CN117701734A - 一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的snp标记、引物对、试剂盒、方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的SNP标记、引物对、试剂盒、方法及其应用，属于生物分子标记领域。为了准确快速选育出适应高海拔生长环境的中国马鹿品种，本发明提供一种利用SNP标记、引物对和试剂盒进行中国马鹿高海拔适应性鉴定的方法，该方法不受马鹿的年龄、性别等限制，可用于马鹿的早期选种，甚至刚出生就可以进行鉴定选择，缩短了育种时间，具有简便、快速、高效、准确的优点，促进了中国马鹿高海拔适应性品种的育种进程。
Description
技术领域
本发明属于生物分子标记领域，具体涉及一种采用生物分子标记技术实现马鹿高海拔适应性的鉴定技术。
背景技术
马鹿(Cervus elaphus)是国家二级重点保护动物，又称作赤鹿、红鹿、八叉鹿，属于鹿科、鹿属，是一种具有极高营养价值和经济价值的大型动物。马鹿是我国目前数量最多的一种大型鹿类，主要分布于中温带的东北及中西部地区，海拔跨度从200m到5000m，其中西藏马鹿和四川马鹿生长的海拔高度为3500-5000m，甘肃马鹿和青海马鹿生长的海拔高度为2200-3800m，阿尔泰马鹿和天山马鹿生长的海拔高度为800-1000m，东北马鹿生长的海拔高度为200m。
野生动生境选择是生态学的一个重要方面，生境破碎化是野生动物数量减少的基本原因(艾尼瓦尔·吐米尔,马合木提·哈力克.塔里木河中游塔里木马鹿种群数量及其栖息地现状的初步分析[J].新疆农业科学,2008,45(4):61-61.)，因此，有关动物生境方面的研究已成为野生动物保护领域的热点研究课题之一(Laurance W F,Love joy T E,Vasconcelos H L.Ecosystem decay of Amazonian forestfragments:a 22-yearinvestigation[J].Conser vation Biology,2002,16:605-618.)。对西藏马鹿生境选择的研究结果显示植被类型、海拔高度、食物丰富度、人类干扰及水源距离对西藏马鹿生境选择的影响最为显著(秦瑜.冈斯底里山南坡草青期西藏马鹿生境选择及其适宜性评价[D].东北林业大学,2009.)；随着海拔高度的增加，气压逐渐降低，空气中氧含量也逐渐减少，对于动物生理、生化及形态学上造成了非可逆的影响(HOCHACHKA P W,RUPERT J L,MONGEC.Adaptation and conservation of physiological systems in the evolution ofhuman hypoxia tolerance[J].Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol,1999,124(1):1-17.)。为了更好地保护管理该珍贵物种，需要准确快速地判断出该地区适合生长发育的马鹿品种，提出相应的保护措施是非常重要的。然而，现有技术中对于中国马鹿高海拔适应性性状相关研究较少，导致缺少能够准确快速选育出适应高海拔生长环境的中国马鹿品种的方法，因此，本领域一直渴望探究一种方法能够准确快速的选育出适应高海拔生长环境的中国马鹿品种，缩短育种进程，节约成本。
SNP单核苷酸多态性位点主要是指在基因组脱氧核酸(DNA)序列上由单个脱氧核苷酸的变异所引起的DNA片段的多态性。SNP的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现的形式有替换、插入和缺失等。
与传统的单基因分析比较，通过扫描基因组大量的SNP位点信息，再依据所有考察位点的特征，采用相应的检验方法，鉴定基因组上受选择信号的区域，这种基因组水平的群体遗传分析能更精确地发现自然选择，SNP作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。
发明内容
本发明为解决现有技术中对于中国马鹿高海拔适应性性状相关研究较少，因此，导致缺少能够准确快速的选育出适应高海拔生长环境的中国马鹿品种的技术问题，本发明提供一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的SNP标记、引物对、试剂盒、方法及其应用。
本发明的目的之一在于提供一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的SNP标记，所述标记包括2个SNP标记，其中SNP-1标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，SNP-2标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
在本发明的一个优选实施例中，所述SNP-1标记在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第201bp处存在C/T突变；所述SNP-2标记在SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第201bp处存在A/G突变。
本发明的目的之二在于提供一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的引物对，共包括2个引物对，所述引物对-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物，所述引物对-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物。
本发明的目的之三在于提供一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的试剂盒，所述的试剂盒包含上述引物对。
本发明的目的之四在于提供一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的方法，所述方法如下：
S1：提取待测马鹿的基因组DNA；
S2：以步骤S1中获得的马鹿基因组DNA为模板建立扩增体系，
以引物对-1作为引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物1；
再以引物对-2作为引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物2；
S3：对S2中获得的PCR产物进行检测，根据检测结果判断马鹿的高海拔适应性。
在本发明的一个优选实施例中，S2中所述的PCR扩增体系为：模板DNA 1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，Mix 11.5μL，ddH2O 11.5μL。
在本发明的一个优选实施例中，S2中所述的PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
在本发明的一个优选实施例中，S3中所述PCR扩增产物1和PCR扩增产物2的检测方法相同，均为sanger测序。
在本发明的一个优选实施例中，S3中所述的判断方法为：
对于以引物对-1作为引物时，当基因型为TT/CT时，则判断中国马鹿具有高海拔适应性，当基因型为CC时，则判断中国马鹿不具有高海拔适应性；
对于以引物对-2作为引物时，当基因型为GG/AG时，则判断中国马鹿具有高海拔适应性，当基因型为AA时，则判断中国马鹿不具有高海拔适应性。
本发明的目的之五在于提供一种上述SNP标记、引物对或试剂盒在中国马鹿高海拔适应性辅助鉴定、辅助育种、筛选及马鹿EPAS1基因分型中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的SNP标记、引物对或试剂盒利用突变碱基的差异，对长度均为401bp的PCR产物进行检测，根据sanger测序结果进行EPAS1基因分型，对于引物对-1，当基因型为TT/CT时，则判断中国马鹿具有高海拔适应性，当基因型为CC时，则判断中国马鹿不具有高海拔适应性；对于引物对-2，当基因型为GG/AG时，则判断中国马鹿具有高海拔适应性，当基因型为AA时，则判断中国马鹿不具有高海拔适应性。
本发明提供的中国马鹿高海拔适应性鉴定方法是从基因层面进行的鉴别，避免了通过生存状态判断是否具有高海拔适应性的偶然性和不准确的问题；并且该方法不受马鹿的年龄、性别等限制，可用于马鹿的早期选种，甚至刚出生就可以进行鉴定选择，缩短了育种时间，操作简便，育种准确度及效率较高，促进了中国马鹿高海拔适应性品种的育种进程。
附图说明
图1为实施例1中EPAS1基因座位的多态性变异与海拔的相关图；其中，A为SNP位点C→T与海拔的相关图，B为SNP位点A→G与海拔的相关图；
图2为实施例2和实施例4中各基因型的测序峰图；其中，A为CC基因型测序峰图，B为CT基因型测序峰图，C为TT基因型测序峰图，D为AA基因型测序峰图，E为AG基因型测序峰图，F为GG基因型测序峰图；
图3为实施例2中各基因型在92个马鹿个体中的验证结果，其中，A为CC/CT/TT基因型统计结果，B为AA/AG/GG基因型统计结果。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明当中。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的实施方式及说明书附图对本发明进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
基因组DNA的提取方法：
对4个马鹿亚种中的92头马鹿个体(包括中高海拔马鹿、低海拔马鹿两种海拔群体，表1)进行血样采集，基因组DNA提取方法参照巴秋爽等(2014)的方法(巴秋爽,李凤,刘玉芬.哺乳动物血液基因组DNA提取方法的比较研究[J].黑龙江畜牧兽医,2014(03):74-76.)
实施例1：一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的SNP标记、引物对及其获取方法
(1)供试材料的选取
所述的供试材料包括表1中的92头马鹿个体，其中低海拔马鹿50头，高海拔马鹿42头；
(2)SNP标记的开发
本发明对不同海拔地区的马鹿进行全基因组重测序和全基因组选择信号的筛选，发现EPAS1基因座位的多态性变异与马鹿的高海拔适应性有关(图1)，因此针对于EPAS1基因座位的多态性变异开发SNP标记，在不同海拔地区的马鹿群体中进行基因分型，结合表型数据，判断基因型与表型的符合度。结果如图2所示，对如SEQ ID NO.1所示SNP-1标记的核苷酸序列进行测序检测，该区段内存在一处SNP位点的变化(C→T)与马鹿高海拔适应性紧密连锁；对如SEQ ID NO.2所示SNP-2标记的核苷酸序列进行测序检测，该区段内存在一处SNP位点的变化(A→G)与马鹿高海拔适应性紧密连锁。
本发明获得的与马鹿高海拔适应性紧密连锁的分子标记核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的401bp核苷酸片段或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的401bp核苷酸片段。
利用EPAS1基因测序数据开发与中国马鹿高海拔适应性紧密连锁的SNP标记设计引物，上述引物对核苷酸序列为：
上游引物F1：5‘-AAGCCTTTACCACCAGCAGC-3’(SEQ ID NO.3)；
下游引物R1：5‘-TCATGTGGAGTGGCCTGTCT-3’(SEQ ID NO.4)；
上游引物F2：5‘-GCTGCTGTGGCTCTTCAACT-3’(SEQ ID NO.5)；
下游引物R2：5‘-CCTCAGTGAACCAGGGCCTA-3’(SEQ ID NO.6)。
实施例2：一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的方法
S1：提取待测马鹿个体的基因组DNA；
S2：以步骤S1中获得的基因组DNA为模板构建扩增体系，所述PCR扩增体系为：模板DNA 1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，Mix 11.5μL，ddH2O 11.5μL；所述引物为：
正向引物F1：5’-AAGCCTTTACCACCAGCAGC-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物R1：5’-TCATGTGGAGTGGCCTGTCT-3’(SEQ ID NO.4)；
正向引物F2：5’-GCTGCTGTGGCTCTTCAACT-3’(SEQ ID NO.5)；
反向引物R2：5’-CCTCAGTGAACCAGGGCCTA-3’(SEQ ID NO.6)；
然后对其进行PCR扩增，PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环，72℃延伸5min，4℃保存，最终获得PCR扩增产物。
S3：利用sanger测序对S2中获得的PCR产物进行基因型检测，通过检测结果判断马鹿的高海拔适应性。
结果如图2所示，对于包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3如SEQ ID NO.4所示的引物对-1，当基因型为TT/CT时，则判断中国马鹿具有高海拔适应性，当基因型为CC时，则判断中国马鹿不具有高海拔适应性；对于包含核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对-2，当基因型为GG/AG时，则判断中国马鹿具有高海拔适应性，当基因型为AA时，则判断中国马鹿不具有高海拔适应性。
本实施例利用SPSS25.0软件的Fisher精确检验对来自不同海拔地区的92只马鹿基因型进行检验分析，结果如表2和图3所示，上述基因型CC在低海拔环境下的马鹿品种中的频率是100％，极显著高于在中高海拔(P<0.01)环境下的马鹿品种中的CT/TT基因型的频率。上述基因型AA在低海拔环境下的马鹿品种中的频率是100％，极显著高于在中高海拔(P<0.01)环境下的马鹿品种中的AG/GG基因型的频率，进一步验证了两处SNP位点的基因型与马鹿高海拔适应性的相关性。
利用本发明的鉴定方法可在中国马鹿新生期判断是否具有高海拔适应性，而采用常规育种需要在马鹿成熟期对其生长发育状况进行观察之后才可鉴定，通过生存状态判断是否具有高海拔适应性存在偶然性和不准确的问题，并且育种周期较长，由此可见，利用本发明所述的鉴定方法从基因层面进行的鉴别，提高了育种准确度，缩短了育种时间，操作简便，育种效率较高，促进了中国马鹿高海拔适应性品种的育种进程。
实施例3：一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的试剂盒
一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的试剂盒包括如下试剂：上游引物F(浓度为2pM)、下游引物F(浓度为2pM)、Mix酶(5U/μL)和ddH2O；所述引物为：
正向引物F1：5’-AAGCCTTTACCACCAGCAGC-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物R1：5’-TCATGTGGAGTGGCCTGTCT-3’(SEQ ID NO.4)；
正向引物F2：5’-GCTGCTGTGGCTCTTCAACT-3’(SEQ ID NO.5)；
反向引物R2：5’-CCTCAGTGAACCAGGGCCTA-3’(SEQ ID NO.6)。
实施例4：一种鉴定中国马鹿高海拔适应性试剂盒的使用方法
S1：提取待测马鹿个体的基因组DNA，并调节基因组DNA浓度至30ng/μL；
S2：按照PCR体系添加样品及试剂，具体包括：模板DNA 1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，Mix 11.5μL，ddH2O 11.5μL；所述引物为：
正向引物F1：5’-AAGCCTTTACCACCAGCAGC-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物R1：5’-TCATGTGGAGTGGCCTGTCT-3’(SEQ ID NO.4)；
正向引物F2：5’-GCTGCTGTGGCTCTTCAACT-3’(SEQ ID NO.5)；
反向引物R2：5’-CCTCAGTGAACCAGGGCCTA-3’(SEQ ID NO.6)；
S3：进行PCR扩增，PCR程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
S4：利用sanger测序对S3中获得的PCR产物进行基因型检测，通过检测结果判断马鹿的高海拔适应性。
结果如图2所示，对于包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3如SEQ ID NO.4所示的引物对-1，当基因型为TT/CT时，则判断中国马鹿具有高海拔适应性，当基因型为CC时，则判断中国马鹿不具有高海拔适应性；对于包含核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对-2，当基因型为GG/AG时，则判断中国马鹿具有高海拔适应性，当基因型为AA时，则判断中国马鹿不具有高海拔适应性。
表1样品采集表
表2SNP位点在不同海拔环境下马鹿品种的基因型频率
本发明说明书中未详细描述内容为本领域技术人员公知技术。虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的SNP标记，其特征在于，所述标记包括2个SNP标记，其中SNP-1标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，SNP-2标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
2.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，所述SNP-1标记在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第201bp处存在C/T突变；所述SNP-2标记在SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第201bp处存在A/G突变。
3.一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的引物对，其特征在于，共包括2个引物对，所述引物对-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物，所述引物对-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物。
4.一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求3所述的引物对。
5.一种鉴别中国马鹿高海拔适应性的方法，其特征在于，所述方法如下：
S1：提取待测马鹿的基因组DNA；
S2：以步骤S1中获得的马鹿基因组DNA为模板建立扩增体系，
以引物对-1作为引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物1；
再以引物对-2作为引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物2；
S3：对S2中获得的PCR产物进行检测，根据检测结果判断马鹿的高海拔适应性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S2中所述的PCR扩增体系为：模板DNA 1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，Mix 11.5μL，ddH2O 11.5μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S2中所述的PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S3中所述PCR扩增产物1和PCR扩增产物2的检测方法相同，均为sanger测序。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S3中所述的判断方法为：
对于以引物对-1作为引物时，当基因型为TT/CT时，则判断中国马鹿具有高海拔适应性，当基因型为CC时，则判断中国马鹿不具有高海拔适应性；
对于以引物对-2作为引物时，当基因型为GG/AG时，则判断中国马鹿具有高海拔适应性，当基因型为AA时，则判断中国马鹿不具有高海拔适应性。
10.权利要求1-2所述的SNP标记、权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒在中国马鹿高海拔适应性辅助鉴定、辅助育种、筛选及马鹿EPAS1基因分型中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311759205.3A CN117701734A (zh) | 2023-12-20 | 2023-12-20 | 一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的snp标记、引物对、试剂盒、方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202311759205.3A CN117701734A (zh) | 2023-12-20 | 2023-12-20 | 一种鉴定中国马鹿高海拔适应性的snp标记、引物对、试剂盒、方法及其应用 |
Publications (1)
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| CN117701734A true CN117701734A (zh) | 2024-03-15 |
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ID=90156742
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2023
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