CN104419716A - 一种标准化、高精度、通用的功能模块构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种标准化、高精度、通用的功能模块构建方法，包括如下步骤：（1）将源基因添加标准化位点形成基因元件，将基因元件连入质粒pLD-Blunt中形成带有基因元件的质粒，进行序列验证；（2）从带有基因元件的质粒中调取基因元件，连入模块工具质粒中的如下缺口：终止子1-启动子-AATG-缺口-TAAA-终止子2；构建出不同的功能模块的质粒；（3）从不同的功能模块的质粒中调取不同的功能模块，与经过酶切的酵母质粒载体共转化酿酒酵母，构建出标准化、高精度、通用的功能模块，存放于质粒中；本发明具有通用性、标准化、高精度、自由选择性。
Description
技术领域
本发明涉及合成生物学领域，尤其涉及一种功能模块构建方法。
背景技术
功能模块在合成生物学研究中有着至关重要的作用。人工优化重构内源代谢路径、改造底盘细胞基因组、快速拼装多个外源基因元件、人工设计构建新生命功能，这些过程均需依托于功能模块。因此，设计一套标准化、高精度、通用的功能模块构建及拼装方法，使得其能够快速高效地获取所需模块，已经成为合成生物学迫切需要的瓶颈技术。
合成生物学亟需的、比较理想的功能模块构建方法，应该具备如下显著特点：1）对任意基因元件，无需位点预修饰。2）在构建过程中，始终维持DNA序列的保真性。3）能高效快速将多个模块组合拼装在一起。4）能自由决定模块起止、强度、组合顺序。目前已有的一些方法各有其显著优点，同时也存在着明显的不足。各个方法的简介如下：
Biobrick方法是iGEM国际遗传工程机器设计大赛所采用的模块构建方法。其特点为：预先对基因元件进行位点修饰，去除EcoR1，Xba1，Spe1，Pst1这四个酶切位点。将带有EcoR1，Xba1与Spe1，Pst1酶切位点的标准化序列添加到每个基因元件两侧形成标准化位点。对基因元件均采用四种酶的合理搭配进行酶切连接，两个相邻的元件会以Xba1与Spe1切出的同尾粘口连接形成“锁死位点”，不会再被切开，从而将两个小元件连成一个新的大元件，继续连接形成功能模块。
CPEC方法是利用PCR扩增为基因元件添加同源臂，同时以PCR扩增质粒载体，所有的PCR产物混在一个体系中，高温失活使得PCR产物充分裂解为单链DNA。在合适的温度下退火，单链DNA互搭，一定概率形成功能模块的质粒的单链雏形，在Phusion等高保真PCR酶扩增下，以互搭处的DNA序列为引物，扩增出双链模块质粒。
SLIC方法是利用3’核酸外切酶将多个元件或模块的PCR片段从3’端消化出一段单链DNA，PCR片段主体部分仍为双链形式。这些相互同源互补的单链DNA臂在合适的温度下会退火互搭，在配套功能酶的作用下将多消化的单链部分补全，转化形成完整的质粒。
Gibson方法与SLIC方法原理是完全一致的，只是Gibson方法采用的是5’核酸外切酶消化各个高浓度PCR片段，在同源互补构成质粒后无需扩增直接转化大肠杆菌，获得拼装的完整质粒。
DNA Assembler方法主要用于拼装单顺反子形式的单个片段，即每个片段是一个完整的“同源臂-启动子-基因元件-终止子-同源臂”PCR产物形式，各个片段与线性化的酵母质粒载体一步转化酿酒酵母，获得完整的多模块质粒。
Golden Gate Assembly方法需要对每个待拼装的PCR片段进行位点预修饰，去除所使用的位点如Bsa1、BsmB1等。在Golden Gate酶切作用下，各个片段露出4个碱基的一一互补粘性末端，所有片段以唯一的顺序连入空质粒载体，形成多模块质粒。
Standardized Assembly of Transcriptional Units方法是采用Golden Gate酶构建单个酵母表达盒的方法，目前尚不涉及多个模块的拼装。对单表达盒的构建，启动子、基因ORF、终止子元件均来自库存序列100%正确的质粒，经过一步酶切连接入工具质粒载体，快速构建出任一启动子与终止子搭配的单个基因模块。
ΦBT1整合酶拼装方法是采用ΦBT1、ΦC31等噬菌体整合酶构建的一套模块拼装方法。拼装单元仍为PCR产物，通过在每个PCR片段两段添加点突变的不同att片段，实现不同片段以唯一顺序特异性的拼装，形成最终质粒。
表1：现有各个方法的优缺点对比如下：（优点用加粗加下划线表示）
上述各个方法各有其优缺点及使用范围，合成生物学发展至今，亟需能够综合各种方法优点、规避缺点的模块构建及拼装方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种标准化、高精度、通用的功能模块构建方法。
一种标准化、高精度、通用的功能模块构建方法，包括如下步骤：
（1）将源基因添加具有酶识别与切割功能的标准化位点形成基因元件，将基因元件连入质粒pLD-Blunt中形成带有基因元件的质粒，进行序列验证；
（2）设计需要组合发挥功能的基因元件先后顺序，按照设计的先后顺序从带有基因元件的质粒中利用所述标准化位点调取基因元件，利用Bsa1酶切割不同的模块工具质粒，形成如下缺口：终止子1-启动子-AATG-缺口-TAAA-终止子2；将调取的不同的基因元件连入缺口，构建出不同的功能模块的质粒；所述不同的模块工具质粒是由不同的模块工具序列与空质粒pRS425K构成；所述模块工具序列为终止子1-启动子-AATGGGAGACC-紫色荧光蛋白基因amilCP的表达盒-GGTCTCCTAAA-终止子2；
（3）用下述两种方式之一种进行:
方式一：从所述不同的功能模块的质粒中利用酶切调取不同的功能模块，与经过酶切的酵母质粒载体共转化酿酒酵母，使不同的功能模块组合在一起，构建出标准化、高精度、通用的功能模块，存放于质粒中；
方式二：从所述不同的功能模块的质粒中利用酶切调取不同的功能模块，在第一个功能模块之前设置有左侧同源臂，在倒数第一个功能模块之后设置有右侧同源臂，共转化酿酒酵母，使不同的功能模块一同整合入酵母基因组，构建出标准化、高精度、通用的功能模块，其存放于基因组中。
所述源基因是从天然生物中克隆的基因或人工合成的基因。
从天然生物中克隆的基因优选为酿酒酵母基因Xks1，毕赤酵母基因Xyl1，毕赤酵母基因Xyl2。
人工合成的基因优选为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
具有酶识别与切割功能的标准化位点是：GGTCTCN+AATG……基因……TAAA+NGAGACC；所述GGTCTCN与NGAGACC是Bsa1酶的识别位点。
不同的模块工具序列中的终止子1，启动子和终止子2的分组选取如表2：
表2：
本发明的优点为:
（1）通用性：无需对DNA序列进行预修饰，可从任一源基因出发构建功能模块。
（2）标准化：采用酶识别与切割功能的标准化位点构建出不同的功能模块，采用标准化的同源重组方法实现不同的功能模块的组合。
（3）高精度：功能模块的构建过程中，无需对所构建的功能模块进行DNA测序校验。
（4）自由选择性：功能模块的构建过程中，能自由选择每个模块的强度与组合顺序。
附图说明
图1是本发明步骤全流程示意图。
图2是本实施例3中表达粉紫色荧光蛋白含有模块工具质粒的紫色大肠杆菌菌落以及含有功能模块质粒的白色大肠杆菌菌落。
图3是本发明实施例3中功能模块的酶切及凝胶电泳结果（每个酶切凝胶电泳条带右侧为对应整个模块质粒凝胶电泳条带）
图4为本发明实施例3中功能模块共转化酿酒酵母成功组合成质粒产生绿色产物deoxychromoviridans引发菌落变成绿色的平板照片。
图5为本发明实施例4中功能模块的酶切及凝胶电泳结果。
图6为本发明实施例4中功能模块共转化酿酒酵母成功整合入酵母基因组使得酵母能够在木糖培养平板上生长的照片。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。
本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明，而不限于本发明的范围。在不背离权利要求书的范围的条件下，本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。另外，需要注意的是除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得。
图1是本发明步骤全流程示意图；
实施例1pLD-Blunt质粒载体的构建，pLD-Blunt质粒载体由SEQ ID NO.28所示。
本发明中，pLD-Blunt是人工构建的用于放置基因元件的唯一克隆载体，其构建过程如下：
（1）选用全式金的pEASY-Blunt试剂盒，取出pEASY-Blunt试剂1μL，加入4μL水，25℃反应5min，转化大肠杆菌，在平板上预涂IPTG与X-gal，利用蓝白斑筛选获得蓝色菌落。
（2）将蓝色菌落接入LB-Amp液体培养基，37℃过夜培养，提取pEASY-Blunt空质粒载体。
（3）利用SEQ ID NO.19所示的引物pLD-Blunt1-F与SEQ ID NO.20所示的引物pLD-Blunt1-R作为上游引物与下游引物，以pEASY-Blunt空质粒载体为模板，对Amp抗性基因引入BsaI点突变，将Amp抗性基因的主要部分扩增出来。PCR扩增体系为50μL：30μLddH2O，10μL5*Buffer，5μL dNTP，2.5μL基因组模板，1μL上游引物，1μL下游引物。反应条件为：95℃3min进行1轮；95℃30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，进行30轮；72℃延伸10min进行1轮。柱回收PCR产物，50μL洗脱液溶解DNA样品。
（4）利用SEQ ID NO.21所示的引物pLD-Blunt2-F与SEQ ID NO.22的示的引物pLD-Blunt2-R作为上游引物与下游引物，以pEASY-Blunt空质粒载体为模板，将空质粒中除去步骤（3）中Amp抗性基因段以及Kan抗性基因ORF之外的部分扩增出来。PCR扩增体系为50μL：30μL ddH2O，10μL5*Buffer，5μL dNTP，2.5μL基因组模板，1μL上游引物，1μL下游引物。反应条件为：95℃3min进行1轮；95℃30s，50-60℃退火30s，72℃延伸1min15s，进行30轮；72℃延伸10min进行1轮。柱回收PCR产物，50μL洗脱液溶解DNA样品。
（5）将步骤（3）与（4）的回收产物等摩尔混匀，形成10μL体系。向其中混入2*GibsonBuffer，混匀后于50℃反应1h，选取5μL进行大肠杆菌转化，涂于预涂了IPTG与X-gal的Amp抗性平板，37℃过夜培养。
（6）步骤（5）中所用2*Gibson Buffer的配制方法见Gibson组装的文章，所用各母液浓度均与文章相符，Buffer的具体体系如下：Tris100μL，PEG100μL，dNTP80μL，DTT10μL，MgCl25μL，NAD20μL，T5酶20μL，Phusion酶12.5μL，Ligase酶100μL，水52.5μL。总体系500μL。
（7）从步骤（5）培养起来的平板上挑取蓝色单菌落，接入LB-Amp培养基，培养12h以上，提取质粒，酶切验证大小。对大小正确的予以保存，作为SEQ ID NO.28所示的pLD-Blunt质粒。
实施例2pRS425K质粒载体的构建，pRS425K的序列以SEQ ID NO.29所示。
本发明中，pRS425K是人工构建的用于放置模块工具序列的克隆载体，其构建过程如下：
（1）选用全式金的pEASY-Blunt试剂盒，取出pEASY-Blunt试剂1μL，加入4μL水，25℃反应5min，转化大肠杆菌，在平板上预涂IPTG与X-gal，利用蓝白斑筛选获得蓝色菌落。
（2）将蓝色菌落接入LB-Amp液体培养基，37℃过夜培养，提取质粒，此即为pEASY-Blunt空质粒载体。同时，将含有pRS425的大肠杆菌菌株接菌，提取pRS425空质粒载体。
（3）利用SEQ ID NO.23所示引物pRS425K1-F与SEQ ID NO.24所示引物pRS425K1-R作为上游引物与下游引物，以pEASY-Blunt空质粒载体为模板，将Kan抗性基因表达盒扩增出来。PCR扩增体系为50μL：30μL ddH2O，10μL5*Buffer，5μL dNTP，2.5μL基因组模板，1μL上游引物，1μL下游引物。反应条件为：95℃3min进行1轮；95℃30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，进行30轮；72℃延伸10min进行1轮。柱回收PCR产物，50μL洗脱液溶解DNA样品。
（4）利用SEQ ID NO.25所示引物pRS425K2-F与SEQ ID NO.26所示引物pRS425K2-R作为上游引物与下游引物，以pRS425空质粒载体为模板，将pRS425中剔除Amp抗性基因表达盒段之外的部分扩增出来。PCR扩增体系为50μL：30μL ddH2O，10μL5*Buffer，5μL dNTP，2.5μL基因组模板，1μL上游引物，1μL下游引物。反应条件为：95℃3min进行1轮；95℃30s，50-60℃退火30s，72℃延伸1min15s，进行30轮；72℃延伸10min进行1轮。柱回收PCR产物，50μL洗脱液溶解DNA样品。
（5）将步骤（3）与（4）的回收产物等摩尔混匀，形成10μL体系。向其中混入2*GibsonBuffer，混匀后于50℃反应1h，选取5μL进行大肠杆菌转化，涂于预涂了IPTG与X-gal的Kan抗性平板，37℃过夜培养。
（6）步骤（5）中所用2*Gibson Buffer的配制方法见Gibson组装的文章，所用各母液浓度均与文章相符，Buffer的具体体系如下：Tris100μL，PEG100μL，dNTP80μL，DTT10μL，MgCl25μL，NAD20μL，T5酶20μL，Phusion酶12.5μL，Ligase酶100μL，水52.5μL。总体系500μL。
（7）从步骤（5）培养起来的平板上挑取蓝色单菌落，接入LB-Kan培养基，培养12h以上，提取质粒，酶切验证大小。对大小正确的予以保存，作为SEQ ID NO.29所示的pRS425K质粒。
实施例3构建合成紫色杆菌素的绿色前体物deoxychromoviridans的功能模块
紫色杆菌素是一种具有抑菌效果的化合物，源自紫色色杆菌（Chromobacteriumviolaceum）。紫色杆菌素是细胞以色氨酸为底物，经由VioA，VioB，VioE，VioD，VioC五个酶反应合成。仅进行前三步反应后，细胞会合成出一种绿色的产物deoxychromoviridans，此产物能使酵母菌落显出绿色。
因此，本实施例对VioA，VioB，VioE三个酶的基因各自设计了3个强度功能模块，在此基础上，通过不同的功能模块共转化酵母，进行不同模块的组合，获得组合功能模块，使酿酒酵母能够生产deoxychromoviridans，令菌落产生绿色。
本实施例中，VioA用SEQ ID NO.1表示，VioB用SEQ ID NO.2表示，VioE用SEQ ID NO.3表示。
（1）①将源基因添加具有酶识别与切割功能的标准化位点形成基因元件。
对VioA，VioB，VioE基因分别添加具有BsaI酶识别与切割功能的标准化位点:GGTCTCN+AATG……基因……TAAA+NGAGACC，添加方法为PCR扩增，PCR模板为已经合成的各个基因，所用引物为：VioA采用引物SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8，VioB采用引物SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10，VioE采用引物SEQ ID NO.11与SEQ ID NO.12。PCR扩增体系为50μL：30μL ddH2O，10μL5*Buffer，5μL dNTP，2.5μL合成基因模板，1μL上游引物，1μL下游引物。反应条件为：95℃3min进行1轮；95℃30s，50-60℃退火30s，72℃延伸1min/2kb-1min/4kb，进行30轮；72℃延伸10min。柱回收PCR产物于50μL洗脱缓冲液中。
②将基因元件连入质粒pLD-Blunt中形成带有基因元件的质粒，连接体系为10μL：步骤（1）中PCR产物6μL，pLD-Blunt质粒载体经由EcoRV酶切回收产物2μL，10*Buffer1μL，连接酶1μL。反应条件：22℃至少3h。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，获得平板转化子，利用M13F与M13R这两个引物进行菌落PCR，筛选阳性转化子。
③对阳性转化子，选择至少3个接到LB-Amp液体培养基中，培养12小时，保存一份菌液，取少量样品送交公司进行DNA测序。将DNA测序正确的基因元件的质粒保存于大肠杆菌菌株中。
（2）①设计需要组合发挥功能的基因元件顺序，按照设计先后的顺序，针对各个基因元件的标准化位点，利用BsaI酶对各个合成基因元件的质粒进行酶切，获得各基因元件。酶切体系为50μL：30μL质粒，13μL ddH2O，5μL10*Buffer，2μL酶；反应条件为：37℃3h以上。上述酶切反应后，所有基因元件均两段均形成AATG与TAAA粘性末端。
②利用BsaI酶切割不同的模块工具质粒，形成如下缺口：终止子1-启动子-AATG-缺口-TAAA-终止子2。反应体系为50μL：20μL质粒，23μL ddH2O，55μL10*Buffer，2μL酶。根据①中的设计顺序，从表2的所有模块工具质粒中调用所需的模块工具质粒。
③步骤②中利用BsaI酶进行切割的模块工具质粒由模块工具序列与空质粒pRS425K构成；所述模块工具序列为终止子1-启动子-AATGGGAGACC-紫色荧光蛋白基因amilCP-GGTCTCCTAAA-终止子2；经由BsaI酶切后，从质粒上将GGAGACC-紫色荧光蛋白基因amilCP-GGTCTCC序列剔除，形成缺口：终止子1-启动子-AATG-缺口-TAAA-终止子2。
④将步骤①酶切得到的基因元件与步骤②中的酶切获得的形成缺口的工具质粒进行DNA柱回收，回收DNA产物，将DNA产物混合在一起，将基因元件连入对应的模块工具质粒缺口。连接体系10μL：6μL基因元件酶切回收产物，2μL模块工具质粒酶切回收产物，1μL10*Buffer，1μL酶。连接反应条件：22℃1h-3h。
⑤将步骤④中连接产物转化入大肠杆菌，涂于LB-Kan平板，37℃过夜培养，利用紫白斑筛选，获得白色的阳性菌落（见图2）。将阳性菌落接入LB-Kan培养基，培养12h以上，存菌，提取质粒，此质粒即为基因元件与模块工具质粒连接形成的功能模块的质粒。对不同的基因元件，获得不同的功能模块如表3。
表3
| 序列编号 | 凝胶电泳图3中编号 | 基因元件名 | 功能模块内容 |
| SEQ ID NO.44 | 3A | VioA | ENO2t-PDC1p-VioA-GPM1t |
| SEQ ID NO.45 | 3B | VioA | ENO2t-PGK1p-VioA-GPM1t |
| SEQ ID NO.46 | 3C | VioA | ENO2t-PGI1p-VioA-GPM1t |
| SEQ ID NO.47 | 3D | VioB | GPM1t-PDC1p-VioB-GPDt |
| SEQ ID NO.48 | 3E | VioB | GPM1t-PGK1p-VioB-GPDt |
| SEQ ID NO.49 | 3F | VioB | GPM1t-PGI1p-VioB-GPDt |
| SEQ ID NO.50 | 3G | VioE | GPDt-PDC1p-VioE-FBA1t |
| SEQ ID NO.51 | 3H | VioE | GPDt-PGK1p-VioE-FBA1t |
| SEQ ID NO.52 | 3I | VioE | GPDt-PGI1p-VioE-FBA1t |
上述功能模块每种取三个样品进行DNA测序，经过测序证明，功能模块的序列是百分之百的正确，证明了本方法在构建功能模块过程中具有高精度的特点。
在已构建了不同的功能模块基础上，将不同的功能模块混合在一起后与质粒载体一同共转化酵母菌，会得到3*3*3=27种组合数的组合功能模块，令酿酒酵母菌产生深绿、浅绿、白色等颜色菌落。步骤如下：
（3）通过方式一构建标准化、高精度、通用的功能模块
①将9个不同的功能模块：ENO2t-PDC1p-VioA-GPM1t，ENO2t-PGK1p-VioA-GPM1t，ENO2t-PGI1p-VioA-GPM1t，GPM1t-PDC1p-VioB-GPDt，GPM1t-PGK1p-VioB-GPDt，GPM1t-PGI1p-VioB-GPDt，GPDt-PDC1p-VioE-FBA1t，GPDt-PGK1p-VioE-FBA1t，GPDt-PGI1p-VioE-FBA1t所在的质粒从保存的大肠杆菌菌株中提取出来，利用NotI酶对质粒进行酶切，进行凝胶电泳，利用柱回收方法回收正确长度的功能模块DNA片段。酶切体系为100ul：质粒5ug，10*Buffer10ul，酶5ul，水补足100ul。
②对构建所需的酵母质粒载体pRS415（但不限于pRS415）以PstI、BamHI进行酶切，以柱回收回收质粒空载体酶切的DNA产物。酶切体系为100ul：质粒5ug，10*Buffer10ul，酶5ul，水补足100ul。
③将步骤①与步骤②中得到两类DNA回收产物混合在一起，等摩尔加入(各0.15pmol)转化体系，共转化酿酒酵母。
所用的、经过优化的酵母转化过程如下：挑酿酒酵母菌（BY4741）的单菌落，30℃过夜培养；次日，接种过夜培养液到5ml YPD中（0.1OD600/ml）。30℃、220r/min培养4h，至OD600达到0.5，5000rpm离心2min，收集细胞；用1ml无菌水重悬并清洗细胞，同上离心，收集细胞；用1ml0.1M LiOAc重悬细胞，同上离心，收集细胞；将上清倒出，剩余的LiOAc重悬细胞，并转移到1.5ml EP管内，置于冰上形成感受态细胞；
准备转化体系：50%PEG3350620μL，1M LiOAc90μL，10mg/ml ssDNA40μL，DNA（步骤①与步骤②中得到两类DNA的混合物）50μL。将转化体系加入100ul感受态细胞中，吹吸均匀，涡旋10s；30℃培养箱中孵育30min。加入90ul DMSO，涡旋混匀10s；42℃热激20min3600rpm离心30s，收集细胞；吸出上清，加入400ul5mM CaCl2，重悬细胞，静置15min；3600rpm离心30s，吸出上清，在无菌水中重悬后涂板。
④在进行转化的酵母菌细胞中，第一个功能模块（ENO2t-PDC1p-GPM1t，ENO2t-PGK1p-GPM1t，ENO2t-PGI1p-GPM1t之一）利用酶切产生的同源臂与酶切的酵母质粒载体进行重组，最后一个功能模块（GPDt-PDC1p-FBA1t，GPDt-PGK1p-FBA1t，GPDt-PGI1p-FBA1t之一）利用酶切产生的同源臂与酶切的酵母质粒载体进行重组，第二个功能模块（GPM1t-PDC1p-GPDt，GPM1t-PGK1p-GPDt，GPM1t-PGI1p-GPDt）以NotI酶切产生同源臂与第一个功能模块及第三个功能模块进行重组，不同的功能模块组合在一起，构建出标准化、高精度、通用的功能模块，存放于质粒中；功能模块组合后的形式为：ENO2t-启动子-VioA-GPM1t-启动子-VioB-GPDt-启动子-VioE-FBA1t。
⑤48h后，观察平板上生长的酵母菌落，见图4，挑取深绿色、浅绿色、基本为白色的进行纯化划线，培养48h，获取纯化的酵母菌落。
⑥将纯化的酵母菌落接入SD-Leu液体培养，培养1天。离心液体培养基里的酵母菌至1.5ml离心管中，提取酵母质粒。
⑦将酵母质粒20ul转化至大肠杆菌中，利用蓝白斑筛选的方法，筛选出白色单菌落作为阳性转化子。
⑧将阳性转化子接入LB-Kan抗性液体培养基，过夜培养，存菌，提取质粒，送交基因公司进行DNA测序。
⑨经过对几个样品的测序验证，得到如下组合功能模块，其对应的酵母菌分别为深绿色、浅绿色。可以发现，组合功能模块内部单个功能模块内容有所不同，说明本发明方法可以用于筛选同一代谢路径上基因元件的最适合表达强度，从而优化目标产物的合成。见表4。
表4
实施例4构建功能模块，整合入酿酒酵母基因组使其能够利用木糖
天然酿酒酵母不能利用木糖，只有将木糖代谢的基因以功能模块形式转入酿酒酵母中，才能赋予其利用木糖、在纯木糖而无葡萄糖的培养基中生长的特性。利用本发明构建了木糖利用所需三个基因Xyl1，Xyl2，Xks1所在的功能模块，并将其拼装在一起，利用发明所述方法整合入酵母基因组。其中Xyl1与Xyl2源自毕赤酵母内克隆，Xks1源自酿酒酵母内克隆。
Xyl1是SEQ ID NO.5所示，Xyl2是SEQ ID NO.6所示，Xks1是SEQ ID NO.4所示。
（1）①将源基因添加具有酶识别与切割功能的标准化位点形成基因元件。
对源基因Xyl1，Xyl2，Xks1基因分别添加具有BsaI酶识别与切割功能的标准化位点:GGTCTCN+AATG……基因……TAAA+NGAGACC，添加方法为PCR扩增，PCR模板为已经合成的各个基因，所用引物为：Xyl1使用引物：SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.14，Xy12使用引物SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.16，Xks1使用引物：SEQ ID NO.17与SEQ ID NO.18。PCR扩增体系为50μL：30μL ddH2O，10μL5*Buffer，5μL dNTP，2.5μL合成基因模板，1μL上游引物，1μL下游引物。反应条件为：95℃3min进行1轮；95℃30s，50-60℃退火30s，72℃延伸1min/2kb-1min/4kb，进行30轮；72℃延伸10min。柱回收PCR产物于50μL洗脱缓冲液中。
②将基因元件连入质粒pLD-Blunt中形成带有基因元件的质粒，连接体系为10μL：步骤（1）中PCR产物6μL，pLD-Blunt质粒载体经由EcoRV酶切回收产物2μL，10*Buffer1μL，连接酶1μL。反应条件：22℃至少3h。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，获得平板转化子，利用M13F与M13R这两个引物进行菌落PCR，筛选阳性转化子。
③对阳性转化子，选择至少3个接到LB-Amp液体培养基中，培养12小时，保存一份菌液，取少量样品送交公司进行DNA测序。将DNA测序正确的基因元件的质粒保存于大肠杆菌菌株中。
（2）①设计需要组合发挥功能的基因元件顺序，按照设计先后的顺序，针对各个基因元件的标准化位点，利用BsaI酶对各个合成基因元件的质粒进行酶切，获得各基因元件。酶切体系为50μL：30μL质粒，13μL ddH2O，5μL10*Buffer，2μL酶；反应条件为：37℃3h以上。上述酶切反应后，所有基因元件均两段均形成AATG与TAAA粘性末端。
②利用BsaI酶切割不同的模块工具质粒，形成如下缺口：终止子1-启动子-AATG-缺口-TAAA-终止子2。反应体系为50μL：20μL质粒，23μL ddH2O，55μL10*Buffer，2μL酶。根据①中的设计顺序，从表2所有模块工具质粒中调用所需的模块工具质粒。
③步骤②中利用BsaI酶进行切割的模块工具质粒由模块工具序列与空质粒pRS425K构成；所述模块工具序列为终止子1-启动子-AATGGGAGACC-紫色荧光蛋白基因amilCP-GGTCTCCTAAA-终止子2；经由BsaI酶切后，从质粒上将GGAGACC-紫色荧光蛋白基因amilCP-GGTCTCC序列剔除，形成缺口：终止子1-启动子-AATG-缺口-TAAA-终止子2。
④将步骤①酶切得到的基因元件与步骤②中的酶切获得的形成缺口的工具质粒进行DNA进行DNA柱回收，回收DNA产物，将DNA产物混合在一起，将基因元件连入对应的模块工具质粒。连接体系10μL：6μL基因元件酶切回收产物，2μL模块工具质粒酶切回收产物，1μL10*Buffer，1μL酶。连接反应条件：22℃1h-3h。
⑤将步骤④中连接产物转化入大肠杆菌，涂于LB-Kan平板，37℃过夜培养，利用紫白斑筛选，获得白色的阳性菌落。将阳性菌落接入LB-Kan培养基，培养12h以上，存菌，提取质粒，此质粒即为基因元件与模块工具质粒连接形成的功能模块的质粒。对不同的基因元件，获得不同的功能模块见表5：
表5
| 序列编号 | 凝胶电泳图5中编号 | 基因元件名 | 功能模块内容 |
| SEQ ID NO.55 | 7A | Xyl1 | FBA1t-TPI1p-Xyl1-PGK1t |
| SEQ ID NO.56 | 7B | Xyl2 | PGK1t-TPI1p-Xyl2-CYC1t |
| SEQ ID NO.57 | 7C | Xks1 | CYC1t-TPI1p-Xks1-TEF1t |
上述功能模块每种取三个样品进行DNA测序，经过测序证明，功能模块的序列是百分之百的正确，证明了本方法在构建功能模块过程中具有高精度的特点。
（3）利用方式二构建标准化、高精度、通用的功能模块。
所述左侧同源臂为Delta1-DR-URA-DR-终止子；所述Delta1是酿酒酵母转座子Ty1的5’UTR区一段序列用SEQ ID NO.41所示，DR-URA-DR是将同源臂DR放置于克鲁维亚酵母URA3基因表达盒两侧形成的片段用SEQ ID NO.43所示；所述右侧同源臂为终止子-Delta2；Delta2是酿酒酵母转座子Ty1的5’UTR区与Delta1紧邻的序列用SEQ ID NO.42所示。
①将3个模块一同整合入酿酒酵母基因组。方式是将不同的功能模块与放置的左侧同源臂以及右侧同源臂共转化酿酒酵母，使得不同的功能模块一同整合入酵母基因组。所使用的不同的功能模块：FBA1t-TPI1p-PGK1t，PGK1t-TPI1p-CYC1t，CYC1t-TPI1p-TEF1t的质粒从保存的大肠杆菌菌株中提取出来，利用NotI酶对质粒进行酶切，进行凝胶电泳，利用柱回收方法回收正确长度的单个模块DNA片段。酶切体系为100ul：质粒5ug，10*Buffer10ul，酶5ul，水补足100ul。
②左侧同源臂的获取过程为：对Delta1-DR-URA-DR-FBA1t序列所在的pRS425K质粒以NotI进行酶切，以柱回收回收质粒空载体酶切的DNA产物。酶切体系为100ul：质粒5ug，10*Buffer10ul，酶5ul，水补足100ul。柱回收酶切产物。DR-URA-DR序列以SEQ ID NO.43所示。Delta1是酿酒酵母转座子Ty1的5’UTR区一段序列，以SEQ ID NO.41表示。
右侧同源臂的获取过程为：对最后一个功能模块CYC1t-TPI1p-Xks1-TEF1t用OE-PCR方法添加Delta2片段形成右侧同源臂CYC1t-TPI1p-Xks1-TEF1t-Delta2。Delta2是酿酒酵母转座子Ty1的5’UTR区一段序列，以SEQ ID NO.42所示。OE-PCR体系为50μL：25μL ddH2O，10μL5*Buffer，5μL dNTP，7.5μL等摩尔CYC1t-TPI1p-Xks1-TEF1t与Delta2的DNA片段模板，1μL上游引物，1μL下游引物。反应条件为：95℃3min进行1轮；95℃30s，50-60℃退火30s，72℃延伸1min/2kb-1min/4kb，进行30轮；72℃延伸10min。柱回收PCR产物。
③将步骤①得到的不同的功能模块的酶切产物与步骤②得到的左侧同源臂与右侧同源臂产物混合在一起，等摩尔比加入(各0.15pmol)转化体系，准备共转化酿酒酵母。
所用的、经过优化的酵母转化过程如下：挑酿酒酵母菌（BY4741）的单菌落，30℃过夜培养；次日，接种过夜培养液到5ml YPD中（0.1OD600/ml）。30℃、220r/min培养4h，至OD600达到0.5，5000rpm离心2min，收集细胞；用1ml无菌水重悬并清洗细胞，同上离心，收集细胞；用1ml0.1M LiOAc重悬细胞，同上离心，收集细胞；将上清倒出，剩余的LiOAc重悬细胞，并转移到1.5ml EP管内，置于冰上形成感受态细胞；
准备转化体系：50%PEG3350620μL，1M LiOAc90μL，10mg/ml ssDNA40μL，DNA（步骤①与步骤②中得到两类DNA的混合物）50μL。将转化体系加入100ul感受态细胞中，吹吸均匀，涡旋10s；30℃培养箱中孵育30min。加入90ul DMSO，涡旋混匀10s；42℃热激20min3600rpm离心30s，收集细胞；吸出上清，加入400ul5mM CaCl2，重悬细胞，静置15min；3600rpm离心30s，吸出上清，在无菌水中重悬后涂板。
④48h后，对平板上生长的酵母菌落进行划线纯化，同时在SD-Ura的木糖平板上划线，见图6。
⑤48h之后，将同时能在SD-Leu平板上与SD-Ura木糖平板上生长起来的酵母菌落接入SD-Leu液体培养，培养1天。
⑥离心液体培养基里的酵母菌至1.5ml离心管中，提取酵母基因组。
⑦对酵母基因组进行PCR验证，以证明所有功能模块均存在于基因组中。对正确的酿酒酵母进行存菌。此时，所有单模块以一个整体成功整合入酵母基因组。
Claims (6)
1.一种标准化、高精度、通用的功能模块构建方法，包括如下步骤：
（1）将源基因添加具有酶识别与切割功能的标准化位点形成基因元件，将基因元件连入质粒pLD-Blunt中形成带有基因元件的质粒，进行序列验证；
（2）设计需要组合发挥功能的基因元件先后顺序，按照设计的先后顺序从带有基因元件的质粒中利用所述标准化位点调取基因元件，利用Bsa1酶切割不同的模块工具质粒，形成如下缺口：终止子1-启动子-AATG-缺口-TAAA-终止子2；将调取的不同的基因元件连入缺口，构建出不同的功能模块的质粒；所述不同的模块工具质粒是由不同的模块工具序列与空质粒pRS425K构成；所述模块工具序列为终止子1-启动子-AATGGGAGACC-紫色荧光蛋白基因amilCP的表达盒-GGTCTCCTAAA-终止子2；
（3）用下述两种方式之一种进行:
方式一：从所述不同的功能模块的质粒中利用酶切调取不同的功能模块，与经过酶切的酵母质粒载体共转化酿酒酵母，使不同的功能模块组合在一起，构建出标准化、高精度、通用的功能模块，存放于质粒中；
方式二：从所述不同的功能模块的质粒中利用酶切调取不同的功能模块，在第一个功能模块之前设置有左侧同源臂，在倒数第一个功能模块之后设置有右侧同源臂，共转化酿酒酵母，使不同的功能模块一同整合入酵母基因组，构建出标准化、高精度、通用的功能模块，其存放于基因组中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述源基因是从天然生物中克隆的基因或人工合成的基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述从天然生物中克隆的基因为酿酒酵母基因Xks1，毕赤酵母基因Xyl1，毕赤酵母基因Xyl2。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述人工合成的基因为SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特点是所述具有酶识别与切割功能的标准化位点是：GGTCTCN+AATG……基因……TAAA+NGAGACC；所述GGTCTCN与NGAGACC是Bsa1酶的识别位点。
6.根据权利要求1所述的方法，其特点是所述不同的模块工具序列中的终止子1，启动子和终止子2的分组选取如表2：
表2：
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