的遗传缺陷(这里以a表示致病基因，A表示正常基因)。杂合型公牛(Aa)虽然只带有一个a，但其却是a基因携带者。这种Aa杂合型公牛常会有健壮外观，女儿牛表现优良，导致a基因在子代、孙代、曾孙代…逐渐传递，经过多代的人工授精，a基因携带者在群体中所占比例就大大提高，从而导致带有二个隐性致病基因(aa)的个体出现。因为带有隐性致病基因的个体与同样带有隐性致病基因的个体配种后，其二分之一后代为带隐性致病基因杂合型个体(Aa)，四分之一后代为发病型个体(aa)，四分之一后代为正常型个体(AA)。

脊椎畸形综合征(Complex Vertebral Malformation,CVM)是荷斯坦奶牛的一种常染色体单基因控制的隐性遗传疾病，最早由丹麦科学家Agerholm报道。随后在美国、荷兰、英国、日本等国家的荷斯坦奶牛中也相继发现。CVM的主要症状为流产、早产和死胎。患病犊牛体型较小、体重偏轻，颈部较短，颈部和/或胸部脊椎骨或肋骨出现各式各样的病变，同时四肢关节僵直、呈现对称的向后方翻转弯曲。另外，CVM对奶牛的繁殖性状也有很大的影响，母牛的不返情率提高，产犊间隔大大延长，流产比例增加。由于CVM导致一半以上的母牛流产都发生在受孕后100-260天，这段时间是母牛的产奶高峰期，流产导致奶牛产奶量难以提高，造成母牛非计划性淘汰，因此带来严重的经济损失。

丹麦科学家通过对CVM患病犊牛系谱分析发现，几乎所有患病犊牛都可以追溯到一个共同祖先，Carlin-M Ivanhoe Bell。该公牛是世界著名的优秀种公牛，在全世界范围内使用时间长达二十几年之久，留下了大量的优秀种公牛后代，同时也导致该病具有分布广、频率高的特点(Thomsen B，Horn P，Panitz F，etal.A missense mutation in thebovine SLC35A3gene,encoding a UDP-N-acetylglucosamine transporter,causescomplex vertebral malformation[J].2006，Genome Research，16(1)：97-105)。CVM的分子遗传学基础是由位于奶牛第3号染色体(BTA3)上的SLC35A3基因外显子4的第559位的单碱基突变(G/T)所致，该基因编码尿苷二磷酸-氮-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白(UDP-N-acetylglucosamine transporter)，负责把尿苷二磷酸-氮-乙酰氨基葡萄糖从细胞质中转运到高尔基体中，点突变导致尿苷二磷酸-氮-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白的第180位的氨基酸由缬氨酸突变为苯丙氨酸，从而影响了其正常功能，导致CVM(Thomsen B，Horn P，PanitzF，etal.A missense mutation in the bovine SLC35A3 gene,encoding a UDP-N-acetylglucosamine transporter,causes complex vertebral malformation[J].2006，Genome Research，16(1)：97-105)。目前丹麦、美国、加拿大等奶牛业发达国家都已经建立了完善的荷斯坦公牛CVM监测体系，所有公牛的CVM检测结果都要进行标识和公布，并记录在其系谱内，CV(carrier of CVM)表示CVM携带者，TV(tested free of CVM)表示非携带者。

英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司成立于1842年，是集实验室服务、测量标准、标准物质及实验室能力验证于一体的市场领导者。LGC基因组学(LGC Genomics)作为其新设的技术部门，为全球的基因组学实验室提供了最新的技术方法和设备。由该部门所开发的竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele-Specific PCR，KASP)技术，已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP进行分型以及检测InDels(Insertions andDeletions，插入和缺失)的，通过使用2个荧光探针、2个通用淬灭探针，再加多个位点特异探针即可检则多个SNP位点，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。其基本过程是:①设计特定的引物和荧光探针构成Primer Mix；②PCR反应I：变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测引物的序列；③PCR反应II：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；④PCR反应III：信号产生---特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测；⑤根据信号检测结果即可判断某SNP位点的基因型。

目前我国用于筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的分子检测方法主要有PCR-SSCP技术和PIRA-PCR技术等，但上述方法包含PCR反应、酶切、凝胶电泳、银染、紫外成像、人工观察结果等一系列步骤，过程相对繁琐，具有费时费力、因结果需要人为判断而增加误判几率、实验中需要接触有毒有害试剂(如电泳时所用的染料溴化乙锭)等特点。由于以上特点，目前常用的分子检测方法在实际操作中容易出现浪费大量人力物力，工作效率低下等问题，并不适合大批量地检测筛查荷斯坦奶牛CVM携带者。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的竞争性等位基因特异性PCR成套引物。

本发明提供的成套引物，为如下1)或2)

1)由引物4、引物5和引物3组成；

2)由引物1、引物2和引物3组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列1；

所述引物2的核苷酸序列为序列2；

所述引物3的核苷酸序列为序列3；

所述引物4的核苷酸序列为序列4；

所述引物5的核苷酸序列为序列5。

上述成套引物中，所述引物4和所述引物5的5’端均连有不同的荧光基团。

所述引物4的5’端连有FAM荧光基团；

所述引物5的5’端连有HEX荧光基团。

上述成套引物中，1)中，所述引物1、所述引物2和所述引物3的摩尔比为2：2：5；

2)中，所述引物4、所述引物5和所述引物3的摩尔比为2：2：5。

本发明的另一个目的是提供鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的竞争性等位基因特异性PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，包括上述的成套引物；

所述成套引物中的引物3在所述PCR试剂中的浓度为30μM；

所述成套引物中的引物4和引物5在所述PCR试剂中的浓度均为30μM。

本发明第三个目的是提供鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的竞争性等位基因特异性PCR试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的成套引物或上述的PCR试剂。

上述的成套引物或上述的成套引物或上述的试剂盒在制备鉴定荷斯坦牛是否携带CVM产品中的应用也是本发明保护的范围。

所述引物4的5’端连有FAM荧光基团；

所述引物5的5’端连有HEX荧光基团。

本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的方法。

本发明提供的方法包括如下步骤：用上述的成套引物中的1)对荷斯坦牛进行荧光定量PCR扩增，检测PCR扩增产物的荧光信号；若PCR扩增产物发FAM荧光，则待测牛不携带或候选不携带CVM；若PCR扩增产物发HEX荧光，则待测牛携带或候选携带CVM。

上述荧光定量PCR扩增的模板为荷斯坦牛的冻精、血液或组织的基因组DNA。

本发明鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的奶牛DNA样品可通过提取奶牛冻精、血液、组织等获得；所提供的引物可通过具有引物合成服务的公司合成获得；所述的KASP Mastermix试剂可通过LGC公司直接购得；其他试剂均可为现有的常规试剂。

本发明的实验证明，本发明利用KASP技术，通过设计一组针对CVM突变位点的引物，将配置好的PCR反应体系置于可检测荧光信号的PCR仪(本发明所用仪器为德国RocheLightCycler480实时荧光定量PCR仪)中，按照设置好的反应程序(LGC公司提供)进行反应，经过约1.5小时后通过配套的软件进行简单识别分析，即可准确获得所有待测样品的基因型，从而实现筛查CVM携带者的目的。

附图说明

图1为使用KASP技术对CVM分型结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、检测CVM的特定引物组的设计及KASP检测方法

一、特定引物组的设计

根据GenBank数据库中奶牛SLC35A3基因的基因组序列(GenBank AccessionNumber AY160683)，在其外显子4的第559位(即GenBank Accession Number AY160683 的自5′端第9871位)的点突变两侧设计引物。第559位为C或G，为正常基因，第383位为A或T，为CVM基因。

利用引物设计软件Primer Premier 5.0，针对目的SNP位点可能出现的两种碱基设计两条引物(分别称为Allele 1引物和Allele 2引物)，和一条反向的通用引物。注意针对SNP位点设计的引物的3’端的最后一位必须准确对应该SNP位点，并严格按照KASP技术的其余要求进行设计。所得引物见表1。

参考相关文献中合适的荧光标签序列(Trick M,Adamski N M,Mugford S G,etal.Combining SNP discovery from next-generation sequencing data with bulkedsegregant analysis(BSA)to fine-map genes in polyploid wheat[J].BMC plantbiology,2012,12(1):14.)为上步中已设计好的Allele 1引物和Allele 2引物，在5’端分别对应加上对应的标签序列(见表2)，最终所得引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

表1加上标签序列前的引物序列

表2加上标签序列后的引物序列

二、竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)

1、KASP的反应体系

参考相关文献配制用于配制PCR反应体系的引物混合液Primer mix(Trick M,Adamski N M,Mugford S G,et al.Combining SNP discovery from next-generationsequencing data with bulked segregant analysis(BSA)to fine-map genes inpolyploid wheat[J].BMC plant biology,2012,12(1):14.)，具体方法是，将ddH₂O 46μl，反向通用引物30μl(100μM)，加上标签序列Allele 1引物和加上标签序列Allele 2引物各12μl(100μM)，共100μl混合均匀即可。

在专用的96孔板中按上述要求配制反应体系配制PCR反应体系：配制好的Primermix，KASP V4.02×Master mix(北京北方仪涛商贸有限公司，产品名称为“KASP V4.02×Master mix 96/384，Low Rox”，产品目录号为“KBS-1016-016”)以及待测DNA样品。其中，KASP Master mix包含了引物对应的两种荧光探针以及进行PCR反应时所需的原料和酶等，该试剂可从LGC公司直接购得；对于待测DNA样品，经后续验证发现，达到最佳检测效果时，DNA样品浓度应在50～60ng/μl。反应体系见表3。

表3 KASP反应体系

2、KASP

将上述1配制好的反应体系放入德国Roche LightCycler480实时荧光定量PCR仪中，按照LGC公司提供的KASP技术操作说明书(《Guide to running KASP genotypingreactions on the Roche LC480-Series instruments》)上所建议的程序(见表4)设定好程序并进行反应。

表4 KASP反应程序

检测PCR扩增产物的荧光信号，若PCR扩增产物发FAM荧光，则待测牛不携带CVM；若PCR扩增产物发HEX荧光，则待测牛携带CVM。

实施例2、KASP检测荷斯坦牛是否携带CVM

1、基因组DNA的提取

根据本单位梁若冰(梁若冰等.中国荷斯坦公牛脊椎畸形综合征和尿苷酸合酶缺乏症遗传缺陷检测[J].中国奶牛,2014,07:22-26.)此前已发现的CVM携带者公牛名单，随机挑选了其中的8头已确定CVM携带者公牛(编号为1-8)，以及已确定为非CVM携带的其中8头公牛(编号为9-16)，总计共16头的冷冻精液，样品采自北京、天津、山东、河北、河南等地区。

按照如下文献第27页描述的DNA提取方法提取精液的基因组DNA：陈慧勇.利用中国荷斯坦定位BTA6上影响产奶性状的QTLs[D].北京：中国农业大学，2005。所提取的冻精DNA将用于稍后的方法验证。

得到CVM携带公牛基因组DNA和非CVM携带公牛基因组DNA。

2、KASP检测

用实施例1的二中的反应体系和反应程序对CVM携带公牛基因组DNA和非CVM携带公牛基因组DNA进行KASP检测，在KASP程序完成后，按照操作说明书上的指引编辑数据集、选择分析方式、确定X轴和Y轴(分别对应不同的荧光信号，即对应不同的等位基因)，最后点击确定按钮即可获得分型结果。设定FAM为蓝色荧光，HEX为红色荧光。

检测PCR扩增产物的荧光信号，若PCR扩增产物发FAM荧光，则待测牛不携带CVM；若PCR扩增产物发HEX荧光，则待测牛携带CVM。

结果如图1所示，1A为同时使用编号为1-8CVM携带者个体与编号为9-16正常个体；1B对图1A中结果进行重复实验；可以看出，编号为1-8的公牛为CVM携带者(红色荧光，HEX荧光)，编号为9-16的公牛为非CVM携带者(蓝色荧光，FAM荧光)。

图1所示编号为1-8的公牛样本的分型结果与梁若冰等(梁若冰等.中国荷斯坦公牛脊椎畸形综合征和尿苷酸合酶缺乏症遗传缺陷检测[J].中国奶牛,2014,07:22-26.)检测的结果一致，说明运用KASP技术对荷斯坦牛CVM位点分型结果准确。对所有16头公牛个体重复进行KASP分析，两次实验结果完全一致，证明本发明所建立的CVM检测方法稳定准确，结果可靠。

Claims (8)

1.一种鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的竞争性等位基因特异性PCR成套引物，由引物4、引物5和引物3组成；

所述引物3的核苷酸序列为序列3；

所述引物4的核苷酸序列为序列4；

所述引物5的核苷酸序列为序列5。

2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述引物4和所述引物5的5’端均连有不同的荧光基团。

3.根据权利要求2所述的成套引物，其特征在于：所述引物4的5’端连有FAM荧光基团；所述引物5的5’端连有HEX荧光基团。

4.根据权利要求1-3中任一所述的成套引物，其特征在于：

所述引物4、所述引物5和所述引物3的摩尔比为2：2：5。

5.鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的竞争性等位基因特异性PCR试剂，包括权利要求1-4中任一所述的成套引物；

所述成套引物中的引物3在所述PCR试剂中的浓度为30μM；

所述成套引物中的引物4和引物5在所述PCR试剂中的浓度均为30μM。

6.鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的竞争性等位基因特异性PCR试剂盒，包括权利要求1-4中任一所述的成套引物或权利要求5所述的PCR试剂。

7.权利要求1-4任一所述的成套引物或权利要求5所述的PCR试剂或权利要求6所述的试剂盒在制备鉴定荷斯坦牛是否携带CVM产品中的应用。

8.一种鉴定或辅助鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的方法，包括如下步骤：用权利要求3或4所述的成套引物对荷斯坦牛进行荧光定量PCR扩增，检测PCR扩增产物的荧光信号；若PCR扩增产物发FAM荧光，则待测牛不携带或候选不携带CVM；若PCR扩增产物发HEX荧光，则待测牛携带或候选携带CVM。