CN106148417B - 标准化生物元件的设计和构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种标准化生物元件的设计和构建方法及其应用。本发明公开标准化生物元件的构建方法,包括如下步骤:(1)构建目的基因载体组、启动子载体组和终止子载体组。本发明基于酵母系统设计和构建了一系列标准化生物元件,利用II型限制性内切酶,可将标准化生物元件组装成超大长度的外源DNA片段,该外源DNA片段是由多个基因组成的目的产物合成途径,将该片段通过酵母同源重组整合到酵母染色体特定位点上,进行稳定表达,可实现目的产物酵母内异源合成,并且可以通过优化各基因的启动子实现目的产物的最优表达,从而在目的产物合成的优化过程中具有独到的优势和重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种标准化生物元件的设计和构建方法及其应用;特别涉及一种酿酒酵母中标准化生物元件的设计和构建方法及其应用,属于基因工程、代谢工程及合成生物学领域。
背景技术
随着分子生物学和基因工程技术的发展,外源代谢途径在大肠杆菌、酵母甚至是哺乳类细胞中进行表达都已经能够实现。虽然这些表达系统都已经被广泛的研究,但目前仍然存在很多不足。一方面,某一代谢产物的代谢途径需要多基因协同作用,各基因常常需要不同程度的表达调控。例如,产酸克雷伯氏杆菌(Klebsiella oxytoca)内的固氮途径由20个基因组成,并且存在着很多未知的调控因子,因此很难构建和优化整个的外源代谢途径。另一方面,虽然分子生物技术的发展使我们有能力在较短的时间内合成大片段染色体,甚至整个基因组,但其所需要的花费也是巨大的。Gibson assembly和Golden Gateassembly的实验技术可以满足我们将小片段DNA合成大片段的部分要求,但是类似于大肠杆菌中BioBrick的标准化的组装元件与合成策略不能直接应用于酵母等真核微生物。
酵母作为一种安全的真核微生物,同时具有强大的同源重组系统,仅利用很小的同源序列,便可进行准确和高效的同源重组,从而可以更为快捷的进行多基因、大片段DNA的组装。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是设计和构建标准化生物元件,将各标准化生物元件组装成超大长度的外源DNA片段,该外源DNA片段为多个基因组成的目的代谢途径(具体可为某种目的产物合成途径),将该外源DNA片段同源重组到酵母染色体,通过对酵母中的目的产物的测定,优化目的代谢途径中各基因的启动子,以实现酵母中目的产物的最优表达。
为了解决以上技术问题,本发明提供一种标准化生物元件的构建方法,包括如下步骤:
(1)构建目的基因载体组、启动子载体组和终止子载体组;
所述目的基因载体组由G种含有目的基因的载体组成,每种所述含有目的基因的载体均含有一种目的基因、两个限制性核酸内切酶A位点、两个限制性核酸内切酶B位点,所述目的基因位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间,和所述目的基因位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间;所述G为大于等于1的自然数,G的值为要体外组装的目的代谢途径的基因总数(如要体外组装的目的代谢途径是β-胡萝卜素外源合成途径,该β-胡萝卜素外源合成途径的基因是crtE基因、crtI基因和crtYB基因,该β-胡萝卜素外源合成途径的基因总数是3,即G为3);所述目的基因为要体外组装的目的代谢途径的基因,每种所述含有目的基因的载体中所含有的目的基因均不同;
所述启动子载体组由P种含有启动子的载体组成,每种所述含有启动子的载体均含有一种目的启动子、所述两个限制性核酸内切酶A位点、所述两个限制性核酸内切酶B位点,所述目的启动子位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间,和所述目的启动子位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间;所述P为大于等于1的自然数,具体为大于等于2的自然数,P的值本领域技术人员可根据需要选择,如可以大于等于要体外组装的目的代谢途径的基因总数,也可以小于等于要体外组装的目的代谢途径的基因总数,每种所述含有启动子的载体中所含有的目的启动子均不同;
所述终止子载体组由T种含有终止子的载体组成,每种所述含有终止子的载体均含有一种目的终止子、所述两个限制性核酸内切酶A位点、所述两个限制性核酸内切酶B位点,所述目的终止子位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间,和所述目的终止子位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间;所述T为大于等于1的自然数,T的值本领域技术人员可根据需要选择,如可以大于等于要体外组装的目的代谢途径的基因总数,也可以小于等于要体外组装的目的代谢途径的基因总数,每种所述含有终止子的载体中所含有的目的终止子均不同;
所述限制性核酸内切酶A位点和所述限制性核酸内切酶B位点中的所述“位点”包含其识别位点和切割位点;
(2)用所述限制性核酸内切酶B酶切所述启动子载体组的载体,得到含有目的启动子的片段;用所述限制性核酸内切酶B酶切所述目的基因载体组的载体,得到含有目的基因的片段;用所述限制性核酸内切酶B酶切所述终止子载体组的载体,得到含有目的终止子的片段;
(3)将所述含有目的启动子的片段中的一种片段、所述含有目的基因的片段中的一种片段和所述含有目的终止子的片段中的一种片段按照上游至下游方向依次连接得到一种目的基因表达盒,该一种所述目的基因表达盒为一种标准化生物元件。
按照该方法连接共可得到P×G×T种目的基因表达盒,即P×G×T种标准化生物元件;
所述限制性核酸内切酶A和所述限制性核酸内切酶B为不同种II型限制性核酸内切酶,具体为不同种IIS型限制性核酸内切酶。
上述方法中,所述限制性核酸内切酶A为限制性核酸内切酶BsaI;
所述限制性核酸内切酶B为限制性核酸内切酶BsmBI或Esp3I;
所述目的基因载体组的含有目的基因的载体的构建包括如下步骤:用一种所述目的基因替换HCkan-O的两个BsaI位点间的片段(两个BsaI位点间的较小片段),HCkan-O的其余序列保持不变,得到一种所述含有目的基因的载体;
所述HCkan-O为一种环状载体,其序列如由序列分别如SEQ ID No.6和SEQ IDNo.15所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示;
所述启动子载体组的含有启动子的载体的构建包括如下步骤:用一种所述目的启动子替换HCkan-P的两个BsaI位点间的片段(两个BsaI位点间的较小片段),HCkan-P的其余序列保持不变,得到一种所述含有启动子的载体;
所述HCkan-P为一种环状载体,其序列如由序列分别如SEQ ID No.3和SEQ IDNo.12所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示;
所述终止子载体组的含有终止子的载体的构建包括如下步骤:用一种所述终止子替换HCkan-T的两个BsaI位点间的片段(两个BsaI位点间的较小片段),HCkan-T的其余序列保持不变,得到一种所述含有终止子的载体;
所述HCkan-T为一种环状载体,其序列如由序列分别如SEQ ID No.9和SEQ IDNo.18所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示。
为了解决以上技术问题,本发明还提供POT重组载体的构建方法,包括如下步骤:
1)按照上述任一所述的方法制备标准化生物元件和制备POT载体组;
所述POT载体组由两种以上(2种-P×G×T种)POT载体组成,每种所述POT载体含有所述的限制性核酸内切酶A位点和所述的限制性核酸内切酶B位点;
2)用一种所述标准化生物元件替换所述POT载体组的一种POT载体的所述两个限制性核酸内切酶B位点间的片段(两个限制性核酸内切酶B位点间的较小片段),POT载体的其余序列保持不变,得到一种POT重组载体;
不同种所述标准化生物元件替换所述POT载体组的不同种POT载体;
所述不同种POT载体用于接收不同种所述标准化生物元件;
具体地,所述POT载体组包括如下1)-11)所示的质粒中的至少一种:
1)POT1质粒,该质粒的序列如SEQ ID No.21所示;
2)POT2质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.22所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.23所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
3)POT3质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.24所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.25所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
4)POT4质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.26所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.27所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
5)POT5质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.28所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.29所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
6)POT6质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.30所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.31所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
7)POT7质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.32所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.33所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
8)POT8质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.34所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.35所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
9)POT9质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.36所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.37所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
10)POT10质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.38所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.39所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
11)POT11质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.40所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.41所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同。
为了解决以上技术问题,本发明还提供一种将标准化生物元件体外组装成目的代谢途径的方法,包括如下步骤:将序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的5’同源臂、序列两端分别带有粘性末端的各标准化生物元件、序列两端分别带有粘性末端的选择标记基因、序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的3’同源臂按照上游至下游方向依次通过碱基互补配对连接组装成目的代谢途径;
或,
将所述序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的5’同源臂、所述序列两端分别带有粘性末端的选择标记基因、所述序列两端分别带有粘性末端的各标准化生物元件、所述序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的3’同源臂按照上游至下游方向依次通过碱基互补配对连接组装成目的代谢途径;
所述序列两端分别带有粘性末端的各标准化生物元件为用权利要求1或2所述的限制性核酸内切酶A酶切由权利要求3所述的方法制备的POT重组载体得到;
所述各标准化生物元件包含的目的基因总数为要体外组装的目的代谢途径的基因总数,每种所述各标准化生物元件包含的目的基因均不同,所述各标准化生物元件连接得到所述目的代谢途径的完整的基因片段;
所述选择标记基因用于筛选将所述目的代谢途径同源重组到宿主菌染色体后得到的重组菌;
所述同源重组位点具体为酵母菌的同源重组位点;
所述选择标记基因具体为酵母菌的选择标记基因,再具体为酵母的营养缺陷型标记基因,可为TRP1基因或LEU2基因或HIS3基因;
所述同源重组位点的5’同源臂的序列具体如SEQ ID No.54中第168位至第667位所示;
所述同源重组位点的3’同源臂的序列具体如SEQ ID No.55中第168位至第667位所示;
所述LEU2基因的序列如SEQ ID No.56中第168位至第2448位所示。
上述任一所述的方法中,所述标准化生物元件包含的目的基因为β-胡萝卜素外源合成途径的基因中的一种;
所述标准化生物元件中的启动子为TDH3启动子、ADH1启动子、CYC1启动子和TEF2启动子中的一种;
所述标准化生物元件中的终止子为TEF1终止子、ADH1终止子和TEF2终止子中的一种;
所述同源重组位点为酵母的HO位点;
所述酵母具体为JDY52,该酵母为BY4727和BY4733交配后形成二倍体菌株产孢得到的单倍体菌株,其基因型为MATa,his3Δ 200 leu2Δ 0 lys2Δ 0 trp1Δ 63 ura3Δ 0met15Δ 0;JDY52的HO位点被所述目的代谢途径取代后的基因型为MATa,his3Δ 200 leu2Δ 0 lys2Δ 0trp1Δ 63 ura3Δ 0 met15Δ 0 ho::URR1-marker-URR2,其中URR1-marker-URR2为所述目的代谢途径;
所述crtE基因、所述crtI基因和所述crtYB基因在所述目的代谢途径的5’-3’方向的排列顺序为crtE基因、crtI基因、crtYB基因。
上述方法中,所述β-胡萝卜素外源合成途径的基因为crtE基因、crtI基因和crtYB基因;
所述crtE基因的序列具体如SEQ ID No.48中第168位至第1298位所示;
所述crtI基因的序列具体如SEQ ID No.50中第168位至第1916位所示;
所述crtYB基因的序列具体如SEQ ID No.52中第168位至第2198位所示;
所述TDH3启动子的序列如SEQ ID No.42所示;
所述ADH1启动子的序列如SEQ ID No.43所示;
所述CYC1启动子的序列如SEQ ID No.57所示;
所述TEF2启动子的序列如SEQ ID No.44所示;
所述TEF1终止子的序列如SEQ ID No.45所示;
所述ADH1终止子的序列如SEQ ID No.46所示;
所述TEF2终止子的序列如SEQ ID No.47所示;
所述序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的5’同源臂为用上述任一所述的限制性核酸内切酶B酶切PMV-URR1得到,所述PMV-URR1的序列如SEQ ID No.54所示;
所述序列两端分别带有粘性末端的选择标记基因为用上述任一所述的限制性核酸内切酶B酶切PMV-selective marker得到,所述PMV-selective marker的序列如SEQ IDNo.56所示;
所述序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的3’同源臂为用上述任一所述的限制性核酸内切酶B酶切PMV-URR2得到,所述PMV-URR2的序列如SEQ ID No.55所示。
为了解决以上技术问题,本发明还提供一种对目的代谢途径进行优化的方法,包括如下步骤:
1)按照上述任一所述的方法体外组装目的代谢途径;
2)将一种所述目的代谢途径同源重组到宿主菌的染色体中,得到含有一种目的代谢途径的一种重组菌,根据重组菌中目的产物的产量优化目的代谢途径,目的产物产量高的重组菌中的目的代谢途径优于目的产物产量低的重组菌中的目的代谢途径;
所述目的代谢途径中的目的基因的启动子导致所述目的产物的产量不同;
所述目的代谢途径具体为目的产物合成途径,再具体为β-胡萝卜素外源合成途径;
所述目的产物具体为β-胡萝卜素;
所述宿主菌具体为酵母,再具体为JDY52酵母,该酵母为BY4727和BY4733交配后形成二倍体菌株产孢得到的单倍体菌株,其基因型为MATa,his3Δ 200 leu2Δ 0 lys2Δ 0trp1Δ 63ura3Δ 0 met15Δ 0;
为了解决以上技术问题,本发明还提供如下A-C任一所示的产品:
A、上述任一所述的方法制备得到的标准化生物元件;
B、上述任一所述的方法制备得到的POT重组载体;
C、上述任一所述的方法制备得到的目的代谢途径。
为了解决以上技术问题,本发明还提供如下D-N任一所示的产品:
D、HCkan-P质粒,该质粒的序列如由序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.12所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示;
E、HCKan-O质粒,该质粒的序列如由序列分别如SEQ ID No.6和SEQ ID No.15所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示;
F、HCkan-T质粒,该质粒的序列如由序列分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.18所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示;
G、POT质粒,该质粒为如下1)-11)所示的质粒中的任一种:
1)POT1质粒,该质粒的序列如SEQ ID No.21所示;
2)POT2质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.22所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.23所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
3)POT3质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.24所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.25所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
4)POT4质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.26所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.27所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
5)POT5质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.28所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.29所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
6)POT6质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.30所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.31所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
7)POT7质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.32所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.33所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
8)POT8质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.34所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.35所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
9)POT9质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.36所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.37所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
10)POT10质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.38所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.39所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
11)POT11质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.40所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.41所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同。H、PMV-URR1质粒,该质粒的序列如SEQ ID No.54所示;
H、PMV-URR1质粒,该质粒的序列如SEQ ID No.54所示;
I、PMV-URR2质粒,该质粒的序列如SEQ ID No.55所示;
J、PMV-selective marker质粒,该质粒的序列如SEQ ID No.56所示;
K、一种重组菌,该重组菌是将上述C同源重组到宿主菌的染色体中得到的含有所述目的代谢途径的重组菌;
所述宿主菌具体为酵母,再具体为JDY52酵母,该酵母为BY4727和BY4733交配后形成二倍体菌株产孢得到的单倍体菌株,其基因型为MATa,his3Δ 200 leu2Δ 0 lys2Δ 0trp1Δ 63ura3Δ 0 met15Δ 0;
L、SEQ ID No.48中第168位至第1298位所示的DNA或cDNA分子;
M、SEQ ID No.50中第168位至第1916位所示的DNA或cDNA分子;
N、SEQ ID No.52中第168位至第2198位所示的DNA或cDNA分子;
O、一种试剂盒,包括所述D、E和F所示的产品;
上述试剂盒中,所述试剂盒还包括所述G所示的产品;
上述任一所述的试剂盒中,所述试剂盒还包含限制性核酸内切酶BsaI和/或如下1)或2)所示的限制性核酸内切酶中的一种:
1)限制性核酸内切酶BsmBI;
2)限制性核酸内切酶Esp3I。
为了解决以上技术问题,本发明还提供上述任一所述的产品在合成目的产物中的应用;
所述目的产物具体为β-胡萝卜素。
本发明针对启动子,目的代谢途径(具体可为某种目的产物合成途径)中的基因以及终止子元件,相应构建了三种不同的载体HCkan-P、HCkan-O和HCkan-T,该3种载体是在pSMART HCKan的基础上,将RFP基因(带有细菌lac启动子和rrnB T1终止子)插入到该质粒的多克隆位点得到的,并在RFP基因两端设计加入BsaI和BsmBI识别位点,其中BsaI识别位点可用于将启动子、基因、终止子分别构建到相应的载体HCkan-P、HCkan-O和HCkan-T上,BsmBI识别位点可用于将启动子、基因、终止子一起构建到下游POT载体上,HCkan-P、HCkan-O和HCkan-T都具有卡那霉素抗性。用于接收启动子、基因和终止子的POT载体是对酵母中常用的pRS416载体进行改造,去除所有的BsaI和BsmBI酶切位点,并将RFP基因构建到质粒的多克隆位点,并在两端引入BsaI和BsmBI识别位点,其中BsmBI用于将启动子、基因、终止子一起构建到相应的POT载体上,BsaI用于释放构建在POT载体上的“启动子-基因-终止子”的“转录调控单元(标准化生物元件)”,使其能够带有固定黏性末端,用于在体外按照设计连接成超大长度的外源DNA片段,将其转化进入酵母体内,同源重组到酵母染色体获得不同表达效率的酵母菌株。通过对这些菌株中目的产物的分析,获取具有生产潜力的高产菌株。
本发明基于酵母系统设计和构建了一系列标准化生物元件,利用II型限制性内切酶,可将各标准化生物元件组装成超大长度的外源DNA片段,该外源DNA片段是由多个基因组成的目的代谢途径(具体可为某种目的产物合成途径),将该片段通过同源重组整合到酵母染色体特定位点上,进行稳定表达,可实现目的产物的酵母内异源合成,并且可以通过优化目的代谢途径(具体可为某种目的产物合成途径)中各基因的启动子实现目的产物的最优表达,本发明在目的代谢途径(具体可为某种目的产物合成途径)的优化过程中具有独到的优势和重要的意义。
附图说明
图1为载体HCKan-P/O/T构建图谱。
图2为载体POT1-11构建图谱。
图3为β-胡萝卜素途径的体外连接组装成的大片段。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种适当的修改和改进,这些修改和改进也属于本发明的保护范围。例如将实施例中所使用的标记基因更改为其他标记,将生物元件接收载体及POT载体中酶切所得黏性末端更改为新的序列,是本领域的普通技术人员所能够理解并实现的。
pSMART HCKan为Lucigen公司产品,产品目录号为40704-2。
pRS416在文献“Robert S.Sikorski,Philip Hieter,A System of ShuttleVectors and Yeast Host Strains Designed for Efficient Manipulation of DNA inSaccharomyces ceratisiae.Genetics,1989,122:19-27.”中公开过,公众可从清华大学获得。
酿酒酵母BY4741(Saccharomyces cerevisiae BY4741)在文献“Brachmann CB,Davies A,Cost GJ,Caputo E,Li J,Hieter P,Boeke JD.Designer deletion strainsderived from Saccharomyces cerevisiae S288C:a useful set of strains andplasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.Yeast,1998,14(2):115-32.”中公开过,公众可从清华大学获得。
下述实施例中的限制性核酸内切酶BsmBI可以替换为Esp3I。
实施例1、HCkan-P、HCkan-O和HCkan-T的构建
一、以pSMART HCKan为模板,以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物,使用超保真DNA聚合酶Q5酶进行PCR扩增(PCR程序:94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃40s,30个循环;72℃7min;4℃+∞),得到PCR扩增产物,BsaI酶切该PCR扩增产物,获得载体大片段1,载体大片段1的序列如SEQ ID No.3所示。
将引物替换为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5,其余实验步骤与上述实验步骤相同,得到PCR扩增产物,BsaI酶切该PCR扩增产物,获得到载体大片段2,载体大片段2的序列如SEQ ID No.6所示。
将引物替换为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8,其余实验步骤与上述实验步骤相同,得到PCR扩增产物,BsaI酶切该PCR扩增产物,获得到载体大片段3,载体大片段3的序列如SEQ ID No.9所示。
二、以合成的pMV-RFP为模板,以SEQ ID No.10和SEQ ID No.11为引物,使用超保真DNA聚合酶Q5酶进行PCR扩增(PCR程序:94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃20s,30个循环;72℃7min;4℃+∞),得到1160bp的PCR扩增产物,BsmBI酶切该PCR扩增产物,获得RFP基因片段1,RFP基因片段1的序列如SEQ ID No.12所示。
将引物替换为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14,其余实验步骤与上述实验步骤相同,得到1160bp的PCR扩增产物,BsmBI酶切该PCR扩增产物,获得RFP基因片段2,RFP基因片段2的序列如SEQ ID No.15所示。
将引物替换为SEQ ID No.16和SEQ ID No.17,其余实验步骤与上述实验步骤相同,得到1182bp的PCR扩增产物,BsmBI酶切该PCR扩增产物,获得RFP基因片段3,RFP基因片段3的序列如SEQ ID No.18所示。
各RFP基因片段中RFP基因序列如SEQ ID No.19所示。
各RFP基因片段中在RFP基因上游带有细菌lac启动子(5’-tttacactttatgcttccgg ctcgtatgtt g-3’),在RFP基因下游带有rrnB T1终止子(5’-caaataaaacgaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gtttta-3’)。
三、将载体大片段1与RFP基因片段1连接得到重组质粒1,将其命名为HCkan-P;将载体大片段2与RFP基因片段2连接得到重组质粒2,将其命名为HCkan-O;将载体大片段3与RFP基因片段3连接得到重组质粒3,将其命名为HCkan-T。将HCkan-P、HCkan-O和HCkan-T送测序,结果正确。
HCkan-P、HCkan-O和HCkan-T构建图谱如图1所示。
实施例2、POT1-11的构建
一、酵母载体pRS416上BsaI和BsmBI位点的去除
以pRS416为模板,以F1和R1为引物,使用超保真DNA聚合酶Q5酶进行PCR扩增(PCR程序:94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,30个循环;72℃7min;4℃+∞),得到2426bp的PCR扩增产物,BsaI酶切该PCR扩增产物,获得基因片段A。
将引物替换为F2和R2,其余实验步骤与上述实验步骤相同,得到1484bp的PCR扩增产物,BsaI酶切该PCR扩增产物,获得基因片段B。
将引物替换为F3和R3,其余实验步骤与上述实验步骤相同,得到1054bp的PCR扩增产物,BsaI酶切该PCR扩增产物,获得基因片段C。
将基因片段A、基因片段B、基因片段C连接得到去除BsaI和BsmBI后的pRS416载体。
F1:5’-ccggtgagcg tgggtctcgt agtcgcggta tcattgcag-3’;
R1:5’-tgatgtggtc tcacagtata gaaccgtgga tgatgtggtg tctacaggat ctg-3’;
F2:5’-ctgcaatgat accgcggtct cgactaccac gctcaccgg-3’;
R2:5’-cagaggggtc tcttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gattaaaggg cctcgtg-3’;
F3:5’-cggggtctct gaaaacctct gacacatgca gctcccggag attgtcacag cttgtct-3’;
R3:5’-agcgtgggtc tctactgttg acccaatgcg tcacccttgt catctaaacc c-3’。
二、多克隆位点的改造
NotI和XhoI双酶切SEQ ID No.20所示的DNA分子,得到基因片段D;NotI和XhoI双酶切步骤一制备的去除BsaI和BsmBI后的pRS416载体,得到载体大片段D;将基因片段D与载体大片段D连接,得到重组质粒,该质粒为多克隆位点改造的pRS416载体。
三、RFP基因的插入
以合成的pMV-RFP为模板,以F4和R4为引物,使用超保真DNA聚合酶Q5酶进行PCR扩增(PCR程序:94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃20s,30个循环;72℃7min;4℃+∞),得到PCR扩增产物,BsmBI酶切该PCR扩增产物,获得RFP基因片段4。
F4:5’-gcggctagag acggcaatac gcaaaccgcc tct-3’;
R4:5’-cagaggtgag acgctctagt agagagcgtt caccg-3’。
BsmBI酶切步骤二制备的多克隆位点改造的pRS416载体,得到载体大片段4;将RFP基因片段4与载体大片段4连接,得到重组质粒,将其命名为POT1,将POT1送测序,结果正确。POT1的序列如SEQ ID No.21所示。
将表1所示的POT1质粒中的待替换序列替换为表1所示的相应序列,得到对应的POT质粒,比如将POT1质粒中第3122位至第3143位的序列“5’-GGTCTCtACCTggctaGAGACG-3’”替换为“5’-GGTCTCtAGGCggctaGAGACG-3’”,并将POT1质粒中第2071位至第2092位的序列“5’-CGTCTCacctcTGAGaGAGACC-3’”替换为“5’-CGTCTCacctcTGGCaGAGACC-3’”,得到质粒POT4。POT2、POT3,POT5-POT 11质粒按照类似的方法,将POT1质粒的两段序列通过表1所示的相应替换得到。
表1 POT质粒的序列替换
载体POT1-11构建图谱如图2所示。
实施例3、体外快速组装β-胡萝卜素外源合成途径
一、含有启动子的各质粒HCKan-P-TDH3、HCKan-P-ADH1、HCKan-P-TEF2的构建
(一)TDH3启动子、ADH1启动子和TEF2启动子的获得
提取酵母BY4741的基因组DNA,以其为模板,以F5和R5为引物,使用超保真DNA聚合酶Q5酶进行PCR扩增(PCR程序:94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃40s,30个循环;72℃7min;4℃+∞),得到687bp的PCR扩增产物a1,该PCR扩增产物含有TDH3启动子,TDH3启动子的序列如SEQ ID No.42所示。
F5:5’-agcgtgggtc tcgggcttca ttatcaatac tgccatttca aagaatacg-3’;
R5:5’-gtgctgggtc tcacatcttt gtttgtttat gtgtgtttat tcgaaact-3’。
将引物替换为F6和R6,其余实验步骤与上述实验步骤相同,得到519bp的PCR扩增产物b1,该PCR扩增产物含有ADH1启动子,ADH1启动子的序列如SEQ ID No.43所示。
F6:5’-agcgtgggtc tcgggctact gtagccctag acttgatagc c-3’;
R6:5’-gtgctgggtc tcacatcgta tatgagatag ttgatt-3’。
将引物替换为F7和R7,其余实验步骤与上述实验步骤相同,得到519bp的PCR扩增产物c1,该PCR扩增产物含有TEF2启动子,TEF2启动子的序列如SEQ ID No.44所示。
F7:5’-agcgtgggtc tcgggctggg cgccataacc aaggtat-3’;
R7:5’-gtgctgggtc tcacatcttt agttaattat agttcgttga ccg-3’。
(二)建立10μL酶切连接反应
反应体系:1μL 10x T4 ligase buffer,0.1μL 100x BSA,10ng HCKan-P,2μL步骤(一)得到的PCR扩增产物a1、b1或c1,4U BsaI(NEB),0.5U T4DNA ligase(ThermoScientific)。
反应条件:37℃,60min;55℃,15min;80℃,15min;10℃,+∞。
利用上述方法将TDH3启动子、ADH1启动子和TEF2启动子分别克隆到载体HCKan-P,得到HCKan-P-TDH3、HCKan-P-ADH1、HCKan-P-TEF2。
以上酶切连接反应的原理如下:BsaI酶切PCR扩增产物a1,得到基因片段a1;BsaI酶切HCkan-P,得到载体大片段;将基因片段a1与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为HCKan-P-TDH3;
BsaI酶切PCR扩增产物b1,得到基因片段b1;BsaI酶切HCkan-P,得到载体大片段;将基因片段b1与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为HCKan-P-HCKan-P-ADH1;
BsaI酶切PCR扩增产物c1,得到基因片段c1;BsaI酶切HCkan-P,得到载体大片段;将基因片段c1与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为HCKan-P-TEF2。
将HCKan-P-TDH3、HCKan-P-ADH1、HCKan-P-TEF2送测序,结果正确。
二、含有终止子的各质粒HCKan-T-TEF1、HCKan-T-ADH1、HCKan-T-TEF2的构建
(一)TEF1终止子、ADH1终止子和TEF2终止子的获得
提取酵母BY4741的基因组DNA,以其为模板,以F8和R8为引物,使用超保真DNA聚合酶Q5酶进行PCR扩增(PCR程序:94℃3min;94℃30s,51℃30s,72℃30s,30个循环;72℃7min;4℃+∞),得到162bp的PCR扩增产物a2,该PCR扩增产物含有TEF1终止子,TEF1终止子序列如SEQ ID No.45所示。
F8:5’-agcgtgggtc tcttagcgag attgataaga cttttctagt tgc-3’;
R8:5’-gtgctgggtc tcggaggctg aaaaaagagg ggaattttta g-3’。
将引物替换为F9和R9,其余实验步骤与上述实验步骤相同,得到207bp的PCR扩增产物b2,该PCR扩增产物含有ADH1终止子,ADH1终止子序列如SEQ ID No.46所示。
F9:5’-agcgtgggtc tcttagccga atttcttatg atttatgatt tttattattaaataagttat-3’;
R9:5’-gtgctgggtc tcggaggccg gtagaggtgt ggtcaat-3’。
将引物替换为F10和R10,其余实验步骤与上述实验步骤相同,得到389bp的PCR扩增产物c2,该PCR扩增产物含有TEF2终止子,TEF2终止子序列如SEQ ID No.47所示。
F10:5’-agcgtgggtc tcttagcagt aataattatt gcttccatat aatatttttatatacctc-3’;
R10:5’-gtgctgggtc tcggaggaga gtatagaata atgaaaacgt tagtagaaag aag-3’。
(二)建立10μL酶切连接反应
反应体系:1μL 10x T4 ligase buffer,0.1μL 100x BSA,10ng HCKan-T,2μL步骤(一)得到的PCR扩增产物a2、b2或c2,,4U BsaI(NEB),0.5U T4DNA ligase(ThermoScientific)。
反应条件:37℃,60min;55℃,15min;80℃,15min;10℃,+∞。
利用上述方法将TEF1、ADH1和TEF2分别克隆到载体HCKan-T,分别得到HCKan-T-TEF1、HCKan-T-ADH1、HCKan-T-TEF2。
以上酶切连接反应的原理如下:
BsaI酶切PCR扩增产物a2,得到基因片段a2;BsaI酶切HCkan-T,得到载体大片段;将基因片段a2与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为HCKan-T-TEF1;
BsaI酶切PCR扩增产物b2,得到基因片段b2;BsaI酶切HCkan-T,得到载体大片段;将基因片段b2与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为HCKan-T-ADH1;
BsaI酶切PCR扩增产物c2,得到基因片段c2;BsaI酶切HCkan-T,得到载体大片段;将基因片段c2与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为HCKan-T-TEF2。
将HCKan-T-TEF1、HCKan-T-ADH1、HCKan-T-TEF2送测序,结果正确。
三、含有β-胡萝卜素合成各相关基因的各质粒HCKan-O-crtE、HCKan-O-crtI、HCKan-O-crtYB的构建
(一)crtE、crtI、crtYB基因的获得
1、基于法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)beta胡萝卜素途径中的crtE基因、crtI基因和crtYB基因,通过密码子优化,使crtE基因、crtI基因和crtYB基因的密码子具有酵母偏好性,并去除克隆及常规操作所用到的限制性内切酶位点。将优化的crtE基因、crtI基因和crtYB基因序列分别克隆在pMV载体中,分别得到PMV-crtE、PMV-crtI、PMV-crtYB质粒。
PMV-crtE质粒的序列如SEQ ID No.48所示。
SEQ ID No.48中第168位至第1298位为crtE基因序列,crtE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.49所示。
PMV-crtI质粒的序列如SEQ ID No.50所示。
SEQ ID No.50中第168位至第1916位为crtI基因序列,crtI蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.51所示
PMV-crtYB质粒的序列如SEQ ID No.52所示。
SEQ ID No.52中第168位至第2198位为crtYB基因序列,crtYB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.53所示
(二)以PMV-crtE为模板,以F11和R11为引物,使用Q5酶进行PCR(94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃90s,30个循环;72℃7min;4℃+∞)扩增,得到1145bp的PCR扩增产物。建立10μL酶切连接反应(反应体系:1μL 10x T4 ligase buffer,0.1μL 100x BSA,10ngHCKan-P,2μL PCR扩增产物,4U BsaI(NEB),0.5U T4DNA ligase(Thermo Scientific),反应条件:37℃,60min;55℃,15min;80℃,15min;10℃,+∞),将crtE克隆到载体HCKan-O,得到HCKan-O-crtE,该酶切连接反应的原理为:BsaI酶切该PCR扩增产物,得到crtE基因片段;BsaI酶切HCKan-O,得到载体大片段;将crtE基因片段与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为HCKan-O-crtE。
F11:5’-agcgtgGGTCTCaGATGGACTACGCTAACATCTTGACCGC-3’;
R11:5’-gtgctgGGTCTCgGCTACAATGGGATGTCAGCCAACTTC-3’。
将模板替换为PMV-crtI,将引物替换为F12和R12,其余实验步骤与上述实验步骤相同,得到1763bp的PCR扩增产物。通过相同的酶切连接反应,将crtI克隆到载体HCKan-O,得到HCKan-O-crtI,该酶切连接反应的原理为:BsaI酶切该PCR扩增产物,得到crtI基因片段;BsaI酶切HCKan-O,得到载体大片段;将crtI基因片段与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为HCKan-O-crtI。
F12:5’-agcgtgGGTCTCaGATGGGTAAGGAACAAGACCAAGAC-3’;
R12:5’-gtgctgGGTCTCgGCTAGAAAGCCAAAACACCAACAGATC-3’。
将模板替换为PMV-crtYB,将引物替换为F13和R13,其余实验步骤与上述实验步骤相同,得到2036bp的PCR扩增产物。通过相同的酶切连接反应,将crtYB克隆到载体HCKan-O,得到HCKan-O-crtYB,该酶切连接反应的原理为:BsaI酶切该PCR扩增产物,得到crtYB基因片段;BsaI酶切HCKan-O,得到载体大片段;将crtYB基因片段与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为HCKan-O-crtYB。
F13:5’-agcgtgGGTCTCaGATGACCGCTTTGGCTTACTACCAAA-3’;
R13:5’-gtgctgGGTCTCgGCTATTGACCTTCCCAACCAGACATAAC-3’。
将HCKan-O-crtE、HCKan-O-crtI、HCKan-O-crtYB送测序,结果正确。
四、启动子、β-胡萝卜素合成相关基因、终止子的POT整合
以crtE基因为例,选取上述构建好的质粒HCKan-P-TDH3、HCKan-O-crtE、HCKan-T-TEF1,建立10μL酶切连接反应(1μL 10x T4 ligase buffer,0.1μL 100x BSA,5U BsmBI(NEB),200ng POT2,200ng HCKan-P-TDH3,400ng HCKan-O-crtE,200ng HCKan-T-TEF1)(55℃,60min;加0.5U T4DNA ligase(Thermo Scientific);25℃,60min;55℃,15min;80℃,15min;10℃,+∞),将TDH3启动子、crtE基因、TEF1终止子一起克隆到POT2载体,得到POT2-pTDH3-crtE-tTEF1。该酶切连接反应的原理为:BsmBI酶切HCKan-P-TDH3,得到pTDH3片段;BsmBI酶切HCKan-O-crtE,得到crtE片段;BsmBI酶切HCKan-T-TEF1,得到tTEF1片段;BsmBI酶切POT2,得到4940长度的载体大片段;将pTDH3片段、crtE片段、tTEF1片段按照5’-3’顺序通过碱基互补配对连接到载体大片段上,得到重组质粒,将其命名为POT2-pTDH3-crtE-tTEF1。将POT2-pTDH3-crtE-tTEF1送测序,结果正确。
按照上述方法,将HCKan-P-TDH3替换为HCKan-P-ADH1,将HCKan-O-crtE替换为HCKan-O-crtI,将HCKan-T-TEF1替换为HCKan-T-ADH1,将POT2替换为POT4,其余步骤不变,得到重组质粒POT4-pADH1-crtI-tADH1。将POT4-pADH1-crtI-tADH1送测序,结果正确。
按照上述方法,将HCKan-P-TDH3替换为HCKan-P-TEF2,将HCKan-O-crtE替换为HCKan-O-crtYB,将HCKan-T-TEF1替换为HCKan-T-TEF2,将POT2替换为POT5,其余步骤不变,可以得到重组质粒POT5-pTEF2-crtYB-tTEF2。将POT5-pTEF2-crtYB-tTEF2送测序,结果正确。
POT2-pTDH3-crtE-tTEF1中的含有TDH3启动子、crtE基因和TEF1终止子的片段pTDH3-crtE-tTEF1片段、POT4-pADH1-crtI-tADH1中的含有ADH1启动子、crtI基因和ADH1终止子的片段pADH1-crtI-tADH1、POT5-pTEF2-crtYB-tTEF2中的含有TEF2启动子、crtYB基因和TEF2终止子的片段pTEF2-crtYB-tTEF2为β-胡萝卜素外源合成途径的各标准化生物元件。此处crtE、crtI、crtYB基因分别用TDH3启动子、ADH1启动子和TEF2启动子启动转录。
五、β-胡萝卜素外源合成途径的标准化生物元件的体外连接与转化
作为同源重组的同源臂的重组目标序列(URR1和URR2)长度为500bp,随机生成。设定的GC含量为50%,并经过NCBI blast检测,在已测序数据库中没有任何同源。本发明中所用的URR1和URR2序列分别如SEQ ID No.55和SEQ ID No.56所示,但本发明保护的内容不仅仅限于本序列。
(一)PMV-URR1的序列如SEQ ID No.54所示,SEQ ID No.54中第168位至第667位为URR1序列。
PMV-URR2的序列如SEQ ID No.55所示,SEQ ID No.55中第168位至第667位为URR2序列。
(二)PMV-LEU的序列如SEQ ID No.56所示,SEQ ID No.56中第168位至第2448位为营养缺陷型标记LEU2的序列。营养缺陷型标记可以是TRP1或LEU2或HIS3。
(三)将POT2-pTDH3-crtE-tTEF1、POT4-pADH1-crtI-tADH1、POT5-pTEF2-crtYB-tTEF2用BsaI酶切,将PMV-URR1、PMV-URR2、PMV-LEU2用BsmBI酶切,得到各酶切产物,将各酶切产物用T4DNA连接酶进行连接,得到超大长度的外源DNA片段URR1-pTDH3-crtE-tTEF1-pADH1-crtI-tADH1-pTEF2-crtYB-tTEF2-LEU2-URR2。
β-胡萝卜素途径的体外连接组装成的大片段如图3所示。
(四)将外源DNA片段
RR1-pTDH3-crtE-tTEF1-pADH1-crtI-tADH1-pTEF2-crtYB-tTEF2-LEU2-URR2利用同源重组整合到来源于酿酒酵母S288C的酿酒酵母JDY52(该酵母为BY4727和BY4733交配后形成二倍体菌株产孢得到的单倍体菌株,基因型为:MATa,his3Δ 200 leu2Δ 0 lys2Δ 0trp1Δ 63ura3Δ 0 met15Δ 0)的HO位点,得到转化子,将得到的转化子通过营养缺陷型标记和PCR鉴定。
其中PCR鉴定的步骤如下:以转化子的基因组DNA为模板,以Primer A和Primer B为引物进行PCR扩增,PCR扩增产物为586bp的目的片段的转化子为含有URR1的转化子,以Primer C和Primer D为引物进行PCR扩增,PCR扩增产物为752bp的目的片段的转化子为含有URR1、TDH3启动子、crtE基因的转化子,以Primer E和Primer F为引物进行PCR扩增,PCR扩增产物为735bp的目的片段的转化子为含有crtE基因、TEF1终止子、ADH1启动子、crtI的转化子,以Primer G和Primer H为引物进行PCR扩增,PCR扩增产物为880bp的目的片段的转化子为含有crtI基因、ADH1终止子、TEF2启动子、crtYB的转化子,以Primer I和Primer J为引物进行PCR扩增,PCR扩增产物为1335bp的目的片段的转化子为含有crtYB基因、TEF2终止子和LEU2的转化子,以Primer K和Primer L为引物进行PCR扩增,PCR扩增产物为977bp的目的片段的转化子为含有LEU2和URR2的转化子,以Primer M和Primer N为引物进行PCR扩增,PCR扩增产物为555bp的目的片段的转化子为含有URR2的转化子,含有所有目的片段的转化子为最终得到的目的转化子。
Primer A:5’-GGGTTCGCAAGTCCTGTTTCTATGCCTTTCTCTTAGTAATTCACG-3’;
Primer B:5’-CCAGAATCCGGGGCCTCTAAAGTAGAGCTAGGTTCGGAC-3’;
Primer C:5’-ACCCAACGATGTGGGGACGGCGTTGCAACTTCGAGGACCT-3’;
Primer D:5’-ACTCCAATGGGATAGCGGTCAAGATGTTAGCGTAGTCCAT-3’;
Primer E:5’-GGAAGCTATCTTGAAGAAGTTGGCTGACATCCCATTGTA-3’;
Primer F:5’-TGATAGCGGTTGGCTTGTCTTGGTCTTGTTCCTTACCCAT-3’;
Primer G:5’-GTAAGCCATTGAAGTCTAACGGAACCGGTATCGACTCTCA-3’;
Primer H:5’-TGTAGATCAAGTGGATTTGGTAGTAAGCCAAAGCGGTCAT-3’;
Primer I:5’-TACTCTTTGCCATTGGTTGCTTACGCTGAAGACTTGGCTA-3’;
Primer J:5’-GGTCACCTGGCAAAACGACGATCTTCTTAGGGGCAGACAT-3’;
Primer K:5’-CTGCCGCCATGATCCTAGTTAAGAACCCAACCCACCT-3’;
Primer L:5’-CCCCGACAGTGCGATTTAGCGAGCCTCTAACTCTTTCG-3’;
Primer M:5’-GCGTGCCTGCTCTCTCGTATTTCTCCTGGAGATC-3’;
Primer N:5’-CTGTTACTGATATGTCTGAGGAAAGTTGATCAAGACCC-3’。
六、β-胡萝卜素含量的测定
β-胡萝卜素含量的具体测定方法参见文献“Ukibe K,Katsuragi T,Tani Y,Takagi H.Efficient screening for astaxanthin-overproducing mutants of theyeast Xanthophyllomyces dendrorhous by flow cytometry.FEMS MicrobiolLett.2008,286(2):241-8”。
将步骤五鉴定得到的目的转化子分别接种于YPD培养基中,培养2-3天后离心收集酵母细胞,将其冻干,破壁后用体积百分含量90%的丙酮水溶液对酵母细胞内的类胡萝卜素进行提取,以β-胡萝卜素(Sigma-Aldrich产品,产品目录号为C4582-5mG)为标准品,进行HPLC检测分析,根据峰面积得到目的转化子β-胡萝卜素的相对产量。
实施例4、β-胡萝卜素外源合成途径的优化
一、按照实施例3的步骤一至步骤四的方法,以β-胡萝卜素外源合成途径为例,将β-胡萝卜素外源合成途径的各标准化生物元件的启动子进行设置,使crtE、crtI、crtYB基因分别用TDH3启动子(强启动子)、TEF2启动子(中启动子)、CYC1启动子(弱启动子,序列如SEQ ID No.57所示)中的其中一种进行启动转录,以调控crtE、crtI、crtYB基因的表达,并按照实施例3中步骤五的方法对URR1、β-胡萝卜素外源合成途径的各标准化生物元件、营养缺陷型标记、URR2按照5’-3’方向进行连接,得到外源DNA片段,并转化酵母,通过营养缺陷型标记和PCR鉴定转化子,共得到27种不同启动子组合的酵母菌转化子,按照实施例3中步骤六的方法检测该27种不同启动子组合的酵母菌转化子的β-胡萝卜素相对产量,以此优化β-胡萝卜素外源合成途径的启动子组合。上述27种不同启动子组合的酵母菌的β-胡萝卜素合成各相关基因的启动子如表1所示。
表1 27种不同启动子组合的酵母菌
结果表明,各酵母菌的β-胡萝卜素含量从高到低的顺序为:#17>#23>#26>#14>#8>#2>#18>#5>#15>#11>#24>#27>#9>#6>#3>#12>#20>#21>#13>#22>#16>#1>#4>#7>#25>#10>#19,即含有弱启动子pCYC1的酵母菌β-胡萝卜素的含量均较低;而且crtYB基因启动子为pTEF2的酵母菌的β-胡萝卜素含量最高。这说明为得到高β-胡萝卜素含量的酵母菌,β-胡萝卜素途径中的基因都需要一定强度的启动子(中启动子或强启动子)调控,而且调控crtYB基因的启动子不能太强。
Claims (3)
1.一种对目的代谢途径进行优化的方法,包括如下步骤:
1)体外组装目的代谢途径;
2)将一种所述目的代谢途径同源重组到酵母菌的染色体中,得到含有一种目的代谢途径的一种重组菌,根据重组菌中目的产物的产量优化目的代谢途径,目的产物产量高的重组菌中的目的代谢途径优于目的产物产量低的重组菌中的目的代谢途径;
体外组装目的代谢途径方法,包括如下步骤:将序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的5’同源臂、序列两端分别带有粘性末端的各标准化生物元件、序列两端分别带有粘性末端的选择标记基因、序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的3’同源臂通过碱基互补配对连接组装成目的代谢途径;
所述序列两端分别带有粘性末端的各标准化生物元件为用限制性核酸内切酶BsaI酶切POT重组载体得到;
POT重组载体的构建方法,包括如下步骤:
(1)制备POT载体组;
所述POT载体组由两种以上POT载体组成,所述POT载体为如下(a)-(k)所示的质粒中的任一一种:
(a)POT1质粒,该质粒的序列如SEQ ID No.21所示;
(b)POT2质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ IDNo.22所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.23所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
(c)POT3质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ IDNo.24所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.25所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
(d)POT4质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ IDNo.26所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.27所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
(e)POT5质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ IDNo.28所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.29所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
(f)POT6质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ IDNo.30所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.31所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
(g)POT7质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ IDNo.32所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.33所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
(h)POT8质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ IDNo.34所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.35所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
(i)POT9质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ IDNo.36所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.37所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
(j)POT10质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.38所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.39所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
(k)POT11质粒,该质粒的大小为5987bp,该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQID No.40所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.41所示,第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列与SEQ IDNo.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;
(2)用一种所述标准化生物元件替换所述POT载体组的一种POT载体的两个限制性核酸内切酶B位点间的片段,POT载体的其余序列保持不变,得到一种POT重组载体;
所述制备标准化生物元件方法,包括如下步骤:
(A)构建目的基因载体组、启动子载体组和终止子载体组;
所述目的基因载体组由G种含有目的基因的载体组成,每种所述含有目的基因的载体均含有一种目的基因、两个限制性核酸内切酶A位点、两个限制性核酸内切酶B位点,所述目的基因位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间,和所述目的基因位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间;所述G为大于等于1的自然数,G的值为要体外组装的目的代谢途径的基因总数;所述目的基因为要体外组装的目的代谢途径的基因,每种所述含有目的基因的载体中所含有的目的基因均不同;
所述启动子载体组由P种含有启动子的载体组成,每种所述含有启动子的载体均含有一种目的启动子、所述两个限制性核酸内切酶A位点、所述两个限制性核酸内切酶B位点,所述目的启动子位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间,和所述目的启动子位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间;所述P为大于等于2的自然数,每种所述含有启动子的载体中所含有的目的启动子均不同;
所述终止子载体组由T种含有终止子的载体组成,每种所述含有终止子的载体均含有一种目的终止子、所述两个限制性核酸内切酶A位点、所述两个限制性核酸内切酶B位点,所述目的终止子位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间,和所述目的终止子位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间;所述T为大于等于1的自然数,每种所述含有终止子的载体中所含有的目的终止子均不同;
(B)用所述限制性核酸内切酶B酶切所述启动子载体组的载体,得到含有目的启动子的片段;用所述限制性核酸内切酶B酶切所述目的基因载体组的载体,得到含有目的基因的片段;用所述限制性核酸内切酶B酶切所述终止子载体组的载体,得到含有目的终止子的片段;
(C)将所述含有目的启动子的片段中的一种片段、所述含有目的基因的片段中的一种片段和所述含有目的终止子的片段中的一种片段连接得到一种目的基因表达盒,该一种所述目的基因表达盒为一种标准化生物元件;
所述限制性核酸内切酶A为限制性核酸内切酶BsaI;
所述限制性核酸内切酶B为限制性核酸内切酶BsmBI;
所述目的基因载体组的含有目的基因的载体的构建包括如下步骤:用一种所述目的基因替换HCkan-O的两个BsaI位点间的片段,HCkan-O的其余序列保持不变,得到一种所述含有目的基因的载体;
所述HCkan-O为一种环状载体,其序列如由序列分别如SEQ ID No.6和SEQ ID No.15所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示;
所述启动子载体组的含有启动子的载体的构建包括如下步骤:用一种所述目的启动子替换HCkan-P的两个BsaI位点间的片段,HCkan-P的其余序列保持不变,得到一种所述含有启动子的载体;
所述HCkan-P为一种环状载体,其序列如由序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.12所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示;
所述终止子载体组的含有终止子的载体的构建包括如下步骤:用一种所述终止子替换HCkan-T的两个BsaI位点间的片段,HCkan-T的其余序列保持不变,得到一种所述含有终止子的载体;
所述HCkan-T为一种环状载体,其序列如由序列分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.18所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示;
所述各标准化生物元件包含的目的基因总数为要体外组装的目的代谢途径的基因总数,每种所述各标准化生物元件包含的目的基因均不同。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述标准化生物元件包含的目的基因为β-胡萝卜素外源合成途径的基因中的一种;
所述标准化生物元件中的启动子为TDH3启动子、ADH1启动子、CYC1启动子和 TEF2启动子中的一种;
所述标准化生物元件中的终止子为TEF1终止子、ADH1终止子和 TEF2终止子中的一种;
所述同源重组位点为酵母的HO位点。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述β-胡萝卜素外源合成途径的基因为crtE基因、crtI基因和crtYB基因;
所述crtE基因的序列具体如SEQ ID No.48中第168位至第1298位所示;
所述crtI基因的序列具体如SEQ ID No.50中第168位至第1916位所示;
所述crtYB基因的序列具体如SEQ ID No.52中第168位至第2198位所示;
所述TDH3启动子的序列如SEQ ID No.42所示;
所述ADH1启动子的序列如SEQ ID No.43所示;
所述CYC1启动子的序列如SEQ ID No.57所示;
所述TEF2启动子的序列如SEQ ID No.44所示;
所述TEF1终止子的序列如SEQ ID No.45所示;
所述ADH1终止子的序列如SEQ ID No.46所示;
所述TEF2终止子的序列如SEQ ID No.47所示;
所述序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的5’同源臂为用权利要求1或2中所述的限制性核酸内切酶B酶切PMV-URR1得到,所述PMV-URR1的序列如SEQ ID No.54所示;
所述序列两端分别带有粘性末端的选择标记基因为用权利要求1或2中所述的限制性核酸内切酶B酶切PMV-selective marker得到,所述PMV-selective marker的序列如SEQID No.56所示;
所述序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的3’同源臂为用权利要求1或2中所述的限制性核酸内切酶B酶切PMV-URR2得到,所述PMV-URR2的序列如SEQ ID No.55所示。
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