JP2006500937A - ヒトの糖鎖付加パターンを有する遺伝子産物の発現のための高収量異種発現細胞系 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトの糖鎖付加パターンを有する組換え遺伝子を安定的に、高収量で発現できる細胞を確立し、任意の標的遺伝子を挿入できる安定普遍前駆細胞を確立するための偏在／普遍的な方法に関する。本発明はさらに、前記方法により得られうる細胞に関する。

Description

本発明は、ヒトの糖鎖付加パターンを有する組換え遺伝子を安定的に、高収量で発現できる細胞を確立し、任意の標的遺伝子を挿入できる安定普遍前駆細胞を確立するための偏在／普遍的な方法に関する。本発明はさらに、前記方法により得られうる細胞に関する。

組換えタンパク質の生産は異なる用途にとって重要である。タンパク質の構造研究（合理的な薬剤の設計および薬剤の最適化はそれらに基づくものである（Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１２ Ｓｕｐｐｌ．，４３−４９（２００１）））、タンパク質（酵素）の工業用途および組換えタンパク質の臨床用途は、その効果的な生産の必要性を増加させる。２０００年２月現在で、米国製薬工業協会の調べによれば、２０個のモノクローナル抗体を含む１２２個の生物製剤が第三相試験またはＦＤＡ認可待ちのいずれかの状態にあった（Ｋ．Ｇａｒｂｅｒ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １９，１８４−１８５）。

用途に応じて、組換えタンパク質の未変性構造および翻訳後修飾（例、グリコシル化）が必須である。バイオテクノロジーの「ペット」生物である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような原核生物は、翻訳後修飾を導入する能力を欠いている。真核細胞のみが、機能的に活性のあるタンパク質を生産するためにしばしば必要とされる、翻訳と同時に、および翻訳後に必要な細胞の機構を有している。各種の異種タンパク質の生産のための各種の真核生物によるシステムが存在する。例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、またはクリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属由来の真菌の発現システムが確立している（ＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇとＧｅｌｉｓｓｅｎ（１９９７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８，５５４−５６０）。時折、真菌で遭遇するプラスミドの不安定性の問題を回避するために、異種タンパク質をコードする配列が、相同組換えにより、真菌の染色体に理想的に組み込まれる。さらに、真菌の発現システムで遭遇する問題は、異種タンパク質の過剰グリコシル化と、不正なオリゴマー化および不十分なリガンドの取り込みのような不正なフォールディングである。昆虫細胞における異種タンパク質の発現−異種タンパク質をコードするＤＮＡはまた、組換えにより染色体に取り込まれるが−は、これらの問題を回避する。しかし、昆虫細胞はシアル酸とシアルグリカンを生産する能力を欠いている。末端のシアル酸残基は、多くの複合糖質において様々な生物学的役割を果たしている。植物はまた、組換えタンパク質の生産に用いることができる。しかし、これらの異種発現システムでは、抽出と精製が困難であることが現実に障害となっている。

哺乳動物発現システム、培養細胞、ならびにトランスジェニック動物にはこれらの不都合はない。組換えタンパク質を培養哺乳動物細胞で一過的に、あるいは構成的（安定的）に生産できる。組換え体の一過性発現では、組換えタンパク質をコードするベクターＤＮＡを細胞に導入し、一般的には細胞ＤＮＡに組み込まない。組換えタンパク質の発現力価は初期では高い。しかし、ベクターＤＮＡが複製されないので、ベクターＤＮＡはそれぞれの細胞増殖で希釈され、それゆえ、発現力価は低下する。ベクターＤＮＡまたはベクターＤＮＡの一部だけが非正統的に細胞のゲノムＤＮＡと組み換わることは殆ど無く、組換えタンパク質をコードする遺伝子は安定的にゲノムに組み込まれる。組換えタンパク質をコードする遺伝子が選択マーカーと結合している場合、このカセットをもつ細胞を安定形質転換細胞として同定、単離することができる。安定形質転換体は、異種タンパク質が連続的に生産される利点を有する。発現力価は主として、プロモーターコンストラクトの強さ、染色体中の組み込み部位、コピー数および問題の組換えタンパク質の型により決定される。多くの強力なプロモーターが市販されているが、それらの転写活性は関連する転写因子の細胞レベルと組み込まれる部位のクロマチン構造に依存して変化する。例えば、染色体ＤＮＡのスキャフォールド−、またはマトリックス接着領域（Ｓ／ＭＡＲエレメント）内での組み込みにより、プロモーター活性−それにより異種遺伝子の発現−が増大し、隣接するクロマチンによる不活性化から保護されることになる。それゆえ、特異的な細胞において高活性のプロモーターを選択し、染色体の活性部分へ組み込むことが非常に望ましい。好ましくは、低コピー数の異種遺伝子が一般に、多コピー遺伝子よりも安定に発現するので、単一の組み込みが望ましい。

単一の、予め選択された高活性の座における組み込みは相同組換えにより達成できる。この方法は、典型的にはマウス胚性幹細胞に適用されるのだが、ヒト起源の体細胞では極めて効率が悪く、大規模のスクリーニングの努力が必要である。その上、殆どのヒト永久細胞系は、これらの細胞系が通常は倍数体であり、２個所以上の同一座を標的とすることが困難となるので、完全に所与の標的遺伝子の発現が止まることが望まれる場合、適用できない。リコンビナーゼ、例えばＣｒｅ、ｆｌｐ、Ｃ１３、とそれぞれの標的部位（ＲＲＳ）を用いた部位特異的組換えが実行可能な代替案である（Ｆｅｎｇ，Ｙ．Ｑ． ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２９２（４），ｐ．７７９−７８５（１９９９）；Ｓｃｈｌａｋｅ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．２４４（１−２），ｐ．１８５−１９３（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０００）；Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７（１），ｐ．３５−４２（Ｊａｎｕａｒｙ １９９９）；Ｇｒｏｔｈ，Ａ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ＵＳＡ，ｖｏｌ．９７（１１），ｐ．５９９５−６０００（Ｍａｙ ２０００））。このアプローチでは、単一のＲＲＳをもつプラスミドを染色体に単一のＲＲＳをターゲットするために用いることができる。この方法には、しかし、ある限定がある：すなわち、逆反応、プラスミドの切り出しが分子間の組換えで、組み込みよりも高速に起きるので、全く効率が悪い。第二に、細菌の遺伝子を含む全プラスミドが組み込まれる。第一の問題を解決するために、例えば、ｆｌｐとｃｒｅの両者に対する異種特異的な標的部位を用いて、一方向性を確立した。これらのＲＲＳをそれぞれのリコンビナーゼは認識するが、組換えを成功させるためには同一部位が必要であり、切り出し反応は排除される（Ｋａｒｒｅｍａｎ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２４（９），ｐ．１６１６−１６２４（１９９６）；Ｔｒｉｎｈ，Ｋ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．２４４，ｐ．１８５−１９３（２０００））。しかし、ターゲティングプラスミドはそれでも染色体の単一の好ましい位置に組み込まれなければならない。そのようなまれな組み込みを見出すための大規模なスクリーニングの努力が必要である。これらのクローンはしばしば二つ以上のコピーのプラスミドを含み、不完全なコピーを含み、細菌の配列を組み込みから排除することができない。これらの細菌の配列は、標的領域をしばしば不活性化する哺乳動物細胞により認識される。それとは別に、ターゲティングカセットをレトロウイルスベクターにより組み込むことができる（Ｋａｒｒｅｍａｎ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２４（９），ｐ．１６１６−１６２４（１９９６））。これらのベクターは染色体内の活性部位を標的とし、完全長のカセットのみが組み込まれ、単一の組み込み部位を作出するように感染量が調節される。しかし、ＩＴＲｓに隣接する発現ユニットはまた、非活性化される。さらに、このシステムの使用は、発現するタンパク質の治療用途を排除するように政府発表機関に制限される。

上記を考慮すると、組換えヒト糖タンパク質を高収量で産生する細胞を得るための対象の産物をコードする任意の遺伝子をもつ細胞系の形質転換／変換の方法、特に厄介なスクリーニング操作を必要としないか、ほとんど必要としない方法が望まれている。驚いたことに、高収量でヒト翻訳後修飾の特性を有する組換え糖タンパク質を発現する細胞が、ヒトまたは基本的にヒト雑種細胞（以下、単に「元の細胞（starting cell）」と称する）で非必須の高発現する細胞遺伝子（以下、単に「元の遺伝子（starting gene）」と称する）を最初に同定し；第二に、元の遺伝子を、部位特異的組み込みのためのリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳｓ）と随意に各種の機能配列を含有する「代替」遺伝子を含む第一のＤＮＡ配列と（例えば、適当なターゲティングカセットを用いることにより）、相同組換えにより直接的に置換し、この前駆発現細胞（機能化細胞）の安定クローンを選択／単離し；第三に、標的遺伝子産物（タンパク質）をコードする対象遺伝子（これ以後、「標的遺伝子」と称する）を、第一のターゲティングカセットに含まれるＲＲＳｓを認識するリコンビナーゼを用いた部位特異的組み込みにより導入し；最後に、大量の組換えタンパク質を産生できる安定発現細胞を選択／単離することにより取得し得ることを見出した。元の遺伝子を標的遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を含む機能ＤＮＡ配列と直接的に置換することもできる。

上記方法に適した元の細胞が、ヒトミエローマおよびハイブリドーマ細胞、およびヒトのヘテロハイブリドーマ細胞（Ｈ−ＣＢ−Ｐ１のようなヒト−マウスのヘテロハイブリドーマ細胞を含む）のような特定の哺乳動物細胞であり、基本的にヒトのグリコシル化パターンを有するタンパク質を生産することをさらに見出した。

本発明を用いると、対象の組換えタンパク質をコードするいかなる遺伝子も前記の特定の哺乳動物細胞に安定的に導入することが可能である。本発明を用いると、組換えタンパク質をコードする対象の遺伝子は、高発現する細胞遺伝子座に、好ましくは染色体の活性部分の高活性細胞プロモーターに近接して組み込まれる。本発明を用いると、ＲＲＳｓで囲まれた代替遺伝子を有する各種起源の前駆細胞系を作製することができる。本発明を用いると、代替遺伝子を、適当なリコンビナーゼにより触媒されるＲＲＳｓでの部位特異的組換えにより、組換えタンパク質をコードする対象遺伝子と交換でき、結果として最終の高収量発現細胞を生ずる。

最後に、ヒト−マウスのヘテロハイブリドーマが非常に明確なヒトのグリコシル化パターンを提供することを見出した。

より具体的には、本発明は、
（１）ヒトの糖鎖付加パターンを本質的に有する標的遺伝子産物を安定的に高収量で発現できる細胞を調製する方法で、その方法が
（ａ）ヒト細胞またはヒトの雑種細胞（元の細胞; starting cell）には必須ではない、元の遺伝子産物（starting gene product）を安定的に高収量で発現できる元の細胞を選択すること；
（ｂ）元の細胞ゲノム内の元の遺伝子産物の座をスクリーニングすること；
（ｃ１）元の遺伝子産物をコードする遺伝子を、機能化前駆細胞を得るために、一つ以上のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）を含む第一の機能ＤＮＡ配列に置き換えること；および
（ｄ）標的遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を含む第二の機能ＤＮＡ配列を、ステップ（ｃ１）で得られた機能化前駆細胞に、第一の機能配列で取り込まれたＲＲＳを認識するリコンビナーゼを用いて挿入すること、または
（ｃ２）元の遺伝子産物をコードする遺伝子を、標的遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を含む機能ＤＮＡ配列に直接置き換えること、
を含む方法；
（２）（１）の方法の好ましい実施態様であって、上記の元の細胞がＢリンパ球由来の不死化細胞である（好ましくは、ヘテロハイブリドーマＨ−ＣＢ−Ｐ１（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１０４）のようなヒト−マウスのヘテロハイブリドーマであって、機能ＤＮＡ配列の組み込みがＩｇ座（好ましくは、前記細胞の再編成されたヒトＩｇ座）で行われる）；
（３）上記（１）または（２）の方法により得られうる標的遺伝子産物を高収量発現できる細胞；
（４）上記（１）または（２）で定義される、工程（ａ）から（ｃ１）を含有する機能化細胞を調製する方法；
（５）上記（４）に定義される前駆細胞；
（６）上記（３）に定義される細胞を培養することを含有する、標的遺伝子産物を高収量発現する方法；
（７）Ｈ−ＣＢ−Ｐ１由来の細胞を培養することにより得られうる標的遺伝子産物、
を提供する。

本発明は元の哺乳動物細胞、特にヒト細胞またはヒト雑種細胞を安定高収量発現細胞に形質転換する方法を提供する。連続的な組換え体の発現を達成するために、組換え産物をコードする遺伝子を細胞のゲノムＤＮＡに組み込む。細胞ＤＮＡへの組換え遺伝子の組み込み部位により発現レベルを高度に決定する。それゆえ、ここで表される方法は組換え遺伝子の細胞中のゲノムの高度に転写活性を有する部分への組み込みを含む。組換えタンパク質をコードする対象遺伝子を非常に強力な組換えプロモーターの支配下に置くか、または高活性の細胞プロモーターの下流に該遺伝子を組み込むことにより、高活性の細胞プロモーターの支配下に置くことができる。

本発明の方法（１）の好ましい実施態様において、元の細胞は元の遺伝子産物を、好ましくは、少なくとも０．３ｆｍｏｌ／細胞／日の量のポリペプチド鎖（約９０ｋｄのタンパク質に関して３０ｐｇ／細胞／日に等しい）で、より好ましくは、１ｆｍｏｌ／細胞／日以上の量（約９０ｋｄのタンパク質に関して１００ｐｇ／細胞／日に等しい）で分泌する。そうでなければ、元の細胞が元の遺伝子産物を分泌しない場合では、高発現する、好ましくは非必須の細胞内または膜タンパク質、または高発現する非コードＲＮＡをコードする遺伝子を選択する。

別の好ましい実施態様では、元の細胞は初期の、不死化または融合細胞、もしくはその遺伝的に修飾された細胞である。それゆえ、元の細胞は初期細胞、不死化細胞（例えば、Ｂリンパ球由来の不死化細胞）または腫瘍細胞、もしくはその遺伝的に修飾された細胞、雑種細胞、一般的にタンパク質製造に用いられる、ＨＥＫ２９３、遺伝的不死化または不死化細胞系との融合により初期細胞から作製されるＰＥＲ．Ｃ６ヒト細胞系のような細胞系から選択され、好ましくはヒトのハイブリドーマまたはヘテロハイブリドーマ細胞（例えば、ヒト−マウス、ヒト−ラットなど）であり、もっとも好ましくは、ヒト−マウスのヘテロハイブリドーマＨ−ＣＢ−Ｐ１（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１０４；ＺＩＭ５１７として以前に引用した）である。

元の細胞がヒト細胞またはヒトのヘテロハイブリドーマ（例えば、上記定義のような細胞）であるなら、前記雑種細胞またはヘテロハイブリドーマは少なくとも一つのヒト染色体を含有し、および／または、ヒトの翻訳後修飾ができることが好ましい。元の遺伝子産物がヒト遺伝子であることが特に好ましい。

元の遺伝子産物は好ましくは、抗体、サイトカイン、ホルモン、酵素、移送タンパク質、貯蔵タンパク質、構造タンパク質などのような分泌タンパク質から選択される。元の遺伝子産物はあるいは、選択された元の細胞の主要産物である。非常に安定なＩｇＭの発現がＨ−ＣＢ−Ｐ１で観察され、あるいはスクリーニング法で選択される。スクリーニングは、マイクロアレイ発現分析、２Ｄタンパク質ゲル電気泳動、定量的ＰＣＲ、ＲＮＡｓｅ保護、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを含む個々の、または複合の方法に基づくものである。これらの個々の方法の能力と感度は当業者には既知である。

本発明の方法により任意の組換えタンパク質を産生することができる。好ましい標的遺伝子産物として、酵素、特にプロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、ホルモン、サイトカイン、レセプターまたはその可溶型（例えば、膜透過ドメインまたは細胞内ドメインを欠くレセプター）、全長の抗体または抗体ドメイン、およびこれらのタンパク質群のドメインを合わせた融合タンパク質があげられるが、これに限定されない。

工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ１）および（ｄ）を含む実施態様（１）の最初の選択肢において、元の遺伝子の置き換えはワンステップ置き換え法により行われ、ここで元の細胞は第一の機能配列を含むベクター構築物と接触し、前記第一の機能配列は不活性化し、部分的または完全に元の遺伝子産物をコードする遺伝子と置き換わる。あるいは、置き換えは二工程または複数工程法により行われ、元の遺伝子産物をコードする遺伝子は削除、または不活性化され、続いて第一の機能配列を含むベクターと接触する。前記第一の機能配列は削除された／不活性化された元の遺伝子産物の部位に組み込まれる。

元の遺伝子の場所への第一の機能配列の特異的組み込みは、標的配列または近接する配列に相同な、ベクター中の第一の機能配列に隣接する配列により促進される。これらの隣接配列は、元の細胞のラムダ、コスミド、ｐａｃまたはｂａｃライブラリーから得られるか、元の細胞のＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより生成される。標的遺伝子の場所への第一の機能配列の特異的組み込みから得られる細胞クローンの割合（パーセンテージ）は、二重選択法を用いることによりさらに増加する。ここで、陽性選択マーカーとして第一の機能配列の一部を含み、陰性選択マーカーは相同隣接配列により第一の機能配列から分離される。相同交換により、陰性選択マーカーなしで、陽性選択マーカーを組み込むことができる。要請選択マーカーの例としては、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、ネオマイシン、あるいはグルタミン合成酵素遺伝子があげられ、ＨＳＶ ｔｋまたはシトシンデアミナーゼが陰性選択マーカーである。マーカーおよびこれらの適用方法は当業者に既知である。

相同交換から得られた細胞クローンを、第一の機能配列から発現される遺伝子産物の要素の存在と元の遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子不活性化により同定した。これらの細胞クローンは機能化前駆細胞を表す。

第一の機能配列は、ｌｏｘＰ、ｆｒｔ、ラムダ様ファージのａｔｔ Ｌとａｔｔ Ｒ、レソルバーゼまたはファージＣ３１インテグラーゼの認識部位から選択される一つ以上のＲＲＳ（ｓ）を含有する。前記認識部位により、例えば修飾されたｌｏｘＰおよびｆｒｔ部位だけでなく、ΦＣ３１インテグラーゼの（野生型の）認識部位により得られる、一方向の組み込みが提供されることが好ましい。第一の機能配列はさらに、マーカー配列、分泌タンパク質遺伝子、プロモーター、エンハンサー、スプライスシグナル、ポリアデニル化シグナル、ＩＲＥＳエレメント等から選択される配列を含むことができる。

標的遺伝子産物の産生細胞を作製するために、機能化前駆細胞（実施態様（１）の第二の選択肢の工程（ｃ２）で得られるような産生細胞がまだない場合は、以下を参照せよ）、例えば、ＰＢＧ０３クローンＤ３（ＤＳＭ ＡＣＣ２５７７）を次いで、第二の機能配列を含む第二のベクターと接触させる。第二の機能配列は、第一の機能配列中に存在する標的遺伝子および前記リコンビナーゼのＲＲＳ（ｓ）を含有する。第二の機能配列はさらに、プロモーター配列、マーカー配列、第一の機能配列のＲＲＳとは異なるリコンビナーゼ認識配列等を含有する。

第二の機能ＤＮＡ配列の組み込みを、アクセサリータンパク質（例えば、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、ΦＣ３１インテグラーゼ、レソルバーゼ等）の存在、または非存在下でのリコンビナーゼのＲＲＳの認識により、行った。これらのリコンビナーゼとアクセサリータンパク質、これらのタンパク質をコードするｍＲＮＡ、もしくは、一過性発現をするためのウイルスまたは非ウイルスベクターが、第二の機能配列の供給とともに、その直前に、もしくは、その直後に供給される。

元の遺伝子の場所に第二の機能配列を含むクローンの純粋な集団を、再構築機能選択マーカー遺伝子を用いた選択により得ることができる。例として、第一の機能配列を用いて導入した不活性化ＡＴＧ欠失選択マーカー遺伝子を、活性プロモーターと第二の機能配列をもつインフレーム−ＡＴＧコドンの供給により再構築できる。

本発明の実施態様（１）の第二の選択肢（工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ２）を含有する）において、元の遺伝子産物をコードする遺伝子を直接（すなわち、前駆細胞の供給なしに）、標的遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を含む機能ＤＮＡ配列（以降、簡単に「第三のＤＮＡ配列」と称する）と置き換えることができる。前記第三のＤＮＡ配列を前述のように、一工程または複数工程の方法で取り込むことができる。第三のＤＮＡ配列はさらに、前述の第一および第二のＤＮＡ配列と同様の（プロモーター、マーカー等のような）機能配列を含む。本発明の実施態様（１）の第二の選択肢は、たった一つの標的遺伝子産物が産生され、その結果、前駆細胞の産生が必要ないならば、特に好ましい。

本発明の好ましい実施態様（２）において、元の細胞は好ましくは、ヒト−マウスのヘテロハイブリドーマ細胞、好ましくはヘテロハイブリドーマ細胞Ｈ−ＣＢ−Ｐ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２１０４）である。機能ＤＮＡ配列の組み込みを、Ｉｇ座で、好ましくはハイブリドーマ細胞のヒト再編成Ｉｇ座（例えば、重鎖または軽鎖（λまたはκ））の一つで行うことができる。再編成免疫グロブリン座は、ハイブリドーマを生じるＢリンパ球の成熟過程で生殖系列の染色体構造から修飾された機能Ｉｇ遺伝子（重鎖λまたはκ）周辺のゲノム配列である。ＩｇＨ座は染色体１４ｑ３２．３３に位置する。Ｈ−ＣＢ−Ｐ１において、この場所は、μイントロンを介してＣμ配列（ＤＤ ２９６ １０２ Ｂ３）に隣接した、Ｄ遺伝子を介してＪ_Ｈ６遺伝子に隣接した、再編成され、アフィニティ成熟したＶＨ１−２遺伝子により形成される。Ｈ−ＣＢ−Ｐ１−ＩｇＨ座の再編成ＶＤＪ領域の配列を配列番号：１２に規定する。

本発明の実施態様（３）および（５）の細胞はＨ−ＣＢ−Ｐ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２１０４）に由来することが好ましい。さらに、本発明の実施態様（３）において、標的遺伝子産物は抗体であることが好ましい。そのような場合、細胞は好ましくはＰＢＧ０４（ＤＭＳ ＡＣＣ２５７７）である。特に、抗体の発現に用いられる上記細胞において、軽鎖が不活性化され、同一の、または異なる標的遺伝子産物をコードする遺伝子で置き換えられていることが適している。

その上、前記のように、Ｈ−ＣＢ−Ｐ１由来の細胞系の発現により得られうる標的遺伝子産物は、独特の、基本的なヒトグリコシル化パターンを有している。

治療用途のための糖タンパク質、特に抗体は、Ｎ結合グリカンのような翻訳後修飾は哺乳動物のみで生じ、それらはこれらのタンパク質の薬学的特性に実質的な影響をもつので、典型的には哺乳動物細胞で製造される。完全に処理されたＮグリカンは、コアとしてフコースを、末端にシアル酸をもつ二触角（バイアンテナリー; biantennary）構造を形成する（図１５）。生理的条件下で、大部分のタンパク質は、完全な構造の先が切り取られた形をしている。グリコシル化が完了する程度は、細胞型だけでなく、培養条件にも依存する。

シアル化、末端シアル酸のグリカンへの付加の程度は変化し、ヒト血液中の抗体で、３０−４０％である。しかし、シアル化されたタンパク質が高いパーセンテージであると、血液中で治療タンパク質の半減期は増加する。Ｈ−ＣＢ−Ｐ１由来の細胞系、例えばＰＢＧ０４は、実施例５に見られるように、糖タンパク質の製造に広く用いられているＣＨＯ細胞およびＮＳ０細胞に比べ、高度にシアル化された糖タンパク質を産生する。治療用糖タンパク質について、ガラクトース添加前の末端のグリカン（Ｇ０構造）が低含量であることが好都合である。そのため、Ｇ０糖タンパク質は二量体化しやすく、補体に依存した細胞毒性を調節する抗体の能力が減退する。ＰＢＧ０４の遺伝的組成により、Ｇ０構造が低いもの（ローラーボトル工程でレプチン−Ｆｃの４．３％）を用いて、より完全なプロセシングが起きる。

一般的なバイアンテナリー構造は全ての哺乳動物で形成される一方、いくつかの特異的な構造（個々の糖の間の結合）はヒトに特異的、あるいはヒトが完全に除外される。これらの構造は同様に生物学的特性に影響する。それゆえ、ヒト特異的な修飾を生成するために必要な酵素を供給し、特殊な結合の原因であるヒト細胞には存在しない酵素を欠損する、治療用途の糖タンパク質を製造するために、細胞を用いることは好適である。そのような細胞は全くヒト由来であるか、またはヒト染色体の一部を含んでいる。後者の細胞において、ヒト特異的なグリコシル化酵素がヒトに存在しない細胞を支配することが重要である。

ノイラミン酸がＮ-アセチルノイラミン酸またはＮ-グリコリルノイラミン酸として付加されると、後者はマウス細胞の主たる構造となる。Ｎ-グリコリルノイラミン酸は旧世界猿とヒトのグリカンには存在しない。それらは免疫原性であり、治療用タンパク質に対する抗体の形成をもたらす。

さらに、マウス細胞はもう一つのグリコシル化酵素であるアルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼを含んでいる。これはｇａｌ残基をグリカンの露出したｇａｌ残基に転移する反応を仲介する。そのような結合はまた、酵母に見出され、防御として、ヒトはこの構造に対する抗体を予め有している。認識により、免疫複合体が形成され、その結果、腎障害を起こす。レプチン−Ｆｃ由来のＰＢＧ０４の１．３％だけがアルファ１，３ ｇａｌを含んでいる。

ほんの一握りのヒトタンパク質が分岐したＮ−アセチルグルコサミンを含んでいる。それ自体、生物学的特性に影響はしないが、酵素複合体がコアのフコシル化を仲介する別の酵素を阻害する。しばしば、分岐したＮ−アセチルグルコサミンをもつタンパク質において、コアのフコースがなくなり、より効果的なＦｃ−ガンマ受容体の結合と、抗体に依存した細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の促進をもたらす。それゆえ細胞は、コアでないフコシル化タンパク質の割合を増加するための（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩＩを発現するように操作された。（米国特許第６，６０２，６８４号）

コアのフコースのない高含量の糖タンパク質はまた、マウス細胞で得られる。しかし、これらのタンパク質はマウスタンパク質に特徴的な、不利な特性を含む。ヒトと、正しい染色体組成細胞をもつマウスの特異的な雑種細胞は両者の有利な特性を合わせることが可能である。ＰＢＧ０４のようなＨ−ＣＢ−Ｐ１由来の細胞系はそのような細胞系である。

本発明はさらに、以下の実施例により説明されるが、これらは発明を限定するものではない。

細胞系Ｈ−ＣＢ−Ｐ１は、ベルリン・ブーフ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｂｕｃｈ）、ロベルト−レスル通（Ｒｏｂｅｒｔｏ−Ｒoｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．） １０（ＤＤＲ−１１１５）の「ドイツ民主共和国自然科学アカデミー微生物学中央研究所（Ｚｅｎｔｒａｌｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｅ， Ａｋａｄｅｍｉｅ ｄｅｒ Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｅｎ ｄｅｒ ＤＤＲ）」に、１９９０年３月１６日に、ＺＩＭ−０５１７として寄託され、ドイツ、ブラウンシュバイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ） ３８１２４、マシュローダー・ヴェーク（Ｍａｓｃｈｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ） １３のＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ））に、２０００年１２月１２日に移管され、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２１０４を付与された。ＰＢＧ０３クローンＤ３（ｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ）をＰＢＧ０４とリネームし、ＤＭＳＺに２００２年９月１８日に、ＤＳＭ ＡＣＣ２５７７として寄託した。

材料と方法
材料：
ＤＮＡクローニング法
ゲノムＤＮＡの単離： Ｔ２５ ｃｍ^２ フラスコの細胞をトリプシン処理し（下記「トリプシン処理」の章を参照せよ）再懸濁した細胞ペレットを１．５ ｍｌエッペンドルフチューブに移し、２００ μｌのＰＢＳを添加した。チューブを５分間、１３，２００ ｒｐｍで遠心し、上清を捨て、ペレットを２ ｍｌの溶液Ａに再懸濁した。懸濁液をファルコンチューブ（１５ ｍｌ）に移した後、１３３ μｌの１０％ ＳＤＳと３３３ μｌのプロテアーゼＫを添加した。５５℃で３時間のインキュベーション、または室温で一晩のインキュベーションを続けて行った。懸濁液を６０７ μｌの６ Ｍ ＮａＣｌと混合し、遠心（４３００ ｒｐｍ、４℃、２０分）前に１５秒間ボルテックスで撹拌した。上清をファルコンチューブ（１５ ｍｌ）に移し、２．５ ｍｌの１００％ エタノールと混合した。界面に形成された糸状のＤＮＡの沈殿をピペットチップで取り、１／２ ＴＥ緩衝液に再懸濁した。ＤＮＡを４℃で保存する前に、５６℃で完全に溶解した。

ＰＣＲ： ＰＣＲ法をゲノムＤＮＡ配列の単離（調製用ＰＣＲ）、またはあるＤＮＡ配列の検出（分析ＰＣＲ）のために用いた。

調製用ＰＣＲ： 調製用ＰＣＲ反応（５０ μｌ）をＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲキット（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて、製造者の指示に従って準備した（２０−３０ ｎｇの鋳型、５ μｌの１５ ｍＭ ＭｇＣｌ_２緩衝液（１０×）、５ μｌのｄＮＴＰミックス、０．５ μｌのそれぞれのプライマー（３０ ｎＭ）、０．５ μｌのポリメラーゼを水で５０ μｌにした）。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））を用いて精製した。

分析ＰＣＲ： 分析ＰＣＲ反応（１０ μｌ）をＴａｑポリメラーゼキット（キアゲン）を用いて、製造者の指示に従って準備した（１０ ｎｇの鋳型、１ μｌの１０×緩衝液、０．５ μｌのｄＮＴＰミックス、０．１ μｌのそれぞれのプライマー（３０ ｐＭ）、０．１ μｌのＴａｑポリメラーゼを水で１０ μｌにした）。

ＰＣＲサイクルのプログラムは、プライマーのアニーリング温度（表２を参照せよ）と予想されるＰＣＲ産物の長さ（伸長時間と温度が決定される；表１を参照せよ）により、それぞれの産物により変化する。

プラスミドＤＮＡの増幅、単離および定量： 大腸菌形質転換体を１ ｍｌ、３０ ｍｌ、または１００ ｍｌ培養で生育させ、プラスミドＤＮＡをそれぞれＭｉｎｉ−、Ｍｉｄｉ−、またはＭａｘｉ−プラスミド精製キット（キアゲン）を用いて単離した。製造者の指示に従った。ＤＮＡ濃度を分光光度計で、２６０ ｎｍと２８０ ｎｍの吸収を測定することにより定量した。

制限酵素による消化： プラスミドＤＮＡを、１ μｇのＤＮＡあたり１単位の適当な制限酵素で、業者の推奨する緩衝液と温度を用いて消化した（表３を参照せよ）。分析に二つ以上の制限酵素が必要ならば、可能ならば、反応を同時消化で行った。さもなければ、反応液のカラム精製工程（キアゲン）を介在させて、経時的に単一の消化を行った。

５’突出末端をもつＤＮＡの末端修復： ＥｃｏＲＩで作られるような５’突出を「平滑」にするために、消化したＤＮＡを製造者の指示に従って、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（ロッシュ）で処理した。末端を埋める反応を熱不活性化工程（６５℃、２０分）により停止し、ＤＮＡをエタノール沈殿するか、または直接ゲル精製にかけた。

ベクターＤＮＡの脱リン酸化： 直鎖化したベクターＤＮＡが適合する末端と自己ライゲーションすることを防ぐために（下記の「ライゲーション」を参照せよ）、ＤＮＡを製造者の指示に従い、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（ロッシュ）を用いて脱リン酸化した。ＡＰを熱により不活性化し（６５℃、１５分）、ライゲーション反応に用いる前に、ＤＮＡをゲル精製した（電気泳動については、下記の「アガロースゲル電気泳動」を参照せよ）。

ＴＯＰＯクローニング： ＰＣＲ増幅産物をインビトロジェンのＴＯＰＯベクターにクローニングした。ＴＯＰＯクローニングキットの指示に従い、精製されたＰＣＲ産物（０．２５−２ μｌ）を塩溶液（０．５ μｌ）と混合し、水を加えて容量を２．５ μｌとした後、ＴＯＰＯベクター（０．５ μｌ）を添加した。室温で３０分間のインキュベーションの後、反応チューブを氷上に移し、反応液の２ μｌを「ワンショット化学的コンピテント大腸菌（ｏｎｅ ｓｈｏｔ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ）」に添加し、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。細胞に熱ショック（４２℃、３０秒）を与え、直ちに氷上に戻し、室温のＳＯＣ培地を２５０ μｌ添加した。混合液をカナマイシンまたはアンピシリンのいずれかを含むＬＢプレートに播く前に、形質転換反応液を３７℃で１時間、振盪（３００ ｒｐｍ）しながらインキュベートした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。

ライゲーション： 全てのライゲーション反応を、０．１−１ μｇの脱リン酸化ベクターと過剰量のインサートを用いて、１０ μｌの容量で行った。反応液は２ μｌのＴ４ライゲーション緩衝液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と１ μｌのＴ４リガーゼ（ロッシュ）を含み、１６℃で２時間、または４℃で一晩インキュベートした。ライゲーション反応液を細菌に形質転換した。

不要な非組換え体のレベルを下げるために、自己ライゲーションしたベクターに唯一の制限部位があるならば、ライゲーション反応液を適切な制限酵素で反応後消化した。消化後、ライゲーション反応液を、再溶解したＤＮＡを再び形質転換反応に用いる前に、アクリルアミド存在下で、エタノール沈殿した（４℃、１４，０００ ｒｐｍ、１５分の遠心）。

コンピテント細菌の形質転換： コンピテント大腸菌ＸＬ２（−７０℃で保存）を氷上で融解し、ライゲーション反応液（氷上保存、上記「ライゲーション」を参照せよ）または１−１００ ｎｇのプラスミドＤＮＡ（再形質転換）のいずれかと混合し、氷上で２０分間インキュベートした。続いて、形質転換反応液を熱ショック（３０−６０秒、４２℃）に付し、チューブを氷上に戻した。２０５ μｌのＳＯＣ培地（抗生物質なし）を添加し、反応液を３７℃で４５分間、振盪（３００ ｒｐｍ）しながらインキュベートした。形質転換反応液を抗生物質（カナマイシン（４０−６０ μｇ／ｍｌ）またはアンピシリン（５０−１００ μｇ／ｍｌ）のいずれか）を含むＬＢプレートに播き、３７℃で一晩インキュベートした。細菌のコロニーをカウントし、形質転換反応の効率を計算した。

アガロースゲル電気泳動： ＤＮＡ断片をその長さに従って、０．７−１．５％ アガロースゲルで分離した。アガロースを１×ＴＡＥ緩衝液に溶解し、２ μｌの臭化エチジウム／１００ ｍｌのアガロースを添加した。アガロースを溶解し、トレイに注いでセットした。ＤＮＡ試料をローディング緩衝液オレンジＧ（Ｏｒａｎｇｅ Ｇ）と混合し、水平ゲルにのせ、ランニング緩衝液として１×ＴＡＥを用いて、４０−９０ Ｖで泳動した。ＤＮＡ／臭化エチジウム複合体をＵＶ光で可視化した。

ＤＮＡ断片のゲル精製： ＤＮＡをアガロースゲルで分離し（４０−８０ Ｖ）、対象のＤＮＡバンドをメスで切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン）を用いて、製造者の指示に従って、ＤＮＡをアガロースブロックから抽出した。

細胞培養
トリプシン処理： 接着細胞をトリプシンを用いて回収した。まず培地を除去し、細胞単層をクエン酸緩衝液（予め３７℃に暖めておく）で洗浄した。少量のトリプシンを直接細胞単層に添加し、３７℃で３−５分間インキュベートした。５％ ＦＣＳを添加したＰＢＧ １．０ 培地を添加することにより、トリプシン処理を停止させた（表４を参照せよ）。細胞懸濁液をファルコンチューブ（５０ ｍｌ）に移し、１０分間遠心した（８００ ｒｐｍ、３０℃）。細胞ペレットを新鮮な培地に再懸濁し、該細胞を電気穿孔法またはさらなる実験に用いた。

細胞のカウンティング
細胞をトリプシン処理した後、ノイバウワーチャンバー（ヘマトサイトメーター）でカウントした。少量の細胞懸濁液をチャンバーに入れ、該チャンバーを顕微鏡下に置いた。チャンバーの四つの四角のうちの一つの中の細胞だけをカウントし、ｍｌあたりの細胞数を得るために、細胞数を１０^４倍した。生細胞と死細胞を区別するために、カウント前に細胞をトリパンブルーで染色した。死細胞は青くなり、一方生細胞は色素を取り込まなかった。

形質転換
Ｈ−ＣＢ−Ｐ１細胞の電気穿孔法： 標準的な電気穿孔法の反応では、１０ μｇの直鎖化したプラスミドＤＮＡを用いた。培養培地を除去し、Ｈ−ＣＢ−Ｐ１単層をクエン酸緩衝液で洗浄し、トリプシン処理した（上記「トリプシン処理」を参照せよ）。細胞ペレットをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（予め３７℃に暖めておく）に再懸濁し、ｍｌあたり３×１０^６細胞とした。７００ μｌの細胞懸濁液を電気穿孔法用キュベット（ｐｅｑＬａｂ；ＥＱＵＢＩＯ ４ｍｍ）に移し、直鎖化したＤＮＡ（１０ μｇ）を添加した。細胞を２５０ Ｖ、１５００ μＦで電気穿孔し、直ちに予め暖めた、５％ ＦＣＳを添加したＰＢＧ １．０ 培地を入れたＴ７５ボトルに移し、３７℃、５％ ＣＯ_２でインキュベートした。

選択
Ｈ−ＣＢ−Ｐ１細胞の選択： 電気穿孔したＨ−ＣＢ−Ｐ１細胞を２日間、３７℃、５％ ＣＯ_２で培養した。２日目、培養培地を除去し、非接着細胞を培養培地の遠心により回収した。１ ｍｌの培養培地（上清）を後の一過性発現試験のために凍結した。トリプシン処理した細胞単層と遠心により培養培地から回収した細胞を合わせて、沈殿とした。細胞を５％ ＦＣＳを添加したＰＢＧ １．０ 培地に再懸濁し、１×１０^６細胞／ｍｌ、１×１０^５細胞／ｍｌ、１×１０^４細胞／ｍｌの希釈液を作製した。それぞれの希釈液に５ μｇ／ｍｌまたは１０ μｇ／ｍｌのブラストサイジン、または２００ μｇ／ｍｌまたは４００ μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを添加した。選択培地を４日目、７日目、１０日目に交換し、Ｈ−ＣＢ−Ｐ１クローンの生育を顕微鏡下で制御した。８日目と１０日目の間に、生細胞が目視できた。１３日目、クローンをトリプシン処理により回収し、細胞を９６ウェルのプレートに播いたときに、ウェルに５細胞または１細胞が含まれるように、細胞ペレットをＰＢＧ １．０ 培地に懸濁した。選択圧（５ μｇ／ｍｌまたは１０ μｇ／ｍｌのブラストサイジン、または２００ μｇ／ｍｌまたは４００ μｇ／ｍｌのハイグロマイシン）をその間維持した。１０日目、陽性細胞クローンと陰性細胞クローンを区別するために、細胞を免疫染色した。細胞培養培地を除去し、細胞により産生される組換えタンパク質を認識する蛍光標識された抗体（２ μｇ／ｍｌ）を添加した標準培地に置き換えた。抗体懸濁液を５％ ＦＣＳを添加したＯｐｔｉＭｅｍ １に置き換える前に、４時間、細胞単層上に置いた。細胞単層を蛍光顕微鏡で観察した。テキサスレッド結合抗体を用いる場合、４７０−４８０ ｎｍのスペクトルを透過するＵＶフィルター（ＷＧ）の顕微鏡を用いた。励起したテキサスレッド標識抗体は５９０ ｎｍのスペクトルの光を放出する。３３０−３５５ ｎｍのスペクトルを透過するＵＶフィルター（ＷＵ）をＡＭＣＡに結合した抗体を可視化するために用いた。励起ＡＭＣＡの放射光は青色のスペクトル（４２０ ｎｍ）を生じた。大きく、強い蛍光のクローンのみを考慮した。一つのウェルに単一のクローンのみとし、該細胞をさらにひろげた。一つのウェルに一つのクローン以上がある場合、個々のクローン（細胞）をマイクロキャピラリーでつり上げさらにひろげるために、新しい９６ウェルプレートに移した（以下の「マイクロキャピラリーによるつり上げ」を参照せよ）。

マイクロキャピラリーによるつり上げ： マイクロキャピラリーピッキング装置として、ジョイスティックにより制御される可動アームについているキャピラリーを用いた。マイクロキャピラリーとアームをフードの内側に、ジョイスティックを外側から制御した。対象のクローンを免疫染色法（上記「Ｈ−ＣＢ−Ｐ１の選択」の項に記載）により同定する場合、マイクロキャピラリーをクローンの上に置き、真空ポンプでキャピラリー内を陰圧にし、対象の細胞塊をキャピラリーに吸引した。アームを９６ウェルプレートの新しいウェル上へ動かし、細胞をその中に注入した。

凍結保存： 長期間、細胞を保存するために、トリプシン処理した細胞を１×１０^６から１×１０^７細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を遠心（７００ ｒｐｍ、１０分）により沈殿させ、上清を除去した。細胞を冷却した前ならし培地（９００ μｌ）に再懸濁し、凍結バイアルを１８０ μｌのＤＭＳＯと７２０ μｌのＦＣＳで満たし、９００ μｌの細胞懸濁液をＤＭＳＯ／ＦＣＳ溶液中に移した。凍結バイアルを２４時間、特別な凍結容器で保存し、緩やかに細胞を凍結させた。長期間の保存のために、凍結バイアルを液体窒素タンクへ移した（−１９６℃保存）。

タンパク質産物の検出
ＥＣ−ウェスタンブロット（増強化学発光）： ｈｏｂＦＣ抗体の検出のために、２０ μｌの細胞培養上清を１０ μｌの５％ ＳＤＳと混合し、２分間、９７℃でインキュベートした。細胞培養培地はＩｇＭ抗体を含むと予想されるので、培養培地は処理しなかった。メンブラン（アマシャム−ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ハイボンド−Ｐ）を最初にメタノールでリンスし（１分）、水で３回洗浄し（１分）、プロットトランスファー緩衝液に浸した３ ＭＭ 濾紙片に置く前に、メンブランをプロットトランスファー緩衝液に浸した。５ μｌの前処理した培養培地（ｈｏｂＦＣ抗体）または５ μｌの未処理の（ＩｇＭ抗体）培養培地をメンブランにスポットし、１分間インキュベートした。メンブランをブロッキング緩衝液に置き、振盪しながら、３０分間インキュベートし、Ｔ−ＰＢＳでの５分間の洗浄を３回行った。ブロッキングしたメンブランを検出抗体溶液（ＩｇＧ １：２０００、およびＩｇＭ １：５０００）に置き、２時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳでの２分、５分および１０分のさらなる洗浄を続けた。メンブランを現像液（アマシャム−ファルマシア、ＥＣＬ）中に置き、１分間インキュベートした。最後に、水分をどかし、３ ＭＭ 濾紙に載せ、乾燥しないようにセロファンでラップした。放射光を暗室で観察した。

実施例１： Ｈ−ＣＢ−Ｐ１細胞のＩｇＭ領域に特異的なターゲティングベクターの調製
抗体が高発現し、タンパク質が分泌されることがよく知られているので、組換え遺伝子をＩｇＭ配列領域に挿入した。それゆえ、最終的なターゲティングベクターには標的とされるゲノムＩｇＭ配列と１００％相同性を有する配列が必要である。基本のターゲティングベクターｐＶＨＣμでは、長さが２ ｋｂのＶＨ領域と７．４ ｋｂのＣμイントロン領域を選択した（図３を参照せよ）。両者を校正活性をもつポリメラーゼ（プルーフスタート・ポリメラーゼ（キアゲン））を用いたＰＣＲの断片として単離し、ｐＣＲ４ＢｌｕｎｔＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にサブクローニングし、最終的にｐＶＨＣμと命名した一つのベクターに合わせた（図３を参照せよ）。

プラスミドｐＶＨＣμＣＥＳＨｈｏｂＦｃとｐＶＨＣμＨｈｏｂＦｃの調製： 基本のターゲティングベクターｐＶＨＣμは内在性カセットをもたない。ＣＥプロモーター、代替遺伝子ｈｏｂＦｃ、三つのＦＲＴ組換え部位、さらにハイグロマイシン耐性遺伝子およびＡＴＧ欠失ネオマイシン遺伝子を含む内在性カセットをベクターｐＣＥＳＨｈｏｂＦｃからＢｓｔＤＩ−ＳｗａＩ断片として単離した。断片の末端をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで埋め、ＰｍｅＩで消化し、脱リン酸化した基本のターゲティングベクターｐＶＨＣμとライゲートした。得られたターゲティングベクターをｐＶＨＣμＣＥＳＨｈｏｂＦｃとした。

ＣＥＳプロモーター構築物を欠くが、内在性カセットのその他の部分を全て含む第二のベクターｐＶＨＣμＨｈｏｂＦｃをさらに構築した。ＢｓｔＢＩ−Ｂｓｔｌ１０７Ｉ断片をｐＣＥＳＨｈｏｂＦｃから単離し、末端を埋めた。ｐＣＥＳＨｈｏｂＦｃのＢｓｔｌ１０７Ｉ制限部位は、ｆｒｔ ｗｔ部位とそれに続くｈｏｂＦｃ遺伝子のすぐ上流にあり、それゆえ単離したＢｓｔｌ１０７Ｉ−ＢｓｔｂＩ断片はプロモーターを欠いている。断片を前にＰｍｅＩで消化したｐＶＨＣμベクターにライゲートし、得られたベクターをｐＶＨＣμＨｈｏｂＦｃとした。ｐＶＨＣμＣＥＳＨｈｏｂＦｃとｐＶＨＣμＨｈｏｂＦｃの両ベクターにおいて、内在性カセットの活性のある耐性マーカー遺伝子はハイグロマイシン耐性遺伝子であった。ハイグロマイシン遺伝子の代わりにブラストサイジン遺伝子を含む別のセットのベクターも作製した。

ｐＶＨＣμＣＳＨｈｏｂＦｃｂｌａｓとｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓの構築： 内在性カセット中のマーカー遺伝子としてブラストサイジン遺伝子をもつターゲティングベクターを作製するために、ベクターｐｃＤＮＡＴＲＤをブラストサイジン遺伝子のドナーとして用いた。最初の工程として、ハイグロマイシン遺伝子とブラストサイジン遺伝子の交換があげられる。このために、ブラストサイジン遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片として、ｐｃＤＮＡＴＲＤから単離した。内在性カセットベクターｐｃＥＳＨｈｏｂＦｃもＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩを用いて開環し、これによりハイグロマイシン遺伝子をＡＴＧ欠失ネオマイシンの部分とともに除去した。ブラストサイジン遺伝子を含む断片を開環したｐＣＥＳＨｈｏｂＦｃにライゲートし、得られたベクターをｐＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓｄｅｌｅｔｅｄと命名した。

第二工程は、偶然に除去されたＡＴＧ欠失ネオマイシン遺伝子の再挿入であった。そのために、ＡＴＧ欠失ネオマイシン遺伝子を包含する断片をｐＣＥＳＨｈｏｂＦｃから単離し、開環したベクターｐＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓｄｅｌｅｔｅｄに挿入した。得られたベクターをｐＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓとした。このベクターをブラストサイジン遺伝子のドナーベクターとして、ｐＶＨＣμＣＳＨｈｏｂＦｃとｐＶＨＣμＨｈｏｂＦｃに用いた。ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片をｐＣＥＳＨｈｏｂＦｃｂｌａｓから単離し、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩで開環したベクターｐＶＨＣμＣＥＳＨｈｏｂＦｃに挿入し、ｐＶＨＣμＣＥＳＨｈｏｂＦｃｂｌａｓを生じさせた。ＣＥＳプロモーターを欠く対照ベクターｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓを作製するために、ベクターｐＶＨＣμＨｈｏｂＦｃもまた、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩで消化し、再びｐＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓから単離したＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片をそこにライゲートした。

実施例２： ｈｏｂＦｃクローンの選択
電気穿孔法： Ｈ−ＣＢ−Ｐ１細胞をプラスミドｐＶＨＣμＣｓｈｏｂＦｃｂｌａｓ、ｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ、ｐＶＨＣμＨｈｏｂＦｃおよびｐＣＳｈｏｂＦｃｂｌａｓを用いて、電気穿孔法で処理した。トランスフェクション効率を調べるために、細胞をプラスミドｐＧＦＰＮ１ＶＡでトランスフェクトし、模擬対照として、細胞を水試料を用いて、電気穿孔処理した。トランスフェクション効率は約２０％であることが明らかとなった。電気穿孔処理後２日目に、トランスフェクトしたプラスミドに応じて、ハイグロマイシンまたはブラストサイジンのいずれかを培養培地に添加した。模擬トランスフェクト細胞が全て死滅した場合、他のトランスフェクション反応の細胞を集め、９６ウェルプレートのウェルあたり１細胞または５細胞のいずれかの密度で再度播いた。細胞を、適当な抗生物質を添加した培地で培養し続けた。

選択条件を最適化するために、細胞を電気穿孔処理後２日目に、Ｔ７５フラスコ中２０ ｍｌに対して１０^４細胞、１０^５細胞、または１０^６細胞播いた。培地には、５ μｇ／ｍｌまたは１０ μｇ／ｍｌのブラストサイジン、または２００ μｇ／ｍｌまたは４００ μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを添加した。１４日目、ｃｍ^２あたりのクローン数を調べた。クローンの最高数は、ＣＥＳプロモーターを欠くプラスミド（ｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ）でトランスフェクトした１×１０^６細胞を播いたフラスコで得られた。細胞をＣＥＳプロモーターをもつプラスミドでトランスフェクトすると、１／３のクローン数となった。さらに、これらのクローンの生育はＣＥＳプロモーターをもたないものよりも悪かった。

抗生物質がもつ、タンパク質産生クローンの選択に対する効果： Ｔ７５フラスコのクローンの拡張に続き、クローンをトリプシン処理し、９６ウェルプレートに５細胞／ウェルで再度播いた。培養培地には、５ μｇ／ｍｌまたは１０ μｇ／ｍｌのブラストサイジン、または２００ μｇ／ｍｌまたは４００ μｇ／ｍｌのハイグロマイシンのいずれかを添加した。播種後１０日目に、細胞をテキサスレッドを結合した抗ＩｇＧ抗体とＡＭＣＡ標識したＩｇＭに対する抗体を用いて染色した。ブラストサイジンを用いて培養した細胞では、高濃度の抗生物質を用いると、陽性クローンは減少するという結果を示した。１０ μｇ／ｍｌのブラストサイジンを用いると、５ μｇ／ｍｌの場合に比べて、１００％以上のｈｏｂＦｃの陰性クローンを観察した。しかし、１０ μｇ／ｍｌのブラストサイジンを用いて培養した細胞を含む９６ウェルプレートの最初の３列をカウントし、プレート全体の結果を出したが、５ μｇ／ｍｌのブラストサイジンを用いて培養した細胞を含む９６ウェルプレートは全ての列をカウントした。

蛍光標識した抗体を用いた選択の利点： 免疫蛍光染色法を用いて、多数のクローンを迅速にスクリーニングできる。直接免疫法を用いて得られた結果は、標的配列のゲノムＤＮＡへの正しい組み込みの最初の兆候であった。発現しないクローンをこの方法で容易に検出した。免疫蛍光染色法は技術的に容易で、メチルセルロース染色法よりも低濃度の抗体を必要とし、細胞の生育に障害を与えない。顕著な傷害なしに、トリプシン処理や細胞を新しい培養器に移すためのマイクロキャピラリーつり上げの前に、細胞を免疫染色することができる。

実施例３：ＩｇＭ座への相同な挿入の検出
ターゲティングベクターをデザインするため、再編成した免疫グロブリン重鎖座を、抗体のｃＤＮＡ配列とヒトゲノム配列の情報を基に、組み立てた。ＩｇＭの産生がターゲティング法によりだめになることを確実にするために、ＡＴＧを含む完全なリーダー配列、Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子をターゲティングベクターから除き、１回の相同組換え事象によりゲノムから削除した。それゆえ、置き換え型のターゲティングベクターはＩｇＭ座と同一の遺伝子型の配列を含み、ｈｏｂＦｃ遺伝子、ブラストサイジンおよびＡＴＧ欠失ネオマイシン耐性遺伝子と直接交叉できる。第１４番染色体上に唯一の再編成された活性のあるＩｇＭ座が元の細胞系Ｈ−ＣＢ−Ｐ１に存在するので、相同組換え事象は、蛍光抗体染色と抗ＩｇＭ抗体を用いた上清のイムノブロッティングにより検出されるＩｇＭの発現を完全に止めてしまう。

ＩｇＭとＩｇＧのウェスタンブロット（ドットブロット）： ドットブロット法を、直接免疫染色法で得られた結果を検証するために用いた。これらのクローンの上清（培地）について、ＩｇＭとＩｇＧが存在するかを試験した。上清においてＩｇＭ陰性、ＩｇＧ陽性であれば、相同組換えが起きたと結論できた。

組み込まれた標的配列の検出のためのＰＣＲ： ターゲティングカセットがＩｇＭ座に組み込まれたかを検証するために、フォワードプライマーＶ５（配列番号：７）およびリバースプライマーＶ６（配列番号：８）またはＶ７（配列番号：９）と、鋳型として細胞クローンから単離したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ反応を準備した。プライマーＶ５は、ターゲティングベクターに存在するＶｈｐｒｏｍ断片の外側のゲノムＶ遺伝子プロモーター配列に結合し、リバースプライマーＶ６は、ＣＥＳプロモーター内側に結合し（それゆえ、ＣＥＳプロモーターをもつプラスミドでトランスフェクトした細胞の場合のみ用いられる）、プライマーＶ７はｈｏｂＦｃ遺伝子の内側に結合する。記載したプライマーの組合せを用いると、ＰＣＲ産物の存在は両方のプライマー結合配列がともに局在すること、すなわち相同組換えに完全に依存する。ＰＣＲアッセイの感度を増加するために、一回目のＰＣＲ産物を鋳型として、プライマーＶＨｐｒｏｍＦ（配列番号：１）とＶＨｐｒｏｍＲ（配列番号：２）を用いたネストＰＣＲ反応に用いた。最終的なネストＰＣＲ産物をＨｉｎｃＩＩとＤｒａＩの制限酵素消化にかけ、得られた配列が正しいことを確認した。これら全てのアッセイから、ＰＢＧ０３クローンＨ６（ｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ）、Ｄ４（ｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ）、Ｅ１１（ｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ）、Ｄ３（ｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ）およびＧ８（ｐＶＨＣμｈｏｂｆｃｂｌａｓ）には正しく標的配列が組み込まれていた。クローンＤ３（ｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ）をＰＢＧ０４とリネームし、ドイツ微生物・細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）に寄託した。

実施例４：標的細胞クローンを作製するための組換え
クローンｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｄ３（ＰＢＧ０４）を、第二の機能配列（ｆｒｔｗｔ、ＧＦＰ ＯＲＦおよびポリアデニル化シグナル、ＡＴＧとｆｒｔ５に続く最小プロモーター）を含有するベクター２、およびｆｌｐリコンビナーゼの機能発現ユニットを含有するプラスミドｐｆｌｐで、トランスフェクション試薬エフェクテン（ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）（キアゲン）を用いて、トランスフェクトした。ベクター２はＧＦＰ発現ユニットを動かすプロモーターを含まない。機能化細胞（ＰＢＧ０４）は、２００ μｇ／ｍｌからのジェネティシン選択に感受性である。ベクター２は、ジェネティシン耐性を賦与するネオマイシン耐性遺伝子がない。予想されるように、緑色蛍光はトランスフェクション後１−４日では検出できなかった。ジェネティシンを用いた選択の２週間後、ＧＦＰを強く発現する個々の安定クローンを検出できた。ＧＦＰの発現は、機能プロモーターに近接して組み込まれるかに依存する。ジェネティシン耐性は、ベクター２のＡＴＧに続くネオ耐性遺伝子の再構築に依存する。全ての場合において、ｆｒｔｗとｆｒｔ Ｆ５の間の配列を置き換え、機能的にＣＥＳプロモーターとＧＦＰをリンクするとともに、ＡＴＧ欠失ネオマイシン遺伝子をＡＴＧとリンクしたと結論する。

実施例５：レプチンＦｃのグリコシル化パターンの研究
ＰＢ６０４のレプチンＦｃをローラーボトル培養で産生し、アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過および膜濾過を含む一般的な工程で精製した。タンパク質をトリプシンで消化し、得られたペプチドをＰＮＧａｓｅ Ｆ消化により脱グリコシル化した。グリカンを２−アミノ−ベンズアミドで標識し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＡＰＳ−２カラムのＨＰＬＣで分離した（図１６）。さらに、表５に示した個々の画分の特徴を調べるために、脱シアル化した、標識試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＢＲＵＫＥＲ ＢＩＦＬＥＸ^ＴＭ）にかけた。

Ｆｃ上の単一のＮ−グリコシル化部位は、３７％がシアル化された複合オリゴ糖構造をもち、この値はヒト血液中の抗体のシアル化の平均に近似する。シアル酸をさらにシアリダーゼ処理、ＤＭＢ標識、およびＢｉｓｃｈｏｆｆ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ−ＯＤＳカラムによる分離により調べ、シアル酸リファレンスパネル（オックスフォード糖質科学（Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓ））と比較した。主として、Ｎ−アセチルノイラミン酸を見出した。２％だけが、マウスミエローマ細胞で支配的な型である、免疫原性であることが示された、Ｎ−グリコリルノイラミン酸であった（Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１７（１）：ｐ．５９−６２ （１９９５））。ヒト細胞では作られず、前から存在する抗体によりクリアランスが増加することが知られている、α１，３ Ｇａｌ構造はグリカンの１．３％にだけ見出された。上記の結果を表６に要約した。

実施例６：ＰＢＧ０４の軽鎖ラムダ座に対するターゲティングベクターの調製
再編成したラムダ鎖座の構造を既知のラムダ遺伝子のｃＤＮＡとヒトゲノム配列をアラインすることにより同定した。遺伝子は、可変遺伝子、すでに合体しているＪおよびＨセグメントからなる。Ｖ３−１９が可変遺伝子として同定された。

この方法は定常遺伝子座が１００％同一の遺伝子コピーを含むために、該遺伝子を同定するには不適当であった。ＰＣＲは、既知のリーダー配列と定常領域遺伝子間にある独特の介在配列のプライマーに基づく。プライマーＶ８１、Ｖ８３（それぞれ、配列番号：１３と１４）は、予想される制限パターンを示し、それゆえ、Ｈ−ＣＢ−Ｐ１の再編成されたラムダ遺伝子を構成する遺伝子（配列番号：２１）としてＪ２ｔｏＨ２を同定できる、正しいサイズのＰＣＲ産物をもたらした。この情報に基づき、再編成された座の配列を提示し、ターゲティングベクターを構築した。

可変遺伝子Ｖ３−１９のコーディング配列の５’上流に隣接する領域を、Ｐｒｏｖｅｓｔａｒｔポリメラーゼ（キアゲン）を用いて、プライマーＶ８９とＶ９４（それぞれ、配列番号：１５と１８）で作製した。４ｋｂ断片をｐＰＣＲ４ｂｌｕｎｔｔｏｐｏ（インビトロジェン）にクローニングした。３プライム隣接領域を２工程で増幅した：重複ＰＣＲ産物をプライマーＶ９０ Ｖ９１とＶ１１５ Ｖ１１６（それぞれ、配列番号：１６、１７、１９および２０）を用いて作製し、両断片に存在する一個所のＳｐｈＩ部位を介して並べた。隣接配列を単一ベクターＰＶＬＣＬにクローニングした（配列番号：２２）。

重鎖座の挿入とは独立に遺伝子の挿入を行うために、類似ではあるがヘテロ特異的なｆｒｔに基づく交換システムを設計した。５’３’の方向に、ヒトアルファ（１）アンチトリプシン遺伝子、ハイグロマイシン耐性マーカー、ｗｔ ｆｒｔ部位、およびＡＴＧ欠失ヒスチジノール耐性マーカーに続く、ｆｒｔ Ｆ３部位、ＣＭＶ ＥＦ１アルファ雑種プロモーターを含む。これらのエレメントをｐＶＬＣＬにクローニングし、ｐＶＬＣＬａａｔｈｙｇを作製した。

ｆｒｔ ｗｔとＦ５の部位は組換えを起こさないので、特異的な交換ベクターは重鎖座と軽鎖座を排他的に標的とすることができ、それぞれ、ネオマイシン耐性マーカーとヒスチジノール耐性マーカーに対するプロモーターと開始コドンを提供する。選択性を増加させるために、交換ベクターはｆｒｔ部位に対して異なるオープンリーディングフレームの開始コドンを含む。結果として、ベクターの誤ったｆｒｔ部位への取り込みは、それぞれの抗生物質への耐性を生じない。

ＰＶＬＣＬａａｔｈｙｇを電気穿孔法を用いて、ＰＢＧ−０４にトランスフェクトした。細胞をＴ７５フラスコに播き、２００ μｇ／ｍｌのハイグロマイシンで選択をした。３週間で得られたクローンを希釈クローニング法で単離し、相同交換で得られたクローンを、蛍光標識した抗ヒト ラムダ鎖抗体を用いて、免疫蛍光シグナルなしで同定した。得られた細胞クローンを、アルファ１アンチトリプシンの発現で解析した。これらのクローンは高レベルで発現される二つの独立のトランスジーンを共発現するのに適している。好ましくは、これらの遺伝子は抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子である。ｆｌｐリコンビナーゼを用いた単一の交換反応で、重鎖および軽鎖の遺伝子をそれぞれの場所に組み込むことができる。

概念の概観、遺伝子のｆｒｔ部位におけるＩｇＨ座への部位特異的挿入を含む高収量発現細胞系を作出するための多段階工程。 Ｈ−ＣＢ−Ｐ１のＩｇＨ座を図１ａおよび図１ｂの上側の図式で表す。ＩｇＨ座は可変遺伝子プロモーター、続いてタンパク質リーダー配列および、再編成され次にエンハンサーＥμ、ＭＡＲおよびＣμコーディング配列をもつ特異的Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子を含んでいる。相同組換えの標的配列を大理石模様で示す。ベクター１（ターゲティングベクター）の隣接配列因子「Ｖｈｐｒｏｍ」と「Ｃμ」、およびゲノムＤＮＡとの相同組換えを介して、隣接配列の間にある第一の機能化配列がゲノムＤＮＡに導入され、組換えＰＢＧ０３ゲノムが得られる。第一の機能化配列は、ｆｒｔ部位（ｆｒｔＦ５、ｆｒｔＦ３およびｆｒｔ ｗｔ）、人工強力プロモーターＣＥＳ（図１ａ）または追加プロモーターなし（図１ｂ）を第一の発現遺伝子（ｈｏｂＦｃ）の上流に含有する。加えて、ブラストサイジンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子、およびＡＴＧ欠損ネオマイシン遺伝子が第一の機能化配列の一部である。組換えゲノムは染色体ＤＮＡに組み込まれた第一の機能配列を有する。 ＦＬＰリコンビナーゼは、組換えＨ−ＣＢ−Ｐ１ゲノムのｆｒｔＦ５とｆｒｔＦ３部位、またはｆｒｔ ｗｔとｆｒｔＦ３部位、およびベクター２（真の目的の遺伝子が導入され、人工の、または内在性のＶＨプロモーターから発現される）との組換えを触媒する（それぞれ図１ａおよび図１ｂ）。ｆｒｔ ｗｔとｆｒｔＦ３との間にある第一の機能化配列の部分は、組換え後にＡＴＧ欠損ネオマイシン遺伝子と同一のオープンリーディングフレームを有するＡＴＧが続く弱いプロモーターに置き換えられる。得られたゲノムはｈｏｂＦｃ遺伝子およびブラストサイジンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子を消失し、代わりに目的の遺伝子（標的遺伝子）および機能ｎｅｏ遺伝子を有する。 ターゲティングベクターの内在カセット（ＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ）。 ＣＥＳプロモーター、ｈｏｂＦｃ融合遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子および開始コドン（ＡＴＧ）欠損ネオマイシン遺伝子を含む内在カセットの詳細な構造を示す。より詳細には、内在配列は改良ｆｒｔ部位（ｆｒｔＦ５）、続いて初期ＣＭＶプロモーター／エンハンサーエレメントおよび延長因子アルファ遺伝子の第一イントロンを含むハイブリッドプロモーター構造を含む。次の要素は、ｆｒｔ野生型部位、続いてｈｏｂＦｃ融合遺伝子（ｈｏｂＦｃ）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ＰＡ）である。ブラストサイジン耐性遺伝子の発現を制御する弱いＳＶ４０プロモーターが続く。最後の要素は、改良ｆｒｔ部位（ｆｒｔＦ３）およびそれに続くＡＴＧ欠損ｎｅｏ遺伝子である。改良ｆｒｔ部位Ｆ３およびＦ５は同一部位で組換えを起こすが、野生型ｆｒｔ部位およびＦ５またはＦ３それぞれでは組換えを生じない。ｆｒｔ Ｆ３部位はＡＴＧを欠く隣接するオープンリーディングフレームを形成するようにｎｅｏ遺伝子の上流に位置する。 隣接領域ＶｈｐｒｏｍとＣμを含む中間体ベクターｐＶＣμのクローニング法。 ２ ｋｂのＶＨプロモーター配列を、ＰＢＧ０３細胞のゲノムＤＮＡから、フォワードプライマーＶＨｐｒｏｍＦ（配列番号：１）とリバースプライマーＶＨｐｒｏｍＲ（配列番号：２）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物ＶＨｐｒｏｍをｐＣＲ ４ＢｌｕｎｔＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングし、得られたベクターをｐＶＨと命名した。７．４ ｋｂのＣμ領域をＨ−ＣＢ−Ｐ１のゲノムＤＮＡから、二つの重複断片、すなわちＣμＭｉｔｔｅＲとＣμＭｉｔｔｅＦとして増幅した。プライマーＣμｉｎｔＶ（配列番号：３）とＣμＭｉｔｔｅＲ（配列番号：５）から産物ＣμＭｉｔｔｅＲが生じ、プライマーＣμＭｉｔｔｅＦ（配列番号：６）とリバースプライマーＣμｉｎｔＲ（配列番号：４）から断片ＣμＭｉｔｔｅＦが生じる。両断片をｐＣＲ ４ＢｌｕｎｔＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングし、得られたベクターをｐＣμＭｉｔｔｅＲおよびｐＣμＭｉｔｔｅＦとした。両方のベクターを制限酵素ＳｐｅＩとＤｒａＩＩＩで開環し、ｐＣμＭｉｔｔｅＲのＳｐｅＩ−ＤｒａＩＩＩ断片を開環したｐＣμＭｉｔｔｅＦに連結することにより、完全長のＣμ配列を再構築した。得られたｐＣμは完全長のＣμ領域（Ｃμイントロン）を有する。ＶＨプロモーター配列およびＣμ配列を、ｐＶＨおよびｐＣμの両者を制限酵素ＳｐｅＩとＰｍｅＩで消化し、分離したＶｈｐｒｏｍのＰｍｅＩ−ＳｐｅＩ断片をホスファターゼ処理した開環ベクターｐＣμに挿入することにより、一つのベクターｐＶＨＣμに結合した。 ターゲティングベクターｐＣＥＳＨｈｏｂＦｃおよびｐＶＨＣμＨｈｏｂＦｃのクローニング法。 高活性プロモーターＣＥＳとｈｏｂＦｃ融合遺伝子を含むターゲティングベクターｐＶＨＣμＣＥＳＨｈｏｂＦｃを、ｐＣＥＳＨｈｏｂＦｃから単離した末端を埋めたＳｗａＩ−ＢｓｔＢＩ断片を、ＰｍｅＩで消化し、脱リン酸化したｐＶＨＣμベクターにライゲートすることにより作製した。ｈｏｂＦｃ融合遺伝子を有し、ＣＥＳプロモーターを持たないターゲティングベクターｐＶＨＣμＨｈｏｂＦｃを、ｐＣＥＳＨｈｏｂＦｃから単離した末端を埋めたＢｓｔ１１０７−ＢｓｔＢＩ断片を、ＰｍｅＩで消化し、脱リン酸化したｐＶＨＣμベクターにライゲートすることにより作製した。 ブラストサイジン耐性をもつターゲティングベクターｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓおよびｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓのクローニング法。 プラスミドｐｃＤＮＡＴＲＤをブラストサイジン遺伝子のドナーとして用いた。ハイグロマイシン遺伝子配列をベクターｐＣＥＳＨｈｏｂＦｃからＦＲＴ５およびネオマイシン配列とともに除去するために、ベクターをＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、脱リン酸化した。ブラストサイジン耐性遺伝子配列を含むｐＣＤＮＡＴＲＤのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を前に開環したｐＣＥＳＨｈｏｂＦｃベクターにライゲートし、得られたプラスミドをｐＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓｄｅｌｅｔｅｄと命名した。Ｆｒｔ Ｆ５配列とＡＴＧ欠失ネオマイシン配列をｐＣＥＳＨｈｏｂＦｃからＳａｌＩ−ＳａｌＩ断片として単離し、ｐＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓｄｅｌｅｔｅｄのＳａｌＩ部位に再挿入した。得られたプラスミドｐＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓをｐＶＨＣμＣＥＳＨｈｏｂＦｃと共にｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓを作製するために用いた。ｈｏｂＦｃ配列とブラストサイジン遺伝子を含有するＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片をｐＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓから単離し、ＢａｍＨＩとＳａｌＩを用いて開環したベクターｐＶＨＣμＣＥＳＨｈｏｂＦｃに挿入し、ｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓを得た。ベクターｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓを、ｈｏｂＦｃ遺伝子とブラストサイジン遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化したベクターｐＶＨＣμＨｈｏｂＦｃにライゲートすることにより作製した。 Ｈ−ＣＢ−Ｐ１クローンの免疫染色。 ｐＶＨＣμＣＥＳＨｈｏｂＦｃｂｌａｓをもつＨ−ＣＢ−Ｐ１細胞のトランスフェクションにより得られたＨ−ＣＢ−Ｐ１クローンを、テキサスレッド結合抗ヒトＩｇＧ、ヤギのＦ_γ断片特異的抗体またはＡＭＣＡ結合抗ヒトＩｇＭ、ヤギのＦｃ_５μ特異的抗体を用いて免疫染色した。左カラムはテキサスレッド結合抗体で染色し、ＵＶ ＷＧフィルターで可視化した二つのＨ−ＣＢ−Ｐ１クローンを示す。右カラムには、ＡＭＣＡ結合抗ＩｇＭ抗体で染色し、ＵＶフィルターＷＵにより可視化した後の同一クローンを示した。上部パネルのクローンではＩｇＧのみの染色が明らかであり、下部パネルのクローンでは両抗体による染色が観察される。最初のクローンは相同組換えから得られ、他のクローンは機能配列の非正統的挿入を含んでいる。 Ｈ−ＣＢ−Ｐ１クローンの直接免疫染色とクローンのさらなる拡張。 細胞の生存度を危険にさらすことなしにＨ−ＣＢ−Ｐ１クローンが免疫染色されること、および続いて、染色された細胞の拡張が可能であることが示されている。96ウェルプレートで10日間培養されたＨ−ＣＢ−Ｐ１クローンをテキサスレッド結合抗ＩｇＧ抗体で免疫染色した。通常の光学顕微鏡で可視化した免疫染色前のクローンの写真を最上部左パネルに示した。テキサスレッド結合抗ＩｇＧ抗体で免疫染色した同一クローンを最上部右パネルに示した。下部パネルはトリプシン処理後のウェルの写真である。下部左パネルに示したように、通常の光学顕微鏡下で写真を撮影すると、細胞は観察されない。右パネルはＵＶフィルターＷＵを通した同一ウェルを示している。細胞は完全にウェルからはがされ、蛍光抗体の沈殿がウェルに残り、細胞表面には接着していない。 個々のクローンの細胞培養上清の抗ＩｇＭドットブロット。 以下のクローン、１：ｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ−Ｄ６；２：ｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ−Ｇ８；３：ｐＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ−Ａ３；４：ｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ−Ｂ４；５：ｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ−Ｄ３；６：ｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ−Ｇ８、の上清をメンブラン上にスポットし、ＥＣＲ染色法を行った。最初の細胞集団は均一にＩｇＭを産生するので、ＩｇＭ発現を検出できないクローンは、ターゲティングベクターにより調節されるＩｇＭ Ｈ遺伝子の不活性化の結果である。相同隣接配列を欠くｐＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓのトランスフェクションにより生じたクローンＡ３はＩｇＭ座を標的とすることができず、ＩｇＭを発現する。 個々のクローンの細胞培養上清の抗ＩｇＧドットブロット。 以下のクローン、１：ｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｄ６；２：ｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｄ６（１：２希釈）；３：ｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ−Ｇ８；４：ｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｇ８（１：２希釈）；５：ｐＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ａ３；６：ｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｂ４；７：ｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｄ３；８：ｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｄ３（１：２希釈）；９：ｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｄ３（１：１０希釈）；１０：ｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｇ８；１１：ｈｏｂＦｃ標品 ５００ ｎｇ／ｍｌ；１２：ｈｏｂＦｃ標品 ５０ ｎｇ／ｍｌ ＩｇＧ、の上清をメンブラン上にスポットし、抗ＩｇＧ抗体を用いてＥＣＲ染色法を行った。 ＰＣＲによる相同組換えの検出。 相同組換え事象が（ターゲティング）ベクターとＨ−ＣＢ−Ｐ１細胞のＩｇ座の間で起きているかを試験するために、ＰＣＲ法を適用した。組換えにより、ＡＴＧ欠損ネオマイシン遺伝子に続く、ｈｏｂＦｃ遺伝子および耐性遺伝子（ハイグロマイシンまたはブラストサイジン）がゲノムＶ遺伝子プロモーター配列とエンハンサーＥμの間に組み込まれる。Ｖｈｐｒｏｍ断片の外側のゲノムＶ遺伝子プロモーター配列に結合するフォワードプライマーＶ５（配列番号：７）を、最初の機能配列内に特異的に結合するプライマーＶ６またはＶ７（それぞれ配列番号：８と９）と組み合わせた。ＰＣＲ産物の存在は両方のプライマーが結合する配列の共存、すなわち相同組換えに強く依存する。陽性であることを確認するために、陽性と推定されるＰＣＲ産物を、プライマーＶｈｐｒｏｍＦとＶｈｐｒｏｍＲ（それぞれ配列番号：１と２）を用いたネストＰＣＲ反応に用いた。ａ：プライマーの位置、ｂ：ＰＣＲ産物の電気泳動分析左：第一のＰＣＲ Ｖ５、Ｖ７レーン１：１ｋｂラダー（インビトロジェン）；レーン２：クローンｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｈ６；レーン３：クローンｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｂ１０；レーン４：クローンｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｄ４；レーン５：クローンｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｄ８；レーン７：陰性コントロール Ｈ−ＣＢ−Ｐ１右：ネストＰＣＲレーン１：１ｋｂラダー（インビトロジェン）；レーン２：陰性コントロール Ｈ−ＣＢ−Ｐ１；レーン３：クローンｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｈ６；レーン４：クローンｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｄ４；レーン５：クローンｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｅ１１ 選択圧なしでのｈｏｂＦｃの発現。 細胞を３ヶ月間選択圧なしで培養した。発現を調べるために、細胞を１０^５細胞／ｍｌの密度で播種した。２４時間後、細胞培養上清を集め、抗ヒトＦｃ抗体を用いたウェスタンブロット（ドットブロット）にかけた。上清を左から右へ、無希釈、１：２希釈および１：１０希釈の順にフィルターにのせた。左：クローンｐＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ａ３（ランダム挿入）、中央上 ｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｇ８；中央下 ｐＶＨＣμｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｇ８；右 ｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｄ３発現はｈｏｂＦｃ遺伝子を含む機能化配列の相同的挿入の結果得られるクローンにおいて安定である。 モデル標的遺伝子としてＧＦＰを用いた標的細胞クローンの生成。 クローンｐＶＨＣμＣＥＳｈｏｂＦｃｂｌａｓ Ｄ３（ＰＢＧ０４と改名）を第二の機能配列（ｆｒｔｗｔ、ＧＦＰオープンリーディングフレームおよびポリアデニル化シグナル、ＡＴＧおよびｆｒｔＦ５に続く最小プロモーター）を含有するベクター２、およびｆｌｐリコンビナーゼの機能発現ユニットを含有するプラスミドｐｆｌｐでトランスフェクトした（注：ベクターは、発現させるための機能プロモーターが欠失しているので、元の細胞ではＧＦＰを発現できない）。Ｇ４１８を用いた選択の２週間後、ＧＦＰを高発現する個々の安定クローンを検出できる。Ｇ４１８耐性同様、ＧＦＰ発現は相同組換え事象に依存する。 ヘテロハイブリドーマＨ−ＣＢ−Ｐ１における再編成の同定。 Ｈ−ＣＢ−Ｐ１由来の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子のｃＤＮＡの配列を決定し、データベースの配列と比較した。重鎖遺伝子を構成するゲノム遺伝子は、相同性から、再編成されていないゲノム配列と同一であった。Ｖ１−２、Ｄ１、Ｊ６およびμの同定を基に、再編成された座のゲノムマップを構築した。この情報を用いてＰＣＲプライマーを設計し、５’から可変遺伝子Ｖ１−２プロモーターを伸長し、Ｄ、Ｊおよびμイントロン配列を含むが、可変遺伝子のＡＴＧは含まれないそれぞれの断片を増幅し、ターゲティングベクターを構築するために用いた。 ラムダ軽鎖可変遺伝子Ｖ３−１９を同様に相同性検索により同定した。座が１００％同一の遺伝子コピーを含んでいるので、このアプローチは定常遺伝子を同定するには不適であった。定常領域遺伝子間の介在配列のプライマーに基づくＰＣＲから、Ｈ−ＣＢ−Ｐ１の再編成されたラムダ遺伝子を構成する遺伝子として、Ｊ２およびＨ２が同定された。 Ｈ−ＣＢ−Ｐ１の染色体分析。 ＧＴＧバンディング、左パネル６８−９４染色体、が見出された。大部分はスペクトル核型分析でマウスの染色体として同定された（中央および右パネル）。Ｈ−ＣＢ−Ｐ１内のヒト染色体を、特異的に標識したヒト染色体ライブラリーを用いたハイブリダイゼーションにより同定した。８本の完全なヒト染色体、すなわち４、５、７、１０、１４、１７、１８、２２番染色体、さらに、４、８、９、１０、１１、１４、１６番染色体の断片を同定した。ヒトＩｇＨ座特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションの結果、完全な１４番染色体上に単一のＩｇＨ座があることが明らかとなった。 哺乳類糖タンパク質のＮ結合オリゴ糖構造の概略図。 レプチン−Ｆｃ分子は二つのＮ結合オリゴ糖、Ｆｃドメインのそれぞれの鎖に一つを含む。 レプチンＦｃのアミノ相−ＨＰＬＣ。 ＰＢＧ−０４のレプチンＦｃをローラーボトル培養で産生し、アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過および膜濾過を含む一般的な方法により精製した。タンパク質をトリプシンで消化し、得られたペプチドをＰＮＧａｓｅ Ｆ消化により脱グリコシル化した。グリカンを２−アミノ−ベンズアミドで標識し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＡＰＳ−２−カラムのＨＰＬＣにより単離した。ピーク番号は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析で用いた画分を表す。

【配列表】

Claims (17)

1. ヒトの糖鎖付加パターンを本質的に有する標的遺伝子産物を安定的に高収量で発現できる細胞を調製する方法で、その方法が
   （ａ）ヒト細胞またはヒトの雑種細胞（元の細胞）には必須ではない、元の遺伝子産物を安定的に高収量で発現できる元の細胞を選択すること；
   （ｂ）元の細胞ゲノム内の元の遺伝子産物の座をスクリーニングすること；
   （ｃ１）元の遺伝子産物をコードする遺伝子を、機能化前駆細胞を得るために、一つ以上のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）を含む第一の機能ＤＮＡ配列に置き換えること；および
   （ｄ）標的遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を含む第二の機能ＤＮＡ配列を、ステップ（ｃ１）で得られた機能化前駆細胞に、第一の機能配列で取り込まれたＲＲＳを認識するリコンビナーゼを用いて挿入すること、または
   （ｃ２）元の遺伝子産物をコードする遺伝子を、標的遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を含む機能ＤＮＡ配列に直接置き換えること、
   を含む方法。
2. 請求項１記載の方法であって、
   （ｉ）元の細胞が元の遺伝子産物を、好ましくは少なくとも0.3 fmol/細胞/日のポリペプチド量、および、より好ましくは1 fmol/細胞/日以上の量分泌し；および／または
   （ｉｉ）元の細胞が初代不死化または融合細胞、またはその遺伝的改変細胞であり；および／または
   （ｉｉｉ）元の細胞がヒトの雑種細胞であるならば、元の遺伝子産物はヒト遺伝子であり；および／または
   （ｉｖ）元の遺伝子産物が分泌タンパク質、例えば抗体、サイトカイン、ホルモン、酵素、移送タンパク質等から選択される、
   方法。
3. 請求項２記載の方法であって、元の細胞がＢリンパ球、好ましくはヒトミエローマまたはハイブリドーマ、またはヒトのヘテロハイブリドーマ、および、より好ましくはヒト−マウスのヘテロハイブリドーマＨ−ＣＢ−Ｐ１（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１０４）である方法。
4. 請求項３記載の方法であって、機能ＤＮＡ配列の挿入が前記元の細胞の再編成Ｉｇ座で、好ましくは再編成免疫グロブリンＨ座またはλ座で行われる方法。
5. 請求項１から４のいずれか一つに記載の方法であって、元の遺伝子産物の座が
   （ｉ）既知である、またはマイクロアレイ発現解析、２Ｄタンパク質ゲル電気泳動、定量的ＰＣＲ、ＲＮＡｓｅ保護、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびそれらの組み合わせを含むスクリーニング手順により決定される；および／または
   （ｉｉ）本質的にヒトの糖鎖付加パターンを与えるように選択される、
   方法。
6. 請求項１から５のいずれか一つに記載の方法であって、元の遺伝子の置換が
   （ｉ）ワンステップ置換法により行われる、ここで元の細胞は第一の機能配列を含むベクター構築物に接触し、前記第一の機能配列が元の遺伝子産物をコードする遺伝子を置換する；または
   （ｉｉ）２または複数ステップ法により行われる、ここで第一の遺伝子産物をコードする遺伝子が削除または不活化され、および続いて第一の機能配列を含むベクター構築物に接触し、前記第一の機能配列が削除または不活化された元の遺伝子産物の部位で取り込まれる、
   方法。
7. 請求項１から６のいずれか一つに記載の方法であって、第一の機能配列が
   （ｉ）ｌｏｘＰ、ｆｒｔ、ラムダ様ファージのａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位、およびレソルバーゼまたはファージＣ３１インテグラーゼの認識部位から選択される一つ以上のＲＲＳ、好ましくは一方向の挿入ができるＲＲＳ、例えば改良ｌｏｘＰ部位、ｆｒｔ部位等を含み；および／または
   （ｉｉ）さらに、マーカー配列、分泌タンパク質、プロモーター、エンハンサー、スプライスシグナル、ポリアデニル化シグナルおよびＩＲＥＳ因子から選択される機能配列を含み；および／または
   （ｉｉｉ）標的遺伝子または隣接する配列に相同な配列でベクターにつながっている、
   方法。
8. 請求項１から７のいずれか一つに記載の方法であって、
   （ｉ）第二の機能ＤＮＡ配列の挿入が、第二の機能配列の送達とともに、その直前、もしくはその直後に、第一の機能配列中に存在するＲＲＳを認識するリコンビナーゼを送達することにより行われ；
   （ｉｉ）インテグラーゼがＣｒｅ、Ｆｌｐ、ΦＣ３１インテグラーゼ、レソルバーぜ等から選択され；
   （ｉｉｉ）標的遺伝子産物が酵素、ホルモン、サイトカイン、受容体、抗体、抗体ドメイン、前記遺伝子産物を含む融合タンパク質等から選択され；
   （ｉｖ）第二の機能ＤＮＡ配列がさらに、プロモーター配列、マーカー配列、スプライスドナーおよびアクセプター配列、第一の機能配列のＲＲＳとは異なるリコンビナーゼ認識配列等から選択される機能配列を含む、
   方法。
9. 請求項１から６のいずれか一つに記載の方法であって、元の遺伝子産物をコードする遺伝子が直接、標的遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を含む機能ＤＮＡ配列と置き換えられる、方法。
10. 請求項１から６記載のステップ（ａ）から（ｃ１）を含む機能化細胞の調製方法。
11. 請求項１０記載の機能化細胞。
12. 請求項１から９記載の方法により得られうる標的遺伝子産物を高収量発現できる細胞。
13. 標的遺伝子産物が抗体、好ましくは細胞がＰＢＧ０４（ＤＭＳ ＡＣＣ２５７７）である、請求項１２記載の細胞。
14. Ｈ−ＣＢ−Ｐ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２１０４）に由来する、請求項１１、１２もしくは１３記載の細胞。
15. さらに不活化された、または同一標的遺伝子産物または異種標的遺伝子産物をコードする遺伝子で置換されたその軽鎖を有する、請求項１３または１４記載の細胞。
16. 請求項１２から１５のいずれか一つに記載の細胞を培養することを特徴とする標的遺伝子産物の高収量発現方法。
17. 請求項１４または１５記載の細胞を培養することにより得られうる標的遺伝子産物。