ES2586618T3 - Especies de levadura genéticamente modificadas, y procesos de fermentación que emplean levaduras genéticamente modificadas - Google Patents

Especies de levadura genéticamente modificadas, y procesos de fermentación que emplean levaduras genéticamente modificadas Download PDF

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Chris Miller
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Laura Ruohonen
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Abstract

Una célula de levadura genéticamente modificada que sobreexpresa una xiluloquinasa funcional y que tiene un gen de xilosa isomerasa exógeno funcional integrado en su genoma, en la que el gen de xilosa isomerasa exógeno es al menos 90% homólogo con SEC ID NO:162 o codifica una enzima xilosa isomerasa que es al menos 60% homóloga con SEC ID NO:163 y tiene una puntuación de identidad menor que 95% comparado con SEC ID NO:59 y una puntuación positiva menor que 97% comparado con SEC ID NO:59, y el gen de xilosa isomerasa está unido operablemente a secuencias de promotor y de terminador que son funcionales en la célula de levadura, y la célula de levadura modificada presenta además una deleción o alteración de un gen nativo que produce una enzima que cataliza la conversión de xilosa en xilitol.

Description

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menos de 10 mU/mg o 5 mU/mg.
“Delecionar o alterar” significa que la región codificadora completa del gen se elimina (deleción), o el gen o su región promotora y/o terminadora se modifica (tal como mediante deleción, inserción o mutación) de modo que el gen ya no produce una enzima activa o produce una enzima con una actividad muy reducida. La deleción o alteración puede realizarse por métodos de ingeniería genética, evolución forzada o mutagénesis y/o selección. En el caso del gen XR o de aldosa reductasa no específico, un método adecuado para ello es clonar las regiones flanqueantes cadena arriba y cadena abajo del gen (que puede incluir una porción de la región codificadora del gen), producir un vector que contenga los flancos clonados cadena arriba y cadena abajo, y transformar la célula hospedante con el vector. El vector puede contener otro material genético, tal como un gen marcador u otro gen que se inserte de modo deseable en el genoma de la célula hospedante en el locus del gen XR nativo o de aldosa no específico (tal como un gen XI, un gen XK, o un gen que permita a la célula producir un producto de la fermentación deseado, tal como un gen L-o D-LDH).
Un método para delecionar el gen XR o de aldosa reductasa no específico es transformar la célula hospedante con un vector que contenga regiones que sean homólogas con los flancos cadena arriba (5’) y cadena abajo (3’) del gen diana. Estas secuencias flanqueantes pueden obtenerse, por ejemplo, amplificando las regiones apropiadas mediante PCR utilizando cebadores diseñados de forma apropiada y ADN genómico como molde. Cualquiera de estas dos regiones puede incluir una porción de la región codificadora del gen diana, aunque el vector no debe contener la porción funcional completa del gen. Estas secuencias flanqueantes son en general secuencias de al menos 50 pares de bases, o al menos 100 o al menos 500 pares de bases. Aunque en teoría no hay un límite superior para la longitud de la secuencia flanqueante, tiene una longitud de preferiblemente hasta aproximadamente 4000 pares de bases, más preferiblemente hasta aproximadamente 1200 pares de bases. Las secuencias flanqueantes son cada una al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 98% y aún más preferiblemente al menos 99% homólogas con las correspondientes secuencias en el genoma de la célula. Estas secuencias flanqueantes pueden incluir las secuencias promotoras y terminadoras, respectivamente, del gen diana. El vector también puede contener uno o más módulos de marcadores de selección (con los promotores y terminadores asociados que sean necesarios) que están emplazados, de forma ventajosa, entre las regiones que son homólogas a los flancos cadena arriba y cadena abajo del gen diana. Este vector puede delecionar el gen diana en una recombinación homóloga, insertando el gen marcador de la selección en el locus del gen diana delecionado. El vector puede incluir, en lugar del módulo del marcador de selección o además de este, otro módulo de expresión, tal como un módulo de expresión de XI, y un módulo de L-o D-LDH, o un módulo de expresión de xiluloquinasa, todos los cuales pueden incluir promotores y terminadores asociados. También pueden diseñarse vectores que aprovechen acontecimientos de formación de bucles espontáneos, tales como los que se describen en el documento WO 03/102152.
La célula hospedante puede tener de modo natural o puede haberse modificado para que tenga una baja actividad xilitol deshidrogenasa. Esta baja actividad de la enzima xilitol deshidrogenasa, medida de la manera descrita en el siguiente ejemplo 6B, de forma adecuada es menor que 2 mU/mg o menor que 1 mU/mg. Si la célula hospedante contiene uno o más genes de xilitol deshidrogenasa que produzca unas actividades mayores de xilitol deshidrogenasa, uno o más de estos genes se altera o deleciona de modo adecuado. La deleción o alteración del gen XDH puede realizarse de una manera análoga a la descrita anteriormente con respecto a la deleción o alteración de la aldosa reductasa. La deleción puede realizarse incorporando los flancos cadena arriba y cadena abajo del gen XDH en un vector de transformación, en lugar de los flancos del gen XR o de aldosa reductasa no específico. Al igual que anteriormente, el vector puede incluir uno o más módulos de marcadores de selección y/o uno o más módulos de expresión distintos. La deleción o alteración preferiblemente logra una reducción de al menos 50% en la actividad enzimática, y más preferiblemente reduce la actividad xilitol deshidrogenasa hasta menos de 2 mU/mg o 1 mU/mg.
La célula modificada preferiblemente expresa una enzima xiluloquinasa que tiene una actividad de al menos 100 mU/mg, tal como al menos 300 mU/mg o al menos 500 mU/mg, medida como se describe en el siguiente ejemplo 5E. La enzima xiluloquinasa se denomina de diversa manera con el número EC 2.7.1.17 y sistemáticamente como ATP:D-xilulosa 5-fosfotransferasa. Su actividad en general es ATP + D-xilulosa = ADP + D-xilulosa 5-fosfato xiluloquinasa (XK). Puede lograrse la sobreexpresión, por ejemplo, por evolución forzada (bajo condiciones que favorezcan la selección de mutantes que sobreexpresen la enzima), mutagénesis, o mediante la integración de uno
o más genes de xiluloquinasa endógenos funcionales en el genoma de la célula hospedante. En este contexto, “exógeno” significa (1) que el gen XK no es nativo a la célula hospedante, (2) que el gen XK es nativo a la célula hospedante pero el genoma de la célula hospedante se ha modificado para proporcionar más copias funcionales del gen XK nativo, o (3) ambos (1) y (2). Los genes de xiluloquinasa adecuados incluyen genes de xiluloquinasa de levadura. Un ejemplo preferido de un gen XK adecuado es el gen XK de S. cerevisiae (ScXKS1). Una secuencia de nucleótidos para el gen ScXKS1 se identifica como SEC ID NO:83. La secuencia de aminoácidos deducida para las enzimas producidas por el gen ScXKS1 se identifica como SEC ID NO:84. Los genes XK adecuados incluyen los que son al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% homólogos con SEC ID NO:83. Los genes XK adecuados incluyen los que codifican enzimas que son al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% homólogas con SEC ID NO:84. Otros genes XK adecuados son nativos a K. marxianus o C. sonorensis, o son al menos 70%, 80%, 80%, 95%, 98% o 99% homólogos con cualquiera de estos.
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2,8 a aproximadamente 4,5.
En una fermentación tamponada, los productos de la fermentación ácidos, tales como el ácido láctico, son neutralizados a medida que se forman en la correspondiente sal lactato. Por tanto, la recuperación del ácido implica la regeneración del ácido libre. Esto se realiza generalmente retirando las células y acidulando el caldo de fermentación con un ácido fuerte, tal como ácido sulfúrico. Se forma un subproducto salino (yeso en el caso en que una sal de calcio es el agente neutralizante, y el ácido sulfúrico es el agente acidulante), que se separa del ácido. Entonces se recupera el ácido mediante técnicas, tales como una extracción líquido-líquido, una destilación, una absorción, etc., como se describe en T.B. Vickroy, vol. 3, capítulo 38 de Comprehensive Biotechnology (ed. M. Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta et al., FEMS Microbiol. Rev., 1995, 16:221-231; patentes de EEUU nº 4.275.234, 4.771.001, 5.132.456, 5.420.304, 5.510.526, 5.641.406, y 5.831.122, y el documento WO 93/00440.
El proceso de la invención puede realizarse de modo continuo, discontinuo, o en combinaciones de estos.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención, en los que el ejemplo 16 ilustra la presente invención, pero no pretenden limitar su alcance. Todas las partes y porcentajes son en peso a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1A: Construcción del plásmido que contiene el promotor de PGK1 de S. cerevisiae y el terminador Gal10 de S. cerevisiae (pNC2, figura 1); construcción del plásmido que contiene el promotor de PDC1 de S. cerevisiae y el terminador Gal10 de S. cerevisiae (pNC4, figura 2)
La secuencia de nucleótidos del promotor de PGK1 de S. cerevisiae (ScPGK1) se identifica como SEC ID NO:1. Esta secuencia se obtiene como un fragmento de restricción a partir de un plásmido patentado denominado pBFY004. Como alternativa, puede obtenerse mediante una amplificación con PCR utilizando el ADN cromosómico de S. cerevisiae como molde, y cebadores diseñados basados en SEC ID NO:1.
El terminador GAL10 de S. cerevisiae (ScGAL10) utilizado tiene la secuencia de nucleótidos identificada como SEC ID NO:2. Esta secuencia se obtiene como un fragmento de restricción a partir de un plásmido patentado denominado pBFY004. Como alternativa, puede obtenerse mediante una amplificación con PCR utilizando el ADN cromosómico de S. cerevisiae como molde, y cebadores diseñados basados en SEC ID NO:2.
El promotor de PDC1 de S. cerevisiae (ScPDC1) se amplificó con PCR utilizando los cebadores identificados como SEC ID NO:3 y SEC ID NO:4, utilizando el ADN cromosómico de la cepa GY5098 de S. cerevisiae (ATCC 4005098) como molde. El termociclado se realizó con 30 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 56 ºC, y 1 minuto a 72 ºC, seguido de una incubación final de 7 minutos a 72 ºC, utilizando la ADN polimerasa PfuTurbo (Stratagene, Madison, WI). La secuencia de nucleótidos del promotor ScPDC1 se identifica como SEC ID NO:5.
Se generó el plásmido pNC2 (figura 1) combinando el promotor ScPGK1 y el terminador ScGal10 sobre el vector de esqueleto pGEM5Z(+) (Promega, Wisconsin). El ScPGK1 y el ScGAL10 están separados en el vector resultante por una región de policonector con los sitios de restricción XbaI, EcoRI y BamHI para insertar genes concretos para ser expresados entre el promotor y el terminador de levadura. Un fragmento de restricción NotI de aproximadamente 1,2 kpb formado por el promotor ScPGK1 y el terminador ScGAL10 con sitios de multiclonación se identifica como SEC ID NO:6.
Se construyó el vector de expresión pNC4 que contiene un módulo de expresión en general de la misma manera, excepto que se utilizó el gen ScPDC1 en lugar del gen ScPGK1. El vector resultante (pNC4) se muestra en la figura
2. Un fragmento de restricción NotI de aproximadamente 1,3 kpb formado por el promotor ScPDC1 y el terminador ScGAL10 con sitios de multiclonación se identifica como SEC ID NO:7.
Ejemplo 1B: Inserción de un gen marcador de resistencia a G418 en pNC2 (ejemplo 1A, figura 1) para crear un plásmido en el que el gen G418 está unido operablemente con el promotor de PGK1 y el terminador ScGAL10 de S. cerevisiae (pVR22, figura 3)
El gen de resistencia a G418 se amplificó mediante PCR utilizando la polimerasa Pfu (Stratagene, Madison, WI) con los cebadores identificados como SEC ID NO:8 y SEC ID NO:9, utilizando el plásmido pPIC9K (Invitrogen, CA) como molde. El termociclado se realizó inicialmente incubando la mezcla de reacción durante 5 minutos a 95 ºC, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 49 ºC, y 2 minutos a 72 ºC, seguido de una incubación final durante 10 minutos a 72 ºC. El producto de la PCR se digirió con BamHI y XbaI, y se aisló un fragmento de 821 pb y se acopló a un fragmento BamHI-XbaI de aproximadamente 4303 pb de pNC2 (ejemplo 1A, figura 1). El plásmido resultante (pVR22, figura 3) tiene el promotor ScPGK1 y el terminador ScGAL10 unidos operablemente al gen de resistencia a G418.
Ejemplo 1C: Inserción de un gen marcador de resistencia a G418 en pNC4 (ejemplo 1A, figura 2) para crear un plásmido en el que el gen G418 está unido operablemente al promotor de PDC1 y al terminador ScGAL10 de S. cerevisiae (pVR29, figura 4)
El gen de resistencia a G418 se amplificó mediante PCR utilizando la polimerasa Pfu (Stratagene, Madison, WI) con
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los cebadores identificados como SEC ID NO:8 y SEC ID NO:9, utilizando el plásmido pVR22 (ejemplo 1B, figura 3) como molde. El termociclado se realizó inicialmente incubando la mezcla de reacción durante 5 minutos a 95 ºC, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 49 ºC, y 2 minutos a 72 ºC, seguido de una incubación final durante 10 minutos a 72 ºC. El producto de la PCR se digirió con BamHI y XbaI, y se aisló un fragmento de 821 pb y se acopló a un fragmento BamHI-XbaI de aproximadamente 4303 pb de pNC4 (ejemplo 1A, figura 2). El plásmido resultante, pVR29 (figura 4) contiene el promotor ScPDC1 y el terminador ScGAL10 unidos operablemente al gen de resistencia a G418.
Ejemplo 1D: Construcción de un vector (pBH5b, figura 5) que contiene las secuencias flanqueantes 5’ y 3’ del gen PDC1 de K. marxianus, y el gen G418 bajo el control del promotor ScPDC1 y el terminador ScGAL10
Un fragmento de ADN de 1254 pb inmediatamente cadena arriba del gen PDC1 de K. marxianus (KmPDC1) se amplificó mediante PCR con los cebadores identificados como SEC ID NO:10 y SEC ID NO:11, utilizando el plásmido pSO21 (descrito en la solicitud de patente publicada de EEUU 2004/029256A1) como molde. El termociclado se realizó incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 2 minutos a 94 ºC, después con 35 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 55 ºC, y 1,5 minutos a 72 ºC, seguido de una incubación final de 7 minutos a 72 ºC. El producto de la PCR se separó en un gel de agarosa al 0,8% y se aisló un producto de aproximadamente 1254 pb. El producto de la PCR y el plásmido pVR29 (ejemplo 1C, figura 4) se digirieron ambos con KpnI y SbfI, y se acoplaron para producir un vector de aproximadamente 6315 pb denominado pBH5a (figura 5). El plásmido pBH5a contiene el gen de resistencia a G418 unido operablemente al promotor ScPDC1 y al terminador ScGAL10, y un fragmento de ADN de aproximadamente 1240 pb homólogo al ADN inmediatamente cadena arriba del gen KmPDC1.
Un fragmento de ADN de 535 pb inmediatamente cadena abajo del gen KmPDC1 se amplificó mediante PCR con los cebadores identificados como SEC ID NO:12 y SEC ID NO:13, utilizando el plásmido pSO21 como molde. El termociclado se realizó incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 2 minutos a 94 ºC, después con 35 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 55 ºC, y 45 segundos a 72 ºC, seguido de una incubación final de 4 minutos a 72 ºC. El producto de la PCR se separó en un gel de agarosa al 0,8% y se aisló un producto de 535 pb. El producto de la PCR se digirió con SbfI y MluI, y el fragmento de 529 resultante se acopló con el fragmento SbfI-MluI de pBH5a para producir el plásmido pBH5b (figura 5). El plásmido pBH5b contiene secuencias correspondientes a las que flanquean el gen KmPDC1, es decir, una secuencia flanqueante cadena arriba de aproximadamente 1,2 kpb y una secuencia flanqueante cadena abajo de ADN de aproximadamente 0,5 kpb, con un único sitio SbfI ubicado entre ellas. El plásmido pBH5b también contiene el marcador de resistencia a G418 unido operablemente al promotor ScPDC1 y al terminador ScGAL10.
Ejemplo 1E: Construcción del vector que contiene un marcador de poli-his y el terminador CYC1 de S. cerevisiae (pVR73, figura 6); eliminación del gen marcador de la resistencia a G418 de pBH5b (ejemplo 1D, figura 5) para formar el vector pVR77 (figura 6)
Se diseñaron los cebadores identificados como SEC ID NO:14 y SEC ID NO:15 basados en el vector pYES6CT (Invitrogen, CA) para la amplificación de bases que contienen un sitio de clonación múltiple, un marcador de poli-his, y un terminador CYC1 de S. cerevisiae (ScCYC1). Los cebadores introducen sitios SbfI y BsmBI en el producto. Las condiciones de la PCR fueron 30 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 55 ºC, y 1 minuto a 68 ºC, seguido de una incubación final a 68 ºC durante 10 minutos utilizando la ADN polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen, CA). El producto de la PCR se purificó en columna, seguido de la adición de nucleótidos de adenina a los extremos 5’ de la clonación TA utilizando la ADN polimerasa Taq incubándose a 72 ºC durante 10 minutos. El producto de 507 pb entonces se clonó con TA en un vector de clonación de TA TOPOII (Invitrogen, CA), y se denominó pVR73 (figura 6). La inclusión del marcador de poli-his en este vector provoca que los genes clonados en el sitio SbfI exclusivo tengan el marcador de his condensado a la proteína expresada a partir de ese gen. Este marcaje de la proteína con el marcador de polihis permite una detección mediante transferencia Western relativamente rápida de la proteína utilizando el conjugado Ni-NTA (HRP) (Quiagen, EEUU) y para la purificación rápida del gen expresado utilizando columnas y resina quelante de Ni (Invitrogen, CA).
El plásmido pBH5b (ejemplo 1D, figura 5) se digirió con SphI, y un fragmento de aproximadamente 4,7 kpb que mantiene el promotor KmPDC1 y el terminador se volvió a acoplar consigo mismo para producir el plásmido pVR77 (figura 6). Así se elimina el marcador de selección del antibiótico G418 de pBH5b.
Ejemplo 1F: Construcción de un vector pVR78 (figura 6) que contiene la región flanqueante cadena arriba KmPDC1, un sitio de multiclonación, un marcador de poli-his, y el terminador ScCYC1
El plásmido pVR73 (ejemplo 1E, figura 6) se digirió con las enzimas SbfI y BsmBI para liberar un fragmento de 504 pb que contiene un sitio de multiclonación, un marcador de poli-his, y un terminador ScCYC1. El vector pVR77 se digirió utilizando las mismas enzimas para producir un fragmento de aproximadamente 4249 pb que contenía el esqueleto del vector y los flancos cadena arriba y cadena abajo de KmPDC1. Los dos fragmentos se acoplan para formar un plásmido de aproximadamente 4752 pb (pVR78, figura 6) que contiene el sitio de restricción SbfI exclusivo 184 pb desde el marcador de poli-his. Este proceso elimina la mayor parte de la región flanqueante cadena abajo de KmPDC1 del plásmido pVR78.
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Ejemplo 2B: Construcción del vector pCM17 (figura 10) que contiene el gen PXYLA reconstruido; mutagénesis dirigida específica de sitio para alterar las bases sobre el gen reconstruido para que coincida con la secuencia en la base de datos de GenBank
5 Se construyó un plásmido que contenía el gen PXYLA reconstruido (ejemplo 2A) acoplando un fragmento de aproximadamente 1,314 kpb producido en la ronda final de la construcción, con un vector TOPOII (Invitrogen, CA). El gen PXYLA reconstruido se diferencia de la secuencia de GenBank en cinco bases. Cada una de estas diferencias se corrigió utilizando un kit de mutagénesis dirigida a múltiples sitios (Stratagene, CA), utilizando este plásmido como molde. Se emplearon tres cebadores mutagénicos 5’-fosforilados purificados por PAGE o HPLC,
10 identificados como SEC ID NO:54, SEC ID NO:55 y SEC ID NO:56 para corregir cuatro de los errores. Los parámetros de ciclado térmico incluyen una etapa de desnaturalización de un minuto y una etapa de apareamiento de un minuto, seguido de una extensión de ocho minutos. Entonces se digirió la hebra parental formada durante la etapa de PCR añadiendo 1 l de la enzima DpnI a la mezcla al final del termociclado. La mezcla se incubó durante 1 hora a 37 ºC y después se utilizó para transformar células de E. coli XL10-Gold Ultracompetent suministradas con el
15 kit. La mezcla se cultivó en placas con Luria-Bertani + ampicilina (LBA) y se incubó a 37 ºC durante la noche. Entonces se repitió el protocolo de mutagénesis dirigida a múltiples sitios para remediar el quinto error. Se emplearon dos cebadores mutagénicos 5’-fosforilados purificados por PAGE o HPLC, identificados como SEC ID NO:57 y SEC ID NO:55. Dos transformantes se secuenciaron y mostraron 100% de homología con la secuencia de GenBank del gen PXYLA. Una de las construcciones se denominó pCM17 (figura 10). Las secuencias de
20 nucleótidos y de aminoácidos del gen PXYLA reconstruidas se identifican como SEC ID NO:58 y SEC ID NO:59.
Ejemplo 3A: Construcción del vector pCM14 (figura 11) que contiene el gen PXYLA bajo el control del promotor KmPDC1 y del terminador ScCYC1, y el gen de resistencia a la higromicina hph de E. coli bajo el control del promotor ScPDC1 y del terminador ScGAL10
El gen PXYLA se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores identificados como SEC ID NO:60 y SEC ID
25 NO:61, utilizando pCM17 (ejemplo 2B, figura 10) como molde. El termociclado se realizó con 35 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 55 ºC, 1,5 minutos a 72 ºC, seguido de una incubación final durante 8 minutos a 72 ºC utilizando la ADN polimerasa Pfx (Invitrogen, CA). El producto de la PCR se digirió con SbfI y se separó electoforéticamente en un gel de agarosa al 1,0%. Se aisló un producto de 1319 pb y se acopló a un fragmento de
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aproximadamente 3,5 kpb y se acopló en el vector de clonación TOPO pCRII para producir el plásmido pVR95 (figura 13).
Ejemplo 4B: Construcción del plásmido pCM19 (figura 14b) que contiene los flancos cadena arriba y cadenaabajo de KmXYL1, y el gen marcador de la resistencia a G418 bajo el control del promotor ScPDC1 y del terminador ScGAL10
Se diseñaron los cebadores identificados como SEC ID NO:69 y SEC ID NO:70 para amplificar un fragmento de aproximadamente 1,3 kpb del plásmido pVR95 (ejemplo 4A, figura 13). Este fragmento incluye la región promotora del gen KmXYL1, así como aproximadamente 300 pb de la región codificadora del gen. Estos cebadores se utilizaron para reacciones de termociclado con 50 ng de ADN plasmídico de pVR95 (ejemplo 4A, figura 13). El termociclado se realizó con 30 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 53 ºC, 1 minuto a 68 ºC, y una incubación final de 8 minutos a 68 ºC utilizando la ADN polimerasa Pfx (Invitrogen, CA). El producto de la PCR se separó electroforéticamente, se digirió con PstI y se acopló a pVR29 (ejemplo 1C, figura 4) que también se había digerido con PstI. El plásmido obtenido mediante este método se verificó para la orientación correcta del gen KmXYL1 y la región promotora en el vector pVR29. El plásmido se denominó pCM18 (figura 14a).
Se diseñaron los cebadores identificados como SEC ID NO:71 y SEC ID NO:72 para amplificar un fragmento de aproximadamente 1,1 kpb del plásmido pVR95. Este fragmento incluye una región cadena abajo del gen KmXYL1, más allá de su terminador. Estos cebadores se utilizaron para reacciones de termociclado con 50 ng de ADN plasmídico de pVR95. El termociclado se realizó con 30 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 59 ºC, 1 minuto a 68 ºC, y una incubación final de 8 minutos a 68 ºC utilizando la ADN polimerasa Pfx (Invitrogen, CA). Los cebadores identificados como SEC ID NO:73 y SEC ID NO:74 se emplearon para reacciones de termociclado con 50 ng del primer producto de la PCR descrito anteriormente para amplificarlo. El termociclado se realizó con 30 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 45 ºC, 1 minuto a 68 ºC, y una incubación final de 8 minutos a 68 ºC utilizando la ADN polimerasa Pfx (Invitrogen, CA). El producto de la PCR obtenido después del segundo termociclado se separó electroforéticamente, se digirió con ApaI y se acopló al plásmido pCM18 que también se había digerido con ApaI, para formar el vector pCM19 (figura 14b). El plásmido pCM19 contenía el flanco cadena abajo del gen KmXYL1 y el flanco cadena arriba del gen KmXYL1 (junto con aproximadamente 300 pb de la región codificadora del gen), separados por un módulo que contiene el gen G418 bajo el control del promotor ScPDC1 y del terminador ScGAL10. Se verificó la orientación correcta de la región cadena abajo de KmXYL1 con respecto al gen de resistencia a G418.
Ejemplo 4C: Construcción del auxótrofo para el uracilo de K. marxianus (CD683) sustituyendo un gen Ura3 funcional por un gen no funcional
El gen Ura3 de K. marxianus (KmUra3) se aisló utilizando el ADN genómico como molde y cebadores diseñados basándose en una secuencia de GenBank (nº de registro AF528508). Un fragmento de 804 pb se clonó en el vector pBluescript (Stratagene, Wisconsin) y pBSKura3Myra marcado (figura 15).
Este plásmido se digirió con EcoRV y se aisló un fragmento de aproximadamente 4 kpb que tiene el gen KmUra3 sin un fragmento EcoRV, y se reacopló para formar el plásmido pBSDeltaUra3Km (figura 15). Este plásmido tiene un gen no funcional (DeltaUra3). El plásmido se digirió utilizando KpnI y NotI y se empleó para transformar una cepa de tipo salvaje de K. marxianus. Los transformantes se seleccionaron en placas 5-FOA. Las colonias que crecieron sobre estas placas se seleccionaron utilizando cebadores diseñados en la misma región del gen DeltaUra3. También se diseñaron cebadores para aislar el gen completo y estos fragmentos se secuenciaron para indicar que este nuevo gen DeltaUra3 no funcional más corto había reemplazado al gen KmUra3 nativo real en los transformantes. Las cepas que se había transformado con éxito se denominaron CD683. La cepa CD683 no crece en placas Sc-Ura, lo cual indica que es un auxótrofo para el uracilo.
Ejemplo 4D: Generación de un mutante de K. marxianus (CD804) con el gen de la xilosa reductasa (KmXYL1)delecionado mediante la transformación de la cepa CD683 (ejemplo 4C) con el plásmido pCM19 (ejemplo 4B, figura 14b)
Se obtuvo un fragmento de aproximadamente 5,2 kpb que contiene las regiones cadena arriba y cadena abajo del gen KmXYL1 con un módulo de expresión de resistencia a G418 entre ambas, mediante la digestión de pCM19 con PvuII. Se utilizó este fragmento para transformar la cepa CD683 de K. marxianus utilizando métodos de electroporación convencionales. Las células transformadas se recuperaron y se cultivaron en placas con extracto de levadura 10 g/l, peptona de levadura 20 g/l, glucosa 50 g/l (YPD) + G418 50 g/ml, y se incubaron a 37 ºC durante 48-96 horas. Se realizó una réplica del cultivo de 96 transformantes que crecían sobre YPD + G418 50 g/ml sobre placas con YPX (extracto de levadura 10 g/l, peptona de levadura 20 g/l + xilosa 50 g/l) + G418 50 g/ml. De los 96 transformantes, 73 no crecieron en las placas con YPX + G418 50 g/ml, lo cual confirma su incapacidad para utilizar la xilosa como fuente de carbono. Esta incapacidad indica que el gen KmXYL1 funcional ha sido delecionado y sustituido por el módulo de G418 en una recombinación homóloga. Los transformantes que no pueden utilizar xilosa como fuente de carbono se denominan CD804.
La ausencia de un gen KmXYL1 funcional se verificó utilizando los cebadores de la PCR identificados como SEC ID NO:75 y SEC ID NO:76, que se diseñaron para amplificar mediante PCR el centro del gen KmXYL1. La presencia
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del gen G418 se verificó mediante PCR utilizando los cebadores identificados como SEC ID NO:77 y SEC ID NO:78. Los resultados indican que el fragmento del gen de resistencia al G418 se había integrado en el locus del gen KmXYL1. Otra PCR empleando un conjunto de cebadores identificados como SEC ID NO:79 y SEC ID NO:80 también confirma que el fragmento del gen de resistencia al G418 ha reemplazado al gen KmXYL1 nativo. Un análisis de la transferencia Southern también confirma que el gen de la xilosa reductasa ha sido eliminado de la cepa CD804.
Ejemplo 4E: Ensayo de la actividad de la enzima xilosa reductasa para las cepas CD683 (ejemplo 4C) y CD804 (ejemplo 4D)
Se inocularon distintos matraces de agitación amortiguados (capacidad de 250 ml) con las cepas CD683 (ejemplo 4C) y CD804 (ejemplo 4D). Los matraces se incubaron a 35 ºC con agitación a 250 rpm y se cultivaron durante la noche. El medio consistió en extracto de levadura 20 g/l, peptona 10 g/l, y dextrosa 100 g/l. Después de 18 horas, las células se sedimentaron mediante centrifugación a 4000 g durante 5 minutos, se lavaron con tampón fosfato de sodio 100 mM, y se resuspendieron en 0,5 ml de tampón de ruptura. El tampón de ruptura consiste en tampón fosfato de sodio 100 mM (pH 7,0), ditiotreitol 1 mM (DTT), 40 mg de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (disuelto en 500 l de DMSO), y 4 comprimidos de cóctel de inhibidores de proteasas (Roche, CA) en un volumen de 200 ml. Las células se lisaron mecánicamente utilizando esferas de vidrio (Invitrogen, CA) y se centrifugaron a 14.000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se retiró y se ensayó en una columna desaladora PD-10 según el protocolo del kit (Amersham Bioscience). La disolución de ensayo de la enzima XR consistió en tampón fosfato de sodio 100 mM (pH 7,0), NADPH 0,2 mM, D-xilosa 0,5 mM, en un volumen total de 1 ml, a la cual se le añadieron cantidades variables de la disolución enzimática, y se siguió la absorbancia a 340 nm. El uso del NADPH indica la actividad de la enzima reductasa. Se empleó una disolución de blanco sin xilosa para determinar la utilización de NADPH de fondo.
Se determinaron las proteínas totales utilizando el reactivo Advanced Protein Assay Reagent (Cytoskeleton nº ADV01) con BSA como patrón. La actividad de la enzima xilosa reductasa de la cepa CD683, según indica el consumo de NADPH, fue de 13,7 mU/mg de proteína. El consumo de NAPDH de la cepa CD804 es coherente con una actividad xilosa reductasa de 4,4 mU/mg de proteína, en lugar de la actividad cero esperada. Esta utilización de NADPH por CD804 se atribuye a una enzima aldosa reductasa no específica que está realizando alguna conversión de xilosa a xilulosa. Las cepas CD683 y CD804 se cultivan una junto a la otra en placas YPX. La cepa CD804 no mostró crecimiento en estas placas tras 4 días, mientras que la cepa CD683 creció sin problemas en estas placas.
Ejemplo 5A: Construcción del plásmido pVR67 (figura 16) que contiene un gen de xiluloquinasa de Saccharomyces cerevisiae (ScXKS1)
Se obtuvieron células de S. cerevisiae de the American Type Culture Collection (ATCC nº de registro 38626) y se cultivaron bajo condiciones convencionales. Se extrajo el ADN genómico de S. cerevisiae utilizando metodologías convencionales. Se realizaron reacciones de amplificación con PCR utilizando la polimerasa Pfx (Invitrogen, CA). Cada reacción contenía ADN genómico de S. cerevisiae a una concentración de 500 ng, cada uno de los cuatro dNTP (es decir, dATP, dGTP, dCTP y dTTP) a una concentración de 0,2 mM, y cada uno de los cebadores de la amplificación identificados como SEC ID NO:81 y SEC ID NO:82 a 1 M. El ciclado se realizó mediante una incubación inicial durante 10 minutos a 94 ºC, seguido de 35 ciclos que consisten en 15 segundos a 94 ºC, 15 segundos a 55 ºC, y 90 segundos a 68 ºC. Un fragmento de aproximadamente 1,8 kpb se purificó en gel utilizando procedimientos convencionales y se clonó en el vector de clonación TA (Invitrogen, CA). El plásmido resultante (pVR67, figura 16) se secuenció para verificar la secuencia del gen ScXKS1. El gen muestra una excelente homología con la secuencia conocida en GenBank (nº de registro X61377). La secuencia de nucleótidos del gen ScXKS1 se identifica como SEC ID NO:83. La secuencia de aminoácidos de la enzima codificada por este gen se identifica como SEC ID NO:84.
Ejemplo 5B: Construcción del plásmido pVR52 (figura 16) que contiene el promotor de TEF1 de S. cerevisiae (ScTEF1) y el terminador ScGAL10
El promotor de TEF1 de S. cerevisiae (ScTEF1) se clonó del vector pTEFZeo (Invitrogen, CA). Se emplearon los cebadores identificados como SEC ID NO:85 y SEC ID NO:86 para amplificar el promotor ScTEF1 e insertar los sitios de restricción XbaI y SstI. El producto de la PCR y el plásmido pNC2 (ejemplo 1A, figura 1) se digirieron con las enzimas XbaI y SstI y se acoplaron para obtener el plásmido pVR52 (figura 16).
Ejemplo 5C: Construcción del plásmido pVR103 (figura 18) que contiene el gen ScXKS1 bajo el control del promotor ScTEF1 y del terminador ScGAL10
El plásmido pVR67 (ejemplo 5A, figura 16) se digirió con XbaI y BamHI. Un fragmento de aproximadamente 1,8 kpb que contiene el gen ScXKS1 se purificó en gel. El plásmido pVR52 (ejemplo 5B, figura 16) también se digirió con XbaI y BamHI, y el fragmento obtenido se acopló al fragmento de aproximadamente 1,8 kpb de pVR67 para formar el vector plasmídico pVR96 (figura 16). Este plásmido contiene el gen ScXKS1 bajo el control del promotor ScTEF1 y del terminador ScGAL10. En este vector, el sitio de inicio ATG del gen ScXKS1 está a aproximadamente 130 pb del final del promotor ScTEF1. Para reducir esta distancia a aproximadamente 70-73 pb se diseñaron los cebadores
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identificados como SEC ID NO:87 y SEC ID NO:88 que pudiesen amplificar el promotor ScTEF1 del vector pTEFzeo con la distancia y los sitios de restricción correctos. Se empleó pTEFzeo (Invitrogen, CA) como molde. El termociclado se realizó con 30 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 57 ºC, y 30 segundos a 72 ºC, seguido de una incubación final de 4 minutos a 72 ºC utilizando el sistema de PCR Failsafe (Epicentre, Madison, WI). El producto de la PCR se separó en un gel de agarosa al 0,8% y se aisló un fragmento de 460 pb. Se realizó una segunda PCR para amplificar este fragmento utilizando los cebadores identificados como SEC ID NO:89 y SEC ID NO:90. El producto de la PCR se digirió con EcoRI y se acopló al plásmido pVR96 digerido con EcoRI (figura 16). El plásmido resultante (pVR102, figura 17) tiene dos promotores ScTEF1, y el segundo es el que controla el gen ScXKS1. La distancia entre el final del promotor y el ATG del gen es exactamente de 73 pb. El plásmido pVR102 se digirió con SphI y se acopló al pPUC19 digerido con SphI (New England Biolabs, EEUU). El plásmido resultante (pVR103, figura 18) se secuenció para verificar el gen ScXKS1 bajo el control del promotor ScTEF1 y del terminador ScGAL10.
Ejemplo 5D: Construcción del plásmido pVR104 (figura 19) que contiene el módulo de expresión ScXKS1 (depVR103, ejemplo 5C) junto con el módulo HisG-ScUra3-HisG (de pVR65, ejemplo 3B)
El plásmido pVR65 (ejemplo 3B, figura 19) se digirió con SphI, y los extremos 5’-fosfato del vector linealizado se desfosforilaron utilizando fosfatasa alcalina de camarón (Roche Diagnostics, EEUU) seguiendo el protocolo del fabricante.
El plásmido pVR103 (ejemplo 5C, figura 18) también se digirió con SphI, y un fragmento de 3,5 kpb que tiene el gen gen ScXKS1 bajo el control del promotor ScTEF1 y del terminador ScGAL10 se acopló al fragmento de pVR65 linealizado para obtener el plásmido pVR104 (figura 19).
Ejemplo 5E: Generación de un mutante de K. marxianus (CD805) que tiene una actividad del gen ScXKS1 sobreexpresada y el gen de la xilosa reductasa delecionado por la cepa transformante CD804 (ejemplo 4D)
Se empleó un fragmento PvuII de aproximadamente 6,8 kpb del plásmido pVR104 (ejemplo 5D, figura 19) para transformar la cepa CD804 (ejemplo 4D), utilizando métodos de electroporación convencionales. Las células transformadas se recuperaron en el medio YPD, se cultivaron en placa después de 4 horas sobre placas SC-Ura (Qbiogene, CA) y se incubaron a 37 ºC durante 48-72 horas. Los transformantes que crecieron sobre placas SC-Ura tras 72 horas se volvieron a sembrar en estrías sobre placas SC-Ura frescas. Los transformantes sembrados de nuevo en estrías se seleccionaron utilizando PCR de colonias.
Una única colonia positiva de la cepa transformada se inoculó en 50 ml de medio YPD y se incubó durante la noche a 37 ºC con agitación a 200 rpm. Se cultivaron 10 l sobre placas 5-FOA y se incubaron durante la noche a 37 ºC. Las colonias que crecieron fueron resistentes a 5-FOA y se prevé que han perdido su gen ScUra3 debido a la recombinación de las regiones HisG. Se realizó una PCR utilizando los cebadores identificados como SEC ID NO:91 y SEC ID NO:92 para amplificar una región de 700 pb para indicar un gen ScXKS1 intacto y aproximadamente 1 kb del gen HisG. Se diseñó un segundo conjunto de cebadores identificados como SEC ID NO:93 y SEC ID NO:94 para amplificar un producto de aproximadamente 1 kpb entre el ScXKS1 y el final del gen. Estos dos conjuntos de cebadores confirman que el gen ScXKS1 se ha integrado en el cromosoma de los transformantes y que el gen ScUra3 ha sido eliminado por la recombinación espontánea de la región HisG. Esta cepa se denominó CD805 y se volvió a ensayar para determinar si había una mayor actividad de proteína xiluloquinasa.
Se diseñaron los cebadores identificados como SEC ID NO:91 y SEC ID NO:93 para amplificar un producto de aproximadamente 2,6 kpb entre el promotor ScTEF1 y el final del gen ScXKS1. Se diseñaron los cebadores identificados como SEC ID NO:92 y SEC ID NO:95 para amplificar un producto de aproximadamente 1,7 kpb entre el gen ScXKS1 y el inicio del fragmento. Estos dos conjuntos de cebadores confirman que el gen ScXKS1 se ha integrado en el cromosoma de la cepa CD805.
Ensayo de la actividad xilulosaquinasa: Se inocularon diferentes matraces de agitación amortiguados (capacidad de 250 ml) con las cepas CD804 (ejemplo 4D) y CD805 (ejemplo 5E). Los matraces se colocaron a 35 ºC, se agitaron a 250 rpm y se cultivaron durante la noche. El medio consistió en extracto de levadura 20 g/l, peptona 10 g/l, y dextrosa 100 g/l. Después de 16 horas, las células se sedimentaron mediante centrifugación a 4000 g durante 5 minutos, se lavaron con tampón fosfato de sodio 100 mM, y se resuspendieron en 0,5 ml de tampón de ruptura. El tampón de ruptura consiste en tampón fosfato de sodio 100 mM (pH 7,0), DTT 1 mM, 40 mg de PMSF (disuelto en 500 l de DMSO), y 4 comprimidos de cóctel de inhibidores de proteasas (Roche) en un volumen de 200 ml. Las células se lisaron mecánicamente utilizando esferas de vidrio (Invitrogen, CA) y se centrifugaron a 14.000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se retiró y se ensayó en una columna desaladora PD-10 según el protocolo del kit (Amersham Bioscience). Se añadieron 10 l de extracto a una mezcla de 80 l de XuK equilibrada a 30 ºC (que contenía 61 mg de Na2ATP·3H2O, 10,0 ml de HEPES 0,1 M/KOH (pH 7,5), 1,2 ml de MgCl2 0,1 M (diluido hasta 16,0 ml), y 10 l de xilulosa 20 mM para un volumen total de 100 ml. Se sustituye a la xilulosa por agua para el blanco. Las reacciones se terminan hirviendo durante dos minutos y transladándose a hielo. Se añadieron 900 l de Hek2 (HEPES 40 mM/KOH (pH 7,5), MgCl2 10 mM, PEP 2,5 mM, y NADH 0,2 mM) y se centrifugó a 14.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se trasladó a una cubeta de espectrofotómetro, y se estableció la absorbancia en la línea
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ScCYC1. Otra copia estaba inmediatamente cadena debajo de este terminador ScCYC1, e incluye un promotor de 1026 pb que tiene la misma longitud que el promotor KmPDC1 nativo. A este promotor le falta la región de 142 pb del gen cadena arriba y también aproximadamente 68 pb en el extremo 5’, comparado con el promotor en pCM29 y la primera copia. La segunda copia también está bajo el control de un terminador ScCYC1. Inmediatamente cadena debajo de este segundo terminador ScCYC1 está el promotor KmPDC1 nativo de 1026 pb, seguido del gen KmPDC1 nativo.
Ejemplo 8C: Análisis enzimático de xilosa isomerasa, xilosa reductasa, xilitol deshidrogenasa y xiluloquinasa de CD861 (ejemplo 8B)
Se inocularon diferentes matraces de agitación amortiguados (capacidad de 250 ml) con CD806 (ejemplo 6B) y CD861 (ejemplo 8B). Los matraces se incubaron a 30 ºC, y se cultivaron durante la noche con agitación a 250 rpm. El medio consistió en extracto de levadura 20 g/l, peptona 10 g/l, y dextrosa 100 g/l, suplementado con G418 300 g/ml e higromicina 150 g/ml. Las células se lisaron utilizando una disolución Y-PER (Pierce-Rockford, IL), seguido de una desalación utilizando columnas PD-10 (Amersham Biosciencies, Piscataway, NJ). Una disolución de ensayo que consistía en TES-NaOH 100 mM, xilosa 250 mM, MgCl2 10 mM, NADH 0,6 mM, 1 U de SDH (Sigma) (pH 7,0) se llevó a 1,0 ml con la adición de 100 l del extracto celular. Se determinó la actividad xilosa isomerasa utilizando un blanco con la misma disolución de ensayo, solo que sin xilosa. La actividad xilosa isomerasa para la cepa CD806 fue cero, mientras que para la cepa CD861 fue de 1,07  0,21 U/mg del extracto bruto. Esto verifica que la cepa CD861 contiene un gen de xilosa isomerasa funcionando.
También se realizaron ensayos de xilosa reductasa, xilitol deshidrogenasa y xiluloquinasa para verificar la actividad/pérdida de actividad en la cepa final. La cepa CD861 (ejemplo 8B) y la cepa CD683 (ejemplo 4C) se cultivaron por separado durante la noche en medio que consistía en extracto de levadura 20 g/l, peptona 10 g/l, y dextrosa 100 g/l (suplementado con G418 300 g/ml e higromicina 150 g/ml para la cepa CD861). Las células se lisaron utilizando la disolución Y-PER. Se determinaron las proteínas totales utilizando el reactivo Advanced Protein Assay Reagent (Cytoskeleton nº ADV01) con BSA como patrón. La actividad de la enzima xilosa reductasa de la cepa CD861 fue de 260  41,8 mU/ml frente a 516,5  10,6 mU/ml en la cepa CD683. La reducción en aproximadamente 50% de la actividad indica la deleción del gen de la xilosa reductasa, atribuyéndose la actividad medida a una enzima aldosa reductasa no específica que realiza algo de conversión de xilosa a xilulosa. La actividad de la enzima xilitol deshidrogenasa fue de 12,4  4,4 mU/ml para la cepa CD861 frente a 110,4  7,2 mU/ml para la cepa CD683. La actividad de la enzima xiluloquinasa fue de 370,5  147,6 mU/ml para la cepa CD861 frente a 44,8  8,2 mU/ml para la cepa CD683.
Ejemplo 8D: Análisis cinético del gen PXYLA en la cepa CD861 (ejemplo 8B)
Una única colonia de la cepa CD861 se inoculó para un crecimiento durante la noche en medio que consistía en extracto de levadura 10 g/l, peptona 20 g/l, y dextrosa 100 g/l. Las células se recolectaron mediante centrifugación, se lavaron una vez con 10 ml de fosfato de sodio 100 mM, PMSF 1 mM (pH 7,0), y se volvieron a centrifugar. A esto se le añadieron 2 ml de disolución Y-PER, se resuspendió con cuidado y la disolución celular se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación intermitente. Las células se sedimentaron mediante centrifugación y el sobrenadante se desaló utilizando columnas PD-10 (Amersham Biosciences). Se realizaron ensayos enzimáticos como se describe en el ejemplo 8C, siendo la única diferencia que se cambia el sustrato a xilosa 0,05-10 mM. Se obtuvieron la Km y la Vmax a partir de gráficas de Michaelis-Menten, que produjeron una correspondiente Vmax de aproximadamente 1,8 con una correspondiente Km de xilosa 2,2 mM. Una gráfica de Linweaver-Burk produjo una correspondiente Vmax de aproximadamente 1,0 con una correspondiente Km de xilosa 1,2 mM.
Ejemplo 8E: Estudios de inhibición de la actividad PXYLA en la cepa CD861 (ejemplo 8B) utilizando xilitol
La cepa CD861 se cultivó en medio de xilosa que contenía diversas concentraciones de xilitol, un inhibidor de la xilosa isomerasa conocido. La Km para la enzima xilosa isomerasa se duplica cuando los niveles de xilitol aumentan de 0 a 0,25 mM, y vuelven a duplicarse cuando los niveles de xilitol aumentan hasta 0,50 mM.
Ejemplo 8F: Tolerancia al pH del gen PXYLA en la cepa CD861 (ejemplo 8B)
Se inoculó una única colonia de CD861 para el crecimiento durante la noche en medio que consistía en extracto de levadura 10 g/l, peptona 20 g/l, y dextrosa 100 g/l. Las células se recolectaron mediante centrifugación, se lavaron una vez con 10 ml de fosfato de sodio 100 mM, PMSF 1 mM (pH 7,0), y se volvieron a centrifugar. A esto se le añadieron 2 ml de disolución Y-PER, se resuspendió con cuidado y la disolución celular se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación intermitente. Las disoluciones de ensayo de duplicación consistieron en TES-NaOH 100 mM, MgCl2 10 mM, NADH 0,6 mM, xilosa 250 mM y 1 U de SDH, respectivamente, ajustadas a pH 7,0, 6,6, 5,9, 4,6 y 3,8 utilizando ácido láctico 5 M (Sigma, EEUU) en un volumen de 900 l. A esto se le añadieron 100 l de la enzima o de una dilución de esta hasta un volumen final de 1 ml. La actividad enzimática se midió como en el ejemplo 8C. La actividad óptima se obtuvo a pH 6,5. A pH 5,9, la proteína mantiene 45% de la actividad máxima.
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CD896 sobre YP + xilosa 50 g/l + carbonato de calcio 23 g/l bajo condiciones de producción anaerobias produjo ácido L-láctico 10 g/l en las primeras 24 horas, tras lo cual el consumo de xilosa se detuvo.
Ejemplo 11A: Construcción de plásmidos duplicados que contienen el gen PXYLA reconstruido con la cola de poli-his codificada (pCM31, figura 23) y sin la cola de poli-his codificada (pVR118, figura 24), junto con el gen ScUra3 sin las repeticiones His flanqueantes
Este experimento se diseñó para aclarar el efecto del marcador de poli-his sobre la actividad del gen PXYLA reconstruido. Se digirieron 5 g de pCM14 (ejemplo 3A, figura 11) con SphI y se separaron electroforéticamente sobre un gel de agarosa al 1,0%. Se aisló un producto de aproximadamente 5889 pb y se acopló a un fragmento de 1450 pb obtenido digiriendo el plásmido pVR113 (ejemplo 10A, figura 22) con SphI, para formar un plásmido de aproximadamente 7339 pb (pCM31, figura 23). El plásmido pCM31 contiene el gen PXYLA con la cola de poli-his y bajo el control del promotor KmPDC1 y del terminador ScCYC1, y el módulo de expresión ScUra3. Por otra parte, se digirieron 5 g del plásmido pCM29 (ejemplo 8A, figura 21) con SphI, y se separaron electroforéticamente sobre un gel de agarosa al 1,0%. Se aisló un producto de aproximadamente 5892 pb y se acopló a un fragmento de 1450 pb obtenido digiriendo el plásmido pVR113 con SphI para formar un plásmido de aproximadamente 7352 pb (pVR118, figura 24). El plásmido pVR118 es similar al plásmido pCM31 pero contiene un codón de fin que evita la codificación de la cola de poli-his.
Ejemplo 11B: Generación de cepas mutantes de K. marxianus que contienen el gen PXYLA reconstruido con el marcador de poli-his (CD929) y sin el marcador de poli-his (CD931), junto con el gen ScUra3 sin las repeticiones His flanqueantes, mediante la transformación de la cepa CD806 (ejemplo 6B) con los plásmidospCM31 (ejemplo 11A, figura 23) y pVR118 (ejemplo 11A, figura 24)
Una única colonia de la cepa CD806 de K. marxianus (ejemplo 6B) se transformó con el plásmido pCM31 utilizando métodos de electroporación convencionales. Las células transformadas se recuperaron del medio YPD y se cultivaron después de 4 horas sobre placas Sc-Ura. Se verificó mediante PCR que dos transformantes contenían el gen PXYLA reconstruido (con el marcador poli-his codificado) y que sobreexpresaban el gen ScXKS1, y también se confirmaron las deleciones de los genes KmXYL1 y KmXYL2. Uno de estos transformantes se denominó cepa CD929.
La cepa CD806 de K. marxianus se transformó con el plásmido pVR118 utilizando métodos de electroporación convencionales. Un transformante, que mediante PCR se verificó que contenía el gen PXYLA reconstruido (sin el marcador de poli-his codificado) y que sobreexpresaba el gen ScXKS1, y que tenía las deleciones de los genes KmXYL1 y KmXYL2, se denominó cepa CD931.
Un paseo genómico de la cepa CD931 demuestra que el gen PXYLA se había integrado dos veces, de la misma manera en que se describió para la cepa CD861 (ejemplo 8B).
Ejemplo 11C: Caracterizaciones con matraces de agitación de las cepas CD929 y CD931 (ejemplo 11B)
Se inocularon por separado colonias individuales de CD929 y CD931 (ejemplo 11B) en 100 ml de extracto de levadura 10 g/l, peptona 20 g/l, glucosa 70 g/l, G418 300 g/ml + higromicina 150 g/ml en un matraz de agitación amortiguado de 250 ml. Los cultivos se incubaron durante la noche a 35 ºC con 250 rpm. Las células se inocularon en tubos Falcon de 50 ml que contenían 45 ml de medio de producción (extracto de levadura 10 g/l, peptona 20 g/l, xilosa 50 g/l, Tes-NaOH 100 mM, MgCl2 10 mM, pH 7,0) hasta una DO de 0,2. Los tubos se colocaron a 37 ºC y 250 rpm, se tomaron muestras a intervalos aleatorios y se analizaron mediante HPLC. La cepa CD929 produjo EtOH 1,7 g/l y acumuló xilosa 1,1 g/l. La cepa CD931 produjo EtOH 15,2 g/l y acumuló xilulosa a 4,5 g/l. La actuación relativa de estas cepas indica que la formación de etanol es aproximadamente nueve veces mayor cuando el gen de la xilosa isomerasa no contiene el marcador de poli-his. De forma similar, la formación de xilulosa aumenta en cuatro veces cuando la cola de poli-his está ausente.
Ejemplo 12A: Reinserción del gen KmXYL2 en la cepa CD861 (ejemplo 8B) mediante la transformación con elplásmido pCM52 (figura 25); evaluaciones con matraces de agitación de los transformantes resultantes
El gen KmXYL2, junto con 982 pb del flanco 5’ y 200 pb del flanco 3’ se amplificó a partir de ADN genómico de una cepa de K. marxianus de tipo salvaje, utilizando los cebadores identificados como SEC ID NO:116 y SEC ID NO:117. Estos cebadores introducen sitios de restricción SacII. El producto de la PCR resultante se digirió con SacII y se acopló a un plásmido tratado con fosfatasa alcalina de camarón digerido de modo similar pVR113 (ejemplo 10A, figura 22). El plásmido resultante se denominó pCM52 (figura 25). Se utilizaron los cebadores identificados como SEC ID NO:118 y SEC ID NO:119 para seleccionar pCM52. El gen KxXYL2 amplificado se secuenció y se descubrió que contenía dos errores, uno de los cuales es silencioso y el otro provoca un cambio del aminoácido 85VI.
El plásmido pCM52 se digirió con PvuII y se transformó en la cepa CD861 (ejemplo 8B) utilizando métodos de electroporación convencionales. Los transformantes se cultivaron en placas Sc-Ura y se incubaron a 37 ºC. Se utilizaron los cebadores identificados como SEC ID NO:104 y SEC ID NO:105 para amplificar la región codificadora del gen KmXYL2. Se utilizaron los cebadores identificados como SEC ID NO:120 y SEC ID NO:121 para amplificar
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