CN102782130A - 马克斯克鲁维酵母来源的高表达启动子 - Google Patents

马克斯克鲁维酵母来源的高表达启动子 Download PDF

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Abstract

本发明提供作为马克斯克鲁维酵母来源的新型高表达启动子的GAL1启动子、包含该高表达启动子的重组多核苷酸、包含该重组多核苷酸的载体、通过将该重组多核苷酸或该载体导入酵母中而得到的转化体、使用该转化体的目的基因的高表达方法、使用该转化体的目的基因产物的制造方法。特征在于利用本发明的高表达启动子。

Description

马克斯克鲁维酵母来源的高表达启动子
技术领域
本发明涉及马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)来源的新型高表达启动子、包含该启动子的重组多核苷酸、包含该重组多核苷酸的载体、通过将该重组多核苷酸或该载体导入酵母中而得到的转化体、使用该转化体的目的基因的高表达方法、使用该转化体的目的基因产物的制造方法。
背景技术
随着近年来基因重组技术的进展，能够使用大肠杆菌等微生物进行各种有用蛋白质的生产。但是，已知使真核生物来源的异种蛋白质基因以大肠杆菌作为宿主进行表达时，存在无法进行正常的加工或糖链的添加等翻译后的正常修饰的问题。因此，作为真核生物的酵母较多用作宿主。作为宿主酵母，已知有例如：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)等(例如参考专利文献1)。但是，异种蛋白质在作为宿主的酵母中的表达量仍有改善的余地。
使异种蛋白质基因在宿主中进行表达时，将以能够使该异种蛋白质基因在可在宿主内发挥作用的启动子的调控下工作的方式配置的重组多核苷酸导入宿主内，使该异种蛋白质在该转化体内表达。启动子的转录活性很大程度上决定异种蛋白质的表达效率，因此，通常使用转录活性高的启动子。另外，优选在所期望的时机诱导异种蛋白质基因的表达。这是因为，在利用转化体进行的发酵生产中，如果首先使转化体尽可能多地增殖、然后使其表达该异种蛋白质，则该异种蛋白质的生成效率提高。作为转录活性高且能够进行诱导的启动子，公知有半乳糖诱导型启动子。半乳糖诱导型启动子是在缺乏葡萄糖时受半乳糖诱导的启动子，在酿酒酵母等中，经常使用GAL1启动子、GAL2启动子、GAL3启动子、GAL5启动子、GAL7启动子、GAL10启动子等半乳糖代谢基因(GAL基因)的启动子(GAL启动子)(例如参考专利文献2)。
另外，马克斯克鲁维酵母为耐热性酵母(例如非专利文献1和2)。利用普通的酵母进行乙醇发酵时，发酵液的温度因发酵热而上升，因此，为了持续进行乙醇发酵，必须对发酵液进行冷却。因此，在工业上进行乙醇发酵时，大规模的冷却设备和该冷却所需要的巨大的能量成本是必不可缺的。但是，马克斯克鲁维酵母即使在48℃的高温下也能够进行增殖(非专利文献3和4)，因此，能够高效地进行乙醇发酵而不需要上述冷却设备和能量成本。目前尚未获知该马克斯克鲁维酵母的GAL启动子的序列。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2008-29239号公报
专利文献2：日本特开2007-89512号公报
非专利文献
非专利文献1：Bioresource Technology(2007)98,3367-3374
非专利文献2：Appl.Microbiol.Biotechnol.(2008)79,339-354
非专利文献3：Applied and Environmental Microbiology(2008)74,7514-7521
非专利文献4：Appl.Microbiol.Biotechnol.(2010)85,861-867
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供作为马克斯克鲁维酵母来源的新型高表达启动子的GAL1启动子、包含该高表达启动子的重组多核苷酸、包含该重组多核苷酸的载体、通过将该重组多核苷酸或该载体导入酵母中而得到的转化体、使用该转化体的目的基因的高表达方法、使用该转化体的目的基因产物的制造方法。
用于解决问题的方法
本发明人进行了深入研究，结果成功地从马克斯克鲁维酵母中分离出GAL1启动子，并且发现，该启动子能够使目的基因在马克斯克鲁维酵母中显著地进行高表达，而且还能够使目的基因在酿酒酵母中进行高表达，从而完成了本发明。
即，本发明涉及(1)一种高表达启动子，其包含下述中的任意一种多核苷酸：(a)序列号1表示的多核苷酸；(b)与上述(a)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸；(c)序列号2表示的多核苷酸；(d)与上述(c)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸；(e)序列号3表示的多核苷酸；以及(f)与上述(e)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸。
另外，本发明涉及(2)一种重组多核苷酸，其包含上述(1)所述的高表达启动子和以能够在该启动子的调控下工作的方式配置的目的基因。
此外，本发明涉及(3)一种载体，其包含上述(2)所述的重组多核苷酸。
另外，本发明涉及(4)一种转化体，其特征在于，通过将上述(2)所述的重组多核苷酸或上述(3)所述的载体导入酵母中而得到；(5)如上述(4)所述的转化体，其特征在于，酵母为选自由酵母属(Saccharomyces)酵母和克鲁维酵母属(Kluveromyces)酵母组成的组中的任意一种酵母；(6)如上述(4)所述的转化体，其特征在于，酵母为选自酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母中的任意一种酵母。
此外，本发明涉及(7)一种目的基因的高表达方法，其特征在于，包括对上述(4)~(6)中任一项所述的转化体进行培养的步骤。
另外，本发明涉及(8)一种目的基因产物的制造方法，其特征在于，包括：对上述(4)~(6)中任一项所述的转化体进行培养的步骤和从培养得到的转化体中回收目的基因产物的步骤。
发明效果
本发明的高表达启动子不仅能够使目的基因在马克斯克鲁维酵母中进行高表达，而且还能够使目的基因在其他酵母中进行高表达。例如，在酿酒酵母中使用本发明的高表达启动子时，与酿酒酵母的GAL10启动子相比，更能够使目的基因进行高表达。因此，使用本发明的高表达启动子时，还能够高效地制造目的基因产物。
附图说明
图1是表示马克斯克鲁维酵母的GAL1启动子、GAL10启动子、GAL7启动子的启动子结构的图。
图2是表示马克斯克鲁维酵母的GAL1启动子(KmGAL1启动子)的启动子结构的图。
图3是表示用于确定KmGAL1启动子的位置的表达分析试验的结果的图。
图4是表示马克斯克鲁维酵母或酿酒酵母的KmGAL1启动子的表达分析试验的结果的图。
具体实施方式
1.本发明的启动子
本发明的高表达启动子的特征在于，(A)包含序列号1、2或3表示的多核苷酸，或者，(B)包含作为上述多核苷酸的突变体并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸。序列号1表示的多核苷酸为马克斯克鲁维酵母来源的GAL1启动子，序列号2表示的多核苷酸为马克斯克鲁维酵母来源的GAL7启动子，序列号3表示的多核苷酸为马克斯克鲁维酵母来源的GAL10启动子。该本发明的高表达启动子不仅能够使目的基因在马克斯克鲁维酵母中进行高表达，而且还能够使目的基因在其他酵母中进行高表达。
作为上述(B)的、包含作为序列号1、2或3表示的多核苷酸的突变体并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸的启动子(以下，也特别表示为“本发明的突变体启动子”)，有：
(a)与序列号1、2或3表示的多核苷酸具有80%以上、优选85%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最优选98%以上的同一性并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸；
(b)包含在序列号1、2或3表示的多核苷酸中缺失、取代或添加1个或2个以上的核苷酸而得到的多核苷酸并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸；
(c)在严格的条件下与序列号1、2或3表示的多核苷酸的互补多核苷酸杂交并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸。
上述(b)中的“缺失、取代或添加1个或2个以上的核苷酸而得到的多核苷酸”是指缺失、取代或添加例如1~20个、优选1~15个、更优选1~10个、进一步优选1~5个中的任意数量的核苷酸而得到的多核苷酸。
上述(c)中的“在严格的条件下”是指形成所谓的特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件，具体而言，可以列举：具有80%以上、优选85%以上的同一性的DNA之间进行杂交而同一性低于上述水平的DNA之间不进行杂交的条件；或者，通常的Southern杂交的洗涤条件即65℃、1×SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成为150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)、0.1%SDS，或在与0.1×SSC、0.1%SDS相当的盐浓度下进行杂交的条件。杂交可以依据分子克隆第二版等中记载的方法来进行。作为上述(c)中的“在严格的条件下进行杂交的多核苷酸”，可以列举与作为探针使用的多核苷酸的互补多核苷酸具有一定水平以上的同一性的多核苷酸，可以优选例示例如具有80%以上、优选85%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最优选98%以上的同一性的多核苷酸。
需要说明的是，序列号1表示的多核苷酸的758位~774位、779位~795位、804位~820位、825位~841位、860位~876位，序列号2表示的多核苷酸的718位~734位、753位~769位、774位~790位、799位~815位、820位~836位，序列号3表示的多核苷酸的939位~955位、954位~970位、988位~1004位分别为转录因子GAL4的结合部位。
由于上述(A)的序列号1、2或3表示的多核苷酸的核苷酸序列是明确的，因此，例如可以使用马克斯克鲁维酵母的基因组DNA作为模板，通过使用基于该核苷酸序列而合成的寡核苷酸作为引物的PCR反应而得到；或者也可以使用马克斯克鲁维酵母的基因组DNA作为模板，通过使用基于该核苷酸序列而合成的寡核苷酸作为探针的杂交而得到。需要说明的是，染色体DNA可以通过常规方法(例如，日本特开2008-237024号公报中公开的方法)而获得。
寡核苷酸的合成可以使用例如市售的各种DNA合成仪，根据常规方法来合成。另外，PCR反应可以使用应用生物系统公司(AppliedBiosystems)制造的热循环Gene Amp PCR系统2400，并使用TaqDNA聚合酶(宝生物公司制造)、KOD-Plus-(东洋纺织公司制造)等，根据常规方法来进行。
另外，上述的本发明的突变体启动子的多核苷酸的突变体也可以通过化学合成、基因工程方法、诱导突变等本领域技术人员已知的任意方法来制作。具体而言，可以通过使用使序列号1、2或3表示的多核苷酸与作为突变原的试剂接触而发生作用的方法、对序列号1、2或3表示的多核苷酸照射紫外线的方法、基因工程的方法等向上述多核苷酸中导入突变来获得多核苷酸的突变体。作为基因工程方法之一的定点诱变法是能够在特定的位置导入特定的突变的方法，因此有用，可以根据分子克隆第二版、Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法),附录1~38,约翰威立父子出版公司(1987-1997)等中记载的方法来进行。
本发明的高表达启动子在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性。某种多核苷酸在某种酵母中是否具有启动子活性可以通过公知的报告基因分析等容易地确认，所述报告基因分析包括例如下述步骤：制作将报告基因以能够工作的方式连接到该多核苷酸的下游而得到的重组多核苷酸的步骤，通过将该重组多核苷酸转化到该酵母中而得到转化酵母的步骤，测定该报告基因在该转化酵母中的表达程度的步骤。
作为上述的“在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母”中的“除马克斯克鲁维酵母以外的酵母”，只要是除马克斯克鲁维酵母以外的种类的酵母则没有特别限制，可以优选例示：乳酸克鲁维酵母等除马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母；酿酒酵母等酵母属酵母；白假丝酵母(Candida albicans)等假丝酵母属酵母；鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)等接合酵母属酵母；粟酒裂殖酵母等裂殖酵母属酵母；巴斯德毕赤酵母等毕赤酵母属酵母；等，其中，可以更优选例示：乳酸克鲁维酵母等除马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维属酵母；酿酒酵母等酵母属酵母，其中，可以进一步优选例示酿酒酵母等酵母属酵母，可以特别优选例示酿酒酵母。
本发明的高表达启动子、后述的本发明的目的基因的高表达方法中的“高表达”、后述的本发明的目的基因产物的制造方法中的“高效率”，优选包括下述情况：(X)在宿主为马克斯克鲁维酵母的情况下，将分泌型荧光素酶CLuc基因以能够工作的方式连接到该启动子的下游而得到重组多核苷酸，将所得的重组多核苷酸导入马克斯克鲁维酵母中而得到转化体，将所得的转化体在YPGal液体培养基(1质量%的酵母提取物、2质量%的多聚蛋白胨、2质量%的半乳糖)中在28℃下振荡培养48小时，此时培养液中的分泌型荧光素酶CLuc的相对表达量(RLU/OD·μl)为25000以上，优选为28000以上，更优选为32000以上，进一步优选为34000以上；(Y)在宿主为除马克斯克鲁维酵母以外的酵母(优选为酿酒酵母)的情况下，将分泌型荧光素酶CLuc基因以能够工作的方式连接到该启动子的下游而得到重组多核苷酸，将所得的重组多核苷酸导入该酵母中而得到转化体，将所得的转化体在YPGal液体培养基(1质量%的酵母提取物、2质量%的多聚蛋白胨、2质量%的半乳糖)中在28℃下振荡培养48小时，此时培养液中的分泌型荧光素酶CLuc的相对表达量(RLU/OD·μl)为1500以上，优选为2000以上，更优选为2500以上，进一步优选为3000以上，进而，更优选包括上述(X)并且包括上述(Y)。
作为本发明的高表达启动子、后述的本发明的目的基因的高表达方法中的“高表达”、后述的本发明的目的基因产物的制造方法中的“高效率”的另一示例，优选包括下述情况：将在该启动子的下游以能够工作的方式连接有分泌型荧光素酶CLuc基因的重组多核苷酸导入马克斯克鲁维酵母中而得到的转化体在YPGal液体培养基(1质量%的酵母提取物、2质量%的多聚蛋白胨、2质量%的半乳糖)中在28℃下振荡培养48小时时培养液中的分泌型荧光素酶CLuc的相对表达量(RLU/OD·μl)相对于将在酿酒酵母的GAL10启动子的下游以能够工作的方式连接有分泌型荧光素酶CLuc基因的重组多核苷酸导入酿酒酵母中而得到的转化体在YPGal液体培养基(1质量%的酵母提取物、2质量%的多聚蛋白胨、2质量%的半乳糖)中在28℃下振荡培养48小时时培养液中的分泌型荧光素酶CLuc的相对表达量(RLU/OD·μl)以比例计为10倍以上，优选为20倍以上，更优选为30倍以上，进一步优选为40倍以上，最优选为50倍以上。
作为本发明的高表达启动子、后述的本发明的目的基因的高表达方法中的“高表达”、后述的本发明的目的基因产物的制造方法中的“高效率”的又一示例，优选包括下述情况：将在该启动子的下游以能够工作的方式连接有分泌型荧光素酶CLuc基因的重组多核苷酸导入马克斯克鲁维酵母中而得到的转化体在YPGal液体培养基(1质量%的酵母提取物、2质量%的多聚蛋白胨、2质量%的半乳糖)中在28℃下振荡培养48小时时培养液中的分泌型荧光素酶CLuc的相对表达量(RLU/OD·μl)相对于将该重组多核苷酸导入酿酒酵母中而得到的转化体在YPGal液体培养基(1质量%的酵母提取物、2质量%的多聚蛋白胨、2质量%的半乳糖)中在28℃下振荡培养48小时时培养液中的分泌型荧光素酶CLuc的相对表达量(RLU/OD·μl)以比例计为2倍以上，优选为3倍以上，进一步优选为4倍以上，最优选为5倍以上。
作为本发明中的多核苷酸，可以优选例示互补的双链多核苷酸，其中，可以特别优选例示互补的双链DNA。
2.本发明的重组多核苷酸
本发明的重组多核苷酸的特征在于，包含本发明的高表达启动子和以能够在该启动子的调控下工作的方式配置的目的基因。本发明的重组多核苷酸能够通过本发明的高表达启动子的活化使该目的基因所编码的目的基因产物(蛋白质或肽)在半乳糖诱导下进行高表达。
本发明中，“以能够在本发明的高表达启动子的调控下工作的方式配置的目的基因”是指，将本发明的高表达启动子与该目的基因以通过使转录因子与本发明的高表达启动子结合而诱导该目的基因的表达的方式进行连接。作为上述“目的基因”，可以是任意的基因，可以优选例示编码某些有用蛋白质的有用蛋白质基因。作为有用蛋白质基因，可以优选例示：纤维素酶基因、淀粉酶基因等糖基化酶基因或病毒疫苗蛋白质的基因。
3.包含本发明的重组多核苷酸的载体
包含本发明的重组多核苷酸的载体的特征在于，包含上述本发明的重组多核苷酸。本发明的载体可以将本发明的重组多核苷酸保持在宿主酵母中，或者可以为了表达目的基因而对酵母进行转化。本发明中的载体可以为线性，也可以为环形。在宿主酵母为马克斯克鲁维酵母的情况下，即使是线性载体也能够在染色体上以高频率发生重组，结果，能够进行转化。另外，在环形载体的情况下，如果进一步包含自我复制序列，则该载体能够在酵母细胞内中进行自主复制而保持在酵母细胞内，结果，能够进行转化。
上述载体只要能够使目的基因在酵母细胞内进行表达则没有特别限制，作为环形的质粒载体，可以优选例示例如pKD1等。
4.本发明的转化体
本发明的转化体的特征在于，通过将本发明的重组多核苷酸或本发明的载体导入酵母中而得到。本发明的转化体能够使目的基因在该细胞内在半乳糖诱导下进行高表达，通过对本发明的转化体进行培养，能够高效地生成目的基因产物。
作为制作本发明的转化体时使用的酵母的种类，没有特别限制，可以优选例示：马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母等克鲁维酵母属酵母；酿酒酵母等酵母属酵母；白假丝酵母等假丝酵母属酵母；鲁氏接合酵母等接合酵母属酵母；粟酒裂殖酵母等裂殖酵母属酵母；巴斯德毕赤酵母等毕赤酵母属酵母；等，其中，可以更优选例示：马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母等克鲁维酵母属酵母；酿酒酵母等酵母属酵母，其中，从目的基因的表达量特别高、目的基因产物的生成效率特别高的观点出发，可以特别优选例示马克斯克鲁维酵母。另外，由于马克斯克鲁维酵母具有耐热性，因此，从能够进行高效的乙醇发酵而不需要对发酵热进行冷却的设备和能量成本的观点出发优选。
作为将本发明的重组多核苷酸或本发明的载体导入酵母中的方法，没有特别限制，可以例示下述公知的方法：利用病毒载体的方法、利用特异性受体的方法、细胞融合法等生物学方法；电穿孔法、显微注射法、基因枪法、超声波基因导入法等物理方法；脂质体转染法、磷酸钙共沉淀法、脂质体法、DEAE葡聚糖法等化学方法；等，其中，从简单且通用性高的观点出发，可以优选例示脂质体转染法。另外，本发明的重组多核苷酸或本发明的载体是否已被导入该酵母中可以通过目的基因容易地确认，或者可以通过将目的基因以及标记基因预先插入到本发明的重组多核苷酸或本发明的载体中并确认该标记基因在转化体中的表达等方法来容易地确认。
5.本发明的目的基因的高表达方法
本发明的目的基因的高表达方法的特征在于，包括对本发明的转化体进行培养的步骤。作为“对本发明的转化体进行培养的方法”，只要能够使该转化体增殖则没有特别限制，可以优选例示例如下述方法：在该转化体能够进行增殖的温度条件下(例如25~33℃，优选为28~30℃)，在YPD培养基(1质量%的酵母提取物、2质量%的多聚蛋白胨、2质量%的葡萄糖)中，振荡培养适当的时间(例如1~10天，优选为1~5天，更优选为1~3天)。
6.本发明的目的基因产物的制造方法
本发明的目的基因产物的制造方法的特征在于，包括：对本发明的转化体进行培养的步骤和从培养得到的转化体中回收目的基因产物的步骤。根据该制造方法，能够以高效率制造目的基因产物。作为“从培养得到的转化体中回收目的基因产物”的方法，只要能够回收目的基因产物则没有特别限制，可以例示：利用层析的方法、利用标签的方法等公知的方法。
实施例1
[从马克斯克鲁维酵母中分离KmGAL1启动子]
本发明人使用Genome Sequencer FLX系统(罗氏诊断公司)对马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的基因组序列获得了基因组序列草图。但是，在第一次测序中，只获得了GAL的部分序列。于是，使用更高性能的Genome Sequencer FLX Titanium(罗氏诊断公司)，由此，终于能够获得基因组序列草图。为了从马克斯克鲁维酵母中获得半乳糖诱导型启动子，本发明人基于酿酒酵母来源的公知的GAL1、GAL10、GAL7等的序列信息，对马克斯克鲁维酵母的基因组序列草图进行了检索。结果，在马克斯克鲁维酵母的基因组序列草图中发现了与酿酒酵母来源的GAL启动子具有较高同一性的序列，并分离出该序列。分离出的该序列的启动子结构示于图1中。如图1所示，与GAL1启动子反向地配置有GAL10启动子、GAL7启动子，并且在GAL1启动子与GAL10启动子之间发现了GAL4结合部位。需要说明的是，马克斯克鲁维酵母中的上述GAL1启动子(KmGAL1启动子)、GAL10启动子(KmGAL10启动子)、GAL7启动子(KmGAL1启动子)的配置与酿酒酵母的上述启动子的已知配置相同。另外，通过使用此次分离出的序列中的GAL1样启动子的后述实施例2或实施例3的实验表明，此次分离出的马克斯克鲁维酵母来源的GAL启动子组为GAL启动子。
实施例2
[KmGAL1启动子的位置的确定]
为了确定KmGAL1启动子的位置，进行了如下的表达分析试验。
首先，准备认为包含KmGAL1启动子的1.4kb的DNA序列(与图2的KmGAL1启动子结构的-1400~0相当的序列)，将其命名为KmGAL1-1400。接着，准备使KmGAL1-1400的5’末端缺失200个碱基而得到的DNA序列(与图2的KmGAL1启动子结构的-1200~0相当的序列)，将其命名为KmGAL1-1200。同样地，准备使KmGAL1-1400的5’末端缺失400个碱基而得到的DNA序列(与图2的KmGAL1启动子结构的-1000~0相当的序列)，将其命名为KmGAL1-1000。同样地，准备使KmGAL1-1400的5’末端缺失580个碱基而得到的DNA序列(与图2的KmGAL1启动子结构的-820~0相当的序列)，将其命名为KmGAL1-820。同样地，准备使KmGAL1-1400的5’末端缺失625个碱基而得到的DNA序列(与图2的KmGAL1启动子结构的-775~0相当的序列)，将其命名为KmGAL1-775。同样地，准备使KmGAL1-1400的5’末端缺失650个碱基而得到的DNA序列(与图2的KmGAL1启动子结构的-750~0相当的序列)，将其命名为KmGAL1-750。同样地，准备使KmGAL1-1400的5’末端缺失800个碱基而得到的DNA序列(与图2的KmGAL1启动子结构的-600~0相当的序列)，将其命名为KmGAL1-600。同样地，准备使KmGAL1-1400的5’末端缺失1000个碱基而得到的DNA序列(与图2的KmGAL1启动子结构的-400~0相当的序列)，将其命名为KmGAL1-400。同样地，准备使KmGAL1-1400的5’末端缺失1200个碱基而得到的DNA序列(与图2的KmGAL1启动子结构的-200~0相当的序列)，将其命名为KmGAL1-200。
利用将分泌型荧光素酶CLuc基因以能够工作的方式连接到GAL1启动子的下游而得到的模板以及上述KmGAL1-1400等9种DNA序列来进行PCR合成。由此，得到在上述KmGAL1-1400等9种DNA序列的下游分别以能够工作的方式连接有分泌型荧光素酶CLuc基因的、KmGAL1-1400-CLuc等9种重组DNA。将所得到的9种重组DNA分别导入马克斯克鲁维酵母中，得到总计为9种的各转化体。将该9种(每一种各两个克隆)转化体在YPD液体培养基(1质量%的酵母提取物、2质量%的多聚蛋白胨、2质量%的葡萄糖)中在28℃下振荡培养48小时，然后，对各种转化体采集5μl培养液的样品，测定分泌型荧光素酶CLuc的相对表达量(RLU；Relative Luciferase Unit，相对荧光素酶活性单位)。另外，使用YPGal液体培养基(1质量%的酵母提取物、2质量%的多聚蛋白胨、2质量%的半乳糖)代替YPD液体培养基进行同样的振荡培养，并测定分泌型荧光素酶CLuc的相对表达量。上述结果示于图3中。需要说明的是，在KmGAL1-1400等启动子名称处各记载两条的柱状图中，左侧表示使用YPD液体培养基(葡萄糖培养基)时两个克隆的平均值，右侧表示使用YPGal液体培养基(半乳糖培养基)时两个克隆的平均值。由图3的结果可知，在使用KmGAL1-1400、KmGAL1-1200、KmGAL1-1000、KmGAL1-820、KmGAL1-775的情况下，CLuc的相对表达量及由培养基中的半乳糖诱导的诱导率均极高，而在使用KmGAL1-750、KmGAL1-600、KmGAL1-400、KmGAL1-200的情况下，与使用KmGAL1-1400等的情况相比，CLuc的相对表达量明显降低。由该结果表明，与图2的KmGAL1启动子结构的-775~750相当的部分对于启动子的活性特别重要，从而确定出KmGAL1启动子的位置。需要说明的是，本说明书中的“活性量”与“相对表达量”为相同的含义。
实施例3
[KmGAL1启动子的表达分析]
为了研究KmGAL1启动子能够使目的基因在马克斯克鲁维酵母中以何种程度进行表达以及能够使目的基因在除马克斯克鲁维酵母以外的酵母中以何种程度进行表达，进行了如下的表达分析试验。
首先，通过使用URA3-5’40-KmGAL10c2引物(序列号4)、15GKmGAL1+22c引物(序列号5)和马克斯克鲁维酵母来源的染色体基因组的PCR，得到KmGAL1启动子(KmGAL1p)的序列。
接着，通过公知的转化法制作下述4种转化体。
(1)通过将在KmGAL1p的下游以能够工作的方式连接有分泌型荧光素酶CLuc基因的KmGAL1p-CLuc导入马克斯克鲁维酵母中而得到的转化体(图4的右端的KmGAL1p)。
(2)通过将在酿酒酵母来源的GAL10启动子的下游以能够工作的方式连接有分泌型荧光素酶CLuc基因的ScGAL10p-CLuc导入马克斯克鲁维酵母中而得到的转化体(自图4的右端起第2位的ScGAL10p)。
(3)通过将KmGAL1p-CLuc导入酿酒酵母中而得到的转化体(自图4的右端起第3位的KmGAL1p)。
(4)通过将ScGAL10p-CLuc导入酿酒酵母中而得到的转化体(图4的左端的ScGAL10p)。
将上述各转化体分别在YPD液体培养基(1质量%的酵母提取物、2质量%的多聚蛋白胨、2质量%的葡萄糖)中在28℃下振荡培养48小时，然后，对各种转化体采集5μl培养液的样品，测定分泌型荧光素酶CLuc的相对表达量(RLU/OD·μl)。另外，使用YPGal液体培养基(1质量%的酵母提取物、2质量%的多聚蛋白胨、2质量%的半乳糖)代替YPD液体培养基进行同样的振荡培养，并测定分泌型荧光素酶CLuc的相对表达量。上述结果示于图4中。需要说明的是，在KmGAL1p等启动子名称处各记载两条的柱状图中，左侧表示使用YPD液体培养基(葡萄糖培养基)时两个克隆的平均值，右侧表示使用YPGal液体培养基(半乳糖培养基)时两个克隆的平均值。
由图4的结果可知，KmGAL1启动子即使在酿酒酵母中也能够在半乳糖诱导下进行表达，而且，在酿酒酵母中使用KmGAL1启动子时CLuc的相对表达量(RLU/OD·μl)(半乳糖诱导下)与使用ScGAL10启动子时相比，以比例计上升至约5倍。一般而言，从属于与宿主所属的种属不同的种属的生物中分离出的启动子大多不能在该宿主中作为启动子发挥作用。而且，该其他生物的启动子通常不会发挥出超过宿主来源的启动子的表达量。因此可以说，马克斯克鲁维酵母来源的GAL1启动子在酿酒酵母中显示出比酿酒酵母来源的GAL 10启动子高5倍的表达性是罕见的现象。
而且，在马克斯克鲁维酵母中使用KmGAL1启动子时CLuc的相对表达量(RLU/OD·μl)(半乳糖诱导下)与在酿酒酵母中使用ScGAL10启动子时CLuc的相对表达量(半乳糖诱导下)相比，以比例计上升至50倍以上。由此可以说，KmGAL1启动子所具有的该高表达性显著。
产业上的可利用性
本发明能够特别有用地用于高表达目的基因和高生成目的基因产物的领域。
Figure IDA00001982570500011
Figure IDA00001982570500021
Figure IDA00001982570500031
Figure IDA00001982570500041

Claims (8)

1.一种高表达启动子，其包含下述(a)~(f)中的任意一种多核苷酸：
(a)序列号1表示的多核苷酸；
(b)与上述(a)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸；
(c)序列号2表示的多核苷酸；
(d)与上述(c)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸；
(e)序列号3表示的多核苷酸；以及
(f)与上述(e)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸。
2.一种重组多核苷酸，其包含权利要求1所述的高表达启动子和以能够在该启动子的调控下工作的方式配置的目的基因。
3.一种载体，其包含权利要求2所述的重组多核苷酸。
4.一种转化体，其特征在于，通过将权利要求2所述的重组多核苷酸或权利要求3所述的载体导入酵母中而得到。
5.如权利要求4所述的转化体，其特征在于，酵母为选自由酵母属(Saccharomyces)酵母和克鲁维酵母属(Kluveromyces)酵母组成的组中的任意一种酵母。
6.如权利要求4所述的转化体，其特征在于，酵母为选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和马克斯克鲁维酵母中的任意一种酵母。
7.一种目的基因的高表达方法，其特征在于，包括对权利要求4~6中任一项所述的转化体进行培养的步骤。
8.一种目的基因产物的制造方法，其特征在于，包括：
对权利要求4~6中任一项所述的转化体进行培养的步骤，和
从培养得到的转化体中回收目的基因产物的步骤。
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