BRPI0409954B1 - espécies leveduras geneticamente modificados e processos de fermentação utilizando levedura geneticamente modificada - Google Patents

Abstract

"espécies leveduras geneticamente modificadas e processos de fermentação utilizando levedura geneticamente modificada". células leveduras são transformadas com um gene xilose isomerase exógeno. modificações genéticas adicionais acentuam a capacidade das células transformadas para fermentar xilose a etanol ou outros produtos de fermentação desejados. essas modificações incluem a deleção de gene(s) aldose redutase não-específicos ou específicos, a deleção de gene(s) xilitol desidrogenase e/ou a superexpressão de xiluloquinase.

Description

"ESPÉCIES LEVEDURAS GENETICAMENTE MODIFICADAS E PROCESSOS DE FERMENTAÇÃO UTILIZANDO LEVEDURA GENETICAMENTE MODIFICADA" Essa invenção está relacionada a certas espécies leveduras geneticamente modificadas geneticamente modificadas.

Devido à gradual depleção dos suprimentos mundiais de petróleo e de gás natural, existe um desejo por parte dos paises importadores de petróleo de reduzir suas dependências de fontes externas de petróleo, e um desejo para estabelecer uma base mais sustentável para economia, muitos esforços têm sido empenhados na produção de combustíveis e de produtos químicos orgânicos e plásticos provenientes de suprimentos alternativos. Os processos de fermentação oferecem a possibilidade de produzir uma variedade de combustíveis e de produtos químicos provenientes de fontes açúcar naturalmente ocorrentes. Por exemplo, o etanol é produzido em quantidade significativa através da fermentação de glicose, muito tipicamente glicose obtida por hidrólise: de amido de milho. Uma espécie levedura Saccharomyces cerevisiae, é um biocatalisador usual para a fermentação de glicose a etanol.

Esses açúcares representam uma fonte de carbono relativamente cara. A biomassa; isto é, hidrolisato de matéria vegetal, oferece a possibilidade de ser uma fonte particularmente barata de carbono. A biomassa consiste principalmente de celulose e hemi-celulose. A celulose pode ser quebrada na forma de açúcares hexose, tipicamente glicose. A maioria das leveduras, incluindo S.cerevisiae, metabolizam açúcares hexose de modo muito eficiente. A hemi-celulose, por outro lado, é rica em açúcares pentose tal como xilose, de modo que a eficiente utilização do carbono requer que esses açúcares pentose sejam também metabolizados. Muito poucas leveduras metabolizam de modo eficiente a xilose a etanol ou a outros produtos desejáveis de fermentação. Desse modo, a fim de explorar o completo potencial econômico oferecido mediante utilização de fontes carbono de biomassa, é necessário prover um biocatalisador que possa converter de modo eficiente a xilose aos desejáveis produtos de fermentação.

Diversas bactérias são capazes de metabolizar xilose em produtos de fermentação, mas estas geralmente produzem uma mistura de produtos, ao invés de um único produto predominante como é usualmente desejado. Os subprodutos usuais são algumas vezes tóxicos para a bactéria. Apesar de certas bactérias terem sido metabolicamente produzidas por engenharia para realizarem fermentações homoetanólicas, as .bactérias tendem a se desempenharem de modo deficiente em ambiente hostil de hidrolisatos lignocelulósicos, os quais se constituem em uma fonte comum de substratos ricos em xilose.

Algumas espécies leveduras tais como S.cerivisiae são conhecidas por fermentar em açúcares hexose predominantemente em etanol, ao invés das misturas de produtos tipicamente produzidas por bactérias. Algumas leveduras possuem outras características que as tornam boas candidatas para vários tipos de processos de fermentação, tais como resistência a ambientes de baixo pH, resistência a certos co-produtos de fermentação tais como ácido acético e furfural, e resistência ao etanol propriamente. A maioria das espécies de leveduras metabolizam xilose (senão todas) através de uma rota complexa, na qual a xilose é primeiramente reduzida a xilitol através de uma enzima xilose redutase (XR). 0 xilitol é em seguida oxidado a xilulose através de uma enzima xilitol desidrogenase (XDH) . A xilulose é em seguida fosforilada através de uma enzima XK, Essa via opera de modo ineficiente em espécies leveduras porque ela introduz um desequilíbrio redox na célula. A etapa xilose-a-xilitol utiliza NADH como um cofator, enquanto que a etapa a etapa xilitol-a-xilulose utililza NADPH como um cofator. Outros processos precisam operar para restaurar o desequilíbrio redox dentro da célula. Isso freqüentemente significa que o organismo não pode crescer anaerobicamente sobre xilose ou outro açúcar pentose.

Apesar de tudo, têm sido feitas tentativas para introduzir genes XR e XDH exógenos em espécies de leveduras tais como S.cerevisiae a fim de conseguir a conversão de xilose a etanol. Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5.866.382, WO 95/13362 e WO 97/42307. A levedura produzida por engenharia não produz etanol de modo eficiente.

Outros organismos podem isomerizar xilose na forma de xilulose e em seguida se fosforilam a xilulose a xilulose 5-fosfato, que em seguida é ainda metabolizada através da via de carbono central da célula. A isomerização é promovida através de uma enzima catalítica, xilose isomerase (XI) e a fosforilação é catalisada por uma enzima xiluloquinase (XK). Essa via é comum em bactérias, mas relativamente raro em espécies eucarióticas tais como leveduras. Ele não cria o desequilíbrio redox criado na via xilose-a-xilitol-a-xilulose, e desse modo é, em princípio, um mecanismo anaeróbico mais eficiente. Um fungo anaeróbico, Piromyces sp. E2 (ATCC 76762), é conhecido possuir um gene que expressa uma enzima XI ativa.

Entretanto, nenhuma das espécies de levedura recombinantes ou do tipo selvagem teve a capacidade para produzir de modo eficiente produtos de fermentação a partir de xilose ou de outros suprimentos de açúcar pentose. Uma tentativa para introduzir o gene Piromyces sp. E2 XI em S.cerevisiae resultou em crescimento muito baixo em xilose e não resultou em produção importante de etanol. Ver, Kuyper e outros, "High-Level Functional Expression of a Fungai Xylose Isomerase: The Key to Efficient Ethanolic Fermentation of Xylose by Saccharomyc.es Cerevisiae?", FEMS Yeast Research 1574 (2003) 1-10, e WO 03/062430A1.

Uma espécie levedura que fermente xilose e outros açúcares pentose eficientemente em um desejado produto de fermentação é, portanto, muito desejável.

Em um aspecto, essa invenção é uma célula de levedura geneticamente modificada que possui um gene xilose isomerase exógeno, funcional, operativamente ligado a seqüências promotoras e terminadoras que são funcionais na célula de levedura, e a célula de levedura modificada possui, adicionalmente, uma deleção ou interrupção de um gene nativo que codifica uma enzima que catalisa a conversão de xilose a xilitol.

Em um segundo aspecto, essa invenção é uma célula de levedura geneticamente modificada do gênero Kluyveromyces ou Candida, que possui integrado dentro de seu genoma um gene xilose isomerase exógeno, funcional, onde o gene xilose isomerase exógeno está operativamente ligado a seqüências promotoras e terminadoras que são funcionais na célula de levedura.

Em um outro aspecto, essa invenção é uma célula de levedura geneticamente modificada que possui um gene de xilose isomerase exógeno, funcional, onde o gene de xilose isomerase exógeno está operativamente ligado a seqüências promotoras e terminadoras que são funcionais na célula de levedura, e que, adicionalmente, contêm um gene xiluloquinase exógeno, funcional, operativamente ligado a seqüências promotoras e terminadoras que são funcionais na célula de levedura.

Em ainda um outro aspecto, essa invenção é uma célula de levedura geneticamente modificada que possui uma deleção ou interrupção de um gene nativo, funcional, que produz uma enzima que catalisa a reação de xilitol a xilulose ou de xilulose a xilitol.

Em um outro aspecto, essa invenção é uma célula de levedura geneticamente modificada que possui uma deleção ou interrupção de um gene nativo que produz uma enzima que catalisa a conversão de xilose a xilitol.

Em ainda um aspecto adicional, essa invenção é um processo de fermentação no qual uma célula de qualquer dos aspectos anteriores é cultivada sob condições de fermentação em um caldo de fermentação que inclui um açúcar pentose. A Figura 1 é um diagrama que descreve o plasmideo pNC2 . A Figura 2 é um diagrama que descreve o plasmideo pNC4 . A Figura 3 é um diagrama que descreve o plasmideo pVR22. A Figura 4 é um diagrama que descreve o plasmideo pVR2 9. A Figura 5 é um diagrama que descreve os plasmideos pBH5a e pBH5b. A Figura 6 é um diagrama que descreve a montagem do plasmideo pVR78 a partir dos plasmideos PVR73 e pVR77. A Figura 7 é um diagrama que descreve o plasmideo pCM3. A Figura 8 é um diagrama que descreve o plasmideo pPSl. A Figura 9 é um diagrama que descreve o plasmideo pCM9. A Figura 10 é um diagrama que descreve o plasmideo pCMl7. A Figura 11 é um diagrama que descreve o plasmideo pCMl4. A Figura 12 é um diagrama que descreve o plasmideo pCM28. A Figura 13 é um diagrama que descreve o plasmideo pVR95. A Figura 14a e 14b são diagramas que descrevem os plasmideos pCM18 e pCM19. A Figura 15 é um diagrama que descreve os plasmideos pBSKura3Km e pBSDeltaüra3KM. A Figura 16 é um diagrama que descreve os plamsideos pVR52, pVR67 e pVR96. A Figura 17 é um diagrama que descreve o plasmideo pVR102. A Figura 18 é um diagrama que descreve o plasmideo pVRl03. A Figura 19 é um diagrama que descreve os plasmideos pVR65 e pVR104. A Figura 20 é um diagrama que descreve os plasmideos pCM21 e pCM23. A Figura 21 é um diagrama que descreve o plasmideo pCM2 9. A Figura 22 é um diagrama que descreve o plasmideo pVRl13. A Figura 23 é um diagrama que descreve o plasmideo pCM31. A Figura 24 é um diagrama que descreve o plasmideo pVR118. A Figura 25 é um diagrama que descreve o plasmideo pCM52. A Figura 26 é um diagrama que descreve o plasmideo pCM55. A Figura 27 é um diagrama que descreve o plasmideo pCM58. A Figura 28 é um diagrama que descreve o plasmideo pMI409. A Figura 30 é um diagrama que descreve o plasmideo pMI410. A Figura 31 é um diagrama que descreve o plasmideo pMI412. A Figura 32 é um diagrama que descreve o plasmideo pMI4 03. A Figura 33 é um diagrama que descreve o plasmideo pMIi417. A Figura 34 é um diagrama que descreve o plasmideo pMI425. A Figura 35 é um diagrama que descreve o plasmideo pS091. A Figura 36 é um diagrama que descreve o plasmideo pS099. A Figura 37 é um diagrama que descreve o plasmideo pS08 9. A Figura 38 é um diagrama que descreve o plasmideo pS096. A Figura 39 é um diagrama que descreve o plasmideo pS057. A Figura 407 é um diagrama que descreve o plasmideo pCM48.

Uma levedura geneticamente modificada da invenção é produzida mediante realizar certas modificações genéticas à célula de levedura hospedeira.

Uma adequada célula de levedura hospedeira contém pelo menos um gene nativo que produz uma enzima ativa que é capaz de catalisar a conversão de D-xilose a xilitol. Esta pode ser especifica para a redução de xilose—>xilitol, ou pode ser não especifica (isto é, operar sobre uma gama de açúcares pentose) . As enzimas produzidas por tais genes são referidas de modo variado pelo número EC 1.1.1.21, e formalmente como alditol:NAD(P) 1-oxidoredutase. A enzima codificada por tais genes possui de modo geral a seguinte atividade: D-xilose + NAD(P)H = xilitol + NAD+ (isto é, pode utilizar ou NADPH ou NADH como cofatores redox, ou ambos). Um gene que expressa uma enzima xilose redutase é aqui referido como um "gene xilose redutase", ou um "gene XR". Em alguns casos, genes XR específicos são aqui designados genes "XYL1". 0 termo "nativo" é utilizado aqui com respeito aos materiais genéticos (por ex., um gene, promotor ou terminador) que são encontrados (à parte das mutações indivíduo-para-indivíduo que não influenciem a sua função) dentro do genoma de células não modificadas daquelas espécies de levedura.

Uma célula de levedura hospedeira capaz de converter D-xilitol a xilitol irá ter geralmente a capacidade nativo para também converter xilitol a D-xilulose. Isto é geralmente conseguido mediante expressar uma enzima xilitol desidrogenase (XDH) que está codificada por um gene referido aqui como "gene xilitol desidrogenase" ou um gene "XDH". Enzimas codificadas por tais genes são referidas de modo variado pelo número EC 1.1.1.9, comumente como xilitol desidrogenase e sistematicamente uma xilitol:NAD+ 2-oxidorredutase (formadora de D-xilulose). Esses genes possuem geralmente a seguinte atividade: xilitol + NAD(P)+ = D-xilose + NAD(P)H (embora NAD+ seja o substrato bem mais preferido, alguns utilizam NADP+). Genes XDH específicos são designados aqui como genes "XYL2". Uma célula hospedeira adequada possui um ou mais genes nativos que produzem uma enzima funcional aldose redutase ou xilose redutase e uma enzima funcional XDH. Uma enzima é "funcional" dentro do contexto dessa invenção se ela é capaz de realizar a sua função usual ou pretendida. Um gene é "funcional" dentro do contexto dessa invenção se ele expressa uma enzima funcional.

Uma outra célula de levedura hospedeira adequada possui a capacidade de transportar xilose através de toda a extensão de sua parede ou membrana celular.

Uma outra célula de levedura hospedeira adequada é uma que cresce naturalmente em xilose, tal como uma que possui uma via ativa natural de xilulose-5-fosfato para gliceraldeído-3-fosfato. Nessa invenção, a via de xilulose-5-fosfato para gliceraldeído-3-fosfato é considerada ativa se pelo menos 10% dos açúcares baseados em glicose são metabolizados pela célula do tipo selvagem através da via de hexose monofosfato. Preferivelmente, pelo menos 20, mais preferivelmente pelo menos 30%, especialmente pelo menos 40% da ribulose-5-fosfato é metabolizado através dessa via. Células hospedeiras adequadas incluem, por exemplo, células levedura Kluyveromyces, Candída, Pichia, Hansenula, Trichosporon, Brettanomyces, Pachysolen e Yamadazyma. Espécies de levedura de particular interesse incluem K.marximanus, K.lactis, K. thermotolerans, C. sonorensis, C.methanosorbosa, C.diddensiae, C.parapsilosis, C.neodentra, C.Balnkii, C.entomophila, C.sceatae, Pachysolen tannophilus e Pichia stipitis são exemplos de células de levedura que crescem em xilose. Elas possuem uma via natural xilulose-5-fosfato para gliceraldeido-3-fosfato, genes funcionais naturais de aldose e/ou xilose redutase, genes ativos de xilitol desidrogenase, e capacidade natural para transportar xilose através da parede ou membrana celular. Células hospedeiras preferidas incluem aquelas das espécies K.marxianus, K.lactis, K. thermotolerans, C.sonorensis e C.methanosorbosa.

A célula hospedeira pode conter modificações genéticas além daquelas especificamente descritas aqui. Por exemplo, a célula hospedeira pode ser geneticamente modificada para produzir (ou não produzir) um tipo particular de produto de fermentação mediante metabolização adicional de xilulose-5-fosfato e/ou gliceraldeido-3-fosfato. Exemplos específicos de tais modificações incluem a deleção ou interrupção de um gene piruvato descarboxilase (PDC) natural, e a inserção de genes exógenos tais como do gene da L-lactato desidrogenase (L-LDH) ou gene da D-lactato desidrogenase (D-LDH). Métodos para produzir modificações desses tipos são descritos, por exemplo, em WO 99/14335, WO 00/71738, WO 02/42471, WO 03/102201, WO 03/102152 e WO 03/049525. Essas modificações podem estar presentes na célula hospedeira antes de modificar adicionalmente a célula hospedeira como aqui descrito, ou podem ser feitas simultaneamente com ou após tais modificações adicionais como descrito aqui. Células de levedura geneticamente modificadas de certos aspectos da invenção incluem um gene de xilose isomerase exógeno, funcional (XI) que está preferivelmente integrado no genoma da célula hospedeira. Nesse contexto, "exógeno" significa (1) o gene XI não é nativo da célula hospedeira, (2) o gene XI é nativo para a célula hospedeira, mas o genoma da célula hospedeira foi modificado para proporcionar cópias funcionais adicionais do gene XI nativo, ou (3) ambos (1) e (2) . Exemplos de genes XI adequados incluem genes XI naturais para as espécies Piromyces E2 (tal como Piromyces sp. E2 xylA que codificam seqüência genética no Genbank (Acesso #AJ249909)) e Cyllamyces aberensis bem como aquelas obtidas a partir de outros fungos anaeróbicos. Seqüências nucleotídicas para os genes das espécies Piromyces E2 e Cyllamyces Aberensis são identificadas como SEQ ID NOs. 58 e 151, respectivamente. Seqüências de aminoácidos deduzidas para as proteínas produzidas através desses genes XI são identificados como SEQ ID NO. 59 e 152, respectivamente. Um gene XI bacteriano adequado é nativo para Bacterioídes thetaiotaomicron. A seqüência nucleotidica para esse gene XI B. thetaiotamicron é identificado como SEQ ID NO. 162. A seqüência de aminoácido deduzida para a enzima produzida por meio desse gene é identificada como SEQ ID NO. 163. Genes XI adequados incluem aqueles que são pelo menos 60%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% homólogos às SEQ ID NOs. 59 ou 152. Alguns genes de xilose isomerase são não mais que 95% ou não mais que 90% homólogos à SEQ ID NO. 58 ou codificam uma enzima que é não mais que 95% ou não mais que 90% homóloga à SEQ ID NO. 59. Outros genes de xilose isomerase adequados são genes xilose isomerase bacterianos que são pelo menos 60, 80, 90, 95, 98 ou 99% homólogos à SEQ ID NO. 162 e/ou produzem uma enzima que é pelo menos 60, 80, 90, 95, 98 ou 99% homóloga à SEQ ID NO. 163.

Porcentagens de homologia das seqüências de aminoácidos podem ser convenientemente computadas usando o software BLAST versão 2.2.1 com parâmetros definidos a priori. Seqüências possuindo um escore de identidades e escore de positivas de pelo menos XX%, usando o algoritmo BLAST versão 2.2.1 com parâmetros definidos a priori, são consideradas pelo menos XX% homólogas. Genes xilose isomerase particularmente adequados incluem aqueles que codificam quanto a uma enzima que possui escore de identidades de pelo menos 60%, comparada com SEQ ID NO. 163, um escore de identidades de menos que 95%, comparados com a SEQ ID NO. 59, e um escore de positivas de menos de 97%, comparados com a SEQ ID NO. 59. O gene XI exógeno está sob o controle de um promotor e um terminador, ambos os quais são funcionais na célula de levedura modificada. Como usado aqui, o termo "promotor" se refere a uma seqüência não transcrita posicionada a montante (isto é, 5' ) em relação ao códon de inicio da tradução de um gene estrutural (gene situado dentro de cerca de 1 a 1000 bp, preferivelmente de 1-500 bp, especialmente de 1-100 bp) e o qual controla o inicio da transcrição do gene estrutural. De modo similar, o termo "terminador" se refere a uma seqüência não transcrita posicionada a jusante (isto é 3') em relação ao códon de término da tradução de um gene estrutural (geralmente situado dentro de cerca de 1 a 1000 bp, mais particularmente de 1-500 pares base e especialmente 1-100 pares base) e a qual controla o final da transcrição do gene estrutural. Um promotor ou terminador está "operativamente ligado" a um gene estrutural se a sua posição no genoma relativamente àquela do gene estrutural é tal que o promotor ou o terminador, como possa ser o caso, realiza sua função de controle transcricional.

Seqüências promotoras e terminadoras podem ser nativas para a célula de levedura ou exógenas. Seqüências promotoras e terminadoras que são altamente homólogas (isto é de 90% ou mais, especialmente de 95% ou mais, muito preferivelmente de 99% ou mais homólogas) em suas partes funcionais em relação às partes funcionais das seqüências promotoras e terminadoras, respectivamente, que sejam nativas para a célula, são úteis também, particularmente quando a inserção do gene exógeno está apontada para um sitio especifico no genoma da célula.

Um promotor adequado é pelo menos 90%, 95% ou 99% homólogo a um promotor que é nativo para um gene de levedura. Um promotor mais adequado é pelo menos 90%, 95% ou 99% homólogo a um promotor para um gene que é nativo da célula hospedeira. Promotores particularmente úteis incluem promotores para genes de levedura piruvato descarboxilase (PDC), fosfoglicerato quinase (PGK), xilose redutase, (XR) , xilitol desidrogenase (XDH) e amplificador da transcrição do fator-1 (TEF-1), especialmente a partir de genes tais como são os nativos da célula hospedeira Um terminador adequado é pelo menos 90%, 95% ou 99% homólogo a um terminador que é natural para um gene de levedura. O terminador pode ser pelo menos 90%, 95% ou 99% homólogo a um terminador para um gene que é nativo da célula hospedeira. Terminadores particularmente úteis incluem terminadores para genes de piruvato descarboxilase (PDS) xilose redutase ,(XR), xilitol desidrogenase (XDH) ou iso-2-citocromo c (CYC) de levedura, ou um terminador proveniente da familia galactose de genes na levedura, particularmente, o assim chamado terminador GAL10. Um terminador GAL10 de S.cerevisiae e um terminador XYC1 de S.cerevisiae têm se mostrado serem terminadores efetivos para genes XI exógenos na levedura. O uso de promotores e terminadores nativos (em relação a célula hospedeira), juntamente com as respectivas regiões flanqueadoras a jusante e a montante, pode permitir a integração direcionada do gene XI em um locl especifico do genoma da célula hospedeira, e quanto à integração simultânea do gene XI e a deleção de um outro gene nativo, tal como, por exemplo, um gene XR, XDH ou PDC.

Uma cauda poli-his(tidina) pode estar presente na extremidade 3' do gene XI. Um método para realizar isto é descrito no Exemplo 3 adiante. A presença da cauda poli-his pode diminuir a performance do gene XI, todavia. A cauda poli-his não é crucial para a invenção e pode ser omitida se desejado. O gene exógeno XI pode ser integrado randomicamente no genoma da célula hospedeira ou inserido em um ou mais locais alvejados(direcionados). Exemplos de locais alvejados incluem o local de um gene que é desejavelmente deletado ou interrompido, tal como um gene XR, XDH ou PDC. Em algumas modalidades, a integração do gene XI adjacente ao sitio do gene PDC nativo aparenta estar relacionada à melhorada performance da célula de levedura modificada na produção de produtos de fermentação. A integração no locus de PDC pode ser conseguida com ou sem a deleção ou interrupção do gene PDC nativo, mas é preferido manter o gene PDC nativo intacto e funcional, particularmente quando um desejado produto de fermentação é etanol ou outro produto que seja um metabólito de piruvato. A integração direcionada pode ser conseguida planejando-se um vetor que possua regiões que sejam homólogas aos flancos a montante (5') e a jusante (3') do gene alvo. Uma ou outra de ambas essas regiões pode incluir uma parte da região codificadora do gene alvo. O cassete XI (incluindo promotores e terminadores associados se diferentes daqueles do gene alvo) e os marcadores da seleção (com promotores e terminadores associados como possa ser necessário) irá se situar no vetor entre as regiões que são homólogas aos flancos a montante e a jusante do gene alvo.

As células levedura geneticamente modificadas podem conter uma cópia única ou múltiplas cópias do gene XI exógeno. Se múltiplas cópias do gene exógeno XI estão presentes, de 2 a 10 ou mais cópias podem estar presentes, tais como de a partir de cerca de 2-8 ou de a partir de cerca de 2-5 cópias. Múltiplas cópias do gene XI exógeno podem estar integradas em um único locus (de modo que elas estão adjacentes umas às outras), ou em diversos loci dentro do genoma da célula hospedeira. Em uma modalidade de particular interesse, múltiplas cópias do gene XI exógeno estão incorporadas na, ou adjacentes ao locus de um gene PDC nativo, com ou sem deleção ou interrupção do gene PDC nativo. É possível para diferentes genes XI exógenos estarem sob o controle de diferentes tipos de promotores e/ou terminadores. A performance da levedura modificada, especialmente sob condições anaeróbicas, é melhorada mediante produzir uma ou mais modificações adicionais ao seu genoma, e/ou selecionar células hospedeiras que possuem certas caracteristicas. Estas incluem uma ou mais de (1) baixa atividade XR (ou outra aldose redutase), (2) baixa atividade XDH e (3) superexpressão de XK. A célula hospedeira pode ,naturalmente, ter que ser modificada para possuir baixa atividade aldose redutase. Uma tal baixa atividade aldose redutase, medida do modo descrito no Exemplo 4E adiante, é adequadamente menor que 1 mU/mg ou menos que 5 mU/mg. Se a célula hospedeira contém um ou mais genes de aldose redutase que produzem enzimas que catalisam a conversão de xilose a xilitol, um ou mais desses genes é adequadamente interrompido ou deletado. Em geral, o(s) gene(s) selecionado(s) para interrupção ou deleção são aqueles os quais individualmente ou coletivamente (1) causam para pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 50% da atividade de redução xilose—»xilitol da célula hospedeira, e/ou (2) são genes XR; isto é, genes que codificam uma enzima especifica para a redução xilose—*xilitol. É de modo geral preferido deletar ou interromper pelo menos um gene XR. A deleção ou a interrupção preferivelmente atinge pelo menos 50% de redução na atividade enzimática, e mais preferivelmente atividade xilose redutase é reduzida para abaixo de 10 mU/mg ou 5 mU/mg.

Por "deletar ou interromper", é significado que a inteira região codificadora do gene é eliminada (deleção), ou o gene ou sua referência promotora e/ou terminadora é modificado (tal como por deleção, inserção, ou mutação) tal que o gene não mais produz uma enzima ativa, ou produz uma enzima com atividade grandemente reduzida. A deleção ou a interrupção pode ser realizada através de métodos de engenharia genética, evolução forçada ou mutagênese e/ou seleção ou triagem. No caso do gene XR ou aldose redutase não especifico, um método adequado para conseguir isso é clonar as regiões de flanco a montante e a jusante do gene (o qual pode incluir uma parte da região codificadora para o gene), produzir um vetor contendo os flancos a montante e a jusante clonados, e transformar a célula hospedeira com o vetor. 0 vetor pode conter outro material genético tal como um gene marcador ou outro gene que é desejavelmente inserido no genoma da célula hospedeira no locus do XR nativo ou de um gene de aldose não especifico (tal como um gene XI, gene XK ou um gene que possibilite à célula produzir um desejado produto de fermentação, como um gene L- ou D-LDH).

Um método de deleção do gene XR ou da aldose redutase não especifica é transformar a célula hospedeira com um vetor contendo regiões que sejam homólogas aos flancos a montante (5') e a jusante (3') do gene alvo. Tais seqüências de flanco podem ser obtidas, por exemplo, mediante amplificação as regiões apropriadas por PCR utilizando adequadamente iniciadores desenhados adequadamente e DNA genômico como o molde. Um ou outro de ambas essas regiões podem incluir uma parte da região codificadora do gene alvo, embora o vetor não deva conter a inteira parte funcional do gene. Tais seqüências flanqueadoras são geralmente seqüências de pelo menos 50 pares base, ou pelo menos 100 ou pelo menos 500 pares base. Embora não exista na teoria limite superior para o comprimento da seqüência flanqueadora, ele é preferivelmente de até cerca de 4000 pares base, mais preferivelmente até cerca de 1200 pares base em comprimento. As seqüências flanqueadoras são cada uma pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 98% e ainda mais preferivelmente pelo menos 99% homóloga às correspondentes seqüências no genoma da célula. Essas seqüências flanqueadoras podem incluir as seqüências promotoras e terminadoras, respectivamente, do gene alvo. 0 vetor pode em adição conter um ou mais cassetes marcadores de seleção {com promotores e terminadores associados como possa ser necessário) que de modo proveitoso residam entre as regiões que sejam homólogas aos flancos a montante e a jusante do gene alvo. Um tal vetor pode deletar o gene alvo em uma recombinação homóloga, inserindo o gene marcador de seleção no local do gene alvo deletado. O vetor pode em lugar da adição ao cassete marcador de seleção incluir um outro cassete de expressão, tal como um cassete de expressão XI, e cassete L- ou D-LDH ou um cassete de expressão xiluloquinase, todos os quais podem incluir promotores e terminadores associados. Vetores podem ser também projetados para tirar proveito dos espontâneos efeitos de "loopout", tais como aqueles descritos em WO 03/102152. A célula hospedeira pode, naturalmente, ter ou ser modificada para ter baixa atividade xilitol desidrogenase. Uma tal baixa atividade da enzima xilitol desidrogenase, medida do modo descrito no Exemplo 6B adiante, é adequadamente menor que 2 mU/mg ou menos que 1 mU/mg. Se a célula hospedeira contém um ou mais genes xilitol desidrogenase resultando em maiores atividades enzimáticas xilitol desidrogenase, um ou mais desses genes está adequadamente interrompido ou deletado. A deleção ou a interrupção do gene XDH pode ser realizada em um modo análogo ao descrito antes com respeito a deleção ou rompimento da aldose redutase. A deleção pode ser realizada mediante incorporar flancos a montante e a jusante do gene XDH em um vetor de transformação, em lugar dos flancos do gene XR ou aldose redutase não específicos. Como anteriormente, o vetor inclui um ou mais cassetes marcadores de seleção e/ou um ou mais outros cassetes de expressão. A deleção interrupção preferivelmente consegue pelo menos uma redução de 50% na atividade enzimática, e mais preferivelmente atividade xilitol desidrogenase reduzida para abaixo de 2 mU/mg ou 1 mU/mg. A célula modificada expressa enzima xiluloquinase possuindo uma atividade de pelo menos 100 mU/mg, tal como pelo menos 300 mU/mg ou pelo menos 500 mU/mg, medido como descrito no Exemplo 5E adiante. A enzima xiluloquinase é referida de modo variado como EC2.7.1.17 e sistematicamente como ATP:D-xiluloquinase 5-fosfotransferase. Sua atividade é geralmente ATP + D-xilulose = ADP + D-xilulose 5-fosfatoXiluloquinase (XK) . A superexpressão pode ser conseguida, por exemplo, através da evolução forçada (sob condições que favoreçam a seleção de mutantes que superexpressem a enzima), mutagênese ou mediante integração de um ou mais genes xiluloquinase exógenos funcionais dentro do genoma da célula hospedeira. Nesse contexto, exógeno significa (1) o gene XK não é nativo para a célula hospedeira, (2) o gene XK é nativo para a célula hospedeira, mas o genoma da célula hospedeira foi modificado para prover cópias funcionais adicionais do gene XK nativo, ou (3) ambos (1) e (2). Genes de xiluloquinase adequados incluem genes de xiluloquinase de levedura. Um exemplo preferido de um adequado gene XK é o gene XK de S.cerevisiae (ScXKSl) . Uma seqüência nucleotídica para o gene ScXKSl é identificada como uma SEQ ID NO. 83. A seqüência de aminoácidos deduzida para as enzimas produzidas pelo gene ScXKSl é identificada como SEQ ID NO. 84. Genes XK adequados incluem aqueles que são pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% homólogos à SEQ ID NO. 84. Outros genes XK são nativos de K.marxianus ou C. sonorensis, ou são pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% homólogos a uma ou outra dessas. O gene XK exógeno está sob o controle de um promotor e um terminador, ambos os quais são funcionais na célula de levedura modificada. Seqüências promotoras e terminadoras adequadas podem ser nativas à célula hospedeira ou apresentar uma alta homologia (isto é, 90% ou mais, especialmente 95% ou mais, muito preferivelmente 99% ou mais de homologia) a um promotor ou terminador natural. Tais promotores e terminadores são particularmente úteis quando o gene XK exógeno é apontado para um sitio especifico no genoma da . célula hospedeira. Outros promotores e terminadores adequados são nativos ao organismo a partir do qual o gene XK foi obtido ou apresentam uma homologia similarmente alta a tais promotores e/ou terminadores nativos. Por exemplo, promotores e terminadores adequados para o gene ScXKSl identificados acima incluem promotores e terminadores para os genes S.cerevisiae. Os promotores e/ou terminadores podem ser aqueles nativos para o particular gene XK ou apresentarem uma homologia similarmente alta para tal promotor e/ou terminador.

Promotores particularmente úteis para o gene ScXKSl incluem promotores de piruvato descarboxilase (PDC) de S.cerevisiae, fosfoglicerato quinase (PGK), xilose redutase (XR), xilitol desidrogenase (XDH) e amplificador do fator-1 (TEF-1). Terminadores particularmente úteis para o gene ScXKSl incluem terminadores de piruvato descarboxilase (PDC) de S.cerevisiae, xilose redutase (XR), xilitol desidrogenase (XDH) ou iso-2-citocromo c (CYC), ou um terminador da família galactose de genes em levedura, particularmente, o assim chamado terminador GAL10. Um terminador S.cerevisiae GAL10 e um terminador S.cerevisiae CYC1 se mostraram ser terminadores eficazes para os genes XI exógenos em levedura. 0 gene XK exógeno pode ser integrado de modo randômico às células hospedeiras, ou inseridos em um ou mais locais alvos, usando métodos análogos àqueles para a inserção do gene XR, como discutido acima. Exemplos de posições alvos incluem o loci de um gene que é desejavelmente deletado ou interrompido, tal como um gene XR, XDH ou PDC. Como anteriormente, a integração direcionada pode ser conseguida mediante projetar um vetor possuindo regiões que sejam homólogas aos flancos a montante (5') e a jusante (3f) do gene alvo. Uma ou outra ou ambas dessas regiões pode incluir uma parte da região codificadora do gene alvo. 0 cassete XK (incluindo os promotores e terminadores associados se diferentes daqueles do gene alvo) e os marcadores de seleção (com os promotores e terminadores associados como possa ser necessário) irão residir sobre o vetor entre as regiões que sejam homólogas aos flancos a montante e a jusante do gene alvo. Células de levedura geneticamente modificadas podem conter uma cópia única ou múltiplas cópias (tais como de a partir de 2 a 10 ou mais cópias, de a partir de 2 a 8 ou de a partir de 2 a 5 cópias) do gene XK exógeno. Múltiplas cópias do gene XK exógeno podem ser integradas em um único locus (de modo que elas sejam adjacentes uma a outra), ou em vários loci no genoma da célula hospedeira. É possível para diferentes genes XK exógenos estar sob o controle de diferentes tipos de promotores e/ou terminadores . Células de acordo com a invenção que possuem baixa atividade xilose redutase, baixa atividade xilitol desidrogenase e superexpressada atividade xiluloquinase são hospedeiras excelentes para a triagem de genes de xilose isomerase exógenos quanto à atividade na célula hospedeira. Essas modificações genéticas criam um ambiente celular que tende a favorecer a expressão xilose isomerase, de modo que se um certo gene é de fato ativo, sua atividade é menos provável de ser superexpressa pelo ambiente celular e portanto, ser mensurável na célula. A modificação genética da célula hospedeira é conseguida em uma ou mais etapas através do projeto e construção de vetores apropriados e a transformação da célula hospedeira com esses vetores. Os métodos de eletroporação e/ou de transformação química (tal como à base de cloreto de lítio ou de acetato de lítio) podem ser usados. Métodos para transformar linhagens de levedura são descritos em WO 99/14335, WO 00/71738, WO 02/42471, WO 03/102152 e WO 03/049525; esses métodos são de modo geral aplicáveis para transformar células hospedeiras de acordo com essa invenção. O DNA usado nas transformações pode ou ser cortado com uma particular enzima de restrição ou usado como DNA circular.

Abordagens gerais para o projeto do vetor de transformação têm sido discutidas acima em um sentido geral. Alguns projetos específicos de vetor de transformação são como a seguir, com os componentes listados na ordem de leitura/transcrição. Todos podem ser circularizados ou linearizados. Todos podem conter sítios de restrição de vários tipos para linearização ou fragmentação. Os vetores podem também conter uma parte de estrutura de cadeia (tal como para a propagação em E.coli, os quais são convenientemente obtidos a partir de vetores levedura ou bacterianos comercialmente disponíveis). 1. Região (5') a montante do gene XR da célula hospedeira; cassete da expressão marcador, região a jusante da região hospedeira (3' ) do gene XR do hospedeiro. 0 cassete da expressão marcador pode ser um cassete da expressão de resistência a higromicina, Ura3, ou G418 com promotores e terminadores como necessário. Um cassete Ura3 pode ser um cassete HisG-Ura3-HisG. Um cassete G418 pode incluir o promotor ScPDCl e o terminador ScGALlO. 2. Alguns como (1), com cassete XI (incluindo promotor e terminador operativamente ligado ao gene) posicionado entre as regiões 5'- e 3'- do gene XR da célula hospedeira. O cassete XI pode incluir um promotor que seja nativo para a célula hospedeira. O cassete XI pode incluir um terminador ScCYCl ou ScGALlO. 3. Alguns como (1) ou (2), com o cassete XK (incluindo promotor e terminador operativamente ligado ao gene) posicionado entre as regiões 5'- e 3'- do gene XR da célula hospedeira. O cassete XR pode incluir um promotor que seja nativo para a célula hospedeira, ou um promotor ScTEFl. 0 cassete XI pode incluir um terminador ScCYCl ou ScGALlO. 4. A montante da região (5') do gene XDH da célula hospedeira; cassete da expressão marcador, região a jusante da região hospedeira (3') do gene XDH hospedeiro. O cassete da expressão marcador pode ser um cassete da expressão de resistência a higromicina, Ura3, ou G418 com promotores e terminadores como necessário. Um cassete Ura3 pode ser um cassete HisG~Ura3-HisG. Um cassete G418 pode incluir o promotor ScPDCl e o terminador ScGALlO. 5. Alguns como (4), com cassete XI (incluindo promotor e terminador operativamente ligado ao gene) posicionado entre as regiões 5'- e 3'- do gene XR da célula hospedeira. O cassete XI pode incluir um promotor que seja nativo para a célula hospedeira. O cassete XI pode incluir um terminador ScCYCl ou ScGALlO. 6. Alguns como (4) ou (5), com o cassete XK (incluindo promotor e terminador operativamente ligado ao gene) posicionado entre as regiões 5'- e 3'- do gene XR da célula hospedeira. O cassete XR pode incluir um promotor que seja nativo para a célula hospedeira, ou um promotor ScTEFl. 0 cassete XI pode incluir um terminador ScCYCl ou ScGALlO. 7. Cassete HisG-Ura3-HisG precedido ou seguido por um cassete XI ou cassete XK. 8. Um cassete XI que inclui um promotor K.marxianus ou um promotor C. sonorensis, o cassete XI sendo precedido ou seguido por um cassete da expressão marcador. O promotor K.marxianus ou C. sonorensis pode ser um promotor PDC ou PGK. 0 terminador no cassete XI pode ser um terminador K.marxianus,· C. sonorensis ou S.cerevisiae, e pode ser especificamente um terminador ScCYCl ou ScGALlO. O cassete da expressão marcador pode ser um cassete da expressão de resistência a higromicina, Ura3, ou G418 com promotores e terminadores como necessário. Um cassete Ura3 pode ser um cassete HisG-Ura3-HisG. Um cassete G418 pode incluir o promotor ScPDCl e o terminador ScGALlO. O cassete XI pode também incluir um cassete XK (tal como descrito em 9 abaixo), ou a jusante ou a montante do cassete XI, e ou na parte mais acima ou na parte mais abaixo do cassete da expressão marcador. 9. Um cassete XK sendo precedido ou seguido por um cassete da expressão marcador. O cassete XK pode incluir um promotor K.marxianus, um promotor C. sonorensis ou um promotor S.cerevisiae. o promotor do cassete XK pode ser especificamente um promotor K.marxianus, ou C.sonorensis PDC ou PGK ou um promotor S. cerevisiae PDC, PGC ou TEF1. O terminador no cassete XK pode ser um terminador K.marxianus, C. sonorensis ou S.cerevisiae, e pode ser especificamente um terminador ScCYCl ou ScGALlO. 0 cassete da expressão marcador pode ser um cassete da expressão de resistência a higromicina, Ura3, ou G418 com promotores e terminadores como necessário. Um cassete Ura3 pode ser um cassete HisG-Ura3~HisG. Um cassete G418 pode incluir o promotor ScPDCl e o terminador ScGALlO. 10. Um cassete XI, cassete XK, ou ambos, sendo precedidos por uma região na parte mais acima (5'~) de um gene XR da célula hospedeira; e seguido por uma região (3'-) na parte mais abaixo de um gene XR hospedeiro. Esse vetor pode incluir outros compostos entre as regiões da parte mais acima e da parte mais abaixo do gene XR. 11. Um cassete XI, cassete XK, ou ambos, sendo precedidos por uma região na parte mais acima (5'~) de um gene XDH da célula hospedeira; e seguido por uma região (3'-) na parte mais abaixo de um gene XDH hospedeiro. Esse vetor pode incluir outros compostos entre as regiões da parte mais acima e da parte mais abaixo do gene XDH. 12. Qualquer dos plasmídeos até agora mencionados incluindo um sitio de auto-replicação que seja ativo na célula hospedeira.

Cassetes XI específicos úteis nos vetores mencionados até agora incluem promotor K.marxianus PDC1 (KmPDCl), gene XI (qualquer descrito acima), e terminador ScCYCl, ScGALlO ou KmPDCl; o promotor C.sonorensis PDC1 (CsPDCl), gene XI e terminador ScCYCl, ScGALlO ou CsPDCl; e o promotor C.sonorensis PGK (CsPGK), gene XI e terminador ScCYCl, ScGALlO ou CsPDCl.

Cassetes XK específicos úteis nos vetores mencionados até agora incluem promotor K.marxianus PDC1 {KmPDCl), gene XK (qualquer descrito acima, mas especialmente o gene ScXKSl) , e terminador ScCYCl, ScGALlO ou KmPDCl; o promotor C.sonorensis PDC1 (CsPDCl) , gene XK e terminador ScCYCl, ScGALlO ou CsPDCl; e o promotor C.sonorensis PGK (CsPGK), gene XK e terminador ScCYCl, ScGALlO ou CsPDCl.

Em adição aos específicos genes marcadores e seleção descritos acima, genes marcadores de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por ex., zeocin (gene de resistência a ble bleomicina de Streptalloteichus hindustanus) , G418 (gene resistência à Canamicina de Tn903), higromicina (gene de resistência a antibiótico aminoglicosídico proveniente de E.coli), ampicilina, tetraciclina, ou Canamicina para células hospedeiras; (b) deficiências de complemento auxotrófico da célula, tal como deficiência ao aminoácido leucina (gene de K.marxianus Leu2) ou deficiência de uracila (por ex., gene Ura3 de K.marxianus ou S.cerevisiae) ; (c) suprimento de nutrientes críticos não disponíveis a partir de meio simples, ou (d) conferem a capacidade para a célula crescer em uma fonte de carbono particular. Um gene de xilose isomerase pode atuar desse modo, permitindo a seleção ocorrer com base na capacidade de crescer em xilose.

Transformantes bem sucedidos podem ser selecionados para isso de modo conhecido, mediante tirar proveito dos atributos contribuídos pelo gene marcador, ou por meio de outras características (tais como a capacidade de crescer em xilose) contribuída pelos genes inseridos. A triagem pode ser realizada através de análise de PCR ou Southern para confirmar que as inserções e deleções desejadas ocorreram, para confirmar o número de cópias e para identificar o ponto de integração dos genes no genoma da célula hospedeira. A atividade da enzima codificada pelo gene inserido e/ou falta de atividade da enzima codificada pelo gene deletado podem ser confirmadas usando métodos de ensaio conhecidos. A célula de levedura geneticamente modificada da invenção contendo o gene XI exógeno é útil para fermentar açúcares pentose aos desejáveis produtos de fermentação tais como etanol e acido lático. Certas modificações genéticas adicionais podem ser necessárias a fim de capacitar as células de levedura a produzirem certos produtos em rendimentos, títulos e/ou produtividades aceitáveis. Por exemplo, a integração de um gene LDH exógeno e a deleção de genes PDC naturais pode ser necessária para obter altos rendimentos de acido lático, como discutido anteriormente.

No processo de fermentação da invenção, a célula da invenção é cultivada em um meio de fermentação que inclui um açúcar pentose. 0 açúcar pentose é preferivelmente xilose, xilano ou outro oligômero de xilose. Tais açúcares são adequadamente hidrolisatos de uma biomassa contendo hemicelulose. O meio de fermentação pode conter outros açúcares bem como, notadamente açúcares hexose tais como dextrose (glicose) frutose, oligômeros de glicose tais como maltose, maltotriose e isomaltotriose, e panose. Em caso de açúcares oligoméricos, pode ser necessário acrescentar enzimas ao caldo de fermentação a fim de digerir a mesma ao açúcar monomérico correspondente. O meio irá tipicamente conter nutrientes como requerido pela célula particular, incluindo uma fonte de nitrogênio (tal como proteínas aminoácidos, fontes de nitrogênio inorgânico tais como amônia ou sais de amônio, e similares), e diversas vitaminas, minerais e similares.

Outras condições de fermentação, tais como temperatura, densidade celular, seleção de substrato(s), seleção de nutrientes, e similares não são considerados serem cruciais para a invenção e são de modo geral selecionados para proporcionar um processo econômico. As temperaturas durante cada uma de fase de crescimento e a fase de produção podem variar na faixa de acima da temperatura de congelamento do meio até cerca de 50 °C, embora a temperatura ótima irá depender de certa forma, do microorganismo em particular. Uma temperatura particularmente preferida durante a fase de produção, é de a partir de cerca de 30-45 °C. Quando a célula é uma K.marxianus produzida por engenharia, ela pode tolerar temperaturas relativamente altas (tais como acima de 40 °C e até 50 °C, especialmente até 45 °C). Outras espécies preferidas de célula, C.sonorensis, pode tolerar temperaturas de até cerca de 40 °C. Essa faixa de temperatura proporciona quanto à possibilidade de conduzir a fermentação em tais temperaturas mais altas(reduzindo desse modo os custos de resfriamento) sem uma significativa perda da produtividade. Uma outra vantagem provida pela boa tolerância a alta temperatura é que se a fermentação se tornar contaminada com um microorganismo indesejado, em muitos casos o microorganismo indesejado pode ser seletivamente aniquilado pelo aquecimento do meio de fermentação até 40 °C ou mais, especialmente a 45 °C ou mais, sem prejudicar de modo significativo as desejadas células da invenção.

Durante a fase de produção, a concentração das células no meio de fermentação está tipicamente na faixa de cerca de 1-150, preferivelmente de cerca de 3-10, ainda mais preferivelmente de cerca de 3-6 g de células secas/litro do meio de fermentação. A fermentação pode ser conduzida de modo aeróbico, microaeróbico ou anaeróbico. Se desejado, a taxa especifica de captação de oxigênio pode ser usada como um controle de processo, como descrito em WO 03/102200. Uma vantagem da invenção é que a célula geneticamente modificada tipicamente pode fermentar xilose anaerobicamente devido à expressão do gene XI e de outras modificações.

Quando o produto de fermentação é um acido, o meio pode ser tamponado durante a fase de produção da fermentação tal que o pH é mantido em uma faixa de cerca de 5,0 até cerca de 9,0, preferivelmente de cerca de 5,5 até cerca de 7,0. Agentes de tamponamento adequados são materiais básicos que neutralizam o ácido lático logo que ele é formado, e incluem, por exemplo, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio, carbonato de sódio, carbonato de amônio, amônia, hidróxido de amônio, e similar. Em geral, esses agentes que são utilizados em processos convencionais de fermentação são também adequados aqui. Está inserido no escopo da invenção, todavia, permitir ao pH do meio de fermentação cair de a partir de um pH inicial que é tipicamente de 6 ou maior, para abaixo do pKa do produto de fermentação ácida, tal como na faixa de cerca de 2 até cerca de 5 ou na faixa de a partir de cerca de 2,8 até cerca de 4,5.

Em uma fermentação tamponada, os produtos de fermentação de caráter ácido tal como ácido lático são neutralizados na medida que são formados ao correspondente sal lactado. A recuperação do ácido, portanto, envolve regenerar o ácido livre. Isso é tipicamente feito mediante remoção das células e acidulação ao caldo de fermentação com um ácido forte tal como o ácido sulfúrico. Um sal subproduto é formado (gesso no caso onde um sal de cálcio é o agente neutralizante e o ácido sulfúrico é o agente de acidulação), o qual é separado do ácido. O ácido é em seguida recuperado através de técnicas tais como extração liquido-liquido, destilação, absorção, etc., tais como são descritas em T.B. Vickroy, Vol. 3, Capitulo 38 do Comprehensive Biotechnology, (ed. M.Moo—Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta, e outros, FEMS Micróbiol. Rev., 1995; 16: 221-231; Patentes U.S. Nos. 4.275.234, 4,771.001, 5.132.456, 5.420.304, 5.510.526, 5.641.406, e 5.831.122, e WO 93/00440. O processo da invenção pode ser conduzido de modo continuo, em batelada, ou alguma combinação desses.

Os exemplos a seguir são providos para ilustrar a invenção, nas não são pretendidos a limitar o seu escopo. Todas as partes e porcentagens estão em peso a menos que de outro modo indicado.

Exemplo IA: Construção de plasmideo contendo promotor S.cerevisiae PGK1 e terminador S.cerevisiae GallO (pNC2, Figura 1); Construção de plasmideo contendo promotor S.cerivisiae PDC1 e terminador S.cerevisiae GallO (pNC4, Figura 2) . A seqüência nucleotidica do promotor S.cerivisiae PGK1 (ScPGKl) é identificada como SEQ ID NO. 1. Essa seqüência foi obtida como um fragmento de restrição proveniente de um plasmideo pertencente a um proprietário designado pBFY004. De modo alternativo, ele pode ser obtido mediante amplificação de PCR usando DNA cromossomal S.cerevisiae como modelo e iniciadores designados baseados na SEQ ID NO. 2. 0 promotor S.cerevisiae PDC1 (ScPDCl ) foi amplificado usando os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 3 e SEQ ID NO. 4, usando DNA cromossomal proveniente da linhagem S.cerevisiae GY5098 (ATCC 4005098) como um gabarito. A termociclagem foi realizada através de 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 56 °C e 1 minuto a 72 °C, seguido por uma incubação final de 7 minutos a 72 °C, usando PfuTurbo DNA polimerase (Stratagene, Madison, WI) . A seqüência nucleotidea do promotor ScPDCl é identificada como SEQ ID NO. 5. O plasmideo pNC2 (Figura 1) foi gerado mediante combinar o terminador ScPGKl e o ScGALlO no vetor de estrutura pGEM5Z(+) (Promega, Wisconsin). 0 ScPGKl e ScGALlO foram separados no vetor resultante por uma região poli-ligante com sítios de restrição Xbal, EcoRI e BamHI para inserir genes particulares para serem expressos entre o promotor e o terminador da levedura. Um fragmento de restrição Notl de ~1,2 kbp composto do promotor ScPGKl e do terminador ScGALlO com sítios de multi-clonagem é identificado como SEQ ID NO. 6. 0 vetor de expressão pNC4 contendo o cassete da expressão foi construído do mesmo modo geral, exceto que o gene ScPDCl foi usado em lugar do gene ScPGKl. O vetor resultante (pNC4) é mostrado na Figura 2. Um fragmento Notl de ~1,3 kbp composto do promotor ScPDCl e do terminador ScGALlO com sítios de multi-clonagem é identificado como SEQ ID NO. 7.

Exemplo 1B: Inserção de um gene marcador de resistência a G418 dentro de pNC2 (Ex. , IA, Figura 1) para criar um pasmídeo no qual o gene G418 está operativamente ligado ao promotor S.cerevisiae PGK1 e ao terminador ScGALlO (pVR22, Figura 3).

O gene de resistência G418 foi amplificado por PCR usando Pfu Polimerase (Stratagene, Madison, WI) com iniciadores identificados como SEQ ID NO. 8 e SEQ ID NO. 9, usando o plamídeo pPIC9K (Invitrogen, CA), como modelo. A termociclagem foi realizada mediante incubar inicialmente a mistura reacional por 5 minutos a 95 °C, seguido por 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 49 °C e 2 minutos a 72 °C, seguido por uma incubação final por 10 minutos a 72 °C. O produto PCR foi digerido com BamHI e Xbal e um fragmento 821 bp foi isolado e ligado a um fragmento BamHI-Xbal de ~4303 bp de pNC2 (Ex. IA, Figura 1) . 0 plasmideo resultante (pVR22, Figura 3) tem o promotor ScPGKl e o terminador ScGALlO operativamente ligados ao gene de resistência a G418.

Exemplo 1C: Inserção de um gene marcador de resistência a G418 para dentro de pNC4 (Ex. IA, Figura 2) para criar um plasmideo no qual o gene G418 está operativamente ligado ao promotor S.cerevisiae PDC1 e ao terminador ScGALlO (pVR29, Figura 4). O gene de resistência G418 foi amplificado por PCR usando Pfu Polimerase (Stratagene, Madison, WI) com iniciadores identificados como SEQ ID NO. 8 e SEQ ID NO. 9, usando o plamideo pVR22 (Ex. 1B, Figura 3) , como modelo. A termociclagem foi realizada mediante incubar inicialmente a mistura reacional por 5 minutos a 95 °C, seguido por 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 49 °C e 2 minutos a 72 °C, seguido por uma incubação final por 10 minutos a 72 °C. 0 produto PCR foi digerido com BamHI e Xbal e um fragmento 821 bp foi isolado e ligado a um fragmento BamHI-Xbal de ~4303 bp de pNC4 (Ex. IA, Figura 2) . O plasmideo resultante pVR29 (Figura 4) tem o promotor ScPGKl e o terminador ScGALlO operativamente ligados ao gene de resistência a G418.

Exemplo 1D: Construção de um vetor (pBH5b, Figura 5) contendo as seqüências de flanco 5'- e 3'- do gene PDCl de K.marxianus, e do gene G418 sob controle do promotor ScPDCl e do terminador ScGALlO.

Um fragmento de 1254 bp de PCR foi amplificado com iniciadores identificados como SEQ ID NO. 10 e SEQ ID NO. 11, usando o plasmideo pS021 (descrito no Pedido de Patente U.S. Publicado 2004/029256A1) como o modelo. A termociclagem foi realizada mediante incubar inicialmente a mistura reacional por 2 minutos a 94 °C, seguido por 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C e 1,5 minuto a 72 °C, seguido por uma incubação final por 10 minutos a 72 °C. 0 produto PCR foi separado sobre um gel 0,8% agarose e um produto -1254 bp isolado. O produto PCR e o plasmideo pVR29 (Ex. 1C, Figura 4) foram ambos digeridos com Kpnl e Sbfl e ligados para produzir um vetor de -6315 bp designado como pBH5a (Figura 5) . 0 plasmideo pBH5a continha o gene de resistência a G418 operativamente ligado ao promotor ScPDCl e ao terminador ScGALlO e um fragmento de -124 0 bp de DNA homólogo ao DNA imediatamente a montante do gene KmPDCl.

Um fragmento 535 bp de DNA imediatamente a jusante do gene KmPDCl foi amplificado por PCR com iniciadores identificados pela SEQ ID NO. 12 e SEQ ID NO. 13, usando plasmideo pS021 como o modelo. A termociclagem foi realizada mediante incubar inicialmente a mistura reacional por 2 minutos a 94 °C, seguido por 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C e 45 segundos a 72 °C, seguido por uma incubação final por 10 minutos a 72 °C. 0 produto PCR foi separado sobre um gel 0,8% agarose e um produto 535 bp isolado. O produto PCR foi digerido com Sbfl e MluI e o fragmento 529 bp resultante foi ligado com o fragmento Sbfl-MluI de pBH5a para produzir o plasmideo pBH5b (Figura 5). O plasmideo pBH5b contém seqüências correspondentes àquelas que flanqueiam o gene KmPDCl; isto é, uma seqüência flanqueadora de ~1,2 kbp a montante e uma seqüência flanqueadora de ~0,5 kbp de DNA a jusante, com um único sitio Sbfl localizado entre elas. 0 plasmideo pBH5b também contém o marcador de resistência a G418 operativamente ligado ao promotor ScPDCl e ao terminador ScGALlO.

Exemplo 1E: Construção de um vetor contendo etiqueta poli-his e terminador S.cerevisiae CYC1 (pVR73, Figura 6); remoção do gene marcador de resistência a G418 dp pBH5b (Ex. 1D, Figura 5) para formar o vetor pVR77 (Figura 6) .

Os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 14 e SEQ ID NO. 15 foram projetados com base no vetor pYES6CT (Invitrogen, CA) para a amplificação de bases contendo múltiplos sítios de clonagem, etiqueta poli-his, e terminador CYC1 S.cerevisiae (ScCYCl). Os iniciadores introduziram sítios Sbfl e BsmBI ao produto. As condições de PCR foram 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 55 °C e 1 minuto a 68 °C, seguida por uma incubação final a 68 °C por 10 minutos usando Platina Pfx DNA polimerase (Invitrogen, CA) . O produto PCR foi purificado em coluna, seguido por adição de nucleotídeos adenina para as pontas 5' da clonagem TA usando Taq DNA polimerase incubada a 72 °C por 10 minutos. O produto 507 bp foi em seguida clonado TA para dentro de vetor de clonagem TOPOU TA (Invitrogen, CA) e designado pVR73 (Figura 6). A inclusão da etiqueta poli-his nesse vetor irá induzir aos genes clonados para dentro do único sitio Sbfl ter a etiqueta his fundida à proteína expressa a partir daquele gene. Essa etiquetagem da proteína com a etiqueta poli-his permite quanto a uma relativamente rápida detecção western blot da proteína usando conjugado Ni-NTA (HRP) (Quiagen, USA) e quanto à rápida purificação do gene expresso usando resina e colunas Ni-quelantes (Invitrogen, CA). O plasmideo pBH5b (ex., 1D, Figura 5) foi digerido com Sphl e um fragmento ~4,7 kbp que retém o promotor e terminador KmPDCl foi re-ligado a ele próprio para produzir o plasmideo pVR77 (Figura 6) . O marcador da seleção antibiótica G418 a partir de pBH5b foi desse modo eliminado.

Exemplo 1F: Construção de um vetor pVR78 (Figura 6) contendo a região flanqueadora KmPDCl a montante, sítio multi-clonagem, etiqueta poli-his e terminador ScCYCl O plasmideo pVR73 (Ex. 1E, Figura 6) foi digerido com enzimas Sbfl e BsmBI para liberar um fragmento 504 bp contendo o sítio multi-clonagem, etiqueta poli-his e terminador ScCYCl. 0 vetor pVR77 foi digerido usando as mesmas enzimas para produzir um fragmento ~4249 bp contendo os flancos a montante e a jusante de KmPDCl e a estrutura de cadeia do vetor. Os dois fragmentos foram ligados para formar um plasmideo ~4752 (pVR78, Figura 6) que continha o único sitio de restrição Sbfl 184 bp da etiqueta poli-his. Esse processo removeu a maior parte da região flanquedora a jusante de KmPDCl do plasmideo pVR78.

Exemplo 1G: Modificação do plasmideo pVR78 (Ex. 1F, Figura 6) para formar plasmideo pCM3 (Figura 7) com reduzida distância a partir do sitio de restrição Sbfl da etiqueta poli-his para melhor expressão do gene.

Iniciadores identificados como SEQ ID NO. 16 e SEQ ID NO. 17 foram projetados apr amplificar a inteira região do plasmideo pVR78 a partir da etiqueta poli-his para o terminador ScCYCl. Os iniciadores também tinham o sitio 5' Sbfl imediatamente a montante do marcador poli-his e sitio 3' Sapl. A reação de PCR foi realizada usando métodos padrões. As condições de PCR consistiram de uma incubação inicial a 94 °C por 2 minutos, seguido por 10 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 63 °C e 1 minuto a 68 °C. Isto foi seguido por um adicional de 20 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 1 minuto a 68 °C. A etapa final foi uma incubação de 8 minutos a 68 °C. A amplificação foi realizada usando platina Pfx DNA polimerase (Invitrogen, CA). O produto de PCR foi digerido com enzimas de restrição Sbfl e Sapl. Um fragmento -3,9 kb obtido por digestão do plasmideo pVR78 com as enzimas 5' Sbfl e 3'Sapl foi ligado ao produto de PCR. Esse plasmideo resultante foi designado pCM3 (Figura 7) .

Exemplo 1H: Construção de um plasmideo (pPSl, Figura 8) contendo gene de resistência a higromicina E.coli sob controle transcricional de promotor ScPDCl e terminador ScGALlΟ O gene E.coli hph que confere resistência a higromicina B foi amplificado em PCR usando os iniciadores identificados pela SEQ ID NO. 18 e SEQ ID NO. 19, usando o plasmideo pRLMex30 (Mach e outros, 1994, Curr. Genet. 25, 567-570) como o modelo. O gene hph pode ser também obtido usando os mesmos iniciadores com DNA cromossomal E.coli servindo como o modelo. A termociclagem foi realizada a 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 56 °C, e 3 minutos a 72 °C, seguido por uma incubação final de 7 minutos a 72 °C usando PfuTurbo DNA polimerase (Stratagene, Madison, WI). O produto de PCR foi separado por eletroforese sobre um gel 0,8% agarose e um fragmento 1026 bp isolado. O fragmento 1026 bp foi em seguida digerido com Xbal e BamHI e ligado no fragmento XbaT-BamHl de pNC4 (ex. IA, Figura 2) contendo o promotor ScPDCl e o termindor ScGALlO para produzir o plasmideo pPSl (Figura 8).

Exemplo II: Construção de um vetor (pCM9, Figura 9) contendo a região flanqueadora a montante de KmPDCl, sitio muilticlonagem, marcador poli-his, terminador (todos provenientes de pCM3, Ex. 1G, Figura 7) e o gene de resistência a higromicina E.coli sob controle transcricional do promotor ScPDCl e terminador ScGALlO (proveniente de pPSl, Ex., 1H, Figura 8). O plasmideo pPSl foi digerido com Sphl e um fragmento contendo ~2,2 kbp contendo o gene hph sob o controle do promotor ScPDCl e do terminador ScGALlO foi ligado a pCM3 Sphl-digerido. O plasmideo resultante (pCM9, Figura 9) contém a região promotora KmPDCl seguido por um único sitio Sbfl e o terminador ScCYCl para a futura expressão do gene xilose isomerase. Adicionalmente, esse cassete para a expressão do gene é posicionado logo em seguida a um fragmento ~2,2 kpb contendo o geno hph sob o controle do promotor ScPDCl e do terminador ScGALlO para a seleção dos transformantes na levedura.

Exemplo 2A: Reconstrução do gene Piromyces spE2 xilose isomerase (PXYLA) com base na seqüência disponível no Genbank O método é usado para reconstruir o gene Piromyces sp. E2 xilose isomerase [PXYLA) adaptado de "A method for synthesizing genes and cDNA's by polymerase chain reaction", por Alberto Di Donato e outros, Analytical Biochemistry, 212, 291-293 (1993). Iniciadores purificados por PAGE são ordenados começando a partir do centro do gene para levar avante a reconstrução. 14-16 bp sobreposições são mantidas para os conjuntos de iniciadores. Os iniciadores são cada um de 60-70 bp de comprimento. 0 gene foi reconstruído em 17 etapas. 0 protocolo PCR que foi seguido durante esse método usou Platinum Pfx (Invitrogen, CA) como a DNA polimerase, e seu tampão e MgS04 como instruído pelo fabricante. A etapa 1 é realizada usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 20 e SEQ ID NO. 21. Esses iniciadores representam o centro da seqüência genética. Não é requerido molde na Etapa 1, na medida que o anelamento dos iniciadores e sua extensão irão formar o molde de núcleo sobre o qual as subseqüentes reações de PCR serão construídas. A ciclagem para a Etapa 1 é 20 ciclos de 94 °C por 1 minuto, 54 °C por 1 minuto e 68 °C por 2 minutos (com 5 segundos adicionais sendo acrescentados a cada ciclo sucessivo), seguidos pelo armazenamento a 4 °C.

Nas etapas de reação 2-17, Platinum Pfx (Invitrogen, CA) foi usado como o DNA polimerase, e seu tampão e MgS04 foram usados como instruído pelo fabricante. 2,5 μΐ, da mistura proveniente de cada etapa foram usados como molde para cada etapa subseqüente (reação 50 μΙΟ . Os conjuntos de iniciadores para cada reação são descritos na Tabela 1. 0 molde em cada caso foi de 5 μΤ de DNA proveniente da etapa de reação precedente. A ciclagem para as etapas 2-17 foi de 20 ciclos de 94 °C por 1 minuto, 46 °C por 1 minuto e 68 °C por 2 minutos (com 5 minutos adicionais sendo acrescentados a cada ciclo sucessivo), seguidos pelo armazenamento a 4 °C.

Tabela 1 Exemplo 2B: Construção de vetor pCM17 (Figura 10) contendo o gene PXYLA reconstruído; mutagênese sítio-direcionada para alterar as bases no gene reconstruído para coincidir com a seqüência na base de dados Genbank Um plasmídeo contendo o gene PXYLA reconstruído (Ex. 2A) foi construído mediante ligar um fragmento -1,314 produzido no ciclo final da construção a um vetor TOPOU (Invitrogen, CA). O gene PXYLA reconstruído diferiu da seqüência Genbank com respeito a cinco bases. Cada uma dessas diferenças foi corrigida usando um kit de mutagênese multi-sítio-direcionada (Stratagene, CA), usando esse plasmídeo como o gabarito. Três iniciadores mutagênicos 5'-fosforilados, purificados por PAGE ou por HPLC identificados como SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55 e SEQ ID NO. 56 foram usados para corrigir quatro dos erros. Os parâmetros da ciclagem térmica incluíram uma etapa de desnaturação de um minuto e uma etapa de anelamento de um minuto, seguido por uma extensão de oito minutos. A fita originária formada durante a etapa de PCR foi então digerida mediante adição de 1 μΐ, de enzima Dpnl à mistura ao final da termociclagem. A mistura foi incubada por 1 hora a 37 °C e em seguida usada para transformar células E.coli XLIO-Gold Ultracompetent fornecidas com o kit. A mistura foi plaqueada sobre placas de Luria-Bertani+ampicilina (LBA) e incubadas a 37 °C durante a noite. O protocolo de mutagênese multi-sítio-direcionada foi em seguida repetido para fixar o quinto erro. Dois iniciadores mutagênicos 5'-fosforilados, purificados por PAGE ou por HPLC identificados como SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 57 e SEQ ID NO. 58 foram usados. Dois transformantes foram seqüenciados e apresentaram 100% de homologia à seqüência Genbank do gene PXYLA. Um dos construtos foi denominado pCM17 (Figura 10). As seqüências nuclotidicas e aminoácidos do gene PXYLA reconstruído são identificadas como SEQ ID NO. 58 e SEQ ID NO. 59.

Exemplo 3A: Construção de vetor pCM14 (Figura 11) contendo o gene PXYLA sob o controle do promotor KmPDCl e terminador ScCYCl, e o gene de resistência higromicina E.coli hph sob o controle do promotor ScPDCl e do terminador ScGALlO. O gene PXYLA foi amplificado usando os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 60 e SEQ ID NO. 61, usando pCM17 (Ex. 2B, Figura 10) como um gabarito. A termociclagem foi realizada por 35 ciclos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C, 1,5 minuto a 72 °C, seguido por uma incubação final por 8 minutos a 72 °C usando DNA polimerase Pfx (Invitrogen, CA). O produto de PCR foi digerido com Sbfl e separado por eletroforese sobre um gel 1,0% agarose. Um produto 1319 bp foi isolado e ligado a um fragmento -6829 obtido pela digestão de pCM9 com Sbfl, para construir um plasmideo de -8148 bp. Um iniciador mutagênico identificado como SEQ ID NO. 62 foi usado para puxar um códon de parada o qual foi acidentalmente acrescentado imediatamente a montante do sitio Sbfl, seguindo o mesmo protocolo como descrito no Exemplo Ex. 2B, para criar um plasmideo de -8148 bp (pCM14, Figura 11). 0 plasmideo pCM14 contém o gene PXYLA sob o controle do promotor KmPDCl e do terminador ScCYCl, com uma cauda na ponta 3' do gene. O plasmideo também contém o gene E.coli hph sob o controle do promotor ScPDCl e do terminador ScGALl0.

Exemplo 3B: Incorporação de um marcador da seleção Ura3 para dentro de um plasmideo pCMl4 (Ex. 3A, Figura 11) , com a deleção do cassete da expressão hph Alani e outros, em "A method for gene disruption que allows repeated use of Ura3 selecion in the construction of multiply disrupted yeast strains", (Genetics, 1987, 116, 541-545) descreveram um método de integração genética ou de interrupção genética. Esse método faz uso de uma linhagem levedura uracil luxotrófica e um cassete repetidor HisG-ScUra3~HisG. Esse cassete pode ser usado como um marcador da seleção para introduzir genes ou interromper genes com a vantagem que o cassete HisG se recombina com ele próprio em gerações subseqüentes. Desse modo a célula de levedura perde o gene ScUra3 durante o evento de recombinação e essa perda do gene ScUra3 restaura de volta a uracil auxotrofia da linhagem de levedura para a subseqüente transformação com o mesmo cassete.

Um cassete HisG-ScUra3-HisG foi obtido a partir de Nancy DaSilva incorporado em um plasmideo designado pNADFll (Nancy DaSilva, UC, Irvine Califórnia). 0 cassete HisG- ScUra3-HisG foi isolado de pNADFll mediante digerir o plasmideo com enzimas BamHI e ExoRI e ligando um fragmento ~3,8 kbp a um plasmideo pPUC19 BamHI e Eco-RI-digerido (New England Biloabs, USA) . O plasmideo resultante é designado pVR65 (Figura 19).

O plasmideo pCMl4 (Ex. 3A, Figura 11) foi digerido com Aatll/Sphl e separado por eletroforese sobre 1% gel. Um fragmento ~5907 contendo o cassete PXYLA foi isolado. O plasmideo pVR65 foi digerido com Aatll/Sfhl e separado por eletroforese sobre 1% gel. Um fragmento HisG-ScUra3-HisG ~4393 bp foi isolado e ligado a um fragmento ~5907 de plasmideo pCM14, com as inserções isoladas. O vetor, resultante foi identificado como pCM28 (fig 12) . Ele contém o gene PXYLA (com etiqueta poli-his) sob o controle do promotor KmPDCl e do terminador ScCYCl, e cassete HisG-Ura3-hisG. O gene E.coli hph e as porções f lanqueadoras que estavam presentes no plasmideo pCM14 são eliminados de pCM28.

Exemplo 4A: Clonagem do gene xilose redutase Kluyveromyces marxianus (KmXYLl) e flancos a montante e a j usante.

Um fragmento 410 bp de uma suposta região codificadora xilose redutase K.marxianus (KmCYLl) e aproximadamente 500 bp do promotor foi determinado por um sequenciamento genômico parcial de um K.marxianus similar com o projeto Génolevures (Genomic Exploration of the Hemiascomycetous Yeast: 12. Kluyveromyces marxianus var. marxianus Bertrand Llorente, Alain Malpertuy, Gaêlle Blandin, François Artiguenave, Patrick Wincker and Bernard Dujon FEBS Letters 487 (1) pp. 71-75) . Com base nessa seqüência e algumas das seqüências conhecidas provenientes de outras xilose redutase de consenso, os iniciadores foram projetados para isolar a seqüência completa do gene KmXYLl e promotor. Uma abordagem de genoma parceiro foi usada para obter seqüências a montante e a jusante de uma seqüência do gene KmXYLl a partir de uma linhagem tipo selvagem de K.marxianus. Um kit de genoma parceiro (BD Biosciences, Paio alto, CA) foi usado para a obtenção da seqüência dos flancos a montante e a jusante. O DNA genômico do K.marxianus foi digerido com enzimas de restrição a partir do kit de genoma parceiro (Invitrogen, CA). Uma biblioteca genômica feita com os fragmentos foi usada como um gabarito para as reações de PCR.

Os iniciadores de PCR identificados como SEQ ID NO. 63 e SEQ ID NO. 64 foram projetados para emparceirar ambas as pontas 5' e 3' para obter a xilose redutase e a seqüência flanqueadora a montante/a jusante. Esses iniciadores foram usados para emparceirar juntamente com os iniciadores AP1 e AP2 do kit de genoma parceiro (BD

Biosciences, CA). Esse conjunto de iniciadores amplificou um fragmento ~2,5 kbp a montante do genoma. O fragmento foi sequenciado para revelar a seqüência de DNA a partir das pontas extremas da região a montante na direção do gene KmXYLl. De modo similar, os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 65 e SEQ ID NO. 66 foram usados para emparceirar juntamente com os iniciadores AP1 e AP2 do kit genoma parceiro. Isso ampliou um fragmento ~1,8 kbp a jusante do gene KmXYLl. O fragmento foi sequenciado para revelar a seqüência de DNA das pontas extremas da região a jusante afastada da xilose redutase. A informação da seqüência obtida a partir do caminho no genoma permitiu o projeto de inicadores identificados como SEQ ID NO. 67 e SEQ ID NO. 68. Esses iniciadores foram usados para reações de termociclagem com 500 ng de DNA genômico proveniente de K.marxianus. A termociclagem foi realizada por 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 56 °C, 3 minutos a 72 °C, seguido por uma incubação final de 7 minutos a 72 °C usando Pfx DNA polimerase (Invitrogen, CA). O produto de PCR foi separado por eletroforese sobre um gel 0,8% agarose. Um produto ~3,5 kbp foi isolado e ligado dentro do vetor topo-clonagem pCRII para produzir o plasmideo pVR95 (Figura 13).

Exemplo 4B: Construção de plasmideo pCM19 (Figura 14b) contendo os flancos a montante e a jusante de KmXYLl, e o gene marcador da resistência a G418 sob o controle do promotor ScPDCl e terminador ScGALlO

Os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 69 e SEQ ID NO. 70 foram projetados para amplificar um fragmento ~1,3 kbp do plasmideo pVR95 (Ex. 4A, Figura 13). Esse fragmento inclui a região promotora do gene KmXYLl bem como ~300 bp da região codificadora do gene. Esses iniciadores foram usados para reações de termociclagem com 50 ng de DNA plasmidico de pVR95 (Ex. 4A, Figura 13). A termociclagem foi realizada a 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 53 °C, 1 minuto a 68 °C, e uma incubação final de 8 minutos a 68 °C usando Pfx DNA polimerase (Invitrogen, CA). O produto de PCR foi separado por eletroforese, digerido com PstI e ligado a pVR29 (Ex. 1C, Figura 4) que foi também digerido com PstI. O plasmideo obtido através desse método foi verificado quanto da correta orientação do gene KmXYLl e da região promotora dentro do vetor pBR29. O plasmideo é designado pCM18 (Figura 14a) .

Os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 71 e SEQ ID NO. 72 foram projetados para amplificar um fragmento ~1,1 kbp do plasmideo pVR95. Esse fragmento inclui a região a jusante do gene KmXYLl para além de seu;terminador. Esses iniciadores foram usados para reações de termociclagem com 50 ng de DNA plasmidico de pVR95. A termociclagem foi realizada a 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 53 °C, 1 minuto a 68 °C, e uma incubação final de 8 minutos a 68 °C usando Pfx DNA polimerase (Invitrogen, CA). O produto de PCR obtido após a segunda termociclagem foi separado por eletroforese, digerido com Apal e ligado ao plasmideo pCM18 que foi também digerido com ApaL, para formar o vetor pCMl9 (Figura 14b). O plasmideo pCM19 continha o flanco a jusante do gene KmXYLl e o flanco a montante do gene KmXYLl (juntamente com -300 bp da região codificadora do gene), separados por um cassete contendo o gene G418 sob o controle do promotor ScPDCl e terminador ScGALlO. A correta orientação da região a jusante de KmXYLl com respeito ao gene de resistência a G418 foi verificada.

Exemplo 4C: Construção de um K.marxianus uracil auxotrófico (CD 683) mediante substituir um gene Ura3 funcional com um gene não-funcional O gene K.marxianus Ura3 (KmURA3) foi isolado usando o DNA genômico como molde e inicidadores projetados baseados na seqüência Genbank (no. de acesso AF528508). Um fragmento de 804 bp foi clonado dentro de vetor pBluescript (Stratagene, Wisconsin) e etiquetado pBSKura3Myra (Figura 15) .

Esse plasmideo foi digerido com ExoRV e um fragmento de ~4kbp que possui o gene KmURA3 com um fragmento EcoRV faltante foi isolado e re-ligado presente formar o plasmideo pBSDeltaUra3Km (Figura 15). Esse plasmideo tinha um gene não-funcional (Deltaüra3). O plasmideo foi digerido usando Kpnl e Notl e usado para transformar uma linhagem de K.marxianus tipo selvagem. Os transformantes foram selecionados sobre placas 5-FOA. As colônias que cresceram sobre essas placas foram triadas usando iniciadores projetados na região faltante do gene DeltaUra3. Os iniciadores foram também projetados para isolar o gene inteiro e aqueles fragmentos foram sequenciados para indicar que esse novo gene DeltaUra3 não-funcional mais curto havia substituído o atual gene KmURA3 nativo nos transformantes. As linhagens transformadas de modo bem sucedido foram designadas CD683. A linhagem CD683 não cresceu na placa Sc-Ura, indicando que ela era uracil auxotrófica.

Exemplo 4D: Geração de um mutante K.marxianus (CD804) com o gene xilose redutase (KmXYCl) deletado mediante transformar a linhagem CD683 (Ex. 4C) com o plasmídeo pCMl9 (ex. 4B, Figura 14b) Um fragmento de ~5,2 kbp contendo as regiões a montante e a jusante do gene KmXYCl com um cassete de expressão da resistência a G418 entre elas foi obtido mediante digestão de pCM19 com PvuJJ. Esse fragmento foi usado para transformar linhagem K.marxianus de CD683 usando métodos padrões de eletroporação. As células transformadas foram recuperadas e plaqueadas sobre 10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona de levedura, 50 g/L de glicose (YPD) + 50 pg/mL placas G418 e incubadas a 37 °C por 48-96 horas. 96 transformantes que cresceram sobre placas de YPD+50 μg/mL de G418 foram, plaqueados em réplica sobre placas YPX (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona de levedura, + 50 g/L xilose) + 50 pg/mL de G418. 73 de 96 transformantes falharam em crescer sobre placas de YPX + 50 μρ/mL G418, confirmando sua incapacidade para usar xilose como uma fonte de carbono. Essa incapacidade indica que o gene KmXYLl funcional havia sido deletado e substituído com o cassete G418 em uma recombinação homóloga. Esses transformantes que foram incapazes para usar xilose como uma fonte de carbono foram designados CD804. A ausência de um gene KmXYLl funcional foi verificada usando iniciadores PCR identificados como SEQ ID NO. 75 e SEQ ID NO. 76, os quais foram projetados para amplificar em PCR o centro do gene KmXYLl. A presença do gene G418 foi verificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 77 e SEQ ID NO. 78. Os resultados indicaram que o fragmento do gene de resistência a G418 estava integrado no local do gene KmXYLl. Uma PCR adicional usando um conjunto de iniciadores identificados como SEQ ID NO. 79 e SEQ ID NO. 80 também confirma que o fragmento do gene de resistência a G418 substituiu o gene KmXYLl nativo. A análise Southern também confirma que o gene xilose redutase foi eliminado da linhagem CD804.

Exemplo 4E: Ensaio de atividade enzima xilose redutase para linhagens CD683 (Ex. 4C) e CD804 (Ex. 4D) Frascos de agitação separados providos de defletores (capacidade de 250 mL) foram inoculados com linhagens CD803 (ex. 4C) e CD804 (Ex. 4D) . Os frascos foram incubados a 35 °C com agitação a 250 rpm e crescidos durante a noite. O meio consistiu de 20 g/L extrato de levedura, 10 g/L peptona, e 100 g/L dextrose. Após 18 horas as células foram centrifugadas a 4000G por 5 minutos, lavadas com 100 mM tampão fosfato de sódio e re-suspensas em 0,5 mL de tampão de ruptura. 0 tampão de ruptura consistiu de 100 mM também fosfato de sódio (pH 7,0), 1 mM ditiotreitol (DTT), 40 mg fluoreto de fenilmetil sulfonila (PMSF) (dissolvido em 500 μΐ DMSO), e 4 tabletes de coquetel inibidor Protease (Roche, CA) em um volume de 200 mL. As células foram lisadas mecanicamente usando microesferas de vidro (Invitrogen, CA) e centrifugadas a 14000G por 15 minutos. 0 sobrenadante foi removido e transcorrido através de uma coluna de dessalinização PD-10 de acordo com o protocolo do kit (Amersham Bioscience). A solução de teste do ensaio da enzima XR consistiu de 100 mM tampão fosfato de sódio {pH 7,0), 0,2 mM NADPH, 0,5 mM D-xilose em um volume total de 1 mL, ao qual variadas quantidades de solução da enzima foi acrescentada e a absorbância foi seguida a 340 nm. A utilização de NADPH indica atividade da enzima redutase. Uma solução em branco sem xilose foi usada para determinar o uso base de NADPH. A proteína total foi determinada usando Advanced Protein Assay Reagent (Cysoskeleton #ADV01) com BSA como um padrão. A atividade da enzima xilose redutase da linhagem CD683, como indicado pelo consumo de NADPH, foi de 13,7 mU/mg de proteína. O consumo de NADPH pela linhagem CD804 foi consistente com uma atividade xilose redutase de 4,4mU/g de proteína, preferentemente que a esperada atividade de zero. Essa utilização de NAPDH por CD804 é atribuída a uma enzima aldose redutase não-específica que está realizando alguma conversão de xilose a xilulose. Linhagens CD683 e CD804 são plaqueadas em paralelo uma a outra sobre placas YPX. A linhagem CD804 não mostrou qualquer crescimento sobre essas placas ao final de 4 dias enquanto que a linhagem CD683 cresceu bem sobre essas placas.

Exemplo 5A: Construção de plasmídeo pVR67 (Figura 16) contendo um gene Saccharomyces cerevisiae xiluloquinase (ScXKSl) Células de S.cerevisiae foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC acesso #38626) e crescidas sob condições padrões. O DNA genômico do S.cerevisiae foi extraído usando métodologias convencionais. As reações de amplificação PCR foram realizads usando Pfx polimerase (Invitrogen, CA). Cada reação continha DNA genômico de S.cerevisiae a uma concentração de 500 ng, cada de 4dNTPs (isto é, cada de dATP, dGTP, dCTP e dTTP) a uma concentração de 0,02 mM, e cada um dos iniciadores de amplificação identificado como SEQ ID NO. 81 e SEQ ID NO. 82 a 1 μΜ. A ciclagem foi realizada mediante uma incubação inicial por 10 minutos a 94 °C, seguido por 35 ciclos consistindo de 15 segundos a 94 °C, 15 segundos a 55 °C, e 90 segundos a 68 °C. Um fragmento ~1,8 kbp foi purificado em gel usando procedimentos convencionais e clonado dentro de um vetor de clonagem TA (Invitrogen, CA). 0 plasmídeo resultante (pVR67, Figura 16) foi seqüenciado para verificar a seqüência do gene ScXKSl. O gene apresenta excelente homologia com a seqüência conhecida no Genbank (acesso #X61377). A seqüência nucleotídica obtida do gene ScXKSl é identificada como SEQ ID NO. 83. A seqüência de aminoácidos da enzima codificada por esse gene é identificada como SEQ ID NO. 84.

Exemplo 5B: Construção de plasmídeo pVR52 (Figura 16) contendo o promotor TEF1 (ScTEFl) e o terminador ScGALlO de S.cerevisiae 0 promotor TEFl (ScTEFl) de S.cerevisiae foi clonado do vetor pTEFZeo (Invitrogen, CA) . Os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 85 e SEQ ID NO. 86 foram usados para amplificar o promotor ScTEFl e inserir sítios de restrição Xbal e SstI. O produto PCR e o plasmídeo pNC2 (Ex. IA, Figura 1) foram digeridos com enzimas Xbal e SstI e ligados para obter o plasmídeo pVR52 (Figura 16).

Exemplo 5C: Construção de plasmídeo pVR103 (Figura 18) contendo o gene ScXKSl sob o controle do promotor ScTEFl e terminador ScGALlO 0 plasmídeo pVR67 (Ex. 5A, Figura 16) foi digerido com Xbal e BamHI. Um fragmento ~1,8 kbp contendo o gene ScXKSl foi purificado em gel. 0 plasmídeo pVR52 (Ex. 5B, Figura 16) foi também digerido com Xbal e BamHI e o fragmento desse modo obtido foi ligado ao fragmento ~1,8 kbp proveniente de pVR67 para formar o plasmídeo vetor pVR96 (Figura 16). 0 plasmídeo contém o gene ScXKSl sob o controle do promotor ScTEFl e terminador ScGALlO. Nesse vetor, o sítio de início ATG do gene ScXKSl é de cerca de 130 bp distante do final do promotor ScTEFl. Para reduzir essa distância para cerca de 70-73 bp, iniciadores identificados como SEQ ID NO. 87 e SEQ ID NO. 88 foram projetados que poderíam apliar o promotor ScTEFl do vetor pTERzeo com a correta distância e sítios de restrição. PTEFzeo (Invitrogen, CA) foi usado como o molde. A termociclagem foi realizada a 30 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 57 °C, e 30 segundos a 72 °C, seguido por uma incubação final de 4 minutos a 72 °C usando o sistema Failsafe PCR (Epicentre, Madison, WI). O produto PCR foi separado sobre um gel 0,8% agarose e um fragmento 460 bp foi isolado. Um segundo PCR foi realizado para amplificar esse fragmento usando os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 89 e SEQ ID NO. 90. O produto PCR foi digerido com EcoRI e ligado ao plasmideo Eco-RI-digerido pVR96 (Figura 16) . O plasmideo resultante (pVR102, Figura 17) tinha dois promotores ScTEFl - o segundo deles sendo o promotor condutor do gene ScXKSl. A distância entre o final do promotor e o ATG do gene foi de exatamente 73 bp. O plasmideo pVR102 foi digerido com Sphl e ligado a pPUC19 Sphl-digerido (New England Biolabs, USA) . 0 plasmideo resultante (pVR103, Figura 18) foi seqüeciado para verificar o gene ScXKSl sob o controle de um promotor ScTEFl e terminador ScGALlO.

Exemplo 5D: Construção de plasmideo pVR104 (Figura 19) contendo o cassete de expressão ScXKSl (de pVR103, Ex. 5C) lado a lado com um cassete HisG-ScUra3-HisG (de pVR65, Ex. 3B). O plasmideo pVR65 (Ex. 3B, Figura 19) foi digerido com Sphl, e as pontas 5'-fosfato do vetor linearizado foram desfosforiladas usando fosfatase alcalina de camarão (Roche Diagnostics, USA) seguindo o protocolo do fabricante. O plasmideo pVR103 (Ex. 5C, Figura 18) foi também digerido com Sphl e um fragmento 3,5 kbp que tinha o gene ScXKSl sob o controle do promotor ScTEFl e terminador ScGALlO foi ligado ao fragmento pVR65 linearizado para obter o plasmideo pVR104 (Figura 19).

Exemplo 5E: Geração de um mutante K.marxianus (CD805) que possui uma superexpressa atividade gene ScXKSl e deletado gene xilose redutase pela transformação da linhagem CD804 Um fragmento ~6, 8 kbp PvuJJ do plasmideo pVR104 (Ex. 5D, Figura 19) foi usado para transformar a linhagem CD804 (Ex. 4D) , usando métodos padrões de eletroporação. As células transformadas foram recuperadas em meio YPD, plaqueadas após 4 horas sobre placas Sc-Ura (Qbiogene, CA) e incubadas a 37 °C por 48-72 horas. Os transformantes que cresceram sobre placas SC-Ura ao final de 72 horas foram riscados novamente sobre placas de SC-Ura fresco. Os transformantes riscados novamente foram triados usando colônia de PCR.

Uma única colônia positiva da linhagem transformada foi inoculada dentro de 50 mL de meio YPD e incubada durante a noite a 37 °C com agitação de 200 rpm. 10 μ!, desta foram plaqueados sobre placas 5-FOA e incubados durante a noite a 37 °C. As colônias que cresceram eram resistentes a 5-FOA e foram esperadas ter perdido o gene ScUra3 devido à recombinação das regiões HisG. PCR foi realizado usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 91 e SEQ ID NO. 92 para amplificar uma região de 700 bp para indicar um gene ScXKSl intacto e ~1 kb do gene HisG. Um segundo conjunto iniciador identificado como SEQ ID NO. 93 e SEQ ID NO. 94 foi projetado para amplificar um produto ~1 kb entre ScXKSl e o final do gene. Esses dois conjuntos iniciadores confirmaram que o gene ScXKSl havia se integrado dentro do cromossoma dos transformantes e o gene ScUra3 tinha sido removido através da recombinação espontânea da região HisG. Essa linhagem foi etiquetada CD805 e foi testada posteriormente quanto a aumentada atividade da proteína xiluloquinase.

Os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 91 e SEQ ID NO. 92 foram projetados para amplificar um produto ~2, 6 kbp entre o promotor ScTEFl e a ponta do gene ScXKSl. Os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 92 e SEQ ID NO. 95 foram projetdos para amplificar um produto ~1,7 kbp entre o gene ScXKSl e o início do fragmento. Esses dois conjuntos de inicadores confirmaram que o gene ScXKSl havia se integrado dentro cromossoma da linhagem CD805.

Ensaio da Atividade Xiluloquinase: Frascos de agitação separados providos de defletores (capacidade de 250 mL) foram inoculados com linhagens CD804 (Ex. 4D) e CD805 (Ex. 5E). Os frascos foram incubados a 35 °C com agitação a 250 rpm e crescidos durante a noite. O meio consistiu de 20 g/L extrato de levedura, 10 g/L peptona, e 100 g/L dextrose. Após 16 horas as células foram centrifugadas a 4000G por 5 minutos, lavadas com 100 mM tampão fosfato de sódio e re-suspensas em 0,5 mL de tampão de ruptura. O tampão de ruptura consistiu de 100 mM também fosfato de sódio (pH 7,0), 1 mM ditiotreitol (DTT), 40 mg fluoreto de fenilmetil sulfonila (PMSF) (dissolvido em 500 μL DMSO), e 4 tabletes de coquetel inibidor Protease (Roche, CA) em um volume de 200 mL. As células foram lisadas mecanicamente usando microesferas de vidro (Invitrogen, CA) e centrifugadas a 14000G por 15 minutos. O sobrenadante foi removido e transcorrido através de uma coluna de dessalinização PD-10 de acordo com o protocolo do kit (Amersham Bioscience) . 10 pL dos extrados foram acrescentados a uma mistura de 89 μΐϋ XuK equilibrada a 30 °C (contendo 61 mg Na2ATP-3H20, 10,0 mL 0,1 M HEPES/KOH (pH 7,5), 1,2 mL 0,1 M MgCl2 (diluído a 16,0 mL) , e 10 μL de 20 mM xilulose para um volume total de 100 mL. Água substituiu xilulose como um ensaio em branco. As reações foram terminadas pela fervura por dois minutos e transferidas para gelo. 900 mL de hek2 (40 mM HEPES/KOH (pH 7,5), 10 mM MgCl2-2,5 mM PEP e 0,2 mM NADH) foram acrescentados e centrifugados a 14000G por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para uma cubeta de espectrofotômetro, e a absorbância da linha base a 340 nm foi estabelecida. 10 μΕ de uma mistura 1:1:1 de mioquinase, piruvato qinae, e lactato desidrogenase foi acrescentada e a absorbância final foi medida. A proteína total foi determinada usando Advanced Protein Assay Reagent (Cysoskeleton #ADV01) com BSA como um padrão. A medição da atividade xiluloquinase para a linhagem CD804 foi 69,7 +/- 8,0 mU/mg, enquanto que para a linhagem CD805 foi de 400,8 +/- 102,7 mU/mg, indicando que CD805 superexpressou atividade ScXKSl.

Exemplo 6A: Construção de plasmídeo pCM23 (Figura 20) contendo flancos a montante e a jusante de um gene K.marxianus xilitol desidrogenase (KmXYL2) , e um gene E.coli hph sob o controle de um promotor ScPDCl e terminador ScGALlO

Um fragmento 988 bp contendo a região promotora do gene K.marxianus xilitol desidrogenase (KmXYL2) foi amplificado por PCR para fora do genoma com os iniciadores indicados como SEQ ID NO. 96 e SEQ ID NO. 97. A termociclagem foi realizada através de 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 52 °C, 1 min a 68 °C, seguido por uma incubação final por 8 minutos a 68 °C usando Pfx DNA polimerase (Invitrogen, CA). O produto foi clonado dentro de um vetor TOPOU (Invitrogen, CA) . O plasmideo pUC19 (New England Biolabs, USA) foi digerido com ExoRI e separado sobre 1% gel. Uma banda 2,686 kbp foi isolada do plasmideo pUCl9 e ligada a um fragmento liberado do plasmideo TOPOU pela digestão com EcoRI, criando um plasmideo ~3,674 referido como pCM20.

Um fragmento contendo a seqüência terminadora e a região a jusante de KmXYL2 foi amplificada por PCR do genoma usando três conjuntos de iniciadores. O primeiro conjunto de iniciadores foi identificado como SEQ ID NO. 98 e SEQ ID NO. 99, os quais amplificaram a região de interesse a jusante. A termociclagem foi realizada por 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C e 1 minuto a 68 °C, seguido por uma incubação final por 8 minutos a 68 °C usando Pfx DNA polimerase (Invitrogen, CA). O segundo conjunto de iniciadores é identificado como SEQ ID NO. 100 e SEQ ID NO. 101. Esses foram usados para introduzir sítios Sphl em ambas as pontas usando 2,5 μΙ, do primeiro produto PCR como um DNA molde. A termociclagem foi realizada por 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 60 °C e 1 minuto a 68 °C, seguido por uma incubação final por 8 minutos a 68 °C usando Pfx DNA polimerase (Invitrogen, CA). O terceiro conjunto de iniciadores é identificado como SEQ ID NO. 102 e SEQ ID NO. 103. Esses amplificaram o produto prévio usando 2,5 uL do segundo PCR como um DNA molde. A termociclagem foi realizada por 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 47 °C e 1 minuto a 68 °C, seguido por uma incubação final por 8 minutos a 68 °C usando Pfx DNA polimerase. O produto final foi clonado dentro de um vetor TOPOU (Invitrogen, CA) e digerido com Sphl e separado sobre 1% gel. Um fragmento -1,008 kbp foi isolado e ligado dentro do plasmideo pCM20 Sphl-digerido (do acima) para formar um plasmideo de -4,682 kbp designado pCM21 (Figura 20). O plasmideo pCM21 foi digerido com Saci/Xbal e separado sobre 1,0% gel. Uma banda -4,665 kbp foi isolada e ligada a uma banda -2,366 isolada mediante digerir o plasmideo pPSl (Ex. 1H, Figura 8) com Saci/Spel. O plasmideo -7,031 kbp resultante foi denominado pCM23 (Figura 20). Ele contém os flancos a montante e a jusante do gene KmXYL2, separados por um gene E.coli hph sob o controle transcricional do promotor ScPDCl e terminador ScGALlO.

Exemplo 6B: Geração de um mutante K.marxianus (CD806) a partir da linhagem CD805 (Ex. 5E) usando um fragmento do plasmideo pCM23 (Ex. 6A, Figura 20) para deletar o gene xilitol desidrogenase Uma única colônia de CD805 foi transformada com um fragmento proveniente do plasmideo pCM23 usando métodos padrões de eletroporação. As células transformadas foram recuperadas em meio YPD e plaqueadas após 48 horas sobre placas de YPD + 150 μg/mL higromicina e incubadas a 37 °C por 48 horas. 86 Transformantes que cresceram sobre as placas de YPD + 150 μρ/ιηΐϋ higromicina foram riscados novamente sobre placas frescas de YPD + 150 μ9/ιη:ο higromicina. Os transformantes foram triados por PCR quanto a presença de xilitol desidrogenase nativo com iniciadores identificados por SEQ ID NO. 104 e SEQ ID NO. 105. A termociclagem foi realizada por um ciclo inicial de 10 minutos a 94 °C, 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 50 °C, 1 minuto a 72 °C, seguido por uma incubação final por 8 minutos a 72 °C usando enzima Failsafe (Epicentre, Wisconsin). Um produto PCR de 1064 bp indicou um gene xilitol desidrogenase intacto. 15 Transformantes não produziram o produto esperado, indicando que aquele gene xilitol desidrogenase havia sido deletado de modo bem sucedido a partir daqueles 15 transformantes.

Esses 15 transformantes foram triados usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 106 e sequie 107. Esse conjunto de iniciadores foi projetado para amplificar em PCR as pontas 5'. Um resultado positivo (fragmento ~1,5 kpb) indica que o fragmento do gene de resistência à higromicina substituiu o gene KmXYL2 no cromossoma do transformante em uma permuta 5'. Um terceiro conjunto iniciador identificado como SEQ ID NO. 108 e SEQ ID NO. 109 foi projetada para amplificar as pontas 3'. Um produto ~1 kbp indica que o fragmento de gene de resistência a higromicina substituiu o gene KmXYL2 no cromossoma do transformante em uma permuta 3'. Dos 15 transformantes, dois mostraram bandas correspondentes a ambos os produtos PCR. Um desses foi etiquetado linhagem CD806. A linhagem CD806 tem uma superexpressada atividade do gene ScXKSl e deletados genes xilose desidrogenase (KmXYL2) e xilose redutase.

Ensaio da atividade xilitol desidrogenase: Frascos de agitação providos de defletores separados (capacidade de 250 mL) foram inoculados com linhagens CD805 (Ex. 5E) e CD806 (Ex. 6B). Os frascos foram colocados a 33 °C com agitação a 250 rpm e crescidos durante a noite. O meio consistiu de 20 g/L extrato de levedura, 10 g/L peptona, e 100 g/L dextrose. Após 16 horas as células foram centrifugadas a 4000G por 5 minutos, lavadas com 100 mM tampão fosfato de sódio e re-suspensas em 0,5 mL de tampão de ruptura. 0 tampão de ruptura consistiu de 100 mM também fosfato de sódio (pH 7,0), 1 mM ditiotreitol (DTT), 40 mg fluoreto de fenilmetil sulfonila (PMSF) (dissolvido em 500 μL DMSO), e 4 tabletes de coquetel inibidor Protease (Roche, CA) em um volume de 200 mL. As células foram lisadas mecanicamente usando microesferas de vidro (Invitrogen, CA) e centrifugadas a 14000G por 15 minutos. O sobrenadante foi removido e transcorrido através de uma coluna de dessalinização PD-10 de acordo com o protocolo do kit (Amersham Bioscience). A amostra foi acrescentada a uma solução de teste consitindo de 100 mM tampão fosfato de sódio (pH 7,0), 0,2 mM NADH, e 20 mM xilose. A absorbância foi seguida a 340 nm. A proteína total foi determinada usando Advanced Protein Assay Reagent (Cysoskeleton #ADV01) com BSA como um padrão. A medição da atividade xiluloquinase para a linhagem CD805 (Ex. 5E) produziu uma atividade enzimática de 14,5 + /- 1,6 mU/mg, enquanto que a atividade da linhagem CD806 foi de 0,0 +/- 0,1 mU/mg. Esses resultados indicam que a atividade da enzima xilitol desidrogenase foi deletada na linhagem CD806.

Exemplo 7A: Geração do mutante K.marxianus (CD882) possuindo gene PXYLA exógeno, superexpressada atividade do gene ScCKSl, e deleções dos genes KmXYLl e KmXYL2 pela transformação da linhagem CD806 (Ex. 6B) com plasmideo pCM28 (Ex. 3B, Figura 12).

Uma única colônia da linhagem CD806 foi transformada com plasmideo pCM28 Nael-digerido usando métodos padrões de eletroporação. Os transformantes foram crescidos a 37 °C durante a noite, e riscados por sobre cinco placas Sc-Ura idênticas para triagem. A presença do gene PXYLA foi verificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 110 e SEQ ID NO. 111. O transformante resultante (designado CD882) continha o gene PXYLA reconstruído, superexpressada atividade gene ScXYSl, e deleções dos genes KmXYLl e KmXYL2.

Exemplo 7B: Análise enzimática e análise Western da linhagem CD882 (Ex. 7A) A proteína oriunda de CD882 foi purificada em coluna usando resina quelante Probond Ni2+ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ligando a cauda 6X poli-his. Uma prova investigativa conjugada Ni-NTA-HRP (qiagen, Valencia, CA, USA) foi usada para a deleção direta das proteínas objetivadas. A análise Western das frações coletadas durante a purificação também confirma a presença da proteína XI na linhagem CD882. As medições da atividade enzimática foram feitas de acordo com o método descrito em "The Streptomyces rubiginous xylose isomerase is misfolded when expressed in Saccharomyces cerevisiae", Gardonyl e outros, 2003. A avaliação confirma a atividade isomerase na mesma fração onde a cauda 6X poli-his do gene PXYLA havia sido detectada pela análise Western na linhagem CD882.

Exemplo 8A: Construção do plasmídeo (pCM29, Figura 21) contendo o gene PXYLA com códon de parada que impede a codificação da cauda poli-his O reconstruído gene PXYLA (Ex. 2A) foi amplificado em PCR usando os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 112 e SEQ ID NO. 113 usando pCM17 (Ex. 2B, Figura 10) como um gabarito. A termociclagem foi realizada através de 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C, 1,5 minuto a 72tc, seguido por uma incubação final por 8 minutos a 72 °C usando Pfx DNA polimerase. O produto PCR foi digerido com Sbfl e separado por eletroforese sobre um gel 1,0% agarose. Um produto 1319 bp foi isolado e ligado a um fragmento 6829 bp obtido pela digestão do ; plasmídeo pCM9 (Ex. II, Figura 9) com Sbfl para construir um plasmídeo -8148 bp (pCM29, Figura 21). 0 plasmídeo continha o gene PXYLA com cauda poli-his inoperante, sob o controle do promotor KmPCDl e terminador ScCYCl, e cassete da expressão E.coli hph.

Exemplo 8B: Geração de uma linhagem mutante K.marxianus (CD861) contendo gene PXYLA não-his-etiquetado, superexpressada atividade ScXKSl e deletados genes xilose desidrogenase e xilose redutase, pela transformação da linhagem CD806 (Ex. 6B) com plasmideo pCM29 (Ex. 8A, Figura 21) Um fragmento 3,192 kb PvuTT/Sphl obtido pela digestão de pCM29 é usado para transformar a linhagem CD806, usando métodos padrões de eletroporação. As células transformadas foram recuperadas em meio YPD e plaqueadas após 6 horas sobre YPX + 300 μg/mL G418 + 150 μg/mL higromicina (pH 7,0) . Após 5 dias a 30 °C, várias centenas de pequenas colônias e uma grande colônia haviam crescido. A colônia foi designada CD861. O genoma parceiro foi realizado sobre linhagem CD861 para averiguar como o gene PXYLA havia se integrado. O gene PXYLA foi descoberto ter se integrado com uma ou mais cópias na parte imediatamente mais acima da região promotora do gene PDC nativo. Uma cópia estava sob o controle de uma região promotora KmPDCl -1236 bp, presente no plasmideo pCM29, que inclui cerca de 142 bp de um gene a montante, e o terminador ScCYCl. Uma outra cópia estava na parte imediatamente mais abaixo desse terminador ScCYCl, e incluiu um promotor 1026 bp que encaixa no comprimento do promotor KmPDCl nativo. Esse promotor é faltante da região 142 bp do gene a montante e um adicional -64 bp na extremidade 5' , comparado ao promotor pCM29 e a primeira cópia. A segunda cópia estava também sob o controle de um terminador ScCYCl. Na parte imediatamente mais abaixo desse segundo terminador ScCYCl estava o promotor KmPDCl 1026 bp nativo, seguido pelo gene KmPDCl nativo.

Exemplo 8C: Análise da enzima xilose isomerase, xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase de CD861 (Ex. 8B) Frascos de agitação separados providos de defletores (capacidade de 250 mL) foram inoculados com linhagens CD806 (Ex. 6B) e CD861 (Ex. 8B). Os frascos foram incubados a 30 °C e crescidos durante a noite com agitação a 250 rpm. O meio consistiu de 20 g/L extrato de levedura, 10 g/L peptona, e 100 g/L dextrose suplementado com 300 μg/mL G418 e 150 μρ/ιτΛ higromicina. As células foram lisadas usando solução Y-PER (Pierce-Rockford, IL) seguido por dessalinização usando colunas PD-10 (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) . Uma solução de teste consistindo de 100 mM TES-NaOH, 250 mM xilose, 10 mM MgCl2, 0,6 mM NADH, 1 U SDH (Sigma) (pH 7,0) foi trazida até 1,0 mL com a adição de 100 μΐ de extrato celular. A atividade xilose isomerase foi determinada usando um ensaio em branco com a mesma solução de teste, apenas sem xilose. A atividade xilose isomerase para a linhagem CD806 foi zero, enquanto que aquela da linhagem CD861 foi 1,07 +/- 0,21:U/mg de extrato bruto. Isso verifica que a linhagem CD861 continha um gene xilose isomerase funcionando.

Os ensaios de xilose redutase, xilitol desidrogenase foram também conduzidos para verificar a atividade/perda da atividade na linhagem final. A linhagem CD861 (Ex. 8B) e a linhagem CD683 (ex. 4C) foram crescidas separadamente durante a noite em meio consistindo de 20 g/L de extrato de levedura, 10 g/1 peptona, e 100 g/L dextrose (suplementado com 300 pg/mL G418 e 150 μg/mL higromicina para a linhagem CD861). As células foram lisadas usando Advanced Protein Assay Reagent (Cysoskeleton #ADV01) com BSA como um padrão. A atividade da enzima xilose redutase na linhagem CD861 foi de 260 +/- 41,8 mU/mL vs. 516,5 +/- 10,6 mU/mL para a linhagem 683. A redução de ~50% na atividade indica a deleção do gene xilose redutase, com a atividade medida sendo atribuída a uma enzima aldose redutase não-específica que esteja realizando alguma conversão de xilose a xilulose. A atividade da enzima xilitol desidrogenase foi de 12,4 +/- 4,4 mU/mL para a linhagem CD861 vs. 110,4 +/- 7,2 mU/mL para a linhagem CD683. A atividade enzima xiluloquinase foi de 370,5 +/- 147,6 mU/mL para a linhagem CD861 vs. 44,8 +/- 8,2 mU/mL para a linhagem CD683.

Exemplo 8D: Análise cinética do gene PXYLA na linhagem CD861 (Ex. 8B) Uma única colônia da linhagem CD861 foi inoculada para crescimento durante a noite em meio consistindo de 10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona, e 100 g/L dextrose. As células foram colhidas.por centrifugação, lavadas uma vez com 10 mL 100 mM fosfato de sódio, 1 mM PMSF (pH 7,0) e centrifugadas novamente. Para isso, 2 mL de solução Y-PER foi acrescentado e suavemente re-suspensa e a solução celular foi incubada na temperatura ambiente por 30 minutos com agitação intermitente. As células foram centrifugadas e o sobrenadante foi dessalinizado usando colunas PD-10 (Amersham Biosciences). Os ensaios enzimáticos foram conduzidos como descrito no Exemplo 8C, com a única diferença sendo que o substrato foi variado de 0,05-10 ,M xilose. Km e Vmax foram derivados de marcações Michaelis-Menten, as quais produziram um correspondente Vmax de ~1,8 com um correspondente Km de 2,2 mM xilose. Uma marcação de Linweaver-Burk produziu um correspondente Vmax de ~1,0 com um correspondente Km de 1,2 mM xilose.

Exemplo 8E: Estudos da inibição da atividade PXYLA em linhagem CD861 (Ex. 8B) usando xilitol Linhagem CD861 foi crescida em meio xilose contendo concentrações variadas de xilitol, um inibidor xilose isomerase conhecido. O Km para a enzima xilose isomerase dobrou quando os niveis de xilitol foram aumentados de 0 a 0,25 mM, e dobrou novamente quando os niveis de xilitol são aumentados para 0,50 mM.

Exemplo 8F: Tolerância a pH do gene PXYLA na linhagem CD861 (Ex. 8B) Uma única colônia de CD861 foi inoculada para crescimento durante a noite em meio consistindo de 10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona e 100 g/L dextrose. As células foram colhidas por centrifugação, lavadas uma vez com 10 mL de 100 mM fosfato de sódio, 1 mM PMSF (pH 7,00 e centrifugadas novamente. Para isso, 2 mL de solução Y-PER foi acrescentado e suavemente re-suspensa e a solução celular foi incubada na temperatura ambiente por 30 minutos com agitação intermitente. As soluções duplicata de teste consistiram de 100 mM TES-NaOH, 10 mM MgCl2, 0,6 mM NADP, 250 mM xilose e 1 U SDH, respectivamente ajustado para pH 7,0; 6,6; 5,9; 4,6; e 3,8; usando 5M ácido latico (Sigma, USA) em volume de 900 μΕ. Para isso 100 μΕ da enzima ou uma sua diluição foi acrescentada para trazer o volume final para 1 mL. A atividade enzimática foi medida como no Exemplo 8C. A atividade ótima foi obtida a pH 6,5. A pH 5,9 a proteína reteve 45% da atividade máxima.

Exemplo 9A: Caracterização de linhagens CD806 (Ex. 6B), CD861 {Ex. 8B) , e CD882 (Ex. 7A) em frascos de agitação microaeróbica Colônias únicas de linhagens CD806, CD861 e CD882 foram inoculadas separadamente para crescimento durante a noite em 100 mL de meio consistindo de 20 g/L extrato de levedura, 10 g/L peptona, e 100 g/L dextrose suplementado com 300 μg/mL G418 e 300 μρ/mL higromicina. Os pesos em células secas foram determinados e o volume apropriado do meio para 2 gramas de células secas em peso (gcdw) foi centrifugado e re-suspenso em 50 mL de meio consistindo de 20 g/L peptona de levedura, 10 g/L extrato de levedura, 50 g/L xilose e 10 mM MgCl2, a pH 7,0. As células foram colocadas em um frasco de agitação provido de defletores e colocadas a 30 °C com agitação de 70 rpm. A linhagem CD806 produziu 0,7 g/L xilitol como seu único produto. A linhagem CD882 produziu 13,5 g/L etanol, 0,4 g/L xililtol e pequenas quantidades de glicerol, acetato, e succínico (<2 g/L total).

Exemplo 9B: Caracterização das linhagens CD806 (Ex. 6B), CD861 (Ex. 8B), e CD882(Ex. 7A) em frascos tubo de agitação Colônias únicas de linhagens CD806, CD861 e CD882 foram inoculadas separadamente para crescimento durante a noite em 100 mL de meio consistindo de 20 g/L extrato de levedura, 10 g/L peptona, e 100 g/L dextrose suplementado com 300 μg/mL G418 e 300 μg/mL higromicina. 50 mL dos crescidos durante a noite provenientes de cada linhagem foram centrifugados, em seguida re-suspensos em 25 mL do meio de produção consistindo de 20 g/L peptona de levedura, 10 g/L extrato de levedura, 50 g/L xilose e 10 mM MgCl2, a pH 7,0. Uma alíquota de 1 mL da re-suspensão celular foi acrescentada a 4 5 mL do meio de produção em um tubo Falcon de 50 mL, e OD inicial foi tomado (ver apêndice para os valores de OD) . Isto foi repetido várias vezes para assegurar que amostras suficientes puderam ser tomadas ao longo do experimento. Os tubos foram em seguida colocados em condições de produção 33 °C e 200 rpm. A linhagem CD861 produziu 21 g/L etanol e apresentou uma produtividade em volume de 0,3 g/L-hora sob essas condições. A linhagem CD806 falhou em consumir qualquer xilose. As linhagens CD861 e CD882 foram ambas capazes de crescimento anaeróbico.

Exemplo 10A: Construção de plasmídeo pVR113 (Figura 22) contendo gene L.helveticus L-lactato desidrogenase (LhLDH) sob controle do promotor ScPGK e terminador ScGALlO e gene ScUra3 sem repetições flanqueadoras His PCR foi realizada usando plasmídeo pCM28 (Ex. 3B, Figura 12) como um gabarito e iniciadores identificados como SEQ ID NO. 114 e SEQ ID NO. 115, para introduzir sítios Sphl removendo ao mesmo tempo as repetições flanqueadoras HisG. A termociclagem foi realizada mediante um ciclo inicial de 10 minutos a 94 °C, seguido por 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 45 °C, 1,4 minuto a 72 °C, seguido por uma incubação final por 8 minutos a 72 °C usando enzima Taq DNA polimerase (Qiagen, USA) . O plasmideo resultante foi digerido com Sphl para obter um fragmento -1,45 kbp contendo o gene ScUra3 sem repetições flanqueadoras HisG.

Um plasmideo (identificado como pVR39) na Figura 6 e no Exemplo 1E de WO 03/102152A1 contendo o gene L.helveticus lactato desidrogenase (LhLDH) sob o controle do promotor ScPGK e do terminador ScGALlO, e do gene marcador de resistência a G418 sob o promotor ScPGK e terminador ScGALlO, foi digerido com Sphl para criar um fragmento -5,16 kbp. Esse fragmento -5,16 kbp foi ligado ao fragmento -1,45 kbp proveniente do acima para formar um plasmideo -6,61 kbp (pVR113, Figura 22).

Exemplo 10B: Geração de linhagem mutante K.marxianus (CD896) contendo gene lactato desidrogenase exógeno, gene PXYLA não-his-etiquetado, superexpressada atividade do gene ScXKSl e deletados genes xilose desidrogenase e xilose redutase, pela transformação da linhagem CD681 (Ex. 8B) com plasmideo pVR113 (Ex. 10A, Figura 22).

Uma única colônia da linhagem CD861 foi transformada com plasmideo pVR113 usando métodos padrões de eletroporação. As células transformadas foram recuperadas em YPD por 24 horas seguida por plaqueamento sobre placas Sc-Ura. Um transformante positivo (linhagem CD896) foi selecionado por triagem PCR para o cassete LhLDH/ScUra3. O transformante apresentou positivos resultados PCR com iniciadores xilose isomerase e xiluloquinase, e negativos para iniciadores xilose redutase e xilitol redutase também.

Exemplo 10C: Caracterização da linhagem CD806 (Ex. 10B) em frasco de agitação Uma única colônia da linhagem CD896 (Ex. 10B) foi inoculada dentro de 50 mL de YPD (10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona e 100 g/L glicose em um frasco de agitação de 250 mL provido de defletores) e crescidos por 16 horas a 250 rpm e 37 °C. A partir dessa cultura, 3 gcdw foi inoculado dentro de YP (10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona) com 50 g/L xilose e 23 g/L CaC03 em frascos agitados (microaeróbico) e garrafas de vidro de 250 mL (anaeróbico). Os frascos foram incubados a 42 °C e as amostras retiradas para HPLC a intervalos aleatórios. A fermentação da linhagem CD896 sob condições microaeróbicas produziu um titulo de ácido L-lático de 39 g/L e rendimentos de 77%-79% sobre a xilose consumida. A produtividade volumétrica do ácido L-lático produzido foi de 1 g/L/hora enquanto que a taxa inicial de consumo estava entre 1,0 e 1,4 g/L/hora. A fermentação da linhagem D896 em YP + 50 g/L xilose + 23 g/L carbonato de cálcio sob condições anaeróbicas de produção produziu 10 g/L ácido L-lático nas primeiras 24 horas após o que o consumo de xilose parou.

Exemplo 11A: construção de plasmideos duplicata contendo o reconstruído gene PXYLA com (pCM31, Figura 23) e sem (pVR118, Figura 24) cauda poli-his codificada, juntamente com gene ScUra3 sem repetições flanqueadoras His Esse experimento foi projetado para elucidar o efeito da etiqueta poli-his sobre a atividade do gene PXYLA reconstruído. 5 μg de pCMl4 (Ex. 3A, Figura 11) foi digerido com Sphl e separado por eletroforese sobre um gel 1, 0% agarose. Um produto -5889 bp foi isolado e ligado a um fragmento 1450 bp obtido pela digestão do plasmideo pVRH3 (Ex. 10A, Figura 22) com Sphl para formar um plasmideo -7339 bp (pCM31, Figura 23). O plasmideo pCM31 contém o gene PXYLA com cauda poli-his e sob o controle do promotor KraPDCl e terminador ScCYCl, e o cassete de expressão ScUra3. Separadamente, 5 ug de plasmideo pCM29 foram digeridas com Sphl, e separado por eletroforese sobre um gel 1,0% agarose. Um produto -5892 bp foi isolado, e ligado a um plasmideo -7342 bp (pVR118, Figura 24) . O plasmideo pVR118 é similar ao plasmideo pCM31, mas contém um códon de parada que impede a codificação da cauda poli-his.

Exemplo 11B: Geração de linhagens mutantes K.marxianus contendo o reconstruído gene PXYLA com (CD929) e sem (CD931) etiqueta poli-his codificada, juntamente com gene ScUra3 sem repetições flanqueadoras His, mediante transformação da linhagem CD806 (Ex. 6B) com plasmídeos pCM31 (Ex. 11A, Figura 23) e pVR118 (Ex. 11A, Figura 24) Uma única colônia de linhagem K.marxianus CD806 (ex. 6B) foi transformada com plasmideo pCM31 usando métodos padrões de eletroporação. As células transformadas foram recuperadas em meio YPD e plaqueadas após 4 horas sobre placas Sc-Ura. Dois transformantes foram verificados por PCR conter o gene PXYLA reconstruído (com etiqueta poli-his codificada) e superexpressaram o gene ScXKSl, e também para confirmar as deleções dos genes KmXYLl e KmXLL2. Um desses transformantes foi designado linhagem CD929. A linhagem K. marxíanus CD806 foi transformada com plasmideo pVR118 usando métodos padrões de eletroporação. Um transformante que foi verificado por PCR conter o gene PXYLA reconstruído (sem etiqueta poli-his codificada) e superexpressado gene ScXKSl, e ter deleções dos genes KmXYLl e KmXYL2, foi designado linhagem CD931. 0 genoma parceiro da linhagem CD931 mostra que o gene PXYLA tinha integrado duas vezes, do mesmo modo como descrito para a linhagem CD861 (Ex. 8B).

Exemplo 11C: Caracterizações de linhagens CD929 e CD931 em frascos de agitação (Ex. 11B) Colônias únicas de CD929 e CD931 (Ex. 11B) foram inoculadas separadamente dentro de 100 mL de 10 g/L extrato levedura, 20 g/L peptona, 70 g/L glicose, 300 μg/mL G418 + 150 pg higromicina em um frasco de agitação de 250 mL provido com defletores. As culturas foram incubadas durante a noite a 35 °C com 250 rpm. As células foram inoculadas dentro de tubos Falcon de 50 mL contendo 45 mL de meio de produção (10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona, 50 g/L xilose, 100 mM Tes-NaOH, 10 mM MgCl2, pH 7,0), para um OD de 0,2. Os tubos foram colocados a 37 °C e 250 rpm, amostrados a intervalos aleatórios e analisados por HPLC. A linhagem CD929 produziu 1,7 g/L EtOH e acumulou 1,1 g/L xilulose. A linhagem CD931 produziu 15,2 g/L EtOH enquanto que acumulou 4,5 g/L de xilulose. A performance relativa dessas linhagens indica que a formação de etanol é cerca de nove vezes maior quando o gene xilose isomerase não contém a etiqueta poli-his. De modo similar, a formação de xilulose é aumentada em quatro vezes quando a cauda poli-his está ausente.

Exemplo 12A: Reinserção do gene KmXYL2 dentro da linhagem CD861 (Ex. 8B) mediante transformação com plasmideo pCM52 (Figura 25); avaliações em frasco de agitação dos transformantes resultantes O gene KmXYL2 juntamente com 982 bp do flanco 5' e 200 bp do flanco 3' foi amplificado a partir do DNA genômico de uma linhagem K.marxianus do tipo selvagem, usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 116 e SEQ ID NO. 117. Esses iniciadores introduzem sítios de restrição SacII. 0 produto PCR resultante foi digerido com SacII e ligado a um similarmente digerido, plasmideo pVR113 de camarão tratado por fosfato alcalino (Ex. 10A, Figura 22). O plasmideo resultante foi designado pCM52 (Figura 25) . Os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 118 e SEQ ID NO. 119 foram usados para triar pCM52. O gene KmXYL2 amplificado foi seqüenciado e descoberto conter dois erros, um dos quais foi silente e um causando uma mudança aminoácido 8 5V—>1. 0 plasmideo pCM52 foi digerido com PvuII e transformado na linhagem CD861 (Ex. 8B) usando métodos padrões de eletroporação. Os transformantes foram plaqueados por sobre placas Sc-Ura e incubados a 37 °C. Os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 104 e SEQ ID NO. 105 foram usados para amplificar a região codificadora do gene KmXYL2 e iniciadores identificados como SEQ ID NO. 120 e SEQ ID NO. 121 foram usados para amplificar a região contendo o gene ScUra3 através do flanco 5' de e para dentro da região codificadora do gene KmXYL2. Cinco transformantes positivos para ambas as bandas e apresentando atividade KirtXDH (transformantes XDH+) foram tomados para análise em frasco de agitação. A atividade KmXDH dos transformantes XDH+ mostra que os erros introduzidos para dentro do gene não destruiram sua atividade.

Os isolados provenientes de cada um dos cinco transformantes XDH+ foram obtidos mediante passagem deles através de placas YPX duas vezes. Os isolados foram em seguida inoculados dentro de meio YPX (pH 6,5) e incubados durante a noite a 35 °C. 2 gcdw de cada um foi colhido por centrifugação e re-suspensos em 50 mL de 10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona, 50 g/L xilose, 10 mM MgCl2 e 7,5 g/L CaC03. Os frascos são colocados em produção a 35 °C e agitação de 70 rpm. A linhagem CD861 (Ex. 8B) é similarmente cultivada, para comparar o efeito da re-inserção de KmXYL2. A linhagem CD861 tem uma produtividade volumétrica de 0,46 g/L-hora e uma taxa de consumo de xilose de 1,47 g/L-hora. Os cinco transformantes XDH+ tiveram produtividade média 70% menor e consumo de xilose 65% menor. Após -48 horas, a linhagem CD861 produziu ~14 g/L etanol e -4,7 g/L xilitol, enquanto que cinco transformantes XDH+ produziram -2,8-6,3 g/L etanol e 1,2-2,2 g/L xilitol. Todos menos um dos transformantes XDH+ pararam de produzir etanol após 40 horas, embora eles todos continuassem a consumir linearmente xilose nas próximas 40 horas.

As células tomadas no inicio da produção e após 67 horas de produção são lisadas e a quantificação de proteína foi realizada usando o Advanced Protein Assay Reagent (Cytoskeleton-USA). Uma solução 10X foi preparada mediante adição de 2,355 mL tampão fosfato de sódio 1M (pH 7,0) a 5 mg β-NADH (Sigma), terminando em uma concentração final de NADH de lm5 mM. Água é acrescentada até um volume de 950 μΐ. (menos o volume da amostra) . O extrato livre de células é então acrescentado e a absorbância seguida a 340 nm por vários minutos para determinar a linha de base. 50 μΐί de 0,4 M xilulose foram então acrescentados e a absorbância a 340 nm foi seguida para determinar a atividade XDH. A atividade XDH para cinco transformantes XDH+ tomados no início da produção variou na faixa de 287-374 mU/mg. Após 67 horas de produção, as atividades XDH variaram de 62-86 mU/mg. A atividade XDH para a linhagem CD8 61 foi de 16 mU/mg no início da produção e de 3 mU/mg após 67 horas de produção.

Exemplo 12B: Deleção do gene ScXKSl da linhagem CD861 (Ex. 8B) mediante transformação com plasmídeo pCM28 (Ex. 3B, Figura 12); avaliações dos transformantes resultantes em frasco de agitação O plasmídeo pCM28 foi separadamente linearizado com Nael e PvuJJ e transformado na linhagem CD861 usando métodos padrões de eletroporação. As células foram recuperadas em YPD por 3 horas seguido por plaqueamento por sobre meio de Sc-Ura. 32 colônias foram re-riscadas por sobre placas duplicatas. Estas foram triadas em PCR usando iniciadores idenficados como SEQ ID NO. 122 e SEQ ID NO. 123 para amplificar a região codificadora do gene ScXKSl. Seis colônias que falharam em produzir a banda (indicando assim a ausência do gene ScXKSl) foram inoculadas durante a noite em YPD para permitir a replicação do gene ScUra3, e plaqueada por sobre placa FOA para selecionar aquelas nas quais o evento de replicação ocorreu. Colônias que surgiram foram re-riscadas por sobre YPD para selecionar quanto a colônias únicas isoladas. Um isolado proveniente de cada transformação foi triado usando os iniciadores acima, e também quanto à presença de PXYLA, KmXYLl e KmXYL2. Uma triagem PCR adicional foi realizada para triar quanto a um evento de dupla permuta, no qual o cassete ScXKSl foi substituído com o cassete PXYLA do plasmídeo pCM28. Todos os seis isolados testaram positivamente para PXYLA e negativo para genes KmXYLl, KmXYL2 e ScXKSl. Um desses foi designado CD1065 e enviado para avaliação em frasco de agitação.

As linhagens CD1065 e CD861 foram separadamente inoculadas dentro de frascos de agitação de 2590 mL contendo 50 mL YPD, e incubadas durante a noite a 37 °C e 250 rpm. As células foram colhidas e 4 gcdw foram inoculados dentro de 50 mL YPX. O frasco foi incubado a 35 °C e agitado a 70 rpm. As amostras foram retiradas periodicamente para monitorar a atividade de fermentação. A linhagem CD1065 apresenta um lapso de tempo de 10-20 horas durante o qual ela consome xilose muito lentamente. Isso é atribuído à repressão glicose dos genes xiluloquinase naturais. Após esse período de indução, a taxa de consumo de xilose aumenta, e a linhagem CD1065 produz cerca de 13 g/L etanol após 65 horas. A linhagem CD861 produz etanol muito mais rapidamente, produzindo cerca de 18 g/L etanol após cerca de 20 horas. A linhagem CD1065 produz cerca de 3,7 g/L de xilulose após cerca de 20 horas, mas a concentração de xilulose se reduz gradualmente a seguir. A atividade xiluloquinase é de cerca de 0 para a linhagem CD1065 e de cerca de 417 mU/mg para a linhagem CD861. As taxas de consumo de xilose para a linhagem CD861 são de aproximadamente o dobro daquelas da linhagem CD1065. A atividade xilose isomerase é de cerca de 0,96 U/mg para a linhagem CD1064 e de cerca de 1,79 U/mg para a linhagem CD861. Esses resultados indicam que a superexpressão da xiluloquinase melhora significativamente a utilização e as taxas de produção de etanol sob essas condições.

As células provenientes das linhagens CD861 e CD1065 foram removidas seguindo a fase de produção, riscadas por sobre placas YPX e colocadas em um vaso anaeróbico. Ambas cresceram de modo comparável.

Exemplo 12C: Reinserção do gene KmXYLl dentro da linhagem CD861 (Ex. 8B) mediante transformação com plasmideo pCM55 (gi 26) ; avaliações em frasco de agitação dos transformantes resultantes 0 gene KmXYLl juntamente com 890 bp do flanco 5' e 414 bp do flanco 3' foi amplificado a partir do DNA genômico de um tipo selvagem da linhagem K.marxianus, usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 124 e SEQ ID NO. 125. Esses iniciadores introduzem sítios de restrição ScII. O produto PCR resultante foi digerido com SacJI e ligado a um similarmente digerido, plasmideo de camarão fosfato alcalino-tratado pVRH3 (Ex. 10A, Figura 22) . 0 plasmideo resultante foi designado pCM55 (Figura 26) . Os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 118 e SEQ ID NO. 126 foram usados para triar o plasmideo pCM55, e o mapeamento da restrição com BstBI e Sbfl foi usado para confirmar a orientação. O gene KmXYLl amplificado foi seqüenciado e descoberto conter três erros, um dos quais era silente e os outros causadores de alterações 71v—>A, 112Y—>H e 3021—»V. O plasmideo pCM55 foi digerido com PvuII e transformado na forma da linhagem CD861 (Ex. 8B) usando métodos padrões de eletroporação. Os transformantes foram plaqueados por sobre placas Sc-Ura e incubados a 37 °C. Os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 127 e SEQ ID NO. 128 foram usados para amplificar a região codificadora do gene KmXYLl e os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 212 e SEQ ID NO. 129 foram usados para amplificar a região contendo o gene ScUra3 através do flanco 3' da e para dentro da região codificadora do gene KmXYLl. Seis transformantes positivos para ambas as bandas (transformantes XR+) foram tomados para as análises em frasco de agitação.

Os isolados provenientes de cada um dos cinco transformantes XR+ foram obtidos mediante riscar novamente do meio mínimo por sobre YPD. Os isolados foram em seguida riscados novamente por sobre YPX + 300 pg/mL G418 + 300 pg/mL higromicina antes da inoculação em meio YPX. Esses transformantes foram então inoculados dentro de um meio contendo 10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona, 50 g/L xilose (pH 6,5) e incubados a 35 °C por 48 horas. 1 gcdw de cada um foi colhido por centrifugação e re-suspenso em 50 mL de 10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona, 50 g/L xilose, 10 mM MgCl2 e 7,5 g/L CaC03. Os frascos foram colocados em produção a 35 °C e em agitação a 70 rpm. A linhagem CD861 (Ex. 8B) é similarmente cultivada, usando 2 gcdw, para comparar o efeito da re-inserção KmXYLl. A linhagem CD861 tem uma produtividade volumétrica de 0,7 9 g/L-hora e uma taxa de consumo de xilose de 2,02 g/L-hora (com base em 2 gcdw) . Cinco dos transformantes XR+ apresentaram um lapso de cerca de 20-50 horas, e em seguida apresentaram produtividades em volume variando de 0,05-0,13 g/L-hora e taxas de consumo de xilose de 0,45-0,67 g/L-hora. Os rendimentos de etanol para esses transformantes XR+ foram de 18-33%, comparado a 51% para a linhagem CD861.

As células tomadas no inicio da produção e após 67 horas de produção são lisadas e a quantificação de proteína foi realizada usando o Advanced Protein Assay Reagent (Cytoskeleton-USA). Uma diluição de 100 μΕ do extrato celular foi acrescentada a uma alíquota de 900 μL de uma solução de 100 mM fosfato de sódio, 0,5 M D-xilose e 0,2 mM NADPH equilibrado a 37 °C. A absorbância foi seguida para determinar a atividade de KmXYLl. Cinco das linhagens XR+ possuem atividades XR na faixa de -34-86 mU/mg. A atividade de KmXYLl desses cinco transformantes XR+ mostra que os erros introduzidos dentro do gene não destruíram sua atividade. A atividade KmXYLl da linhagem CD861 é de aproximadamente 4 mU/mg. 0 sexto transformante XR+ mostra uma atividade KmXYLl de 19,5 mU/mg, muito menor que as outras. Como tal, ele se parece com a linhagem CD8 61 muito mais do que os outros. Essa sexta linhagem XR+ se desempenha similarmente como CD861 no cultivo em frasco de agitação (após o período de lapso de tempo inicial) e produz cerca de 13,8 g/L de etanol após cerca de 51,5 horas.

Esses resultados mostram que a atividade XR nativo tem um efeito adverso sobre a capacidade dessas linhagens em fermentar xilose a etanol sob essas condições.

Exemplo 12D: Reinserção de genes KmXYXl e KmXYL2 dentro da linhagem CD861 (Ex. 8B) mediante transformação com plasmídeo pCM58 (Figura 27); avaliações em frasco de agitação dos transformantes resultantes Um plasmídeo é construído do mesmo modo como descrito para o plasmídeo pCM52 (Ex. 12A, Figura 25), exceto que os flancos do gene KmXYL2 estão orientados na direção oposta que no plasmídeo pCM52. Esse plasmídeo é designado pCM53. O gene KmXYL2 no plasmídeo pCM58 é seqüenciado e descoberto conter quatro erros, três dos quais são silentes e o outro soma para uma mutação do aminoácido 2601—»V. O gene KmXYLl juntamente com a região do flanco 5' da região do flanco 3' do gene foi amplificado a partir do DNA genômico de uma linhagem K.marxlanus tipo selvagem, usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 130 e SEQ ID NO. 131. Esses iniciadores introduzem sítios de restrição Saci e NotI. O produto PCR resultante foi digerido com Saci e NotI e ligado a um similarmente digerido plasmídeo pCM53. O plasmideo resultante foi designado pCM58 (Figura 27) . Os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 66 e SEQ ID NO. 119 foram usados para triar o plasmideo pCM58, e o mapeamento da restrição com Seal e Xmnl foi usado para confirmar a orientação. O gene KmXYLl foi seqüenciado e descoberto conter dois erros, um dos quais era silente e o outro provocando uma mudança aminoácido 71V—»A. O plasmideo pCM58 foi digerido com PvuII e transformado na linhagem CD861 (Ex. 8B) usando métodos padrões de eletroporação. Os transformantes foram plaqueados por sobre placas Sc-Ura e incubadas a 37 °C. Os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 132 e SEQ ID NO. 133 foram usados para amplificar a região codificadora do gene KmXYLl e os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 134 e sli 105 foram usados para amplificar a região contendo o gene KmXYL2 e flancos. Cinco transformantes positivos para ambas as bandas foram tomados para posterior análise.

Cinco transformantes selecionados foram inoculados para dentro de um meio liquido contendo 10 g/L extrato levedura, 20 g/L peptona, 50 g/L xilose (pH 6,5) e incubados a 35 °C por 48 horas. 4 gcdw de cada um foram colhidos por centrif ugação e re-suspensos em 50 mL de 10 g/L extrato levedura, 20 g/L peptona, 50 g/L xilose, 10 mM MgCl2 e 7,5 g/L CaC03. Os frascos são colocados em produção a 35 °C e com agitação de 70 rpm. A linhagem CD861 (Ex. 8B) é cultivada similarmente para comparar o efeito das re-inserções KmXYLl e KmXYL2. A linhagem CD861 consome essencialmente a totalidade da xilose em 30 horas, produzindo 16,1 g/L etanol nesse tempo. O rendimento de etanol para a linhagem CD8 61 foi de 67%. Os cinco transformantes XR+ e XDH+ todos consumiram xilose muito mais lentamente, e produziram rendimentos médios de etanol de cerca de 16%. A linhagem CD861 produziu um rendimento de xilitol de 10%, mas os cinco transformantes produziram em media um rendimento de xilitol de 56%. A atividade xilose redutase para a linhagem CD861 foi de cerca de 2 mU/mg, enquanto que ela variou de 126-425 mü/mg nos transformantes, após 73,5 horas de cultivo. A atividade xilitol desidrogenase na linhagem CD861 foi zero, mas variou de 21 a 98 mü/mg nos transf ormantes após 73,5 horas de cultivo. O aumento nas atividades dessas enzimas indica que os genes KmXYLl e KMXL2 reinseridos foram funcionais nos cinco transformantes. A atividade xilose isomerase foi maior na linhagem CD861 (-131 mü/mg) que nos cinco transformantes (-26-45 mü/mg). Entretanto, o xilitol que estava presente pode ter atividade xilose isomerase inibida nos cinco transformantes XR+, XDH+, resultando em um valor artificialmente baixo.

Esses dados indicam também que a deleção ou a interrupção da via da aldose redutase/xilitol desidrogense é benéfico nas linhagens que possuem um gene xilose isomerase exógeno, sob essas condições de fermentação.

Exemplo 13A: Construção de plasmideo pMI410 que tem por alvo XDH (Figura 29) para transformação Candida sonorensis DNA genômico de C.sonorensis (ATCC acesso No. 32109) foi obtido como descrito em WO 03/049525.

Uma parte da biblioteca C.sonorensis lambda descrito em WO 03/049525 foi triado mediante utilização do gene Pichia stipitis XYL2 (Kõtter e outros, 1990, Curr.

Genet. 18:493-500). O gene XYL2 foi etiquetado com 32P -dCTP usando o Random Primed Labeling Kit (Boehringer Mannheim). A hibridização foi realizada mediante incubação durante a noite a 55 °C em uma solução contendo 6xSSC 5x 0,5% SDS de Denhardt 100 g/mL DNA desnaturado de esperma de arenque. Os filtros foram lavados após hibridização na temperatura ambiente em uma solução de 2x SSC por 5 minutos e repetido, em seguida de uma lavagem a 55 °C em 2xSSC- 0, 1 SDS por 30 minutos. Isso resultou no isolamento de clones de hibridização que continham o gene C.sonorensis xilitol desidrogenase (CsXDH). A região 5' do gene CsXDH foi amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 135 e SEQ ID NO. 136 e o gene CsXDH foi usado como um gabarito. 0 produto PCR foi. cortado com Saci e Sall para produzir um fragmento 642 bp que foi isolado em gel. O plasmideo pMl281 foi preparado mediante cortar o plasmideo pMI278 (descrito na Figura 14 de WO 03/049525) com Xbal, e circularizando um fragmento 4976 assim obtido. O fragmento 642 bp proveniente do acima foi ligado a um fragmento 4965 bp obtido pela digestão do plasmideo pMI281 com Saci e Sall. O plasmideo resultante foi denominado pMl409 (Figura 28).

A região 3' do gene CsXDH foi amplificada por PCR usando os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 137 e SEQ ID NO. 138 e o mesmo clone da biblioteca lambda usado como um gabarito. O produto PCR foi cortado com Notl e Apal. Um fragmento 457 bp foi isolado em gel e ligado a um fragmento 5551 bp obtido pela digestão do plasmideo pMI409 com Notl e Apal. 0 plasmideo resultante foi denominado pMI410 (Figura 29).

Exemplo 13B: Construção de plasmideo pMI412 que tem por alvo XR (Figura 31) para transformação C.sonorensis Uma seqüência xilose redutase homóloga foi amplificada por PCR usando oligonucleotideos identificados como SEQ ID NO. 139 e SEQ ID NO. 140 e DNA genômico de C.sonorensis como um gabarito. Os oligonucleotideos foram projetados com base nas seqüências conservadas descobertas nas seqüências xilose redutase e aldose redutase fungais conhecidas. O produto PCR 700 bp foi etiquetado e usado como uma prova investigativa para o isolamento dos clones CsXR lambda genômicos a partir da biblioteca genômica similarmente como descrito em WO 03/049525. A região 5' do gene C.sonorensis xilose redutase {CsXR) foi amplificado por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 141 e SEQ ID NO. 142. Uma parte do clone a biblioteca C.sonorensis lambda descrita em WO 03/04 9525 que contém o gene CsXR foi usado como um gabarito. O produto PCR foi cortado com Saci e Sall. Um fragmento 526 bp foi isolado em gel e ligado a um fragmento 4965 bp obtido mediante digestão do plasmideo pMI281 com Saci e Sall. 0 plasmideo resultante foi denominado pMI411 (Figura 30). A região 3' do gene CsXR foi amplificada por PCR usando os iniciadores identificados como SEQ ID NO. 143 e SEQ ID NO. 144 e o mesmo clone da biblioteca lambda usado como um gabarito. O produto PCR foi cortado com Notl e Apal. Um fragmento 591 bp foi isolado em gel e ligado a um fragmento 5435 bp obtido pela digestão do plasmideo pMI411 com Notl e Apal. O plasmideo resultante foi denominado pMI412 (Figura 31).

Exemplo 13C: Construção do plasmideo pMI417 da expressão PXYLA (Figura 33) para a simultânea inserção de PXYLA e deleção de CsXR em C.sonorensis O gene PXYLA proveniente de ATG para o sitio único Agel foi amplificado por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 145 e SEQ ID NO. 146 e pCM29 (Ex. 8A, Figura 21) como gabarito. O produto PCR foi cortado com Agel e Kpnl e um fragmento 453 bp foi isolado em gel. O plasmideo pCM29 foi cortado com Agel. Um fragmento 8151 bp foi. isolado em gel e parcialmente digerido com Kpnl. O fragmento 6501 bp resultante foi isolado em gel e ligado ao fragmento PCR 453 bp. 0 plasmideo foi denominado pMI400. O plasmideo pMI278 foi cortado com BamHI, preenchido com a enzima Klenow e parcialmente digerido com Xbal. 0 fragmento 6675 bp resultante foi isolado em gel. O plasmideo pMl400 foi cortado com Sbfl, tornado com a ponta cega com T4 polimerase, e cortado com Xbal. O fragmento 1358 bp resultante foi isolado em gel e ligado ao fragmento 6675 bp de pMI278 para formar o plasmideo pMI403 (Figura 32). O plasmídeo ρΜΙ412 (Εχ. 13Β, Figura 31) foi cortado com Sall e NotI. Um fragmento 4037 bp foi isolado e ligado a um fragmento 5042 bp obtido pela digestão de pMI403 com Sall e NotI. O plasmídeo resultante foi denominado pMI417 (Figura 33) . O plasmídeo pMI417 contém o gene PXYLA e um gene marcador de G418 com regiões promotoras e terminadoras associadas entre as regiões a montante e a jusante do gene CsXR. 0 gene PXYLA está sob o controle do promotor PGK e do terminador ScGALlO de C.sonorensis.

Exemplo 13D: Construção do plasmídeo pMl425 da expressão ScXKSl (Figura 34) para a simultânea inserção de ScXKSl e deleção de CsXDH na transformação C.sonorensis A região 5' de ScXKSl de ATG até o único sítio BglII foi amplificada por PCR usando iniciadores identificadoscomo SEQ ID NO. 147 e SEQ ID NO. 148 e pVR103 (Ex. 5C, Figura 18) como o gabarito. O produto PCR foi cortado com NotI e BglII e um fragmento 267 bp foi isolado em gel. O plasmídeo pVR103 (ex. 5C, Figura 18) foi cortado com NotI e BglII. Um fragmento 4633 bp foi obtido e ligado ao fragmento 267 bp de PCR. O plasmídeo foi denominado pMI4 0 6. O plasmídeo pMI403 (Ex. 13C, Figura 32) é cortado com EcoNI, preenchido usando a enzima Klenow e cortado com Sall. Um fragmento 6505 bp é isolado em gel. 0 plasmídeo pMI271 (descrito na Figura 7 de WO 03/049525) é cortado com BamHI, preenchida usando a enzima Klenow e cortada com Sall. O fragmento 1666 bp resultante é isolado em gel e ligado ao fragmento 6505 bp. 0 plasmídeo resultante é denominado ρΜΙ423. Ο plasmideo ρΜΙ410 (Εχ. 13Α, Figura 29) e ο plasmídeo ρΜΙ406 foram cada um digerido com Xbal, desfosforilado usando fosfatase alcalina intestinal de novilho, e cortada com BamHI. Os fragmentos 5032 bp e 1814 bp foram isolados em gel. O plasmideo pMI423 foi digerido com Xbal e o fragmento 2817 bp isolado em gel. Os três fragmentos foram ligados e o plasmideo resultante denominado pMI425 (Figura 34). 0 plasmideo pMI425 contém uma porção da região promotora para o gene CsXDH, um gene hph com associadas regiões promotoras e terminadoras, o gene ScXKSl sob o controle de um promotor PGK e um terminador ScGALlO de C.sonorensis, seguido por uma porção da região terminadora para o gene CsXDH.

Exemplo 13E: Geração de linhagens mutantes C. sonorensis (Cs/T-1, Cs/T-25, SC/T-34 e Cs/T-51) contendo os reconstruídos gene PXYLA e gene ScXKSl Plasmídeos pMI417 (Ex. 13C, Figura 33) e pMI425 (Ex. 13D, Figura 34) são usados para transformar uma colônia C.sonorensis usando métodos químicos similares àqueles descritos em WO 03/049525. As células transformadas foram plaqueadas por sobre YPD + 200 μρ/πΛ G418 ou por sobre YPD + 200 μg/mL higromicina e 200 μg/mL G418. A análise PCR com provas investigativas PXYLA e ScXKSl confirmam a presença de linhagens como a seguir: Linhagem Cs/T-1: 1 cópia de PXYLA e 1 cópia de ScXKSl Linhagem CS/T-25: 1 cópia de PXYLA e 2 cópias de ScXKSl Linhagem Cs/T-51: 2 cópias de PXYLA e 1 cópia de ScXKSl Linhagem CS/T-34: 2 cópias de PXYLA e 2 cópias de ScXKSl Exemplo 13F: Geração de linhagens mutantes C.sonorensis (Cs/417-201, -206, -208 e -214) contendo o reconstruído gene PXYLA com e sem uma deleção do gene CsXR mediante transformação com o plasmídeo pMI417 (Ex. 13C, Figura 33) 0 plasmídeo pMI417 é digerido com Saci e Apal e usado para transformar uma colônia C.sonorensis usando métodos químicos similares àqueles descritos em WO 03/049525. As células transformadas foram plaqueads por sobre YPD + 200 μρ/πΛ G418. A análise PCR identifica colônias possuindo o gene PXYLA e a deleção CsXR. A análise Southern confirma que a linhagem designada Cs/417-206 contém uma cópia do gene PXYLA enquanto que o gene designado Cs/417-214 contém duas cópias do gene PXYLA, em adição à deleção de CsXR. A linhagem Cs/417-210 contém duas cópias do gene PXYLA mas não contém deleção CsXR. Cs/417-208 contém uma única cópia do gene PXYLA e não contém deleção CsXR.

Exemplo 13G: Geração de linhagens mutantes C.sonorensis (Cs/417-214/425A e Cs/417-214/425B) contendo o reconstruído gene PXYLA, o gene ScXKSl, uma deleção do CsXR com (A) e sem <B) a deleção do gene CsXDH, mediante transformação de Cs/417-214 (Ex. 13F) com plasmídeo pMI425 (Ex. 13D, Figura 34) O plasmideo ρΜΙ425 é digerido com Pmel e PspOMI e usado para transformar a linhagem Cs/417-214 usando métodos químicos similares àqueles descritos em WO 03/049525. As células transformadas foram plaqueadas por sobre YPD + 200 pg/mL higromicina ou por sobre YPD + 200 μg/mL higromicina + 200 pg/mL G418. A análise Southern é usada para identificar colônias que contêm o gene CsXKSl e para determinar se ocorreu uma deleção do gene CSXDH. Uma linhagem possuindo duas cópias do reconstruído gene PXYLA, uma cópia do gene ScXKSl, uma deleção do gene CsXR e uma deleção do gene CsXDH é designada Cs/417-214/425A. Uma linhagem possuindo duas cópias do reconstruído gene PXYLA, uma cópia do gene ScXKSl, uma deleção do gene CsXR mas sem deleção do gene CsXDH é designada Cs/417-214/425B.

Exemplo 13H: Geração da linhagem mutante C.sonorensis (C29/403-7) contendo o reconstruído gene PXYLA e um gene lactato desidrogenase (LDH) funcional mediante transformação com plasmideo pMI403 (Ex. 13c, Figura 32) O plasmideo pMI430 é usado para transformar uma linhagem mutante C.sonorensis correspondente àquela identificada como linhagem 246-27 em WO 03/049525, usando métodos químicos similares àqueles descritos aqui. A linhagem 246-27 contém um gene lactato desidrogenase (LDH) exógeno, funcional. As células transformadas foram plaqueadas por sobre YPD + 200 μg/mL G418. Uma linhagem apresentando atividade de 70 mU/mg XI é designada C29/403-7. Ela aparentemente contém múltiplas cópias do gene PXYLA, sob o controle do promotor CsPGK e do terminador ScGALlO. Em adição, a linhagem C29/403-7 contém um gene lactato desidrogenase funcional.

Exemplo 131: Geração da linhagem mutante C.sonorensis (C29/403-7/425) contendo o reconstruído gene PXYLA, o gene ScXKSl e um gene LDH funcional, mediante transformação da linhagem C29/403-7 (Ex. 13H) com plasmídeo pMI425 (Ex. 13D, Figura 34) O plasmídeo pMI425 é digerido com Saci e Notl e usado para transformar a linhagem C29/403-7 (Exemplo 13H) usando métodos químicos similares àqueles descritos em WO 03/049525. As células transformadas foram plaqueads por sobre YPD + 200 μg/mL higromicina e por sobre YPD + 200 μρ/πΟΙ, higromicina e 200 μg/mL G418. As análises PCR e Southern são usadas para identificar transformantes contendo os genes PXYLA e ScSKSl, os quais são coletivamente designados C29/403-7/425. A linhagem C29/403-7/425 contém o gene lactado desidrogenase funcional.

Exemplo 13 J: Geração de linhagens mutantes C.sonorensis (C29/417-4 e C29/417-9) contendo o reconstruído gene PXYLA e uma deleção do gene CsXR O plasmídeo pMI417 (Figura 13C, Figura 33) é digerido com Saci e Apal e usado para transformar uma linhagem mutante C.sonorensis correspondente àquela identificada como linhagem 246-27 em WO 03/049525, usando métodos químicos similares àqueles ali descritos. As células transformadas foram plaqueadas por sobre YPD + 200 μρ/πιΐΐ G418. A análise PCR identifica colônias possuindo o gene PXYLA e a deleção CsXR. A análise Southern confirma que uma linhagem mutante designada C29/417-4 contém uma cópia do gene PXYLA, e uma linhagem mutante designada C29/417-9 contém duas cópias do gene PXYLA, em adição à deleção de CsXR.

Exemplo 13K: Geração de linhagens mutantes C.sonorensis contendo o reconstruído gene PXYLA, o gene ScXKSl, um gene LDH, uma deleção do gene CsXR e com (C29/417-9/425-11) e sem (C29/417-9/425-9) deleção do gene CsXDH, mediante transformação da linhagem C29/417-9 (Ex. 13J) com plasmideo pMl425 (Ex. 13D, Figura 34) O plasmideo pMI425 é digerido com Pmel e Apal e usado para transformar a linhagem C29/417-9 (Ex. 13J) , usando métodos químicos similares àqueles descritos em WO 03/049525. As células transformadas foram plaqueadas por sobre YPD + 200 μρ/ιηΐ, higromicina. A análise PCR identifica colônias possuindo o gene ScXKSl e aquelas também contendo a deleção CsXDH. Os transformantes com e sem a deleção CsXDH são designados C29/417-9/425-11 e C29/417-9/425-9, respectivamente.

Exemplo 14: Caracterização de linhagens C.sonorensis em frasco de agitação a partir dos Exemplos 13E-13K A Tabela a seguir resume as linhagens selecionadas para as caracterizações em frasco de agitação, e reporta as atividades xilose e xiluloquinase Linhagens Produtoras de Etanol Linhagens Produtoras de Ácido Lático (todas contendo LDH exógeno) Notas das Tabelas precedentes: 1XI = gene PXYLA. 2XK = gene ScXKSl. 3XR = gene xilose redutase nativa. 4XDH = gene xilitol desidrogenase nativa. As Figuras indicam o número de cópias integradas do gene. As Figuras indicam o número de cópias integradas do gene. " + " indica que o gene nativa está intacto; indica uma deleção do gene nativa. 5N.D. -não determinado.

As atividades xiluloquinase e xilose isomerase para essas amostras foram determinadas como a seguir: As amostras (5-10 mL) foram centrifugadas e lavadas uma vez com tampão 10 mM fosfato de sódio, pH 7,0. Após a lavagem, as amostras foram re-suspensas dentro do reagente de extração proteína de levedura Y-PER (Pierce, Rockford, IL) contendo inibidores protease (Complete Mini, livre de EDTA, Roche). Após 20 minutos de incubação na temperatura ambiente, as células foram centrifugadas a 13000 rpm por 10 minutos a +4 °C. As amostras do sobrenadante foram coletadas para as medições da atividade. A atividade xiluloquinase foi determinada mediante um protocolo em duas etapas. Na etapa 1, a reação continha 50 mM HEPES/KOH pH 7,5, 5 mM ATP, 6 mM MgCl2 e 20 mM xilulose. A reação de base foi determinada mediante adição de água em lugar de xilose. Após a adição da amostra de enzima, as reações foram incubadas a 30 °C por 0 e 240 segundos. Após a incubação as reações foram interrompidas mediante sua incubação a 95 °C por 5 minutos. Após a reação ter parado 40 mM HEPES/KOH pH 7,5, 10 mM MgCl2, 2,5 mM PEP e 0,2 mM NADH foram acrescentados à reação e a absorbância a 340 nm foi medida. Após a medição da absorbância inicial, uma mistura de mioquinase, piruvato quinase e lactato desidrogenase foi acrescentada. Essa reação foi incubada por mais 1 hora e a absorbância a 340 nm foi medida. A atividade xiluloquinase foi calculada a partir da produção de ADP durante os ensaios. A atividade xilose isomerase foi determinada mediante monitorar a oxidação de NADH a 340 nm a 30 °C. a reação contém (em adição à amostra) 100 mM TES-NaOH, pH 7,0, 250 mM xilose, 10 mM MgCl2, 0,6 mM NADH e 2,5 U sorbitol desidrogenase. A linha de base foi determinada mediante medição da atividade sem xilose. O ensaio xilose isomerase foi realizado em um analisador Cobas Mira automatizado (Roche).

As concentrações de proteína foram determinadas usando o método de Lowry (Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. e Randall, R.J. (1951), Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 193: 265-275).

Albumina de soro bovino (Sigma) foi usado como um padrão proteína.

Exemplo 14A: Caracterizações de C.sonorensis do tipo selvagem e de linhagens Cs/T-1, -25, -34, -51 (Ex. 13E), Cs/417-201, -206, -208, -214 (Ex. 13F) e Cs/417-214/425A e -B (Ex. 13G) em frascos de agitação microaeróbicos 50 mL de YP (10 g/L extrato de levedura e 20 g/L peptona) + 5% glicose + lOmM MgCl2 em frascos de 250 mL ofi inoculado com células crescidas sobre placas YPD e incubadas durante a noite com com agitação a 250 rpm a 30 °C. Uma alíquota de 5 mL foi retirada para ensaios de XI, XK e proteína. OD6oo foi medido e uma quantidade de células equivalentes de OD60o=12 (correspondendo a 4 g/L célula em peso seco) (OD60o=40 para linhagens Cs417-214/425A e -B) em 50 mL foi coletada por centrifugação e re-suspensas em 50 mL de YP + 5% xilose + 10 mM MgCl2. As células re-suspensas foram tranferidas para dentro de um frasco de 250 mL contendo 1,2 g CaC03. As culturas foram incubadas a 30 °C com agitação de 100 rpm. As amostras para HPLC (para medição do consumo de xilose e produção de etanol, xilitol, acetato e xilulose) e medições de OD6oo foram coletadas diariamente. A fermentação foi realizada por aproximadamente 11 dias.

As linhagens Cs/T-1, -25, -34, -51 e Cs/417- 214/425A e -B produziram 2-5 g/L etanol, com xilitol sendo o produto principal para essas linhagens. 0 C.sonorensis do tipo selvagem e linhagens Cs/417-201, -206, -208 e -214 não produzem etanol sob as condições microaeróbicas. Isso indica que ambos xilose isomerase e xiluloquinase são necessários para a produção de etanol sob condições microaeróbicas. Todas as linhagens XR+ também produziram acetato.

As linhagens Cs/417-201, -206, -208, -214 e Cs/417-214/425B consumiram xilose lentamente e não foi produzido etanol, xilitol ou acetato sob essas condições microaeróbicas. A linhagem Cs/417-201/425A também consumiu xilose lentamente e produziu algum xilitol. Em 11 dias, as linhagens Cs/417-206 e Cs/417-214 produziram 0,7 e 1,2 g/L de xilose respectivamente. Isso sugere gue sob essas condições microaeróbicas, a xilose acumulou em linhagens XI+ que não superexpressaram XK, e que a quantidade de acumulação de xilose depende da atividade XI.

Exemplo 14B: Caracterizações de C.sonorensis tipo selvagem e linhagens Cs/T-25, -34 (Ex. 13E), Cs/417-201, -214, (Ex. 13F), Cs/417-214/425A e B (Ex. 13G) em frascos de agitação anaeróbica 50 mL de YP + 5% glicose + 10 mM MgCl2 em frascos de 250 mL foi inoculado com células crescidas sobre placas YPD e incubadas durante a noite com agitação a 250 rpm a 30 °C. Uma alíquota de 5 mL foi removida para os ensaios de XI e XK. Οϋδοο foi medido e uma quantidade de células equivalentes de OD6oo=12 (correspondendo a 4 g/L célula em peso seco) (OD6oo=40 para linhagens Cs417-214/425A e -B) em 50 mL foi coletada por centrifugação e re-suspensas em 50 mL de YP + 5% xilose + 10 mM MgCl2 + 24 g/L CaC03. As culturas foram incubadas a 30 °C com agitação de 100 rpm em frascos e agitação de 100 mL fechados com tampa. O cultivo foi amostrado. As amostras para HPLC (para medição do consumo de xilose e produção de etanol, xilitol, acetato e xilulose) e medições de OD6oo foram coletadas diariamente. A fermentação foi realizada por aproximadamente 15 dias.

As linhagens Cs/T-25 e -34 produziram 2 g/L etanol durante os primeiros 8 dias de incubação enquanto que a linhagem C.sonorensis do tipo selvagem não produziram quantidades detectáveis de etanol. As linhagens Cs/417-201 e -214 também falharam em produzir etanol sob essas condições, indicando que ambos os genes xilose isomerase e xiluloquinase são necessários para obter capacidade de fermentação anaeróbica sobre xilose nessas linhagens. A linhagem Cs/417-214/425A produziu ~13 g/L etanol após 4 dias e ~25 g/L etanol após 11 dias. 0 rendimento sobre xilose para etanol foi de aproximadamente 55% após 4 dias e de 53% após 11 dias. 0 consumo de xilose foi de 22-23 g/L após 4 dias e de 48049 g/L após 11 dias. A linhagem Cs/417-214/425B consumiu ~16 g/L de xilose em 4 dias e produziu 7 g/L etanol. Isso indica que nessas linhagens, a interrupção da via XR/XDH nativa combinada com a expressão exógena do gene XI e a superexpressão XK é importante para conseguir boa produção de etanol. A interrupção de ambos os genes CsXR e CsXDH é visto proporcionar a melhor produção de etanol sob condições anaeróbicas.

Exemplo 14C: Caracterizações de linhagens 246-27 mutantes C.sonorensis LDH-produtoras e linhagens C29/403-7 (Ex. 13H) e C29/403-7/425 (Ex. 131) em frascos de agitação microaeróbica Cultivos em frascos de agitação microaeróbica foram realizados para cada uma dessas três linhagens, usando as condições gerais descritas no Exemplo 14A, exceto que a produção de lactato foi monitorada.

Sob essas condições microaeróbicas, a linhagem 246-27 e linhagem C29/403-7 consumiram xilose em cerca de 0,5 g/L/hora e todas produziram ácido lático em cerca de 0,4 g/L/hora. A linhagem C29/403-7/425 produziu cerca de 10-15% mais ácido lático e cerca de 10-15% menos xilitol que a linhagem C29/403-7 sob essas condições. A linhagem C29/403-7 produziu mais xilulose que as outras, sugerindo que a xilulose se acumula nessa linhagem por causa da atividade xilose isomerase.

Ao final dos cultivos, as células provenientes de cada frasco são riscadas por sobre placas de YPD + xilose e por sobre placas de YP + glicose e incubadas em vasos anaeróbicos por 9 dias. Nenhuma cresceu anaerobicamente, mas todas cresceram aerobicamente em meio xilose e glicose.

Exemplo 14D: Caracterizações de linhagens 246-27 mutantes C.sonorensis LDH-produtoras e linhagens C29/403-7 (Ex. 13H) e C29/403-7/425 (Ex. 131) e C29/417-9 (Ex. 13J) em frascos de agitação anaeróbica Cultivos em frascos de agitação anaeróbica foram realizados para cada uma dessas três linhagens, usando as condições gerais descritas no Exemplo 14B, exceto que a produção de lactato foi também monitorada.

Todos consumiram xilose a uma taxa de cerca de 0,1 g/L/hora. As linhagens 246-27, C29/403-7, C29/403-7/425 e C29/417-9 produziram 4,1, 4,8, 6,4 e 3,0 g/L de ácido lático, 0,3, 0,45, 0,3 e 0,3 g/L xilitol e 0,3, 1,45, 0,9 e 0,85 g/L xilulose, respectivamente, após 141 horas. Sob essas condições, a superexpressão da enzima xiluloquinase leva a uma melhorada produção de ácido lático. As linhagens com superexpressada xilose isomerase mas sem superexpressada xiluloquinase acumulam xilulose, indicando que o gene xilose isomerase é ativo.

Exemplo 14E: Caracterizações de linhagens 246-27 mutantes C.sonorensis LDH-produtoras e linhagens C29/417-4 e -9 (Ex. 13J), C29/417-9/425-9 e -11 (Ex. 13K) em frascos de agitação microaeróbica Cultivos em frascos de agitação anaeróbica foram realizados para cada uma dessas três linhagens, usando as condições gerais descritas no Exemplo 14C. os cultivos foram continuados por 7 dias.

Sob essas condições microaeróbicas, a linhagem 246-27 consumiu xilose mais rápido que outras linhagens. A linhagem C29/417-4, -9, C20/417-425-9 e -11 produziram cerca de 2-5 g/L de ácido lático após 7 dias, tempo após o que 25-35 g/L de xilose residual permaneceu. A capacidade da linhagem C29/417-9/425-11 em produzir ácido lático confirma que a via da xilose isomerase e xiluloquinase é operativo nessas linhagens. A linhagem C29/417-9/425-11 consumiu xilose ligeiramente mais rápido que C29/417-9/425-9, mas também acumulou 1-2 g/L xilitol.

Exemplo 14F: Caracterizações de linhagens C29/417-9 (Ex. 13J), C29/417-9/425-9 e -11 (Ex. 13K) mutantes C.sonorensis LDH-produtoras em frascos de agitação anaeróbica Cultivos em frascos de agitação anaeróbica foram realizados para cada uma dessas três linhagens, usando as condições gerais descritas no Exemplo 14D.

As linhagens C29/417-9, C29/417-9/425-9 e C29/417- 9/425-11 produziram 4,4, 6,2 e 24,4 g/L ácido lático após 146 horas. O rendimento do ácido lático sobre xilose foi 0,40, 0,70 e 0,95 g/g, respectivamente para essas linhagens. Não foi produzido xilitol por uma ou outra linhagem C29/417-9/425-9 ou -11, enquanto que a linhagem C29/417-9 produziu 2,7 g/L xilitol. Sob essas condições, a superexpressão da enzima xiluloquinase leva a melhorada produção de ácido lático. Isso indica que nessas linhagens, a interrupção da via da xilose redutase/xilitol desidrogenase nativa combinada com a superexpressão exógena xilose isomerase e xiluloquinase proporcionam boa produção de ácido lático. A interrupção de ambos os genes CsXR e CsXDH é vista proporcionar a melhor produção sob condições anaeróbicas.

Exemplo 15A: Geração de linhagens mutantes K,marxianus (CD1103 e CD1106) contendo o gene Cyllamyces aberensis xilose isomerase (CaXYLA) Cyllamyces aberensis CNA (isolado ffewl de bovino, U.K.) foi obtido do Gareth Wyn Griffith, Institute of Biological Sciences, University of Wales, Alberrystwyth, Ceredigion SY23 3 DA, Grã Bretanha. As reações PCR foram conduzidas usando DNA como o gabarito, usando 0,5 μΜ do iniciador de sentido identificado como SEQ ID NO. 149 e 0,5 μΜ do iniciador anti-sentido identificado como SEQ ID NO. 150 tampão Phusion HF e 0,2 μΜ de cada dNTP. Nessa construção, a primeira seqüência metionina codificada como detectada na ponta 5' do gene serviu como a metionina de partida, e um códon de parada contido na estrutura foi incluído em adição aos sitios Sbfl de restrição. 3 Minutos antes da desnaturaçào, 2 U de Phusion polimerase (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia) foi acrescentado. A reação foi ciclada 35 vezes como a seguir: 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 45 °C e 1 minuto a 72 °C com uma extensão final de 8 minutos a 72 °C. Um fragmento PCR 1346 bp foi obtido e ligado a plasmideo TOPO com o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) e seqüenciado. O gene C.aberensis xilose isomerase (CaXYLA) possui a seqüência nucleotidica identificada como SEQ ID NO. 151. A seqüência de aminoácidos deduzida para a proteína codificada por esse gene é dada como SEQ ID NO. 152. O DNA genômico de K.marxianus foi obtido a partir de uma linhagem tipo selvagem de K.marxianus similar àquela descrita anteriormente. O gene K.marxianus Ura3 (KmURA3) mais cerca de 750 bp da região promotora Ura3 e cerca de 250 bp da região terminadora Ura3 foi isolada em um protocolo padrão usando Failsafe Polymerase (Epicenter), com o DNA genômico como gabarito e iniciadores identificados como SEQ ID NO. 153 e SEQ ID NO. 154. As condições de PCR foram 5 minutos a 95 °C, 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C e 2 minutos a 68 °C, seguido por 25 ciclos de 30 segundos a 95 °C e 2,5 minutos a 68 °C, terminando em um ciclo de geração de ponta cega de 68 °C por 8 minutos. O produto PCR ~1,8 kb resultante foi clonado dentro de vetor pCR-XL-TOPO (Invitrogen) e seqüenciado para verificação. O plasmideo resultante foi designado pSO90. A seqüência nucleotidica do gene KmURA3 clonado aparece como SEQ ID NO. 155. O plasmideo pSO90 é digerido com Sphl e a região KmURA3 ~1,8 kbp é isolada em gel e ligada a um similarmente digerido e tratado por fosfatase alcalina de camarão, fragmento -4570 bp de plasmídeo pCM9 (Ex. 11, Figura 9) . O plasmideo resultante (pSO90, Figura 35) contém o gene de seleção KmURA3, o promotor KmPDCl, um sitio Sbfl e o terminador ScCYCl. 0 plasmideo contendo CaXYLA proveniente do acima foi digerido e um fragmento -1,4 kbp contendo o gene CaXYLA é usolado em gel. 0 plasmideo pS091 é similarmente digerido e tratado por fosfato alcalno de camarão para obter um fragmento 6376 bp. Esses fragmentos são ligados com HC T4 ligase (Invitrogen) apr formar um plasmideo (pS099, Figura 36) que contém um gene de seleção KmURA3 e o gene CaXYLA sob o controle do promotor KmPDCl e do terminador ScCYCl.

Uma colônia K.marxianus correspondendo a CD806 (Ex. 6B) é cultivada. 20 mL de células são centrifugadas e transformadas com o plasmideo pS099 usando métodos padrões de eletroporação, após a digestão do plasmideo com Aatll e BsmBI (sem limpeza) . 100 μΕ de células foram plaqueadas sobre placas SC-Ura e deixadas para crescer a 37 °C até serem formadas colônias. As colônias foram riscadas por sobre placas Sc-Ura secundárias, onde todas apresentaram crescimento secundário. Os transformantes foram triados por PCR quanto à presença do gene KmURA3 intacto (inserido com o plasmideo pS099) com iniciadores identificados como SEQ ID NO. 156 e SEQ ID NO. 157 e também quanto a uma região interna do gene CaXYLA usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 158 e SEQ ID NO. 159. CD1103 contém o gene CaXYLA, um gene KmURA3 intacto, e um gene KmURA3 rompido. CD1106 contém o gene CaXYLA e o KmURA3 interrompido.

Exemplo 15B: Fermentação anaeróbica com linhagens CD1103 e CD1106 (Ex. 15A) Frascos de agitação providos de defletores contendo 100 mL do meio (20 g/L extrato de levedura, 10 g/L peptona, 100 g/L glicose) foram separadamente inoculados com linhagens CD1103 e 1106 e foram incubadas durante a noite a 35 °C e agitadas a 250 rpm. As células foram colhidas após ~14 horas, e 4 g/L células secas de cada linhagem foram acrescentados a separados tubos Falcon de 50 mL tampados por rosca contendo 45 mL de peptona levedura, 50 g/L D-xilose, 7,5 g/L CaC03 e 10 mM MgCl2. Os tubos foram cultivados anaerobicamente por 65 horas a 30 °C com agitação a 70 rpm. A linhagem 1103 produziu acima de 9 g/L de etanol, e a linhagem 1106 produziu acima de 7 g/L de etanol nesse mesmo tempo. A atividade XI foi determinada pela lise das células tomadas a partir da fase de crescimento. A atividade XI foi medida e descoberta ser de aproximadamente 83 mU/mg para cada uma das linhagens 1103 e 1106.

Exemplo 16A: Clonagem do gene B.thetaiotaomicron xilose isomerase (BtXYLA) (pS089, Figura 37) DNA genômico Bacteróides thetaiotaomicron foi obtido da Washington University (St. Louis, MO) Department of Molecular Biology and Pharmacology. O gene BtXLYA foi isolado em um protocolo padrão usando Pfx polimerase (Stratagene), com o DNA genômico como gabarito e iniciadores identificados como SEQ ID NO. 160 e SEQ ID NO. 161. As condições PCR foram 95 °C por 3 minutos; 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C e 2 minutos a 68 °C, seguido por 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C e 2,5 minutos a 68 °C, terminando em um ciclo de geração de ponta cega de 68 °C por 8 minutos. O produto PCR ~1,4 kb foi clonado para dentro do vetor pCR-XL-TOPO (Invitrogen) e seqüenciado para verificação. O plasmideo resultante foi designado pS089 (Figura 37). As seqüências nucleotidica e dos aminoácidos deduzida do gene BtXYLA aparece como SEQ ID NO. 162 e SEQ ID NO. 163, respectivamente.

Exemplo 16B: Criação de plasmideo contendo plasmideo do gene de seleção BtXYLA KmURA3 (pS096, Figura 38) O gene BtXYLA ~1,4 kb foi extraído em gel a partir do plasmideo pX08 9 após uma digestão Sbfl e ligado a um similarmente digerido fragmento 6376 bp do plasmideo pS091 (Ex. 16A, Figura 35). O plasmideo resultante (pS096, Figura 38) contém o gene de seleção KmURA3, o gene BtXYLA sob o controle do promotor KmPDCl, e do terminador ScCYCl.

Exemplo 16C: Criação de mutantes K.marxianus (CD1089-1096) mediante transformação de uma linhagem correspondente a CD806 (Ex. 6B) com o plasmideo pS096 (Ex. 16B, Figura 38) Uma colônia K.marxianus correspondente a CD806 (Ex. 6B) é cultivada. 20 mL de células são centrifugadas e transformadas com plasmideo pX096 usando métodos padrões de eletroporação. O plasmideo pS096 é digerido com Aatll e BsmBI antes da integração. 100 μΙ, de células foram plaqueadas sobre placas Sc-Ura e deixadas crescer a 37 °C até serem formadas colônias. As colônias foram riscadas por sobre placas secundárias de SC-Ura. Os transformantes foram triados por PCR quanto à presença do gene KmURA3 intacto com iniciadores identificados como SEQ ID NO. 156 e SEQ ID NO. 157. Uma triagem PCR para uma região -450 bp na região mais acima do códon de parada BtXYLA e logo dentro do terminador ScCYCl é realizada com iniciadores identificados como SEQ ID NO. 164 e SEQ ID NO. 165. Dos transformantes de testagem positiva quanto a ambos os genes KmURA3 e BtXYLA naturais, oito são selecionados e designados CD1089-1096, respectivamente.

Para a determinação da atividade xilose isomerase, as linhagens foram crescidas a 30 °C, 250 rpm por -14 horas em YPD (10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona, 100 g/L dextrose) . As células foram lisadas de acordo com o protocolo para Y-PER (Pierce #78990). A proteína total foi determinada usando Advanced Protein Assay Reagent (Cysoskeleton #ADV01) com BSA como um padrão. As atividades xilose isomerase para as linhagens CD806 e CD1089-1096 são como a seguir: As atividades maiores de CD1089 e CD1092 podem ser devido à integração de múltiplas cópias do gene BtXYLA ou de um sitio preferido de integração.

Exemplo 16D: Caracterização de linhagens CD1089-1096 (Ex. 16C) em frasco de agitação Colônias únicas de linhagens CD806, e CD1089-1096 foram separadamente inoculadas para crescimento em 100 mL do meio consistindo de 10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona, e 100 g/L dextrose. As células foram crescidas por 14 horas a 30 °C, após o que as células foram coletadas e o peso seco de célula determinado. 1,4 g/L de peso seco de célula de cada cultura é acrescentado a separados tubos Falcon de 50 mL contendo 10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona, 50 g/L D-xilose, 7,5 g/L CaCCh , e 10 mM MgCl2. Essas culturas foram incubadas a 30 °C com agitação a 70 rpm. Ambas as amostras foram tomadas para análise HPLC aproximadamente a cada 24 horas. Após 72 horas, os resultados dessa fermentação anaeróbica foram como os apresentados na Tabela a seguir.

Em estudos de fermentação microaeróbica em frasco de agitação, as linhagens CD1089 e CD1092 produziu até cerca de 1 grama de etanol após cerca de 7 horas de fermentação a 30 °C e 70 rpm.

Linhagens CD1089-1096 foram plaqueadas ao final de um cultivo de xilose em baixo oxigênio por sobre placas YPX e colocadas em uma câmara anaeróbica por dois dias. Todas exceto CD1095 apresentaram crescimento anaeróbico sob essas condições, com as linhagens CD1089 e CD1092 apresentando o maior crescimento anaeróbico.

Exemplo 17: Fermentação em frasco de agitação de linhagens CD804 (Ex. 4D), CD805 (Ex. 5E) e CD806 (Ex. 6B) em meio com xilose e enzima glicose isomerase comercial externamente acrescentada Linhagens CD804, CD805 e CD806 foram separadamente inoculadas a um Οϋβοο de 0,1 a partir de placas YPD agar e foram crescidas por 16 horas a 33 °C com 250 rpm, em frascos de agitação de 250 mL providos com defletores contendo 50 mL YPD suplementado com 50 μg/mL G418. Após determinar que glicose residual permaneceu no frasco e que as células estavam conseqüentemente em fase de crescimento exponencial, 0,5 g/L equivalentes de células em peso seco de cada linhagem foi colhido por centrifugação e re-suspensas separadamente em frascos de agitação de 250 mL providos de defletores contendo 47,5 mL YP suplementado com 50 g/L D-xilose. 2,5 mL glicose isomerase (Gensweet SGI; Genecor Inc., CA) (também conhecido como xilose isomerase) foi acrescentado aos fracos de agitação e as culturas foram crescidas a 33 °C com 70 rpm. Para controles, 0,5 g/L equivalentes de células em peso seco de cada uma das linhagens CD804, 805 e 806 foram separadamente re-suspensas em frasco de agitação de 250 mL providos de defletores contendo 50 mL YP suplementado com 50 g/L D-xilose onde a glicose isomerase foi omitida. Esses frascos de agitação foram também incubados a 33 °C com 70 rpm. As amostras foram retifads em diversos intervalos no tempo e as células foram removidas por filtração. O sobrenadante da cultura foi analisado quanto a xilose, xilitol e etanol através de métodos HPLC.

Após 25 horas, a linhagem CD804 (Ex. 4D) tinha consumido 15 g/L D-xilose e produzido cerca de 4,7 g/L de xilitol e 1 g/L de etanol a partir do frasco contendo a glicose isomerase. Em contraste, as linhagens CD805 (Ex. 5C) e CD806 (Ex. 6B) tinham cada uma consumido 25 g/L D-xilose em presença da glicose isomerase. A linhagem CD805 produziu nesse tempo cerca de 1,9 g/L de xilitol e 7,1 g/L de etanol. A linhagem CD806 produziu nesse tempo cerca de 1,8 g/L de xilitol e 6,8 g/L de etanol. A xilulose pareceu ter sido consumida pelas linhagens em taxas bastante altas, algo que não é observado em S.cerevisiae. A via não oxidativa da pentose fosfato controla a taxa de fermentação de xilulose mas não de xilose em S.cerevisiae TMB3001. (FEM Yeast Res. 2002 agosto; 2 (3) : 277-82. Johansson B, Hahn-Hagerdal B) .

Sem glicose isomerase adicionada, cada uma das linhagens CD804, CD805 e CD806 consumiu xilose muito lentamente.

Exemplo 18: Transformação da linhagem correspondente a CD806 (Ex. 6B) com plasmideo pCM48 auto-replicante (Figura 40) para introduzir o gene PXYLA; cultivo das linhagens resultantes Um cassete contendo o promotor KmPCDl, gene PXYLA e terminador ScCYCl foi amplificado por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 166 e SEQ ID NO. 167, usando plasmideo pCM29 (Ex. 8A, Figura 21) como o gabarito. Esses iniciadores foram projetados para incorporarem sítios de restrições PacI e MluI. As condições de termociclagem foram de uma incubação inicial de 94 °C por 2 minutos, seguido por 30 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 50 °C por 30 segundos, e 70 °C por 3 minutos. Isto foi seguido por uma incubação final a 70 °C por 8 minutos. O produto foi digerido com as enzimas de restrição acima e um fragmento 2,804 kbp assim obtido foi ligado dentro do fragmento obtido pela digestão similar de um plasmideo designado pS057 (Figura 39) (contendo um sítio de auto-replicação pKDl), para produzir o plasmideo pCM48 (Figura 40). Os transformantes foram mapeados em restrição usando EcoRI e Sbfl, e dois deles foram tomados para sequenciamento. A completa região codificadora PXYLA foi seqüenciada e verificada ser idêntica para ambos os transformantes à seqüência no plasmideo pCM29. 2 μg de plasmideo pCM28 não digerido foram transformadas em uma linhagem correspondente a CD806 (Ex. 6B) usando métodos padrões de eletroporação. As células foram recuperadas por 4 horas em YPX, plaqueadas sobre placas YPX contendo 300 μρ/ιηΐ, G418 e 150 μg/mL higromicina e incubadas a 37 °C por 2 dias. Isso produiu um grande número de transformantes. Vários transformantes foram riscados novamente por sobre placas idênticas e incubados a 37 °C por vários dias. Quatro transformantes foram selecionados e inoculados para dentro de -100 mL de YPX em um frasco de agitação de 250 mL provido de defletores e incubados a 37 °C com agitação de 250 rpm. A linhagem CD8 61 foi incluída e a biomassa preparada do mesmo modo. Após 17 horas, 2 gcdw de cada um foi inoculado para dentro de frascos de agitação separados de 250 mL providos de defletores contendo 50 mL do meio (10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona, 50 g/L xilose, 7,5 g/L CaCC>3, 10 mM MgCl2 e pH 7,0). Os quatro transformantes produziram cerca de 9-12,3 g/L etanol após 40 horas. A linhagem original não produziu etanol. 10 mL da cultura da noite foram colhidos por centrifugação e tomados para os ensaios de enzima. As atividades xilose isomerase para os quatro transformantes variaram da faixa de 456 a 531 mü/mg.

REIVINDICAÇÕES

Claims (4)

1. Célula de levedura geneticamente modificada do gênero Kluyveromyces ou Candlda, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula de levedura geneticamente modificada possui um genoma e um gene de xilose isomerase exógeno que possui qualquer uma das SEQ. ID Nos. 58, 151 ou 162, onde o gene de xilose isomerase exógeno está operativamente ligado a sequências promotoras e terminadoras que são funcionais na célula de levedura, e a célula de levedura modificada adicionalmente possui uma deleção ou interrupção de um gene de xilose redutase nativo, que produz uma enzima que catalisa a conversão de xilose a xilitol e uma deleção ou interrupção de um gene de xilitol desidrogenase nativo.

2. Célula de levedura geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que contém um gene de xiluloquinase exógeno funcional tendo a SEQ ID NO: 83, operativamente ligado a sequências promotoras e terminadoras que são funcionais na célula de levedura.

3. Célula de levedura geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que adicionalmente possui uma deleção ou interrupção de um gene de piruvato descarboxilase nativo.

4. Processo de fermentação, CARACTERIZADO pelo fato de que uma célula, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 é cultivada sob condições de fermentação em um caldo de fermentação que inclui um açúcar pentose.