CN102703336A - 基因修饰酵母物种和使用基因修饰酵母的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因修饰酵母物种和使用基因修饰酵母的发酵方法。具体地，用外源木糖异构酶基因转化酵母细胞。额外的基因修饰增强了所转化的细胞将木糖发酵成乙醇或者其他希望的产物的能力。那些修饰包括缺失非特异或特异的醛糖还原酶基因、缺失木糖醇脱氢酶基因和/或超表达木酮糖激酶。

Description

基因修饰酵母物种和使用基因修饰酵母的发酵方法
本申请是申请日为2004年5月3日的中国专利申请200480019052.8“基因修饰酵母物种和使用基因修饰酵母的发酵方法”的分案申请。
根据与美国能源部(United States Department of Energy)的合同号DE-FC07-021D14349进行了本发明。美国政府对本发明具有某些权利。
本申请要求保护2003年5月2日申请的美国临时申请号60/467,727的利益。
技术领域
本发明涉及某些基因修饰酵母物种。
背景技术
因为全世界石油和天然气原料的逐渐耗尽，部分石油进口国希望减小对外国石油资源的依赖，并希望建立经济的更加可持续的基础，所以大量努力正致力于从替代原料产生燃料和有机化学制剂和塑料。发酵方法提供了从天然存在的糖源产生多种燃料和化学制剂的可能性。例如，通过发酵葡萄糖大量产生乙醇，最通常葡萄糖通过水解玉米淀粉得到。一种酵母物种啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)是将葡萄糖发酵成乙醇的最常用的生物催化剂。
这些糖代表相对昂贵的碳源。生物量(biomass)，即植物物质水解产物提供了尤其廉价的碳源的可能性。生物量主要由纤维素和半纤维素组成。纤维素可以分解成己糖，通常是葡萄糖。多数酵母，包括啤酒糖酵母，十分有效地代谢己糖。另一方面，半纤维素富含戊糖，如木糖，因此有效的碳利用需要这些戊糖也被代谢。非常少的酵母将木糖有效代谢成乙醇或者其他希望的发酵产物。因此，为了利用使用生物量碳源提供的全部经济潜力，必需提供可以有效将木糖转化成所希望的发酵产物的生物催化剂。
多种细菌能够将木糖代谢成发酵产物，但是这些细菌通常产生产物混合物，而不是通常所希望的一种主要产物。常见副产物有时对于细菌是有毒的。尽管某些细菌已经经代谢工程改造以进行高乙醇(homoethanolic)发酵，但是细菌倾向于在木素纤维素水解产物的苛刻环境下低效进行，其中木素纤维素水解产物是富含木糖的底物的通常来源。
公知某些酵母物种如啤酒糖酵母将己糖主要发酵成乙醇，而不是细菌通常产生的产物混合物。某些酵母具有其他特征，其使得它们是多种类型发酵方法的良好候选者，所述特征为诸如对低pH环境的抗性、对某些发酵共同产物如乙酸和糠醛的抗性，和对乙醇自身的抗性。
多数酵母物种通过复杂途径代谢木糖(如果代谢的话)，其中通过木糖还原酶(XR)首先将木糖还原成木糖醇。然后通过木糖醇脱氢酶(XDH)将木糖醇氧化成木酮糖。然后通过XK酶磷酸化木酮糖。该途径在酵母物种中无效率地运行，因为其在细胞中产生氧化还原不平衡。木糖到木糖醇步骤使用NADH作为辅因子，而木糖醇到木酮糖步骤使用NADPH作为辅因子。必须运行其他过程以恢复细胞内的氧化还原不平衡。这通常意味着生物在木糖或其他戊糖上不能厌氧生长。
然而，已经试图向酵母物种如啤酒糖酵母中导入外源XR和XDH基因以实现木糖向乙醇的转化。见，例如，美国专利号5,866,382、WO95/13362和WO97/42307。该工程改造的酵母不能有效产生乙醇。
其他生物可以将木糖异构化成木酮糖然后将木酮糖磷酸化成木酮糖5-磷酸，其然后通过细胞的中心碳途径进一步代谢。通过催化酶木糖异构酶(XI)促进异构化，并通过木酮糖激酶(XK)催化磷酸化。该途径在细菌中是常见的，但是在真核物种如酵母中相对罕见。它不产生木糖至木糖醇至木酮糖途径中的氧化还原不平衡，从而原则上是更有效的厌氧机制。公知一种厌氧真菌Piromyces sp.E2(ATCC76762)具有表达活性XI酶的基因。
然而，没有野生型或者重组酵母物种能够从木糖或者其他戊糖原料有效产生所希望的发酵产物。将Piromyces sp.E2XI基因导入啤酒糖酵母的尝试导致在木糖上的非常缓慢的生长并且不导致所报导的乙醇生产。见Kuyper等人，“High-Level Functional Expression of aFungal Xylose Isomerase：The Key to Efficient EthanolicFermentation of Xylose by Saccharomyces Cerevisiae？”，FEMS YeastResearch1574(2003)1-10，和WO03/062430A1。
因此非常希望可以将木糖和其他戊糖有效发酵成所希望的发酵产物的酵母物种。
发明内容
一方面，本发明是具有功能性外源木糖异构酶基因的基因修饰酵母细胞，其中外源木糖异构酶基因可操作地连接在酵母细胞中有功能的启动子和终止子序列，且修饰的酵母细胞还具有天然基因的缺失或破坏，所述天然基因编码催化木糖向木糖醇转化的酶。
第二方面，本发明是基因组中整合了功能性外源木糖异构酶基因的克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)或者假丝酵母属(Candida)的基因修饰酵母细胞，其中外源木糖异构酶基因可操作地连接在酵母细胞中有功能的启动子和终止子序列。
另一方面，本发明是具有功能性外源木糖异构酶基因的基因修饰酵母细胞，其中外源木糖异构酶基因可操作地连接在酵母细胞中有功能的启动子和终止子序列，并且所述细胞还含有可操作地连接在酵母细胞中有功能的启动子和终止子序列的功能性外源木酮糖激酶基因。
再一方面，本发明是基因修饰酵母细胞，其具有功能性天然基因的缺失或破坏，所述天然基因产生催化木糖醇向木酮糖或者木酮糖向木糖醇的反应的酶。
另一方面，本发明是基因修饰酵母细胞，其具有天然基因的缺失或破坏，所述天然基因产生催化木糖向木糖醇转化的酶。
再一方面，本发明是发酵方法，其中在发酵条件下在包括戊糖的发酵液体培养基中培养任意前面方面的细胞。
附图说明
图1是描绘pNC2质粒的图。
图2是描绘pNC4质粒的图。
图3是描绘pVR22质粒的图。
图4是描绘pVR29质粒的图。
图5是描绘pBH5a和pBH5b质粒的图。
图6是描绘从质粒pVR73和pVR77装配的pVR78质粒的图。
图7是描绘pCM3质粒的图。
图8是描绘pPS1质粒的图。
图9是描绘pCM9质粒的图。
图10是描绘pCM17质粒的图。
图11是描绘pCM14质粒的图。
图12是描绘pCM28质粒的图。
图13是描绘pVR95质粒的图。
图14a和14b是描绘pCM18和pCM19质粒的图。
图15是描绘pBSKura3Km和pBSDeltaUra3KM质粒的图。
图16是描绘pVR52、pVR67和pVR96质粒的图。
图17是描绘pVR102质粒的图。
图18是描绘pVR103质粒的图。
图19是描绘pVR65和pVR104质粒的图。
图20是描绘pCM21和pCM23质粒的图。
图21是描绘pCM29质粒的图。
图22是描绘pVR113质粒的图。
图23是描绘pCM31质粒的图。
图24是描绘pVR118质粒的图。
图25是描绘pCM52质粒的图。
图26是描绘pCM55质粒的图。
图27是描绘pCM58质粒的图。
图28是描绘pMI409质粒的图。
图30是描绘pMI410质粒的图。
图31是描绘pMI412质粒的图。
图32是描绘pMI403质粒的图。
图33是描绘pMI417质粒的图。
图34是描绘pMI425质粒的图。
图35是描绘pSO91质粒的图。
图36是描绘pSO99质粒的图。
图37是描绘pSO89质粒的图。
图38是描绘pSO96质粒的图。
图39是描绘pSO57质粒的图。
图40是描绘pCM48质粒的图。
具体实施方式
通过进行对宿主酵母细胞的某些基因修饰制备得到本发明的基因修饰酵母。
适宜的宿主酵母细胞含有至少一种天然基因，其产生能够催化D-木糖转化成木糖醇的活性酶。这些酶可以是对木糖→木糖醇还原特异的或者可以是非特异性的(即，对一系列戊糖操作)。通过此类基因产生的酶以不同的名称称作EC号1.1.1.21和正式称作糖醇：NAD(P)1-氧化还原酶。此类基因编码的酶通常具有下面的活性：D-木糖+NAD(P)H＝木糖醇+NAD+(即，它可以用NADPH或者NADH或者两者作为氧化还原辅因子)。表达木糖还原酶的基因在本文称作“木糖还原酶基因”，或者“XR基因”。在一些实例中，特定XR基因在本文中称作“XYL1”基因。
文中所用术语“天然的”用于指在酵母物种的未修饰细胞的基因组内发现的遗传材料(例如，基因、启动子或者终止子)(除了不影响其功能的个体-个体突变之外)。
能够将D-木糖转化成木糖醇的宿主酵母细胞通常具有能够将木糖醇进一步转化成D-木酮糖的天然能力。这通常通过表达由本文称作“木糖醇脱氢酶基因”或者“XDH基因”的基因编码的木糖醇脱氢酶(XDH)来完成。此类基因编码的酶以不同的名称称作EC号1.1.1.9，通常称作木糖醇脱氢酶和系统地称作木糖醇：NAD+2-氧化还原酶(D-木酮糖形成)。这些基因通常具有下面的活性：木糖醇+NAD(P)+＝D-木酮糖+NAD(P)H(尽管NAD+是目前为止优选的底物，但是一些利用NADP+)。特定XDH基因在本文称作“XYL2”基因。适宜的宿主细胞具有一种或多种天然基因，其产生功能性醛糖还原酶或者木糖还原酶和功能性XDH酶。如果酶能够发挥其通常或者计划的作用，那么在本发明上下文内中称该酶是“功能性的”。如果基因表达功能性的酶，那么在本发明上下文内中称该基因是“功能性的”。
另一种适宜的宿主酵母细胞能够跨过其细胞壁或细胞膜运输木糖。
另一种适宜的宿主酵母细胞是天然在木糖上生长的酵母细胞，如具有从木酮糖-5-磷酸到甘油醛-3-磷酸的活性天然途径的酵母细胞。在本发明中，如果野生型细胞通过磷酸己糖途径代谢至少10％基于葡萄糖的糖，那么认为从木酮糖-5-磷酸到甘油醛-3-磷酸的途径是活性的。优选地，通过该途径代谢至少20％，更优选至少30％，特别是至少40％的核酮糖-5-磷酸。
适宜的宿主细胞包括，例如，来自克鲁维氏酵母属、假丝酵母属、毕赤氏酵母属(Pichia)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、丝孢酵母属(Trichosporon)、酒香酵母属(Brettanomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)和Yamadazyma的酵母细胞。尤其重要的酵母物种包括马克斯克鲁维氏酵母(K.marxianus)、乳克鲁维氏酵母(K.lactis)、耐温克鲁维氏酵母(K.thermotolerans)、C.sonorensis、C.methanosorbosa、C.diddensiae、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、C.naeodendra、C.balnkii、C.entomophila、C.scehatae、嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus)和具柄毕赤氏酵母(P.stipitis)。马克斯克鲁维氏酵母、C.sonorensis、C.scehatae、嗜鞣管囊酵母和具柄毕赤氏酵母是在木糖上生长的酵母细胞的实例。它们具有天然的木酮糖-5-磷酸到甘油醛-3-磷酸途径，天然的功能性醛糖和/或木糖还原酶基因、活性木糖醇脱氢酶基因，和通过细胞壁或细胞膜转运木糖的天然能力。优选的宿主细胞包括物种马克斯克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母、耐温克鲁维氏酵母、C.sonorensis和C.methanosorbosa的那些宿主细胞。
宿主细胞可以含有不同于本文特别指出的那些基因修饰的基因修饰。例如，可以基因修饰宿主细胞以通过进一步代谢木酮糖-5-磷酸和/或甘油醛-3-磷酸产生(或不产生)特定类型的发酵产物。此类修饰的特定实例包括缺失或破坏天然丙酮酸脱羧酶(PDC)基因，和插入外源基因，如L-乳酸脱氢酶(L-LDH)或者D-乳酸脱氢酶(D-LDH)基因。产生这些类型修饰的方法描述于例如，WO99/14335、WO00/71738、WO02/42471、WO03/102201、WO03/102152和WO03/049525。在如本文描述的进一步修饰宿主细胞前宿主细胞中可以存在这些修饰，或者这些修饰可以在本文描述的此类进一步修饰同时或者之后进行。
本发明某些方面的基因修饰酵母细胞包括功能性外源木糖异构酶(XI)基因，其优选整合到宿主细胞的基因组。在该上下文中，“外源”指(1)XI基因不是宿主细胞天然的，(2)XI基因是宿主细胞天然的，但是宿主细胞的基因组已经受到修饰以提供天然XI基因的额外的功能性拷贝，或者(3)(1)和(2)两者。适宜的XI基因的实例包括对Piromyces物种E2(如Genbank(登录号AJ249909)中Piromyces sp.E2xylA编码基因序列)和Cyllamyces aberensis天然的XI基因以及从其他厌氧真菌得到的XI基因。Piromyces物种E2和CyllamycesAberensis XI基因的核苷酸序列分别标识为SEQ.ID.NOs.58和151。通过这些XI基因产生的蛋白质的推导的氨基酸序列分别标识为SEQ.ID.No.59和152。适宜的细菌XI基因是多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)天然的。该多形拟杆菌XI基因的核苷酸序列标识为SEQ.ID.NO.162。该基因产生的酶的推导氨基酸序列标识为SEQ.ID.NO.163。适宜的XI基因包括与SEQ.ID.NOs.58或151至少60％、80％、90％、95％、98％或99％同源的基因。适宜的XI基因包括编码与SEQ.ID.NOs.59或152至少60％、80％、90％、95％、98％或99％同源的酶的基因。一些适宜的木糖异构酶基因与SEQ.ID.NO.58的同源性不超过95％或者不超过90％，或者编码的酶与SEQ.ID.NO.59的同源性不超过95％或者不超过90％。其他适宜的木糖异构酶基因是细菌木糖异构酶基因，其与SEQ.ID.NO.162至少60、80、90、95、98或99％同源和/或产生与SEQ.ID.NO.163至少60、80、90、95、98或99％同源的酶。
可以使用BLAST版本2.2.1软件用默认参数方便地计算氨基酸序列的百分比同源性。使用BLAST版本2.2.1软件用默认参数计算同一性得分和阳性得分为至少XX％的序列被认为至少XX％同源。尤其适宜的木糖异构酶基因包括编码与SEQ.ID.NO.163相比具有至少60％的同一性得分、与SEQ.ID.NO.59相比具有少于95％的同一性得分、与SEQ.ID.NO.59相比具有少于97％的同一性得分的酶的基因。
外源XI基因处于启动子和终止子的控制下，启动子和终止子两者在修饰酵母细胞中都是功能性的。文中所用术语“启动子”指位于结构基因的翻译起始密码子的上游(即5’)(通常在约1-1000bp内，优选1-500bp，特别是1-100bp)并且控制结构基因转录起始的未转录的序列。类似地，术语“终止子”指位于结构基因的翻译完成密码子的下游(即3’)(通常在约1-1000bp内，更通常1-500bp，特别是1-100bp)并且控制结构基因转录结束的未转录的序列。如果启动子或终止子在基因组中的位置相对于结构基因的位置使得启动子或终止子根据具体情况而定发挥其转录控制功能，那么启动子或终止子“可操作地连接”结构基因。
启动子和终止子序列可以是酵母细胞天然和外源的。在功能部分分别与细胞天然启动子和终止子序列的功能部分高度同源(即，90％或以上，特别95％或以上，最优选99％或以上同源)的启动子和终止子序列也是有用的，当外源基因的插入靶向细胞基因组的特定位点时尤其如此。
适宜的启动子与酵母基因天然的启动子至少90％、95％或99％同源。更适宜的启动子与宿主细胞天然的基因的启动子至少90％、95％或99％同源。尤其有用的启动子包括酵母丙酮酸脱羧酶(PDC)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)和转录增强子因子-1(TEF-1)基因的启动子，特别来自宿主细胞天然的这些基因的启动子。
适宜的终止子与酵母基因天然的终止子至少90％、95％或99％同源。终止子可以与宿主细胞天然基因的终止子至少90％、95％或99％同源。尤其有用的终止子包括酵母丙酮酸脱羧酶(PDC)、木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)或异-2-细胞色素c(CYC)基因的终止子，或者来自酵母中半乳糖基因家族的终止子，尤其所称作的GAL10终止子。已经表明啤酒糖酵母GAL10终止子和啤酒糖酵母CYC1终止子是酵母中外源XI基因的有效终止子。
(宿主细胞)天然启动子和终止子以及各自上游和下游侧翼区的使用可以允许XI基因靶向整合到宿主细胞基因组的特定基因座，和同时整合XI基因和缺失另一天然基因，如XR、XDH或PDC基因。
聚组氨酸尾可以存在于XI基因的3’末端。在下面的实施例3中描述了其实现方法。然而，聚组氨酸尾的存在可以降低XI基因的性能。聚组氨酸尾对于本发明不是关键的并且如果希望可以省略。
外源XI基因可以随机插入宿主细胞的基因组或者插入一个或多个靶定位置。靶定位置的实例包括希望缺失或破坏的基因的基因座，如XR、XDH或PDC基因的基因座。在一些实施方案中，与天然PDC基因位点相邻的XI基因的整合似乎与发酵产物生产中修饰酵母细胞的提高的性能有关。可以用或不用天然PDC基因的缺失或破坏来完成在PDC基因座上的整合，但是优选保持天然PDC基因完整和功能性，当所希望的发酵产物是乙醇或者为丙酮酸代谢物的其他产物时尤其如此。
可以通过设计具有与靶基因的上游(5’-)和下游(3’-)侧翼同源的区域的载体实现定向整合。这两种区域的任一种可以包括靶基因的编码区的一部分。XI盒(如果与靶基因的启动子和终止子不同，那么包括相关的启动子和终止子)和选择标记(如需要可以具有相关的启动子和终止子)将存在于载体上与靶基因的上游和下游侧翼同源的区域间。
基因修饰酵母细胞可以含有单拷贝或多拷贝的外源XI基因。如果存在多拷贝的外源XI基因，则可以存在2到10个或更多拷贝，如约2-8或约2-5个拷贝。外源XI基因的多个拷贝可以整合在宿主细胞基因组内的一个基因座(从而它们彼此相邻)或者几个基因座上。在尤其重要的实施方案中，外源XI基因的多个拷贝整合入或与天然PDC基因的基因座相邻，存在或不存在天然PDC基因的缺失或破坏。不同外源XI基因可能处于不同类型启动子和/或终止子的控制下。
通过对酵母的基因组进行一个或多个额外的修饰，和/或选择具有某些特征的宿主细胞改进经修饰的酵母的性能，尤其在厌氧条件下的性能。这些性能包括(1)低XR(或者其他醛糖还原酶)活性，(2)低XDH活性和(3)XR超表达的一种或多种。
宿主细胞可以天然地具有或者经过修饰而具有低醛糖还原酶活性。以下面的实施例4E中描述的方式测量的这种低醛糖还原酶活性适宜地小于10mU/mg或者小于5mU/mg。如果宿主细胞含有产生催化木糖向木糖醇转化的酶的一个或多个醛糖还原酶基因，那么就适宜地破坏或缺失一个或多个这些基因。通常，选择用于破坏或者缺失的基因是单独或者共同地(1)占宿主细胞的木糖→木糖醇还原活性的至少40％，优选至少50％，和/或(2)为XR基因，即编码对木糖→木糖醇还原特异的酶的基因的那些基因。通常优选缺失或破坏至少一个XR基因。缺失或破坏优选实现酶活性的至少50％减小，更优选将木糖还原酶活性减小到低于10mU/mg或5mU/mg。
“缺失或破坏”指除去(缺失)基因的整个编码区，或者修饰(如通过缺失、插入或突变)基因或者其启动子和/或终止子区，从而该基因不再产生活性酶，或者产生具有严重降低的活性的酶。可以通过基因工程方法、强迫进化或者诱变和/或选择或筛选可以实现缺失或破坏。对于XR或者非特异醛糖还原酶基因，完成缺失或破坏的适宜的方法是克隆基因的上游和下游侧翼区(其包括该基因的一部分编码区)，产生含有所克隆的上游和下游侧翼的载体，和用该载体转化宿主细胞。载体可以含有其他遗传材料，如标记基因或其他基因，希望所述基因插入到宿主细胞基因组中天然XR或者非特异醛糖基因(如XI基因、XK基因或者使得细胞能够产生所希望的发酵产物的基因，如L-或D-LDH基因)的基因座上。
缺失XR或者非特异醛糖还原酶基因的一种方法是用含有与靶基因的上游(5’-)和下游(3’-)侧翼同源的区域的载体转化宿主细胞。例如，使用适当设计的引物和使用基因组DNA作为模板，通过PCR扩增适宜的区域可以得到此类侧翼序列。两种这些区域之一可以包括靶基因的一部分编码区，尽管载体不应该含有该基因的完整功能部分。此类侧翼序列通常是至少50个碱基对，或至少100或至少500个碱基对的序列。尽管对侧翼序列长度在理论上没有上限，但是其长度优选最多约4000个碱基对，更优选最多约1200个碱基对。每个侧翼序列与细胞基因组的相应序列具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，更优选至少99％的同源性。这些侧翼序列可以分别包括靶基因的启动子和终止子序列。载体可以还含有一个或多个选择标记盒(如果需要具有相关的启动子和终止子)，所述选择标记盒有利地位于与靶基因的上游和下游侧翼同源的区域之间。这种载体可以在同源重组中缺失靶基因，在所缺失的靶基因的基因座上插入选择标记基因。载体可以代替选择标记盒或除了选择标记盒之外包括另一表达盒，如XI表达盒，和L-或D-LDH盒或者木酮糖激酶表达盒，所有这些表达盒都可以包括相关启动子和终止子。还可以设计载体以利用自发环出事件，如WO03/102152中描述的。
宿主细胞可以天然地具有或者经修饰而具有低木糖醇脱氢酶活性。以在下面的实施例6B中描述的方式测量的这种低木糖醇脱氢酶活性适宜地小于2mU/mg或者小于1mU/mg。如果宿主细胞含有一个和多个木糖醇脱氢酶基因，从而导致较高的木糖醇脱氢酶活性，则可以适宜地破坏和缺失这些基因的一个和多个。可以与关于醛糖还原酶缺失或破坏在前面描述的类似的方法进行XDH基因缺失或破坏。通过向转化载体中整合入XDH基因的上游和下游侧翼，来代替XR或者非特异醛糖还原酶基因的侧翼，可以进行缺失。如前，载体可以包括一个和多个选择标记盒和/或一个或多个其他表达盒。缺失或破坏优选实现酶活性的至少50％减小，更优选将木糖醇脱氢酶活性减小到低于2mU/mg或1mU/mg。
经修饰的细胞优选表达木酮糖激酶，如在下面的实施例5E中描述所测量的，所述木酮糖激酶具有至少100mU/mg，如至少300mU/mg或者至少500mU/mg的活性。木酮糖激酶以不同名称称作EC2.7.1.17和系统地称作ATP：D-木酮糖5-磷酸转移酶。其活性通常为ATP+D-木酮糖＝ADP+D-木酮糖5-磷酸木酮糖激酶(XK)。例如，通过强迫净化(在适宜选择超表达该酶的突变体的条件下)、诱变或者通过将一个或多个功能性外源木酮糖激酶基因整合到宿主细胞的基因组中可实现超表达。在该上下文中，“外源的”指(1)XK基因不是宿主细胞天然的，(2)XK基因是宿主细胞天然的，但是宿主细胞的基因组已经经修饰以提供天然XK基因的额外的功能拷贝，或者(3)(1)和(2)两者。适宜的木酮糖激酶基因包括酵母木酮糖激酶基因。适宜的XK基因的优选实例是啤酒糖酵母XK基因(ScXKS1)。ScXKS1基因的核苷酸序列标识为SEQ.ID.NO.83。通过ScXKS1基因产生的酶的推导的氨基酸序列标识为SEQ.ID.NO.84。适宜的XK基因包括与SEQ.ID.NO.83至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同源的那些基因。适宜的XK基因包括编码与SEQ.ID.NO.84至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同源的酶的那些基因。其他适宜的XK基因是马克斯克鲁维氏酵母或者C.sonorensis天然的基因或者与这些基因的每一个至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同源的基因。
外源XK基因处于启动子和终止子的控制下，启动子和终止子两者在经修饰的酵母细胞中都是功能性的。适宜的启动子和终止子序列可以是宿主细胞天然的或者与天然启动子或终止子具有高同源性(即，90％或更大，特别是95％或更大，最优选99％或更大同源性)。当外源XK基因被靶定在宿主细胞基因组的特定位点时，此类启动子和终止子是尤其有用的。其他适宜的启动子和终止子是XK基因从中得到的生物天然的或者显示出与此类天然启动子和/或终止子具有相似的高同源性。例如，上面鉴定的ScXKS1基因的适宜的启动子和终止子包括啤酒糖酵母基因的启动子和终止子。启动子和/或终止子可以是特定XK基因天然的或者显示出与此类启动子和/或终止子相似的高同源性。
ScXKS1基因的尤其有用的启动子包括啤酒糖酵母丙酮酸脱羧酶(PDC)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)和转录增强子因子-1(TEF-1)启动子。ScXKS1基因的尤其有用的终止子包括啤酒糖酵母丙酮酸脱羧酶(PDC)、木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)或异-2-细胞色素c(CYC)终止子或者来自酵母中的半乳糖基因家族的终止子，尤其所称作的GAL10终止子。已经表明啤酒糖酵母GAL10终止子和啤酒糖酵母CYC1终止子是酵母中外源XI基因的有效终止子。
外源XK基因可以随机整合到宿主细胞的基因组，或者使用与上述插入XR基因的方法类似的方法插入到一个或多个靶定位置。靶定位置的实例包括希望缺失或破坏的基因，如XR、XDH或者PDC基因的基因座。如前，通过设计具有与靶基因的上游(5’-)和下游(3’-)侧翼同源的区域的载体可以实现靶向整合。这两个区域的任一个可以包括靶基因的一部分编码区。XK盒(如果与靶基因的那些启动子和终止子不同，则可以包括相关的启动子和终止子)和选择标记(如果需要具有相关的启动子和终止子)将位于载体上与靶基因的上游和下游侧翼同源的区域之间。
基因修饰酵母细胞可以含有单拷贝或多拷贝(如2到10或更多拷贝，2到8或2到5个拷贝)的外源XK基因。外源XK基因的多个拷贝可以整合在宿主细胞基因组的一个基因座(从而它们彼此相邻)或者几个基因座上。不同外源XK基因可能处于不同类型启动子和/或终止子的控制下。
具有低木糖还原酶活性、低木糖醇脱氢酶活性和超表达的木酮糖激酶活性的根据本发明的细胞是筛选宿主细胞中外源木糖异构酶基因活性的极佳的宿主。这些基因修饰产生有助于木糖异构酶表达的细胞环境，因此如果某个基因实际上有活性，那么其活性较少可能受到细胞环境的抑制并因此在细胞中是可测量的。
通过设计和构建适宜的载体和用那些载体转化宿主细胞在一步或多步中实现宿主细胞的基因修饰。可以使用电穿孔和/或化学(如基于氯化钙或乙酸锂的)转化方法。转化酵母株系的方法在WO99/14335、WO00/71738、WO02/42471、WO03/102201、WO03/102152和WO03/049525中描述；这些方法通常可应用于根据本发明转化宿主细胞。用于转化的DNA可以用特定限制酶切割或者用作环状DNA。
已经在一般意义上在上面讨论了转化载体设计的一般性方法。下面是某些特定转化载体设计，其中以阅读/转录的顺序列出组分。所有都可以是环状或线性的。所有都可以含有用于线性化或者片段化的多种类型的限制位点。载体还可以含有主链部分(如用于在大肠杆菌(E.coli)中增殖)，其可以从通过商业途径可得到的酵母或者细菌载体方便地得到。
1.宿主细胞XR基因的上游(5’-)区；标记表达盒，宿主XR基因的宿主下游(3’-)区。标记表达盒可以是潮霉素、Ura3或者G418抗性表达盒，如果需要，所述表达盒可以具有启动子和终止子。Ura3盒可以是HisG-Ura3-HisG盒。G418盒可以包括ScPDC1启动子和ScGAl10终止子。
2.与(1)相同，其中XI盒(包括可操作地连接基因的启动子和终止子)位于宿主细胞XR基因的5’-和3’-区之间。XI盒可以包括宿主细胞天然的启动子。XI盒可以包括ScCYC1或ScGAL10终止子。
3.与(1)或(2)相同，其中XK盒(包括可操作地连接基因的启动子和终止子)位于宿主细胞XR基因的5’-和3’-区之间。XK盒可以包括宿主细胞天然的启动子，或者ScTEF1启动子。XI盒可以包括ScCYC1或ScGAL10终止子。
4.宿主细胞XDH基因的上游(5’-)区；标记表达盒、宿主XDH基因的宿主下游(3’-)区。标记表达盒可以是潮霉素、Ura3或者G418抗性表达盒，如果需要，所述表达盒可以具有启动子和终止子。Ura3盒可以是HisG-Ura3-HisG盒。G418盒可以包括ScPDC1启动子和ScGAl10终止子。
5.与(4)相同，其中XI盒(包括可操作地连接基因的启动子和终止子)位于宿主细胞XR基因的5’-和3’-区之间。XI盒可以包括宿主细胞天然的启动子。XI盒可以包括ScCYC1或ScGAL10终止子。
6.与(4)或(5)相同，其中XK盒(包括可操作地连接基因的启动子和终止子)位于宿主细胞XR基因的5’-和3’-区之间。XK盒可以包括宿主细胞天然的启动子，或者ScTEF1启动子。XI盒可以包括ScCYC1或ScGAL10终止子。
7.XI盒或者XK盒前面或者后面的HisG-Ura3-HisG盒。
8.XI盒，包括马克斯克鲁维氏酵母启动子或C.sonorensis启动子，所述XI盒在标记表达盒的前面或后面。马克斯克鲁维氏酵母或C.sonorensis启动子可以为PDC或者PGK启动子。XI盒中的终止子可以是马克斯克鲁维氏酵母、C.sonorensis或啤酒糖酵母终止子，并且可以特别为ScCYC1或ScGAL10终止子。标记表达盒可以是潮霉素、Ura3或者G418抗性表达盒，如果需要，所述表达盒可以具有启动子和终止子。Ura3盒可以是HisG-Ura3-HisG盒。G418盒可以包括ScPDC1启动子和ScGAl10终止子。XI盒还可以包括XK盒(如下面的9中描述的)，其位于XI盒的上游或下游，并且在标记表达盒的上游或下游。
9.标记表达盒后面或前面的XK盒。XK盒可以包括马克斯克鲁维氏酵母启动子、C.sonorensis启动子或啤酒糖酵母启动子。XK盒启动子可以特别为马克斯克鲁维氏酵母或C.sonorensisPDC或PGK或啤酒糖酵母PDC、PGC或TEF1启动子。XK盒中的终止子可以是马克斯克鲁维氏酵母、C.sonorensis或啤酒糖酵母终止子，并且可以特别为ScCYC1或ScGAL10终止子。标记表达盒可以是潮霉素、Ura3或者G418抗性表达盒，如果需要，所述表达盒可以具有启动子和终止子。Ura3盒可以是HisG-Ura3-HisG盒。G418盒可以包括ScPDC1启动子和ScGAl10终止子。
10.XI盒、XK盒或者两者，前面为宿主细胞XR基因的上游(5’-)区；后面是宿主XR基因的下游(3’-)区。该载体可以包括XR基因的上游和下游区之间的其他组分。
11.XI盒、XK盒或者两者，前面为宿主细胞XDH基因的上游(5’-)区；后面是宿主XDH基因的下游(3’-)区。该载体可以包括XDH基因的上游和下游区之间的其他组分。
12.前面质粒的任一种，还包括在宿主细胞中有活性的自复制位点。
可用于前面载体的特定XI盒包括马克斯克鲁维氏酵母PDC1(KmPDC1)启动子、XI基因(上述任一种)和ScCYC1、ScGAL10或KmPDC1终止子；C.sonorensis PDC1(CsPDC1)启动子、XI基因和ScCYC1、ScGAL10或CsPDC1终止子；和C.sonorensis PGK(CsPGK)启动子、XI基因和ScCYC1、ScGAL10或CsPDC1终止子。
可以用于前面载体的特定XK盒包括马克斯克鲁维氏酵母PDC1(KmPDC1)启动子、XK基因(上述任一种，但是特别为ScXKS1基因)、和ScCYC1、ScGAL10或KmPDC1终止子；C.sonorensisPDC1(CsPDC1)启动子，XK基因和ScCYC1、ScGAL10或CsPDC1终止子；C.sonorensis PGK(CsPGK)启动子、XK基因和ScCYC1、ScGAL10或CsPDC1终止子；和啤酒糖酵母TEF-1(ScTEF1)启动子，XK基因和ScCYC1、ScGAL10或CsPDC1终止子。
除了上述特定选择标记基因，通常的选择标记基因编码如下蛋白质，所述蛋白质(a)赋予宿主细胞对抗生素或其他毒素的抗性，所述抗生素或其他毒素抗性为例如zeocin(印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)ble博来霉素抗性基因)、G418(Tn903的卡那霉素抗性基因)、潮霉素(大肠杆菌的氨基糖苷类抗生素抗性基因)、氨苄青霉素、四环素或者卡那霉素；(b)补充细胞的营养缺陷型缺陷，如氨基酸亮氨酸缺陷(马克斯克鲁维氏酵母Leu2基因)或者尿嘧啶缺陷(例如，马克斯克鲁维氏酵母或啤酒糖酵母Ura3基因)；(c)提供不能从简单培养基得到的关键营养物，或者(d)赋予细胞在特定碳源上生长的能力。木糖异构酶基因可以以该方式作用，从而使得能够基于在木糖上生长进行选择。
通过利用标记基因贡献的特征，或者通过插入基因贡献的其他特征(如能够在木糖上生长)可以以已知方式选择成功的转化体。通过PCR或者DNA印迹分析证实已经发生所希望的插入和缺失、证实拷贝数和鉴定基因整合到宿主细胞的基因组的位点可以进行筛选。使用公知的测定方法可以证实所插入的基因编码的酶的活性和/或缺失的基因编码的酶的活性的缺乏。
含有外源XI基因的本发明的基因修饰酵母细胞可用于发酵戊糖成所希望的发酵产物，如乙醇和乳酸。某些额外的基因修饰对于使得酵母细胞能够以可接受的得率、滴度和/或生产力产生某些产物是必需的。例如，如前文讨论的，整合外源LDH基因和缺失天然PDC基因对于得到高乳酸得率是必需的。
在本发明的发酵方法中，在包括戊糖的发酵培养基中培养本发明的细胞。戊糖优选为木糖、木聚糖或者木糖的其他寡聚体。这些糖适宜地为含有半纤维素的生物量的水解产物。发酵培养基可以还含有其他糖，特别是己糖，如右旋糖(葡萄糖)果糖、葡萄糖的寡聚体，如麦芽糖、麦芽三糖和异麦芽三糖，和潘糖。对于寡聚糖，必需向发酵液体培养基中加入酶以便将这些寡聚糖消化成相应的单体糖。
培养基将通常含有特定细胞所需的营养物，包括氮源(如氨基酸、蛋白质、无机氮源，如氨或者铵盐，等等)，和多种维生素、矿物质等等。
认为其他发酵条件，如温度、细胞密度、底物的选择、营养物的选择等等对于本发明不是关键的，并且通常选择用以提供经济方法。在每个生长期和生产期期间的温度可以为高于培养基的冷冻温度到约50℃，尽管最适温度在某种程度上取决于特定微生物。优选的温度，尤其生产期的优选温度为约30-45℃。当细胞是工程改造的马克斯克鲁维氏酵母时，其可以耐受相对高温(如高于40℃到最高达50℃，特别是最高达45℃)。另一优选的细胞种类C.sonorensis可以耐受最高达约40℃。该温度范围提供了在此类较高温度进行发酵(从而降低冷却成本)而不显著损失生产力的可能。良好的高温耐受提供的另一优点是如果发酵受到不希望的微生物的污染，那么在许多情况中，通过加热发酵培养基到40℃或者以上，特别是45℃或以上，可以选择性杀死不希望的微生物而不严重伤害本发明的所需细胞。
生产期期间，培养基中的细胞浓度通常为约1-150，优选约3-10，甚至更优选约3-6g干细胞/升发酵培养基。
可以在需氧、微需氧或者厌氧下进行发酵。如果希望，如WO03/102200中描述的，可以将比氧气摄入速率用作过程对照。本发明的一个优点是基因修饰细胞由于表达XI基因和其他修饰一般可以厌氧发酵木糖。
当发酵产物是酸时，可以在发酵的生产期期间缓冲培养基从而使PH保持在约5.0到约9.0，优选约5.5到约7.0。适宜的缓冲剂是在乳酸形成时将其中和的碱性材料，并且其包括例如，氢氧化钙、碳酸钙、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵、氨、氢氧化铵等等。通常，用于常规发酵过程的那些缓冲剂在此处也是适宜的。然而，在本发明的范围内允许发酵培养基的pH从通常为6或更高的起始pH，降低到低于酸性发酵产物的pKa，如约2到约5或者约2.8到约4.5。
在缓冲发酵中，在形成酸性发酵产物如乳酸时将其中和为相应的乳酸盐。从而酸的回收包括再生游离酸。这通常通过除去细胞和用强酸如硫酸酸化发酵液体培养基来实现。形成盐副产物(当钙盐是中和剂并且硫酸是酸化剂时形成石膏)，分离所述副产物与酸。然后通过诸如液-液萃取、蒸馏、吸收等的技术回收酸，如ComprehensiveBiotechnology，(编者M.Moo-Young)，Pergamon，Oxford，1985的T.B.Vickroy，卷3，38章；R.Datta，等人，FEMS Microbiol.Rev.，1995；16：221-231；美国专利号4,275,234、4,771，001、5,132,456、5,420,304、5,510,526、5,641,406和5,831,122和WO93/00440中描述的。
本发明的方法可以连续、分批或者以它们的一些组合进行。
提供下面的实施例以阐明本发明，但是这些实施例不意在限制本发明的范围。除非另外指出，所有部分和百分数都是按重量计的。实施例1A：构建含有啤酒糖酵母PGK1启动子和啤酒糖酵母Gal10终止子的质粒(pNC2，图1)；构建含有啤酒糖酵母PDC1启动子和啤酒糖酵母Gal10终止子的质粒(pNC4，图2)
啤酒糖酵母PGK1启动子(ScPGK1)的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。该序列以称作pBFY004的专有质粒的限制片段得到。备选地，可以通过PCR扩增使用啤酒糖酵母染色体DNA作为模板和基于SEQ.ID.NO.1设计的引物得到所述序列。
所用的啤酒糖酵母GAL10终止子(ScGAL10)具有标识为SEQ.ID.NO.2的核苷酸序列。该序列以称作pBFY004的专有质粒的限制片段得到。备选地，可以通过PCR扩增使用啤酒糖酵母染色体DNA作为模板和基于SEQ.ID.NO.2设计的引物得到所述序列。
使用标识为SEQ ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4的引物，使用啤酒糖酵母株系GY5098(ATCC4005098)的染色体DNA作为模板通过PCR扩增啤酒糖酵母PDC1启动子(ScPDC1)。使用PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene，Madison，WI)，以94℃1分钟，56℃1分钟和72℃1分钟的30个循环，和72℃7分钟的最终温育进行热循环。ScPDC1启动子的核苷酸序列标识为SEQ.ID.NO.5。
通过组合pGEM5Z(+)(Promega，Wisconsin)主链载体上的ScPGK1和ScGal10终止子产生质粒pNC2(图1)。通过具有限制位点XbaI、EcoRI和BamHI的多接头区在所得载体中分离ScPGK1和ScGAL10以将待表达的特定基因插入到酵母启动子和终止子之间。由具有多克隆位点的ScPGK1启动子和ScGAL10终止子组成的～1.2kbpNotI限制片段标识为SEQ.ID.NO.6。
以相同的一般方法构建含有表达盒的表达载体pNC4，只是使用ScPDC1基因代替ScPGK1基因。所得载体(pNC4)在图2中显示。由ScPGK1启动子和ScGAL10终止子组成的具有多克隆位点的～1.3kbp NotI片段标识为SEQ.ID.NO.7。
实施例1B：将G418抗性标记基因插入到pNC2(实施例1A，图1)中以产生其中G418基因可操作地连接啤酒糖酵母PGK1启动子和ScGAL10终止子的质粒(pVR22，图3)。
使用Pfu聚合酶(Stratagene，Madison，WI)与标识为SEQ.ID.NO.8和SEQ.ID.NO.9的引物，使用质粒pPIC9K(Invitrogen，CA)作为模板通过PCR扩增G418抗性基因。通过最初在95℃温育反应混合物5分钟，然后为95℃30秒、49℃30秒和72℃2分钟的35个循环，接着为72℃10分钟的最后温育进行热循环。将PCR产物用BamHI和XbaI消化并分离821bp片段并连接到pNC2(实施例1A，图1)的～4303bp BamHI-XbaI片段。所得质粒(pVR22，图3)具有可操作地连接G418抗性基因的ScPGK1启动子和ScGAL10终止子。
实施例1C：将G418抗性标记基因插入到pNC4(实施例1A，图2)中以产生其中G418基因可操作地连接啤酒糖酵母PDC1启动子和ScGAL10终止子的质粒(pVR29，图4)
使用Pfu聚合酶(Stratagene，Madison，WI)与标识为SEQ.ID.NO.8和SEQ.ID.NO.9的引物，使用质粒pVR22(实施例1B，图3)作为模板通过PCR扩增G418抗性基因。通过最初在95℃温育反应混合物5分钟，然后为95℃30秒、49℃30秒和72℃2分钟的35个循环，接着为72℃10分钟的最后温育进行热循环。将PCR产物用BamHI和XbaI消化并分离821bp片段并连接到pNC4(实施例1A，图2)的～4303bp BamHI-XbaI片段。所得质粒pVR29(图4)含有可操作地连接G418抗性基因的ScPDC1启动子和ScGAL10终止子。
实施例1D：构建含有马克斯克鲁维氏酵母PDC1基因的5’-和3’-侧翼序列和处于ScPDC1启动子和ScGAL10终止子控制下的G418基因的载体(pBH5b，图5)
用标识为SEQ.ID.NO.10和SEQ.ID.NO.11的引物，使用质粒pSO21(描述于美国公开的专利申请2004/029256A1)作为模板通过PCR扩增紧靠在马克斯克鲁维氏酵母PDC1(KmPDC1)基因上游的1254bp的DNA片段。通过最初在94℃温育反应混合物2分钟，然后为94℃30秒、55℃30秒和72℃1.5分钟的35个循环，接着为72℃7分钟的最后温育进行热循环。在0.8％琼脂糖凝胶上分离PCR产物并分离～1254bp产物。PCR产物和pVR29质粒(实施例1C，图4)用KpnI和SbfI两者消化并连接产生～6315bp载体，其称作pBH5a(图5)。pBH5a质粒含有可操作地连接ScPDC1启动子和ScGAL10终止子的G418抗性基因和与紧靠在KmPDC1基因上游的DNA同源的DNA的～1240bp片段。
用标识为SEQ.ID.NO.12和SEQ.ID.NO.13的引物，使用质粒pSO21作为模板通过PCR扩增紧靠在KmPDC1基因下游的DNA的535bp片段。通过最初在94℃温育反应混合物2分钟，然后为94℃30秒、55℃30秒和72℃45秒的35个循环，接着为72℃4分钟的最后温育进行热循环。在0.8％琼脂糖凝胶上分离PCR产物并分离535bp产物。将PCR产物用SbfI和MluI消化并将所得529bp片段连接pBH5a的SbfI-MluI片段以产生质粒pBH5b(图5)。pBH5b质粒含有相应于KmPDC1基因侧翼的那些序列，即～1.2kbp上游侧翼序列和～0.5kbpDNA下游侧翼序列，它们之间具有一个SbfI位点。pBH5b质粒还含有可操作地连接ScPDC1启动子和ScGAL10终止子的G418抗性标记。
实施例1E：构建含有聚组氨酸标记和啤酒糖酵母CYC1终止子的载体(pVR73，图6)，从pBH5b(实施例1D，图5)除去G418抗性标记基因以形成载体pVR77(图6)
基于pYES6CT载体(Invitrogen，CA)设计标识为SEQ.ID.NO.14和SEQ.ID.NO.15的引物用来扩增含有多克隆位点、聚组氨酸标记和啤酒糖酵母CYC1终止子(ScCYC1)的碱基。引物将SbfI和BsmBI位点导入产物。PCR条件为94℃1分钟、55℃1分钟和68℃1分钟的30个循环，接着为68℃10分钟的最后温育，其中使用Platinum PfxDNA聚合酶(Invitrogen，CA)。柱纯化PCR产物，然后使用Taq DNA聚合酶在72℃温育10分钟将腺苷酸加入到TA克隆的5’末端。然后将507bp产物TA克隆到TOPOII TA克隆载体(Invitrogen，CA)并称作pVR73(图6)。在该载体中包括聚组氨酸标记将导致基因克隆到唯一SbfI位点以使组氨酸标记融合到从该基因表达的蛋白质。用聚组氨酸标记对蛋白质加标签使得能够使用Ni-NTA(HRP)缀合物(Quiagen，美国)相对快速的对蛋白质进行蛋白质印迹检测和使用Ni-螯合树脂和柱(Invitrogen，CA)快速纯化所表达的基因。
将质粒pBH5b(实施例1D，图5)用SphI消化，并将保留KmPDC1启动子和终止子的～4.7kbp片段自身再连接得到质粒pVR77(图6)。然后除去来自pBH5b的G418抗生素选择标记。
实施例1F：构建含有KmPDC1上游侧翼区、多克隆位点、聚组氨酸标记和ScCYC1终止子的载体pVR78(图6)
将质粒VR73(实施例1E，图6)用酶SbfI和BsmBI消化以释放含有多克隆位点、聚组氨酸标记和ScCYC1终止子的504bp片段。用相同酶消化载体pVR77以产生～4249bp片段，其含有KmPDC1上游和下游侧翼和载体主链。连接所述两个片段形成～4752bp质粒(pVR78，图6)，其含有距离来自聚组氨酸标记184bp的唯一SbfI限制位点。该过程从质粒pVR78除去了多数KmPDC1下游侧翼区。
实施例1G：修饰质粒pVR78(实施例1F，图6)以形成从SbfI限制位点到聚组氨酸标记距离缩短以更好地进行基因表达的质粒pCM3(图7)
设计标识为SEQ.ID.NO.16和SEQ.ID.NO.17的引物以用来扩增从聚组氨酸标记到ScCYC1终止子的质粒pVR78的完整区域。该引物还具有紧靠在聚组氨酸标记上游的5’SbfI位点和3’SapI位点。使用标准方法进行PCR反应。PCR条件由94℃2分钟的最初温育，然后为94℃30秒、63℃30秒和68℃1分钟的10个循环组成。接着为94℃30秒、68℃1分钟的额外的20个循环。最后步骤为68℃8分钟的温育。用Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，CA)进行扩增。将PCR产物用SbfI和SapI限制酶消化。将通过用酶5’SbfI和3’SapI消化质粒pVR78得到的～3.9kb片段连接到PCR产物。所得质粒称作pCM3(图7)。
实施例1H：构建处于ScPDC1启动子和ScGaL10终止子转录控制下的含有大肠杆菌潮霉素抗性基因的质粒(pPS1，图8)
用标识为SEQ.ID.NO.18和SEQ.ID.No.19的引物，使用质粒pRLMex30(Mach等人1994，Curr.Genet.25,567-570)作为模板通过PCR扩增赋予潮霉素B抗性的大肠杆菌hph基因。使用相同引物，用大肠杆菌染色体DNA作为模板也可得到hpb基因。使用PfuTurboDNA聚合酶(Stratagene，Madison，WI)，以94℃1分钟、56℃1分钟和72℃3分钟的30个循环，接着为72℃7分钟的最后温育进行热循环。在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物并分离1026bp片段。然后将该1026bp片段用XbaI和BamHI消化并连接到含有ScPDC1启动子和ScGaL10终止子的pNC4(实施例1A，图2)的XbaI-BamHI片段，得到质粒pPS1(图8)。
实施例1I：构建含有KmPDC1上游侧翼区、多克隆位点、聚组氨酸标记、ScCYC1终止子(都来自pCM3，实施例1G，图7)和处于ScPDC1启动子和ScGAL10终止子(来自pPS1，实施例1H，图8)的转录控制下的大肠杆菌潮霉素抗性基因的载体(pCM9，图9)
用SphI消化质粒pPS1并将含有处于ScPDC1启动子和ScGAL10终止子控制下的hph基因的～2.2kbp片段连接到SphI消化的pCM3。所得质粒(pCM9，图9)含有KmPDC1启动子区，其后为单一SbfI位点和用于将来木糖异构酶基因表达的ScCYC1终止子。此外，用于基因表达的该盒刚好位于接近含有处于ScPDC1启动子和ScGAL10终止子控制下的hph基因的～2.2kbp片段，其用于酵母中转化体的选择。
实施例2A：基于Genbank中可得到的序列重构Piromyces sp.E2木糖异构酶(PXYLA)基因
用于重构Piromyces sp.E2木糖异构酶(PXYLA)基因的方法从Alberto Di Donato等人，Analytical Biochemistry212,291-293(1993)的“A method for synthesizing genes and cDNA’s by polymerase chainreaction”改编而来。PAGE纯化的引物从基因的中心开始到出来的重构体进行排列。使引物组保持14-16bp重叠。每个引物长60-70bp。以17步重构该基因。
该方法中采用的PCR方案使用Platinum Pfx(Invitrogen，CA)作为DNA聚合酶，且其缓冲液和MgSO4按照生产商的教导。使用标识为SEQ.ID.NO.20和SEQ.ID.NO.21的引物进行步骤1。这些引物代表所述基因序列的中心。在步骤1中不需要模板，因为引物的退火及其延伸将形成核心模板，将在其上建立随后的PCR反应。步骤1的循环为94℃1分钟、54℃1分钟和68℃2分钟的20个循环(向每个连续循环添加额外的5秒)，然后为4℃保存。
在反应步骤2-17中，Platinum Pfx(Invitrogen，CA)用作DNA聚合酶，且其缓冲液和MgSO4按照生产商的教导。来自每步的2.5μl混合物用作每个随后步骤的模板(50μ1反应物)。每次反应的引物组在表1中描述。每种情况的模板为来自前面反应步骤的5μl DNA。步骤2-17的循环为94℃1分钟、46℃1分钟和68℃2分钟的20个循环(向每个连续循环添加额外的5秒)，然后为4℃保存。
表1
Figure BSA00000722505800221
实施例2B：构建含有重构的PXYLA基因的载体pCM17(图10)；进行定点诱变以改变重构基因上的碱基从而与GenBank数据库中的序列吻合
通过将最后一轮构建中产生的～1.314kbp片段连接到TOPOII载体(Invitrogen，CA)来构建含有重构的PXYLA基因(实施例2A)的质粒。重构的PXYLA基因与Genbank序列有5个碱基不同。使用多定点诱变试剂盒(Stratagene，CA)，使用该质粒作为模板纠正每一个这些不同。将通过PAGE或HPLC纯化的三种5’磷酸化的标识为SEQ.ID.NO.54、SEQ.ID.NO.55和SEQ.ID.NO.56的诱变引物用于纠正四个错误。热循环参数包括1分钟变性步骤和1分钟退火步骤，然后是8分钟延伸。通过在热循环结束时向混合物加入1μl DpnI酶来消化该PCR步骤中形成的亲本链。混合物在37℃温育1小时，然后用于转化随试剂盒提供的XL10-Gold Ultracompetent大肠杆菌细胞。将混合物铺平板在Luria-Bertani+氨苄青霉素(LBA)板上并在37℃过夜温育。然后重复多定点诱变方案以修补第五个错误。使用两种PAGE或HPLC纯化的标识为SEQ.ID.NO.57和SEQ.ID.NO.55的5’磷酸化诱变引物。对两种转化体进行测序并且它们显示出与PXYLA基因的Genbank序列具有100％同源性。一个构建体命名为pCM17(图10)。重构的PXYLA基因的核苷酸和氨基酸序列标识为SEQ.ID.NO.58和SEQ.IDNO.59。
实施例3A：构建含有处于KmPDC1启动子和ScCYC1终止子控制下的PXYLA基因，和处于ScPDC1启动子和ScGAL10终止子控制下的大肠杆菌hph潮霉素抗性基因的载体pCM14(图11)
使用标识为SEQ.ID.NO.60和SEQ.ID.NO.61的引物，用pCM17(实施例2B，图10)作为模板通过PCR扩增PXYLA基因。使用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，CA)，通过94℃30秒、55℃30秒、72℃1.5分钟的35个循环，接着为72℃8分钟的最后温育进行热循环。在1.0％琼脂糖凝胶上电泳分离SbfI消化的PCR产物。分离1319bp产物并连接到通过用SbfI消化pCM19得到的～6829bp片段，以构建～8148bp质粒。按照与实施例2B中描述的相同方案，将标识为SEQ.ID.NO.62的诱变引物用于移去终止密码子，其意外地加入到紧靠在SbfI位点的上游，以产生～8148bp质粒(pCM14，图11)。
质粒pCM14含有处于KmPDC1启动子和ScCYC1终止子控制下的PXYLA基因，聚组氨酸尾在该基因的3’末端。该质粒还含有处于ScPDC1启动子和ScGAL10终止子控制下的大肠杆菌hph基因。
实施例3B：将Ura3选择标记整合到pCM14质粒(实施例3A，图11)，其中缺失hph表达盒
Alani等人在“A method for gene disruption that allows repeateduse of Ura3 selection in the construction of multiply disrupted yeaststrains，”(Genetics，1987，116,541-545)中已经描述了基因整合或基因破坏的方法。该方法利用尿嘧啶营养缺陷型酵母株系和HisG-ScUra3-HisG重复盒。该盒可以用作导入基因或者破坏基因的选择标记，其优点是HisG盒在随后世代中与自身重组。从而，酵母细胞在重组事件中丧失了ScUra3基因，并且ScUra3基因的该丧失恢复了酵母株系的尿嘧啶营养缺陷型，使得可以用相同盒随后进行转化。
从Nancy DaSilva得到整合入称为pNADF1l(Nancy DaSilva，UCIrvine，California)的质粒的HisG-ScUra3-HisG盒。通过将质粒用BamHI和EcoRI酶消化并将～3.8kbp片段连接到BamHI和EcoRI消化的质粒pPUC19(New England Biolabs，美国)，来从pNADF11分离HisG-ScUra3-HisG盒。所得质粒称作pVR65(图19)。
将质粒pCM14(实施例3A，图11)用AatII/SphI消化并在1％凝胶上电泳分离。分离含有PXYLA盒的～5907bp片段。将质粒pVR65用AatII/SphI消化并在1％凝胶上电泳分离。分离～4293bpHisG-ScUra3-HisG片段并连接到来自质粒pCM14的～5907bp片段，分离插入片段。所得载体标识为pCM28(图12)。其含有处于KmPDC1启动子和ScCYC1终止子控制下的PXYLA基因(具有聚组氨酸标记)，和HisG-Ura3-HisG盒。从pCM28除去存在于质粒pCM14中的大肠杆菌hph基因和侧翼部分。
实施例4A：克隆马克斯克鲁维氏酵母木糖还原酶(KmXYL1)基因和上游和下游侧翼
通过Génolevures计划(Genomic Exploration of theHemiascomycetous Yeasts：12.Kluyveromyces marxianus var.marxianus Bertrand Llorente，Alain Malpertuy，
Figure BSA00000722505800241
Blandin，Francois Artiguenave，Patrick Wincker and Bernard Dujon FEBSLetters 487(1)71-75页)中相似马克斯克鲁维氏酵母的部分基因组测序确定了推定的马克斯克鲁维氏酵母木糖还原酶(KmXYL1)编码区的410bp片段和约500bp启动子。基于该序列和来自其他酵母木糖还原酶共有序列的一些公知序列，设计引物以分离完整KmXYL1基因序列和启动子。用基因组步移(gemone walking)方法从马克斯克鲁维氏酵母的野生型株系得到KmXYL1基因序列上游和下游的序列。用基因组步移试剂盒(BD Biosciences，Paolo Alto，CA)得到上游和下游侧翼的序列。将来自马克斯克鲁维氏酵母的基因组DNA用来自基因组步移试剂盒(Invitrogen，CA)的限制酶消化。将用片段得到的基因组文库用作PCR反应的模板。
设计标识为SEQ.ID.NO.63和SEQ.ID.NO.64的PCR引物来步移5’末端和3’末端两者以得到木糖还原酶和上游/下游侧翼序列。这些引物用于与来自基因组步移试剂盒(BD Biosciences，CA)的引物AP1和AP2一起步移。该组引物扩增基因上游的～2.5kbp片段。对该片段测序以揭示从上游区的最末端到KmXYL1基因的DNA序列。类似地，标识为SEQ.ID.NO.65和SEQ.ID.NO.66的引物与来自基因组步移试剂盒的引物AP1和AP2一起步移。这扩增了KmXYL1基因下游的～1.8kbp片段。对该片段测序以揭示从下游区的最末端离开木糖还原酶的DNA序列。
从基因组步移得到的序列信息使得能够设计标识为SEQ.ID.NO.67和SEQ.ID.NO.68的引物。这些引物用于用500ng马克斯克鲁维氏酵母的基因组DNA进行热循环反应。使用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，CA)，通过94℃1分钟、56℃1分钟、72℃3分钟的30个循环，然后为72℃7分钟的最后温育进行热循环。PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离。分离～3.5kbp产物并连接到pCRII topo-克隆载体中以得到质粒pVR95(图13)。
实施例4B：构建含有KmXYL1上游和下游侧翼，和处于ScPDC1启动子和ScGAL10终止子控制下的G418抗性标记基因的质粒pCM19(图14b)
设计标识为SEQ.ID.NO.69和SEQ.ID.NO.70的引物以从质粒pVR95(实施例4A，图13)扩增～1.3kbp片段。该片段包括KmXYL1基因的启动子区以及该基因的编码区的～300bp。这些引物用于用来自pVR95(实施例4A，图13)的50ng质粒DNA进行热循环反应。使用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，CA)，通过94℃1分钟、53℃1分钟、68℃1分钟的30个循环，然后为68℃8分钟的最后温育进行热循环。PCR产物经电泳分离，PstI消化并连接到也用PstI消化的pVR29质粒(实施例1C，图4)。验证通过该方法得到的质粒中KmXYL1基因的正确方向和插入到pVR29载体中的启动子区。该质粒称作pCM18(图14a)。
设计标识为SEQ.ID.NO.71和SEQ.ID.NO.72的引物以从pVR95扩增～1.1kbp片段。该片段包括KmXYL1基因远离其终止子的下游的区域。这些引物用于用来自pVR95的50ng质粒DNA进行热循环反应。使用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，CA)，通过94℃1分钟、59℃1分钟、68℃1分钟的30个循环，然后为68℃8分钟的最后温育进行热循环。标识为SEQ.ID.NO.73和SEQ.ID.NO.74的引物用于用50ng上述第一种PCR产物进行热循环反应以将其扩增。使用PfxDNA聚合酶(Invitrogen，CA)，通过94℃1分钟、45℃1分钟、68℃1分钟的30个循环，然后为68℃8分钟的最后温育进行热循环。第二次热循环后的PCR产物经电泳分离，用ApaI消化并连接到也用ApaI消化的质粒pCM18，以形成载体pCM19(图14b)。质粒pCM19含有KmXYL1的下游侧翼和KmXYL1基因的上游侧翼(以及该基因的～300bp的编码区)，所述上游侧翼和下游侧翼通过含有处于ScPDC1启动子和ScGAL10终止子控制下的G418基因的盒隔开。验证KmXYL1下游区关于G418抗性基因的正确方向。
实施例4C：通过用非功能性基因替换功能性Ura3基因构建马克斯克鲁维氏酵母尿嘧啶营养缺陷型(CD683)
使用基因组DNA作为模板和基于Genbank序列(登录号AF528508)设计的引物分离马克斯克鲁维氏酵母Ura3(KmUra3)基因。将804bp片段克隆到pBluecript载体(Stratagene，Wisconsin)并标记为pBSKura3Myra(图15)。
将该质粒用EcoRV消化并分离缺失EcoRV片段的KmUra3基因的～4kbp片段，并再连接以形成质粒pBSDeltaUra3Km(图15)。该质粒具有非功能性基因(DeltaUra3)。用KpnI和NotI消化质粒并将其用于转化马克斯克鲁维氏酵母的野生型株系。在5-FOA板上选择转化体。用在DeltaUra3基因的缺失区域设计的引物筛选生长在这些板上的菌落。还设计引物以分离整个基因并对那些片段进行测序以表明该新的较短的无功能Delta Ura3基因已经替换了转化体中的KmUra3基因。将成功转化的株系称为CD683。株系CD683不生长Sc-Ura板，表明其是尿嘧啶营养缺陷型。
实施例4D：通过用质粒pCM19(实施例4B，图14b)转化株系CD683(实施例4C)产生具有缺失的木糖还原酶(KmXYL1)基因的马克斯克鲁维氏酵母突变体(CD804)
通过用PvuII消化pCM19得到含有KmXYL1基因上游和下游区以及位于它们之间的G418抗性表达盒的～5.2kbp片段。该片段用于用标准电穿孔方法转化马克斯克鲁维氏酵母株系CD683。回收转化的细胞并铺平板在10g/L酵母提取物、20g/L酵母蛋白胨、50g/L葡萄糖(YPD)+50μg/ml G418板上并在37℃温育48-96小时。生长在YPD+50μg/ml G418板上的96个转化体在YPX(10g/L酵母提取物，20g/L酵母蛋白胨+木糖50g/L)+50μg/ml G418板上复制。96个转化体的73个不能在YPX+50μg/ml G418板上生长，证明它们不能利用木糖作为碳源。该无能力表明功能性KmXYL1基因已经在同源重组中被缺失并且用G418盒代替。不能用木糖作为碳源的那些转化体称作CD804。
使用标识为SEQ.ID.NO.75和SEQ.ID.NO.76的PCR引物证实功能性KmXYL1基因的缺乏，设计所述引物以PCR扩增KmXYL1基因的中心。使用标识为SEQ.ID.NO.77和SEQ.ID.NO.78的引物通过PCR证实G418基因的存在。结果表明G418抗性基因片段整合在KmXYL1基因的基因座上。使用标识为SEQ.ID.NO.79和SEQ.ID.NO.80的一组引物进行进一步的PCR还证实G418抗性基因片段代替了天然KmXYL1基因。DNA印迹分析还证实木糖还原酶基因从株系CD804缺失。
实施例4E：株系CD683(实施例4C)和CD804(实施例4D)的木糖还原酶活性测定
将单独的带挡板的摇瓶(250ml容量)接种株系CD683(实施例4C)和CD804(实施例4D)。摇瓶在以250rpm振荡下在35℃温育并过夜生长。培养基由20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖组成。18小时后，以4000G离心细胞5分钟，用100mM磷酸钠缓冲液洗涤并重悬浮在0.5ml破裂缓冲液中。破裂缓冲液由溶于200ml体积的100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、1mM二硫苏糖醇(DTT)、40mg苯甲基磺酰氟(PMSF)(溶于500μl DMSO)和4片蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche，CA)组成。用玻璃珠(Invitrogen，CA)机械裂解细胞并以14,000G离心15分钟。移取上清液并根据试剂盒方案(AmershamBioscience)通过PD-10脱盐柱运行。XR酶测定试验溶液由溶于总体积1ml的100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、0.2mM NADPH、0.5mM D-木糖组成，向所述溶液加入各种量的酶容易并在监视340nm的吸收。NADPH使用表明还原酶酶活性。没有木糖的空白溶液用于确定背景NADPH使用。
使用Advanced Protein Assay Reagent(Cysoskeleton#ADV01)，以BSA作为标准确定总蛋白质。通过NADPH消化指出的株系CD683的木糖还原酶活性为13.7mU/mg蛋白质。株系CD804的NADPH消耗与4.4mU/mg蛋白质的木糖还原酶活性一致，而不是预期的0活性。CD804的该NADPH使用归因于非特异醛糖还原酶，其进行木糖向木酮糖的一些转化。株系CD683和CD804相互铺平板在YPX板上。株系CD804在第4天结束时未表现出在那些板上的任何生长，而株系CD683在那些板上生长良好。
实施例5A：构建含有克隆的啤酒糖酵母木酮糖激酶(ScXKS1)基因的质粒pVR67(图16)
从美国典型培养物保藏中心(ATCC登录号38626)得到啤酒糖酵母细胞并在标准条件下生长所述细胞。用常规方法从啤酒糖酵母提取基因组DNA。用Pfx聚合酶(Invitrogen，CA)进行PCR扩增反应。每个反应物含有浓度为500ng的啤酒糖酵母基因组DNA、浓度为0.2mM的4种dNTP的每一种(即，dATP、dGTP、dCTP和dTTP的每一种)和1μM的标识为SEQ.ID.NO.81和SEQ.ID.NO.82的扩增引物的每一种。通过94℃10分钟的初始温育，然后为94℃15秒、55℃15秒和68℃90秒的35个循环进行循环。用常规方法凝胶纯化～1.8kbp片段并将其克隆到TA克隆载体中(Invitrogen，CA)。对所得质粒(pVR67，图16)进行测序以验证ScXKS1基因序列。该基因显示出与Genbank中的公知序列(登录号X61377)的极好的同源性。ScXKS1基因的核苷酸序列标识为SEQ.ID.NO.83。该基因编码的酶的氨基酸序列标识为SEQ.ID.NO.84。
实施例5B：构建含有啤酒糖酵母TEF1(ScTEF1)启动子和ScGAL10终止子的质粒pVR52(图16)
从pTEFZeo(Invitrogen，CA)载体克隆啤酒糖酵母TEF1(ScTEF1)启动子。将标识为SEQ.ID.NO.85和SEQ.ID.NO.86的引物用于扩增ScTEF1启动子和插入XbaI和SstI限制位点。将PCR产物和质粒pNC2(实施例1A，图1)用XbaI和SstI酶消化并连接以得到质粒pVR52(图16)。
实施例5C：构建含有处于ScTEF1启动子和ScGAL10终止子控制下的ScXKS1基因的质粒pVR103(图18)
将质粒pVR67(实施例5A，图16)用XbaI和BamHI消化。凝胶纯化含有ScXKS1基因的～1.8kbp片段。将质粒pVR52(实施例5B，图16)也用XbaI和BamHI消化并将所得片段连接到来自pVR67的～1.8kbp片段以形成质粒载体pVR96(图16)。该质粒含有处于ScTEF1启动子和ScGall0终止子控制下的ScXKS1基因。在该载体中，ScXKS1基因的ATG起始位点与ScTEF1启动子的末端离开约130bp。为了将该距离减小到约70-73bp，设计标识为SEQ.ID.NO.87和SEQ.ID.NO.88的引物，其将以正确的距离和限制位点从pTEFzeo载体扩增ScTEF1启动子。将pTEFzeo(Invitrogen，CA)用作模板。使用FailsafePCR系统(Epicentre，Madison，WI)，通过94℃30秒、57℃30秒和72℃30秒的30个循环，接着为72℃4分钟的最终温育进行热循环。在0.8％琼脂糖凝胶上分离PCR产物并分离460bp片段。使用标识为SEQ.ID.NO.89和SEQ.ID.NO.90的引物进行第二次PCR以扩增该片段。PCR产物经EcoRI消化并连接到EcoRI-消化的质粒pVR96(图16)。所得质粒(pVR102，图17)具有两个ScTEF1启动子-第二个为驱动ScXKS1基因的启动子。该启动子的末端和基因的ATG之间的距离恰好为73bp。将质粒pVR102用SphI消化并连接到SphI消化的pPUC19(New England Biolabs，美国)。所得质粒(pVR103，图18)经测序以证实ScXKS1基因处于ScTEF1启动子和ScGAL10终止子控制下。
实施例5D：构建含有在HisG-ScUra3-HisG盒(来自pVR65，实施例3B)旁边的ScXKS1表达盒(来自pVR103，实施例5C)的质粒pVR104(图19)
用SphI消化质粒pVR65(实施例3B，图19)，并使用虾碱性磷酸酶(Roche Diagnostics，美国)按照生产商的方案对线性化载体的5’-磷酸末端去磷酸化。
也用SphI消化质粒pVR103(实施例5C，图18)，并将具有处于ScTEF1启动子和ScGAL10终止子控制下的ScXKS1基因的3.5kbp片段连接到线性化pVR65片段以得到质粒pVR104(图19)。
实施例5E：通过转化株系CD804(实施例4D)产生具有超表达的ScXKS1基因活性和缺失的木糖还原酶基因的马克斯克鲁维氏酵母突变体(CD805)
使用标准电穿孔方法，将来自质粒pVR104(实施例5D，图19)的～6.8kbp PvuII片段用于转化株系CD804(实施例4D)。在YPD培养基中回收转化的细胞，4小时后在SC-Ura板(Qbiogene，CA)上铺平板并在37℃温育48-72小时。72小时结束时将在SC-Ura板上生长的转化体在新鲜SC-Ura板上再划线培养。用菌落PCR筛选再划线的转化体。
将经转化株系的单个阳性菌落接种到50ml YPD培养基中并以200rpm振荡在37℃过夜温育。将10μl该培养物铺平板在5-FOA板上并在37℃过夜温育。由于HisG区的重组，生长的菌落抗5-FOA并且预期丢失了ScUra3基因。用标识为SEQ.ID.NO.91和SEQ.ID.NO.92的引物进行PCR以扩增指示完整ScXKS1基因的700bp区域和～1kb的HisG基因。设计标识为SEQ.ID.NO.93和SEQ.ID.NO.94的第二个引物组以用于扩增ScXKS1和所述基因末端之间的～1kbp产物。这两个引物组证实ScXKS1基因已经整合到转化体的染色体中，并且ScUra3基因已经通过HisG区的自发重组除去。该株系标记为CD805并且用于进一步试验增加的木酮糖激酶蛋白质活性。
设计标识为SEQ.ID.NO.91和SEQ.ID.NO.93的引物以扩增ScTEF1启动子和ScXKS1基因末端间的～2.6kbp产物。设计标识为SEQ.ID.NO.92和SEQ.ID.NO.95的引物以扩增ScXKS1基因和所述片段开始处之间的～1.7kbp产物。这两个引物组证实ScXKS1基因已经整合到株系CD805的染色体中。
木酮糖激酶活性测定：将单独的带挡板摇瓶(250ml容量)接种株系CD804(实施例4D)和CD805(实施例5E)。将摇瓶置于35℃，以250rpm振荡并过夜生长。培养基由20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖组成。16小时后以4000G离心细胞5分钟，用100mM磷酸钠缓冲液洗涤并重悬浮在0.5ml破裂缓冲液中。破裂缓冲液由溶于200ml体积的100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、1mM DTT、40mgPMSF(溶于500μl DMSO)和4片蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche)组成。用玻璃珠(Invitrogen，CA)机械裂解细胞并以14,000G离心15分钟。移取上清液并根据试剂盒方案(Amersham Bioscience)通过PD-10脱盐柱运行。将10μl提取物加入30℃平衡的80μl XuK混合物中(含有61mg Na2ATP·3H2O，10.0ml0.1M HEPES/KOH(pH7.5)，1.2ml0.1M MgCl2(稀释到16.0ml)，和10μl20mM木酮糖，总体积为100ml。用水代替木酮糖作为空白。通过煮沸2分钟并转移到冰上结束反应。加入900μl Hek2(40mM HEPES/KOH(pH7.5)，10mM MgCl2，2.5mM PEP和0.2mM NADH)并以14,000G离心10分钟。将上清液转移到分光光度计比色杯，并确定最初340nm基线吸收。加入10μl肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的1∶1∶1混合物并测量最终吸收。用Advanced Protein Assay Reagent(Cysoskeleton#ADV01)以BSA作为标准测定总蛋白质。株系CD804的木酮糖激酶活性测量为69.7+/-8.0mU/mg，而株系CD805的为400.8+/-102.7mU/mg，表明CD805具有超表达的ScXKS1活性。
实施例6A：构建含有马克斯克鲁维氏酵母木糖醇脱氢酶(KmXYL2)基因的上游和下游侧翼和处于ScPDC1启动子和ScGAL10终止子控制下的大肠杆菌hph基因的质粒pCM23(图20)
用SEQ.ID.NO.96和SEQ.ID.NO.97所示的引物从基因组PCR扩增含有马克斯克鲁维氏酵母木糖醇脱氢酶(KmXYL2)基因的启动子区的988bp片段。用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，CA)，通过94℃30秒、52℃30秒、68℃1分钟的35个循环，接着为68℃8分钟的最后温育进行热循环。将产物克隆到TOPOII载体(Invitrogen，CA)。质粒pUC19(New England Biolabs，美国)用EcoRI消化并在1.0％凝胶上分离。从pUC19质粒分离2.686kbp带并连接到通过用EcoRI消化从TOPOII质粒释放的片段，从而产生～3.674kbp质粒，将其称作pCM20。
用三组引物从基因组PCR扩增含有KmXYL2的终止子序列和下游区的片段。第一组引物标识为SEQ.ID.NO.98和SEQ.ID.NO.99，其扩增目的下游区。用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，CA)，通过94℃30秒、55℃30秒和68℃1分钟的35个循环，接着为68℃8分钟的最后温育进行热循环。第二组引物标识为SEQ.ID.NO.100和SEQ.ID.NO.101。用2.5μl第一次PCR产物作为DNA模板，将第二组引物用于在两个末端导入SphI位点。用Pfx DNA聚合酶，通过94℃30秒、60℃30秒和68℃1分钟的35个循环，接着为68℃8分钟的最后温育进行热循环。第三组引物标识为SEQ.ID.NO.102和SEQ.ID.NO.103。其用2.5μl第二次PCR产物扩增前面的产物。用Pfx DNA聚合酶，通过94℃30秒、47℃30秒和68℃1分钟的35个循环，接着为68℃8分钟的最后温育进行热循环。将最终产物克隆到TOPOII载体(Invitrogen，CA)中，并用SphI消化并且在1.0％凝胶上分离。分离～1.008kbp片段并将其连接到SphI消化的质粒pCM20(来自上面)，以形成～4.682kbp质粒，其称作pCM21(图20)。
用SacI/XbaI消化质粒pCM21并在1.0％凝胶上分离。分离～4.665kbp带并连接到通过用SacI/SpeI消化质粒pPS1(实施例1H，图8)分离的～2.366kbp带。所得～7.031kbp质粒称作pCM23(图20)。其含有KmXYL2基因的上游和下游侧翼，它们由处于ScPDC1启动子和ScGAL10终止子的转录控制下的大肠杆菌hph基因隔开。
实施例6B：用来自质粒pCM23(实施例6A，图20)的片段从株系CD805(实施例5E)产生马克斯克鲁维氏酵母突变体(CD806)以缺失木糖醇脱氢酶基因
使用标准电穿孔方法用来自质粒pCM23的片段转化株系CD805的单个菌落。在YPD培养基中回收经转化的细胞并在4小时后铺平板在YPD+150μg/ml潮霉素板上，并在37℃温育48小时。48小时后生长在YPD+150μg/ml潮霉素板上的86个转化体在新鲜YPD+150μg/ml潮霉素板上再次划线培养。通过PCR用SEQ.ID.NO.104和SEQ.ID.NO.105标识的引物对转化体筛选天然木糖醇脱氢酶的存在。用Failsafe酶(Epicentre，Wisconsin)，通过94℃10分钟的最初循环，94℃30秒、50℃30秒、72℃1分钟的35个循环，接着为72℃8分钟的最后温育进行热循环。1064bp的PCR产物表明完整的木糖醇脱氢酶基因。15个转化体不产生所预计的产物，表明木糖醇脱氢酶基因已经成功地从所述15个转化体缺失。
用标识为SEQ.ID.NO.106和SEQ.ID.NO.107的引物对那15个转化体进行PCR筛选。设计该引物组以PCR扩增5’末端。阳性结果(～1.5kbp片段)表明重组体的染色体中潮霉素抗性基因片段以5’交换代替了KmXYL2基因。设计标识为SEQ.ID.NO.108和109的第三个引物组以PCR扩增3’末端。～1kbp的产物表明重组体的染色体中潮霉素抗性基因片段以3’交换代替了KmXYL2基因。在15个转化体中，两个显示相应于两种PCR产物的带。一种标记为株系CD806。株系CD806具有超表达的ScXKS1基因活性并且缺失木糖脱氢酶(KmXYL2)和木糖还原酶(KmXYL1)基因。
木糖醇脱氢酶活性测定：用株系CD805(实施例5E)和CD806(实施例6B)接种单独的带挡板的摇瓶(250ml容量)。将摇瓶置于33℃，以250rpm振荡并过夜生长。培养基由20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖组成。16小时后以4000G离心细胞5分钟，用100mM磷酸钠缓冲液洗涤并重悬浮在0.5ml破裂缓冲液中。破裂缓冲液由溶于200ml体积的100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、1mM DTT、40mg PMSF(溶于500μl DMSO)和4片蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche)组成。用玻璃珠(Invitrogen，CA)机械裂解细胞并以14,000G离心15分钟。移取上清液并根据试剂盒方案(Amersham Bioscience)通过PD-10脱盐柱运行。将样品加入由100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、0.2mM NADH和20mM木酮糖组成的测试溶液中。监视340nm吸收。用Advanced Protein Assay Reagent(Cysoskeleton#ADV01)以BSA作为标准测定总蛋白质。株系CD805(实施例5E)的酶分析得到14.5+/-1.6mU/mg的酶活性，而株系CD806的活性为0.0+/-0.1mU/mg。这些结果表明在株系CD806中已经缺失木糖醇脱氢酶活性。
实施例7A：通过用质粒pCM28(实施例3B，图12)转化株系CD806(实施例6B)产生具有外源PXYLA基因、超表达的ScXKS1基因活性和缺失KmXYL1和KmXYL2基因的马克斯克鲁维氏酵母突变体(CD882)
使用标准电穿孔方法用NaeI消化的质粒pCM28转化株系CD806的单个菌落。转化体在37℃过夜生长，并在5个相同的Sc-Ura板上划线培养以进行筛选。使用标识为SEQ.ID.NO.110和SEQ.ID.NO.111的引物通过PCR验证PXYLA基因的存在。所得转化体(称作CD882)含有重构的PXYLA基因、超表达的ScXKS1基因活性并且缺失KmXYL1和KmXYL2基因。
实施例7B：株系CD882(实施例7A)的酶和蛋白质印迹分析
用结合6X聚组氨酸尾的Probond Ni2+螯合树脂(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)柱纯化来自CD882的蛋白质。将Ni-NTA-HRP缀合的探针(Qiagen，Valencia，CA，美国)用于直接检测标记的蛋白质。对纯化期间收集的级分的蛋白质印迹分析进一步证实株系CD882中存在XI蛋白质。根据“The Streptomyces rubiginosus xylose isomerase ismisfolded when expressed in Saccharomyces cerevisiae”，Gardonyl等人，2003中描述的方法进行酶活性测量。该评估证实株系CD882中相同级分中的木糖异构酶活性，其中在所述级分中通过蛋白质印迹分析已经检测到6X聚组氨酸尾PXYLA基因。
实施例8A：用防止聚组氨酸尾编码的终止密码子构建含有重构的PXYLA基因的质粒(pCM29，图21)
用标识为SEQ.ID.NO.112和SEQ.ID.NO.113的引物使用pCM17(实施例2B，图10)作为模板PCR扩增重构的PXYLA基因(实施例2A)。用Pfx DNA聚合酶，通过94℃30秒、55℃30秒、72℃1.5分钟的35个循环，接着为72℃8分钟的最后温育进行热循环。用SbfI消化PCR产物并在1.0％琼脂糖凝胶上电泳分离。分离1319bp产物并连接到通过用SbfI消化质粒pCM9(实施例1I，图9)得到的6829bp片段，以构建～8148bp的质粒(pCM29，图21)。该质粒含有处于KmPCD1启动子和ScCYC1终止子控制下的具有非可操作性的聚组氨酸尾的PXYLA基因和大肠杆菌hph表达盒。
实施例8B：通过用质粒pCM29(实施例8A，图21)转化株系CD806(实施例6B)产生含有非组氨酸标记的PXYLA基因、超表达的ScXKS1基因活性和缺失木糖脱氢酶和木糖还原酶基因的马克斯克鲁维氏酵母突变株系(CD861)
将通过消化pCM29所得3.192kb PvuII/SphI片段用于使用标准电穿孔方法转化株系CD806。在YPD培养基中回收转化的细胞并在6小时后在YPX+300μg/ml G418+150μg/ml潮霉素(pH7.0)上铺平板。30℃5天后，已经生长了数百小菌落和一个较大的菌落。将大菌落称作CD861。
对株系CD861进行基因组步移以确定PXYLA基因怎样整合。发现PXYLA基因以一个以上的拷贝整合于紧靠在天然PDC基因的启动子区的上游。一个拷贝处于存在于质粒pCM29中的～1236bpKmPDC1启动子区的控制下，所述拷贝包括约142bp上游基因和ScCYC1终止子。另一拷贝位于紧靠在ScCYC1终止子的下游，并且包括与天然KmPDC1启动子长度匹配的1026bp启动子。该启动子与pCM29和第一个拷贝中的启动子相比缺失上游基因的142bp区和5’末端的额外的～68bp。第二个拷贝也在ScCYC1终止子的控制下。紧靠在该第二个ScCYC1终止子下游的为天然的1026bp KmPDC1启动子，接着是天然KmPDC1基因。
实施例8C：CD861(实施例8B)的木糖异构酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶分析
将单独的带挡板摇瓶(250ml容量)接种CD806(实施例6B)和CD861(实施例8B)。在250rpm振荡下将摇瓶在30℃温育，并过夜生长。培养基由20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖组成，补加了300μg/ml G418和150μg/ml潮霉素。用Y-PER溶液(Pierce-Rockford，IL)裂解细胞，然后用PD-10柱(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)脱盐。将由100mM TES-NaOH、250mM木糖、10mM MgCl2、0.6mM NADH、1U SDH(sigma)(pH7.0)组成的受试溶液补充到1.0mL，加入100μL细胞提取物。使用仅仅没有木糖的相同受试溶液的空白来确定木糖异构酶活性。株系CD806的木糖异构酶活性为0，而株系CD861的为1.07+/-0.21U/mg粗提取物。这证实株系CD861含有正发挥功能的木糖异构酶基因。
还进行木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶测定以验证最终株系中的活性/活性损伤。株系CD861(实施例8B)和株系CD683(实施例4C)单独于由20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖组成的培养基中(对于株系CD861补加300μg/ml G418和150μg/ml潮霉素)生长过夜。用Y-PER溶液裂解细胞。使用Advanced ProteinAssay Reagent(Cysoskeleton#ADV01)，以BSA作为标准测定总蛋白质。株系CD861中的木糖还原酶活性为260+/-41.8mU/mL，作为对比，株系CD683的为516.5+/-10.6mU/mL。活性的～50％减小表明木糖还原酶基因的缺失，所测量的活性归因于进行木糖向木酮糖的一些转化的非特异性醛糖还原酶。木糖醇脱氢酶活性为对于株系CD861为12.4+/-4.4mU/mL，作为对比，对于株系CD683为110.4+/-7.2mU/mL。木酮糖激酶活性对于株系CD861为370.5+/-147.6mU/mL，作为对比，对于CD683为44.8+/-8.2mU/mL。
实施例8D：株系CD861(实施例8B)中PXYLA基因的动力学分析
将株系CD861的单个菌落接种在由10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和100g/L右旋糖组成的培养基中以过夜生长。通过离心收获细胞，将其用10ml100mM磷酸钠、1mM PMSF(pH7.0)洗涤一次并再次离心。向其中加入2ml Y-PER溶液并温和重悬浮，并将细胞溶液在室温温育30分钟，其中间歇搅拌。离心细胞并用PD-10柱(AmershamBiosciences)将上清液脱盐。如实施例8C中描述的进行酶测定，唯一不同是底物从0.05-10mM木糖变动。从米-曼氏图得到Km和Vmax，该曲线给出的相应的Vmax为～1.8，相应的Km为2.2mM木糖。Linweaver-Burk图给出的相应的Vmax为～1.0，相应的Km为1.2mM木糖。
实施例8E：使用木糖醇对株系CD861(实施例8B)中PXYLA活性的抑制研究
株系CD861生长在含有各种浓度木糖醇的木糖培养基中，木糖醇是已知的木糖异构酶抑制剂。当木糖醇水平从0增加到0.25mM时，木糖异构酶的Km加倍，且当木糖醇水平增加到0.50mM时，木糖异构酶的Km再次加倍。
实施例8F：株系CD861(实施例8B)中PXYLA基因的pH耐受性
将株系CD861的单个菌落接种在由10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和100g/L右旋糖组成的培养基中以过夜生长。通过离心收获细胞，将其用10ml 100mM磷酸钠、1mM PMSF(pH7.0)洗涤一次并再次离心。向其中加入2ml Y-PER溶液并温和重悬浮，并将细胞溶液在室温温育30分钟，其中间歇搅拌。完全一样的受试溶液由溶于900L体积的100mM TES-NaOH、10mM MgCl2、0.6mM NADH、250mM木糖和1U SDH组成，使用5M乳酸(Sigma，美国)将其分别调节为pH7.0、6.6、5.9、4.6和3.8。向受试溶液中加入100μL酶或者其稀释液以使终体积达到1mL。如实施例8C中所述测量酶活性。在pH6.5得到最适活性。在pH5.9时，蛋白质保留45％的最大活性。
实施例9A：株系CD806(实施例6B)、CD861(实施例8B)和CD882(实施例7A)的微需氧摇瓶表征
将株系CD806、CD861和CD882的单个菌落分别接种在100ml培养基中以过夜生长，所述培养基由20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖组成，补加了300μg/ml G418和300μg/ml潮霉素。测定细胞干重并离心适宜体积的培养基得到2g细胞干重(gcdw)，并重悬浮在由20g/L酵母蛋白胨、10g/L酵母提取物、50g/L木糖和10mM MgCl2，pH7.0组成的培养基中。将细胞置于250mL带挡板的摇瓶中并置于30℃以70rpm振荡。株系CD806产生唯一产物0.7g/L木糖醇。株系CD882产生3.8g/L木糖醇和0.4g/L乙酸作为其仅可测量的产物。株系CD861产生13.5g/L乙醇、0.4g/L木糖醇和少量甘油、乙酸和琥珀酸(共＜2g/L)。
实施例9B：CD806(实施例6B)、CD861(实施例8B)和CD882(实施例7A)的管式摇瓶表征
将株系CD806、CD861和CD882的单个菌落分别接种在100ml培养基中以过夜生长，所述培养基由20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖组成，补加了300μg/ml G418和300μg/ml潮霉素。将每个株系的50ml过夜生长物离心，然后重悬浮在25ml生产培养基中，所述生产培养基由20g/L酵母蛋白胨、10g/L酵母提取物、50g/L木糖和10mM MgCl2，pH7组成。将细胞悬浮物的1ml等分试样加入到50ml Falcon管中的45ml生产培养基中并测定最初OD(见OD值附录)。该测定重复数次以确保整个实验中可以采集足够样品。将管置于生产条件33℃和200rpm中。在这些条件下株系CD861产生21g/L乙醇并显示出0.3g/L-小时的体积生产力。株系CD806不能消耗木糖。株系CD861和CD882都能够厌氧生长。
实施例10A：构建含有处于ScPGK启动子和ScGAL10终止子控制下的瑞士乳杆菌(L.helveticus)L-乳酸脱氢酶基因(LhLDH)和没有侧翼His重复序列的ScUra3基因的质粒pVR113(图22)
使用质粒pCM28(实施例3B，图12)作为模板和标识为SEQ.ID.NO.114和SEQ.ID.NO.115的引物进行PCR以导入SphI位点同时除去侧翼HisG重复序列。使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，美国)，通过94℃10分钟的最初循环，然后为94℃30秒、45℃30秒、72℃1.4分钟的35个循环，接着为72℃8分钟的最后温育进行热循环。用SphI消化所得质粒以得到～1.45kbp片段，其含有ScUra3基因而无侧翼HisG重复序列。
将含有处于ScPGK启动子和ScGAL10终止子控制下的瑞士乳杆菌乳酸脱氢酶(LhLDH)基因和处于ScPGK启动子和ScGAL10终止子控制下的G418抗性标记基因的质粒(WO03/102152A1的图6和实施例1E中标识为pVR39)用SphI消化以产生～5.16kbp片段。将该～5.16kbp片段连接到上面的～1.45kbp片段以形成～6.61kbp质粒(pVR113，图22)。
实施例10B：通过用质粒pVR113(实施例10A，图22)转化株系CD861(实施例8B)产生含有外源乳酸脱氢酶基因、无组氨酸标记PXYLA基因、超表达的ScXKS1基因活性和缺失木糖脱氢酶和木糖还原酶基因的马克斯克鲁维氏酵母突变株系(CD896)
用标准电穿孔方法用质粒pVR113转化株系CD861的单个菌落。在YPD中回收转化的细胞4小时，随后在Sc-Ura板上铺平板。通过PCR筛选LhLDH/ScUra3盒选择一个阳性转化体(株系CD896)。用木糖异构酶和木酮糖激酶引物，转化体显示出阳性PCR结果，对于木糖还原酶和木糖醇脱氢酶引物则显示出阴性结果。
实施例10C：株系CD896(实施例10B)的摇瓶表征
将株系CD896(实施例10B)的单个菌落接种到50mL YPD(250ml带挡板摇瓶中10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和100g/L葡萄糖)并在37℃以250rpm生长16小时。将该培养物的3gcdw接种到摇瓶(微需氧)和250mL玻璃瓶(厌氧)中的YP(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨)和50g/L木糖和23g/L CaCO3中。摇瓶在42℃温育并以随机事件间隔抽取样品用于进行HPLC。在微需氧条件下株系CD896的发酵得到39g/L的L-乳酸滴度和对于所消耗的木糖的77％-79％的得率。产生的L-乳酸的容量生产力为1g/L/小时，而最初木糖消耗速率为1.0到1.4g/L/小时。在厌氧生产条件下，株系CD896在YP+50g/L木糖+23g/L碳酸钙上发酵在前24小时产生10g/L L-乳酸，随后木糖消耗停止。
实施例11A：构建含有有(pCM31，图23)和没有(pVR118，图24)编码的聚组氨酸尾的重构PXYLA基因以及无侧翼His重复序列的ScUra3基因的重复质粒
设计该实验以阐明聚组氨酸标记对重构的PYXLA基因活性的影响。将5μg pCM14(实施例3A，图11)用SphI消化并在1.0％琼脂糖凝胶上电泳分离。分离～5889bp产物并将其连接到通过用SphI消化质粒pVR113(实施例10A，图22)得到的1450bp片段，以形成～7339bp质粒(pCM31，图23)。质粒pCM31含有处于KmPDC1启动子和ScCYC1终止子控制下的具有聚组氨酸尾的PXYLA基因与ScUra3表达盒。分别地，将5μg质粒pCM29(实施例8A，图21)用SphI消化并在1.0％琼脂糖凝胶上电泳分离。分离～5892bp产物并将其连接到通过用SphI消化质粒pVR113得到的1450bp片段，以形成～7342bp质粒(pVR118，图24)。质粒pVR118类似于质粒pCM31，但是含有防止聚组氨酸尾编码的终止密码子。
实施例11B：通过用质粒pCM31(实施例11A，图23)和pVR118(实施例11A，图24)转化株系CD806(实施例6B)产生含有(CD929)和没有(CD931)编码的聚组氨酸尾的重构的PXYLA基因、以及没有侧翼His重复序列的ScUra3基因的马克斯克鲁维氏酵母突变株系
用标准电穿孔方法用质粒pCM31转化马克斯克鲁维氏酵母株系CD806(实施例6B)的单个菌落。在YPD培养基中回收转化的细胞，4小时后在Sc-Ura板上铺平板。通过PCR证实两个转化体含有重构的PXYLA基因(具有编码的聚组氨酸标记)和超表达的ScXKS1基因，还证实缺失了KmXYL1和KmXYL2基因。这些转化体之一命名为株系CD929。
用标准电穿孔方法用质粒pVR118转化马克斯克鲁维氏酵母株系CD806。通过PCR证实转化体含有重构的PXYLA基因(没有编码的聚组氨酸标记)和超表达的ScXKS1基因，并且缺失了KmXYL1和KmXYL2基因，将该转化体命名为株系CD931。
以对株系CD861(实施例8B)描述的相同的方式，株系CD931的基因组步移表明PXYLA基因已经整合了两次。
实施例11C：株系CD929和CD931(实施例11B)的摇瓶表征
将CD929和CD931(实施例11B)的单个菌落分别接种在250mL带挡板的摇瓶中100mL的10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、70g/L葡萄糖、300μg/ml G418+150μg/ml潮霉素中。培养物在35℃250rpm下过夜温育。将细胞接种到含有45mL生产培养基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、50g/L木糖、100mM Tes-NaOH、10mM MgCl2，pH7.0)的50mL falcon管中，达到OD0.2。将管置于37℃和250rpm下，在随机时间间隔取样并通过HPLC分析。株系CD929产生1.7g/L EtOH并积累1.1g/L木酮糖。株系CD931产生15.2g/L EtOH而积累4.5g/L木酮糖。这些株系的相对性能表明当木糖异构酶基因不含有聚组氨酸标记时乙醇形成为约9倍更大。类似地，当不存在聚组氨酸尾时木酮糖形成增加了4倍。
实施例12A：通过用质粒pCM52(图25)转化将KmXYL2基因再插入到株系CD861(实施例8B)；所得转化体的摇瓶评估
使用标识为SEQ.ID.NO.116和SEQ.ID.NO.117的引物从野生型马克斯克鲁维氏酵母株系的基因组DNA扩增KmXYL2基因以及982bp5’侧翼和200bp3’侧翼。这些引物导入SacII限制位点。将所得PCR产物用SacII消化并将其连接到类似消化的、虾碱性磷酸酶处理的质粒pVR113(实施例10A，图22)。所得质粒命名为pCM52(图25)。用标识为SEQ.ID.NO.118和SEQ.ID.NO.119的引物筛选pCM52。对扩增的KmXYL2基因进行测序并发现其含有两个错误，一个为沉默的，一个导致氨基酸改变：85V→I。
将质粒pCM52用PvuII消化并使用标准电穿孔方法转化入株系CD861(实施例8B)。将转化体铺平板在Sc-Ura板上并在37℃温育。用标识为SEQ.ID.NO.104和SEQ.ID.NO.105的引物扩增KmXYL2基因的编码区并用标识为SEQ.ID.NO.120和SEQ.ID.NO.121的引物扩增通过KmXYL2基因的5’侧翼并进入KmXYL2基因的编码区的含有ScUra3基因的区域。对两条链阳性并且显示出KmXDH活性(XDH+转化体)的5个转化体被用于摇瓶分析。XDH+转化体的KmXDH活性表明导入所述基因的错误没有破坏其活性。
通过将5个XDH+转化体通过YPX板传代两次得到它们每一种的分离物。然后将分离物接种到YPX培养基(pH6.5)并在35℃过夜温育。通过离心收获各2gcdw分离物并将其重悬浮在50ml的10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、50g/L木糖、10mM MgCl2和7.5g/L CaCO3中。将摇瓶在35℃和70rpm振荡下进行生产。类似培养株系CD861(实施例8B)以比较KmXYL2再插入的效果。
株系CD861具有0.46g/L-小时的容量生产力和1.47g/L-小时的木糖消耗。5个XDH+转化体平均为70％较低生产力和65％较低木糖消耗。～48小时后，株系CD861产生～14g/L乙醇和～4.7g/L木糖醇，而5个XDH+转化体产生～2.8-6.3g/L乙醇和1.2-2.2g/L木糖醇。约40小时后除一个之外所有XDH+转化体都停止产生乙醇，尽管40小时后它们都继续线性地消耗木糖。
生产开始和生产67小时后采集的细胞被裂解并使用advancedprotein assay reagent(Cytoskeleton-美国)进行蛋白质定量。通过向5mgβ-NADH(Sigma)加入2.355ml1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)来制备10X溶液，导致最终NADH浓度为1.5mM。加入水至体积950μL(小于样品体积)。然后加入无细胞提取物并监视340nm吸收几分钟以确定背景。然后加入50μL 0.4M木酮糖并监视340nm吸收以确定XDH活性。生产开始时获取的5种XDH+转化体的XDH活性为287-374mU/mg。67小时生产后，XDH活性为62-86mU/mg。株系CD861的XDH活性在生产开始时为16mU/mg，生产67小时后为3mU/mg。
实施例12B：通过用质粒pCM28(实施例3B，图12)转化从株系CD861(实施例8B)缺失ScXKS1基因；所得转化体的摇瓶评估
将质粒pCM28分别用NaeI和PvuII线性化并使用标准电穿孔方法转化到株系CD861中。在YPD中回收细胞3小时，随后将其铺平板在Sc-Ura缺失(dropout)培养基上。将32个菌落在重复的平板上再划线培养。将这些菌落用标识为SEQ.ID.NO.122和SEQ.ID.NO.123的引物进行PCR筛选以扩增ScXKS1基因的编码区。将不能产生带(从而表明不存在ScXKS1基因)的6个菌落在YPD中过夜温育以允许ScUra3基因的环出，并将其铺平板在FOA板上以选择其中发生环出事件的菌落。将长出的菌落在YPD上再次划线以选择单个菌落分离物。用上面的引物筛选来自每次转化的一个分离物，并且还筛选PXYLA、KmXYL1和KmXYL2基因的存在。进行额外的PCR筛选以筛选双交换事件，其中将ScXKS1盒用来自质粒pCM28的PXYLA盒代替。所有6个分离物经测试对PXYLA阳性并且对KmXYL1、KmXYL2和ScXKS1基因阴性。其中的一个称作CD1065并送出用于进行摇瓶评估。
将株系CD1065和CD861分别接种到含有50ml YPD的250ml摇瓶中，并在37℃和250rpm过夜温育。收获细胞并将4gcdw接种到50ml YPX中。在35℃和70rpm振荡下温育所述瓶。定时取出样品以监控发酵活性。株系CD1065显示出10-20小时时间的滞后，在此期间它非常缓慢地消耗木糖。这归因于天然木酮糖激酶基因的葡萄糖抑制。该诱导期后，木糖消耗速率增加，并且65小时后株系CD1065产生约13g/L乙醇。株系CD861更快地产生乙醇，从而在约20小时后产生约18g/L乙醇。株系CD1065在约20小时后产生约3.7g/L木酮糖，但是之后木酮糖浓度逐渐降低。木酮糖激酶活性对于株系CD1065为约0，对于株系CD861为约417mU/mg。株系CD861的木糖消耗速率为株系CD1065的约2倍。株系CD1064的木糖异构酶活性为约0.96U/mg，株系CD861的木糖异构酶活性为约1.79U/mg。这些结果表明在这些条件下木酮糖激酶的超表达显著提高了木糖利用和乙醇产生。
生产期后除去来自株系CD861和CD1065的细胞，在YPX板上划线并将其置于厌氧罐中。两者生长相当。
实施例12C：通过用质粒pCM55(图26)转化将KmXYL1基因再插入到株系CD861中(实施例8B)；所得转化体的摇瓶评估
使用标识为SEQ.ID.NO.124和SEQ.ID.NO.125的引物，从野生型马克斯克鲁维氏酵母株系的基因组DNA扩增KmXYL1基因以及890bp5’侧翼和414bp3’侧翼。这些引物导入SacII限制位点。将所得PCR产物用SacII消化并将其连接到类似消化的、虾碱性磷酸酶处理的质粒pVR113(实施例10A，图22)。所得质粒称作pCM55(图26)。用标识为SEQ.ID.NO.118和SEQ.ID.NO.126的引物筛选质粒pCM55，并用BstBI和SbfI的限制酶切作图证实方向。对扩增的KmXYL1基因进行测序并发现含有三处错误，一个错误是沉默的，其他导致氨基酸改变71V→A、112Y→H和302I→V。
将质粒pCM55用PvuII消化并使用标准电穿孔方法转化到株系CD861中(实施例8B)。将转化体铺平板在Sc-Ura板上并在37℃温育。将标识为SEQ.ID.NO.127和SEQ.ID.NO.128的引物用于扩增KmXYL1基因的编码区，并将标识为SEQ.ID.NO.121和SEQ.ID.NO.129的引物用于扩增通过KmXYL1基因的3’侧翼并进入KmXYL1基因的编码区的含有ScUra3基因的区域。将对两条带(XR+转化体)阳性的6个转化体用于进行摇瓶分析。
通过从基本培养基再划线到YPD上得到5种XR+转化体每一种的分离物。然后将分离物在YPX+300μg/ml G418+300μg/ml潮霉素上再划线，随后接种在YPX培养基中。然后将这些转化体接种到含有10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、50g/L木糖(pH6.5)的培养基中，并在35℃温育48小时。通过离心收获每种的1gcdw并重悬浮在50ml10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、50g/L木糖、10mM MgCl2和7.5g/LCaCO3中。将瓶在35℃和70rpm振荡下进行生产。使用2gcdw类似培养株系CD861(实施例8B)以比较KmXYL1再插入的效果。
株系CD861具有0.79g/L-小时的容量生产力和2.02g/L-小时的木糖消耗速率(基于2gcdw)。XR+转化体的5种显示出约20-50小时的滞后，且之后显示出0.05-0.13g/L-小时的体积生产力和0.45-0.67g/L-小时的木糖消耗速率。这5种XR+转化体的乙醇得率为18-33％，相比而言，株系CD861的为51％。
在生产开始和生产67小时后取出的细胞被裂解并用advancedprotein assay reagent(Cytoskeleton-美国)进行蛋白质定量。将100μl细胞提取物稀释液加入100mM磷酸钠、0.5M D-木糖和0.2mMNADPH，平衡到37℃的溶液的900μl等分试样中。监视吸收以测定KmXYL1活性。5种XR+株系具有～34-86mU/mg的XR活性。这5种XR+转化体的KmXYL1活性表明导入基因的错误没有破坏其活性。株系CD861的KmXYL1活性为约4mU/mg。
第6种XR+转化体显示出19.5mU/mg的KmXYL1活性，其比其他转化体的活性低许多。同样的，其比其他转化体更类似株系CD861。该第6种XR+株系在摇瓶培养(最初的滞后期之后)的表现与CD861相似并且约51.5小时后产生约13.8g/L乙醇。
这些结果表明天然XR活性对这些株系在这些条件下将木糖发酵成乙醇的能力具有不利影响。
实施例12D：通过用质粒pCM58(图27)转化将KmXYX1和KmXYL2基因再插入株系CD861(实施例8B)；所得转化体的摇瓶评估
以和对质粒pCM52(实施例12A，图25)所描述的相同方式构建质粒，只是KmXYL2基因侧翼以与质粒pCM52相反方向定向。该质粒命名为pCM53。对质粒pCM53中的KmXYL2基因进行测序并发现含有四处错误，其中的3处是沉默的，另一处产生氨基酸260I→V的突变。
使用标识为SEQ.ID.NO.130和SEQ.ID.NO.131的引物，从野生型马克斯克鲁维氏酵母株系的基因组DNA扩增KmXYL1基因以及该基因的5’侧翼区和3’侧翼区。这些引物引入SacI和NotI限制位点。用SacI和NotI消化所得PCR产物并将其连接到类似消化的质粒pCM53。将所得质粒称作pCM58(图27)。用标识为SEQ.ID.NO.66和SEQ.ID.NO.119的引物筛选质粒pCM58，并用ScaI和XmnI的限制酶切作图证实方向。对扩增的KmXYL1基因进行测序并发现含有两处错误，一个是沉默的并且另一个导致氨基酸改变71V→A。
用标准电穿孔方法，将质粒pCM58用PvuII消化并转化入株系CD861(实施例8B)。将转化体铺平板在Sc-Ura板上并在37℃温育。用标识为SEQ.ID.NO.132和SEQ.ID.NO.133的引物扩增KmXYL1基因的编码区并用标识为SEQ.ID.NO.134和SEQ.ID.NO.105的引物扩增含有KmXYL2基因和侧翼的区域。5个转化体对两条带都是阳性并将它们用于进一步分析。
将5个所选转化体接种在含有10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、50g/L木糖(pH6.5)的液体培养基中并在35℃温育48小时。通过离心收获每一种的4gcdw并将其重悬浮在50ml10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、50g/L木糖、10mM MgCl2和7.5g/L CaCO3中。将瓶在35℃和70rpm振荡下进行生产。类似培养株系CD861(实施例8B)以比较KmXYL1和KmXYL2再插入的效果。
株系CD861在30小时内基本上消耗掉所有木糖，在那时产生16.1g/L乙醇。株系CD861的乙醇得率为67％。5个XR+、XDH+转化体都更慢地消耗木糖，并产生约16％的平均乙醇得率。株系CD861产生10％的木糖醇得率，但是5种转化体的平均木糖醇得率为56％。株系CD861的木糖还原酶活性为约2mU/mg，而培养73.5小时后在转化体中的木糖还原酶活性为126-425mU/mg。株系CD861中的木糖醇脱氢酶活性为0，但是在培养73.5小时后转化体中的木糖醇脱氢酶活性为21到98mU/mg。这些酶活性的增加表明再插入的KmXYL1和KmXYL2基因在5种转化体中都发挥功能。株系CD861中的木糖异构酶活性(～131mU/mg)高于所述5种转化体中的活性(～26-45mU/mg)。然而，所存在的木糖醇可能抑制了5种XR+、XDH+转化体中的木糖异构酶活性，从而导致人工低值。
该数据还表明在这些发酵条件下，醛糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径的缺失或破坏对于具有外源木糖异构酶基因的株系是有益的。
实施例13A：构建用于Candida sonorensis转化的XDH-靶定质粒pMI410(图29)
如WO03/049525所述得到C.sonorensis(ATCC保藏号32109)的基因组DNA。
使用具柄毕赤氏酵母XYL2基因(
Figure BSA00000722505800461
等人1990Curr.Genet，18：493-500)作为探针筛选WO03/049525中描述的C.sonorensisλ文库的一部分。使用Random Primed Labeling Kit(BoehringerMannheim)用32P-dCTP标记XYL2基因。通过在含有6xSSC 5xDenhardt’s0.5％SDS100g/ml变性鲱精DNA的溶液中55℃下过夜温育来进行杂交。杂交后将滤器在室温下在2xSSC溶液中洗涤5分钟并重复洗涤，然后在55℃在2xSSC-0.1SDS中洗涤30分钟。这导致含有C.sonorensis木糖醇脱氢酶基因(CsXDH)的杂交克隆的分离。
用标识为SEQ.ID.NO.135和SEQ.ID.NO.136的引物和用CsXDH基因作为模板经PCR扩增CsXDH基因的5’区。将PCR产物用SacI和SalI切割以产生642bp片段，将其凝胶分离。
通过用XbaI切割质粒pMI278(描述于WO03/049525的图14)并环化所得4976bp片段来制备质粒pMI281。将来自上面的642bp片段连接到通过用SacI和SalI消化质粒pMI281得到的4965bp片段。所得质粒命名为pMI409(图28)。
使用标识为SEQ.ID.NO.137和SEQ.ID.NO.138的引物和用相同λ文库克隆作为模板经PCR扩增CsXDH基因的3’区。用NotI和ApaI切割PCR产物。凝胶分离457bp片段并将其连接到通过用NotI和ApaI消化质粒pMI409得到的5551bp片段。所得质粒命名为pMI410(图29)。
实施例13B：构建用于C.sonorensis转化的XR-靶定质粒pMI412(图31)
使用标识为SEQ.ID.NO.139和SEQ.ID.NO.140的寡核苷酸和用C.sonorensis的基因组DNA作为模板通过PCR扩增木糖还原酶的序列同源物。基于在已知的真菌木糖还原酶和醛糖还原酶序列中发现的保守序列设计寡核苷酸。标记700bp PCR产物并将其用作探针从WO03/049525中描述的基因组文库类似地分离基因组CsXRλ克隆。
使用标识为SEQ.ID.NO.141和SEQ.ID.NO.142的引物经PCR扩增C.sonorensis木糖还原酶(CsXR)基因的5’区。将含有CsXR基因的在WO03/049525中描述的C.sonorensisλ文库克隆的一部分用作模板。用SacI和SalI切割PCR产物。凝胶分离526bp片段并将其连接到通过用SacI和SalI消化质粒pMI281得到的4965bp片段中。将所得质粒命名为pMI411(图30)。
用标识为SEQ.ID.NO.143和SEQ.ID.NO.144的引物和用相同λ文库克隆作为模板经PCR扩增CsXR基因的3’区。用NotI和ApaI切割PCR产物。凝胶分离591bp片段并将其连接到通过用NotI和ApaI消化质粒pMI411得到的5435bp片段中。所得质粒命名为pMI412(图31)。
实施例13C：构建PXYLA表达质粒pMI417(图33)以用于在C.sonorensis中同时插入PXYLA和缺失CsXR
用标识为SEQ.ID.NO.145和SEQ.ID.NO.146的引物和用pCM29(实施例8A，图21)作为模板经PCR扩增从ATG到单个AgeI位点的PXYLA基因。用AgeI和KpnI切割PCR产物并凝胶分离453bp片段。用AgeI切割质粒pCM29。凝胶分离8151bp片段并用KpnI部分消化。凝胶分离所得6501bp片段并将其连接到453bp PCR片段。将该质粒命名为pMI400。
用BamHI切割质粒pMI278，用克列诺(Klenow)酶进行填补并用XbaI部分消化。凝胶分离所得6675bp片段。将质粒pMI400用SbfI切割，用T4聚合酶使其平端化，并用XbaI切割。凝胶分离所得1358bp片段并将其连接到pMI278的6675bp片段以形成质粒pMI403(图32)。
用Sall和NotI切割质粒pMI412(实施例13B，图31)。分离4037bp片段并将其连接到通过用SalI和NotI消化pM1403所得的5042bp片段。所得质粒命名为pMI417(图33)。质粒pMI417含有PXYLA基因和G418标记基因，其中相关的启动子和终止子区在CsXR基因的上游和下游区之间。PXYLA基因处于C.sonorensis PGK启动子和ScGAL10终止子的控制下。
实施例13D：构建ScXKS1表达质粒pMI425(图34)以在C.sonorensis转化中同时插入ScXKS1和缺失CsXDH
用标识为SEQ.ID.NO.147和SEQ.ID.NO.148的引物和用pVR103(实施例5C，图18)作为模板经PCR扩增从ATG到单一BglII位点的ScXKS15’区。用NotI和BglII切割PCR产物并凝胶分离267bp片段。用NotI和BglII切割质粒pVR103(实施例5C，图18)。得到4633bp片段并将其连接到267bp PCR片段。将该质粒命名为pMI406。
用EcoNI切割质粒pMI403(实施例13C，图32)，用克列诺酶进行填补并用SalI切割。凝胶分离6505bp片段。用BamHI切割质粒pMI271(WO03/049525的图7中描述的)，用克列诺酶进行填补并用SalI切割。凝胶分离所得1666bp片段并将其连接到6505bp片段。所得质粒命名为pMI423。
将质粒pMI410(实施例13A，图29)和质粒pMI406每种用XbaI消化，用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化并用BamHI切割。凝胶分离5032bp和1814bp片段。用XbaI消化质粒pMI423并凝胶分离所得2817bp片段。连接三个片段并将所得质粒命名为pMI425(图34)。质粒pMI425含有CsXDH基因的启动子区的一部分，具有相关的启动子和终止子区的hph基因，处于C.sonorensis PGK启动子和ScGAL10终止子控制下的ScXKS1基因，接着是CsXDH基因的终止子区的一部分。
实施例13E：产生含有重构的PXYLA基因和ScXKS1基因的C.sonorensis突变株系(Cs/T-1、Cs/T-25、SC/T-34和Cs/T-51)
使用类似于WO03/049525中描述的化学方法用质粒pMI417(实施例13C，图33)和pMI425(实施例13D，图34)转化C.sonorensis菌落。将转化细胞铺平板在YPD+200μg/ml G418或YPD+200μg/ml潮霉素和200μg/ml G418上。用PXYLA和ScXKS1探针进行PCR分析证实存在如下株系：
株系Cs/T-1:1拷贝PXYLA和1拷贝ScXKS1
株系CS/T-25:1拷贝PXYLA和2拷贝ScXKS1
株系Cs/T-51:2拷贝PXYLA和1拷贝ScXKS1
株系CS/T-34:2拷贝PXYLA和2拷贝ScXKS1
实施例13F：通过用质粒pMI417(实施例13C，图33)转化产生含有重构的PXYLA基因且有和没有CsXR基因缺失的C.sonorensis突变株系(Cs/417-201、-206、-208和-214)
用SacI和ApaI消化质粒pMI417，并将其用于使用与WO03/049525中描述的相似的化学方法转化C.sonorensis菌落。将转化的细胞铺平板在YPD+200μg/ml G418上。PCR分析鉴定了具有PXYLA基因和CsXR缺失的菌落。DNA印迹分析证实，除了CsXR缺失外，称作Cs/417-206的株系含有一个拷贝的PXYLA基因，而称作Cs/417-214的株系含有两拷贝PXYLA基因。株系Cs/417-201含有两拷贝PXYLA基因，但是无CsXR缺失。Cs/417-208含有一拷贝的PXYLA基因并且没有CsXR缺失。
实施例13G：通过用质粒pMI425(实施例13D，图34)转化Cs/417-214(实施例13F)产生含有重构的PXYLA基因、ScXKS1基因、缺失CsXR和缺失(A)和不缺失(B)CsXDH基因的C.sonorensis突变株系(Cs/417-214/425A和Cs/417-214/425B)
将质粒pMI425用PmeI和PspOMI消化并将其用于转化株系Cs/417-214，其中使用与WO03/049525中描述的相似的化学方法。将转化细胞铺平板在YPD+200μg/ml潮霉素或YPD+200μg/ml潮霉素+200μg/ml G418上。用PCR和DNA印迹分析鉴定含有ScXKS1基因的菌落并确定是否已经发生了CsXDH基因的缺失。将具有两拷贝重构的PXYLA基因、1拷贝ScXKS1基因、缺失CsXR基因和缺失CsXDH基因的株系命名为Cs/417-214/425A。将具有两拷贝重构的PXYLA基因、1拷贝ScXKS1基因、缺失CsXR基因但不缺失CsXDH基因的株系命名为Cs/417-214/425B。
实施例13H：通过用质粒pMI403(实施例13C，图32)转化产生含有重构的PXYLA基因和功能性乳酸脱氢酶(LDH)基因的C.sonorensis突变株系(C29/403-7)
使用类似于WO03/049525所描述的化学方法，用质粒pMI403转化相应于WO03/049525中标识为株系246-27的突变C.sonorensis株系。株系246-27含有功能性外源乳酸脱氢酶(LDH)基因。将转化细胞铺平板在YPD+200μg/ml G418上。将显示出70mU/mg XI活性的株系称作C29/403-7。其明显含有处于CsPGK启动子和ScGAL10终止子控制下的PXYLA基因的多个拷贝。此外，株系C29/403-7含有功能性乳酸脱氢酶基因。
实施例13I：通过用质粒pMI425(实施例13D，图34)转化株系C29/403-7(实施例13H)产生含有重构的PXYLA基因、ScXKS1基因和功能性LDH基因的C.sonorensis突变株系(C29/403-7/425)
将质粒pMI425用SalI和NotI消化并用于转化株系C29/403-7(实施例13H)，其中使用类似于WO03/049525中描述的化学方法。将转化细胞铺平板在YPD+200μg/ml潮霉素和在YPD+200μg/ml潮霉素和200μg/ml G418上。用PCR和DNA印迹分析鉴定含有PXYLA和ScSKS1基因的转化体，将它们统称为C29/403-7/425。株系C29/403-7/425含有功能性乳酸脱氢酶基因。
实施例13J：产生含有重构的PXYLA基因和缺失CsXR基因的C.sonorensis突变株系(C29/417-4和C29/417-9)
将质粒pMI417(图13C，图33)用SacI和ApaI消化并用于转化相应于WO03/049525中标识为株系246-27的突变C..sonorensis株系，其中使用类似于WO03/049525中描述的化学方法。将转化细胞铺平板在YPD+200μg/ml G418上。PCR分析鉴定了具有PXYLA基因和CsXR缺失的菌落。DNA印迹分析证实，除CsXR缺失外，称作C29/417-4的突变株系含有一拷贝的PXYLA基因，称作C29/417-9的突变株系含有2拷贝PXYLA基因。
实施例13K：通过用质粒pMI425(实施例13D，图34)转化株系C29/417-9(实施例13J)产生含有重构的PXYLA基因、ScXKS1基因、LDH基因、缺失CsXR基因和缺失(C29/417-9/425-11)和没有缺失(C29/417-9/425-9)CsXDH基因的C..sonorensis突变株系
将质粒pMI425用PmeI和ApaI消化并用于转化株系C29/417-9(实施例13J)，该转化使用类似于WO03/049525中描述的化学方法。将转化的细胞铺平板在YPD+200μg/ml潮霉素上。PCR分析鉴定了具有ScXKS1基因的菌落和还含有CsXDH缺失的菌落。将具有和没有CsXDH缺失的转化体分别命名为C29/417-9/425-11和C29/417-9/425-9。
实施例14：来自实施例13E-13K的C.sonorensis株系的摇瓶表征
下面的表格概述了选择用于摇瓶表征的株系并报导了木糖异构酶和木酮糖激酶活性。
产生乙醇的株系
Figure BSA00000722505800511
产生乳酸的株系(都含有外源LDH)
Figure BSA00000722505800521
前面表格的注释：1XI＝PXYLA基因。2XK＝ScXKS1基因。3XR＝天然木糖还原酶基因。4XDH＝天然木糖醇脱氢酶基因。数字指出整合的基因拷贝数。数字指出了整合的拷贝数。“+”指出天然基因是完整的；“-”指出天然基因的缺失。5N.D.-未确定。
如下确定这些样品的木酮糖激酶和木糖异构酶活性：
离心样品(5-10ml)并用100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤一次。洗涤后，将样品重悬浮在含有蛋白酶抑制剂(Complete Mini，无EDTA，Roche)的Y-PER酵母蛋白质提取试剂(Pierce，Rockford，IL)中。室温温育20分钟后，在+4℃以13,000rpm离心细胞10分钟。收集上清液样品用于活性测量。
通过两步方案测定木酮糖激酶活性。在步骤1中，反应物含有50mM HEPES/KOH pH7.5、5mM ATP、6mM MgCl2和20mM木酮糖。通过加入水代替木糖测定背景反应。加入酶样品后，在30℃温育反应物0和240秒。温育后通过将反应物在95℃温育5分钟使反应停止。反应停止后向反应物加入40mM HEPES/KOH pH7.5、10mM MgCl2、2.5mM PEP和0.2mM NADH并测量340nm处的吸收。测量最初吸收后，加入肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的混合物。将该反应物再温育1小时并测量340nm处的吸收。测定期间从ADP产生计算木酮糖激酶活性。
通过监控340nm处30℃的NADH的氧化来测定木糖异构酶活性。反应物含有(除了样品外)100mM TES-NaOH，pH7.0、250mM木糖、10mM MgCl2、0.6mM NADH和2.5U山梨醇脱氢酶。通过测量没有木糖的活性来检测背景。在Cobas Mira自动分析仪(Roche)中进行木糖异构酶测定。
用Lowry方法(Lowry，O.H.，Rosebrough，N.J.，Farr，A.L.和Randall，R.J.(1951)，Protein measurement with the Folin phenolreagent，J.Biol.Chem.193：265-275)测定蛋白质浓度。牛血清清蛋白(Sigma)用作蛋白质标准。
实施例14A：野生型C.sonorensis和株系Cs/T-1、-25、-34、-51(实施例13E)、Cs/417-201、-206、-208、-214(实施例13F)和Cs/417-214/425A和-B(实施例13G)的微需氧摇瓶表征
用生长在YPD板上的细胞接种250ml瓶中的50ml YP(10g/L酵母提取物和20g/L蛋白胨)+5％葡萄糖+10mM MgCl2并在30℃以250rpm过夜温育。取出5ml等分试样用于XI、XK和蛋白质测定。测量OD600并通过离心收集50ml中等价于OD600＝12的细胞量(相应于4g/L细胞干重)(株系Cs/417-214/425A和-B的OD600＝40)，并将其重悬浮在50ml YP+5％木糖+10mM MgCl2中。将重悬浮的细胞转移到含有1.2g CaCO3的250ml瓶中。在30℃以100rpm振荡温育培养物。每天收集用于HPLC(测量木糖消耗和乙醇、木糖醇、乙酸和木酮糖产生)和OD600测量的样品。进行发酵约11天。
株系Cs/T-1、-25、-34-51和Cs/417-214/425A和-B产生2-5g/L乙醇，木糖醇是这些株系的主要产物。野生型C.sonorensis株系和株系Cs/417-201、-206、-208和-214在微需氧条件下不产生乙醇。这表明在微需氧条件下乙醇产生需要木糖异构酶和木酮糖激酶两者。所有XR+株系还产生乙酸。
在这些微需氧条件下株系Cs/417-201、-206、-208、-214和Cs/417-214/425B缓慢消耗木糖并且不产生乙醇、木糖醇或乙酸。株系Cs/417-201/425A也缓慢消化木糖并产生一些木糖醇。在11天时，株系Cs/417-206和Cs/417-214分别产生0.7和1.2g/L木酮糖。这表明在这些微需氧条件下，不具有超表达的XK的XI+株系中积累木酮糖，并且木酮糖积累的量取决于XI活性水平。
实施例14B：野生型C.sonorensis株系和株系Cs/T-25、-34(实施例13E)、Cs/417-201、-214(实施例13F)、Cs/417-214/425A和B(实施例13G)的厌氧摇瓶表征
用生长在YPD板上的细胞接种250ml瓶中的50ml YP+5％葡萄糖+10mM MgCl2，并在30℃以250rpm过夜温育。取出5ml等分试样用于XI、XK和蛋白质测定。测量OD600并通过离心收集50ml中等价于OD600＝12的细胞量(相应于4g/L细胞干重)(株系Cs/417-214/425A和-B的OD600＝40)，并重悬浮在50ml YP+5％木糖+10mM MgCl2+24g/L CaCO3中。在用水闸(water lock)密封的100ml摇瓶中，在30℃以100rpm振荡温育培养物。对培养取样。定期收集用于HPLC(测量木糖消耗和乙醇、木糖醇、乙酸和木酮糖产生)和OD600测量的样品。持续培养15天。
株系Cs/T-25和-34在温育的前8天产生2g/L醇，而野生型C.Sonorensis株系不产生可检测的乙醇。在这些条件下株系Cs/417-201和-214也不能产生乙醇，表明需要木糖异构酶和木酮糖激酶基因两者以得到这些株系中在木糖上进行厌氧发酵能力。
株系Cs/417-214/425A在4天后产生～13g/L醇并且在11天后产生～25g/L醇。木糖向乙醇转化的得率在4天后约为55％，在11天后约为53％。木糖消耗在4天后为22-23g/L，在11天后为48-49g/L。株系Cs/417-214/425B在4天内消耗～16g/L木糖并产生7g/L醇。这表明在这些株系中，对天然XR/XDH途径的破坏联合外源XI基因表达和XK超表达对于实现良好的乙醇产生是重要的。发现在厌氧条件下，破坏CsXR和CsXDH基因两者提供了最佳的乙醇产生。
实施例14C：产生LDH的C.sonorensis突变株系246-27和株系C29/403-7(实施例13H)和C29/403-7/425(实施例13I)的微需氧摇瓶表征
使用实施例14A中描述的一般条件，对这三种株系的每一种进行微需氧摇瓶培养，只是还监控乳酸产生。
在这些微需氧条件下，株系246-27和株系C29/403-7以约0.5g/L/小时消耗木糖并且都以约0.4g/L/小时产生乳酸。在这些条件下株系C29/403-7/425比株系C29/403-7多产生约10-15％乳酸和少产生约10-15％木糖醇。株系C29/403-7比其他株系产生更多的木酮糖，表明因为木糖异构酶活性，在该株系中积累木酮糖。
培养结束时，将来自每个瓶的细胞在YP+木糖上和在YP+葡萄糖上划线并在厌氧罐中温育9天。没有株系厌氧生长，但是所有株系都在木糖和葡萄糖培养基中需氧生长。
实施例14D：产生LDH的C.sonorensis突变株系246-27和株系C29/403-7(实施例13H)、C29/403-7/425(实施例13I)和C29/417-9(实施例13J)的厌氧摇瓶表征
使用实施例14B中描述的一般条件对这三种株系的每一种进行厌氧摇瓶培养，只是还监控乳酸产生。
所有株系都以约0.1g/L/小时的速率消耗木糖。141小时后，株系246-27、C29/403-7、C29/403-7/425和C29/417-9分别产生4.1、4.8、6.4和3.0g/L乳酸，0.3、0.45、0.3和0.3g/L木糖醇和0.3、1.45、0.9和0.85g/L木酮糖。在这些条件下，木酮糖激酶的超表达导致提高的乳酸产生。具有超表达的木糖异构酶但是没有超表达的木酮糖激酶的株系积累木酮糖，表明木糖异构酶基因是有活性的。
实施例14E：产生LDH的C.sonorensis突变株系246-27和株系C29/417-4和-9(实施例13J)、C29/417-9/425-9和-11(实施例13K)的微需氧摇瓶表征
使用实施例14C中描述一般条件，对这三种株系每一种进行微需氧摇瓶培养。培养持续7天。
在这些微需氧条件下，株系246-27比其他株系更快地消耗木糖。株系C29/417-4、-9、C20/417-425-9和-11在7天后产生约2-5g/L乳酸，之后保持25-35g/L残留木糖。株系C29/417-9/425-11产生乳酸的能力证实木糖异构酶和木酮糖激酶途径在这些株系中起作用。株系C29/417-9/425-11比C29/417-9/425-9株系稍快地消耗木糖，但是也积累1-2g/L木糖醇。
实施例14F：产生LDH的C.sonorensis突变株系C29/417-9(实施例13J)、C29/417-9/425-9和-11(实施例13K)的厌氧摇瓶表征
使用实施例14D中描述的一般条件，对这三种株系每一种进行厌氧摇瓶培养。
146小时后株系C29/417-9、C29/417-9/425-9和C29/417-9/425-11产生4.4、6.2和24.4g/L乳酸。对于这些株系，木糖向乳酸转化的得率分别为0.40、0.70和0.95g/g。株系C29/417-9/425-9或-11不产生木糖醇，而株系C29/417-9产生2.7g/L木糖醇。在这些条件下，木酮糖激酶的超表达导致提高的乳酸生产。这表明在这些株系中，天然木糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径的破坏联合外源木糖异构酶和木酮糖激酶超表达提供了良好的乳酸生产。在厌氧条件下发现CsXR和CsXDH基因两者的破坏提供了最佳产生。
实施例15A：产生含有Cyllamyces aberensis木糖异构酶(CaXYLA)基因的马克斯克鲁维氏酵母突变株系(CD1103和CD1106)
从Gareth Wyn Griffith，Institute of Biological Sciences，University of Wales，Aberystwyth，Ceredigion SY23 3DA，英国得到Cyllamyces aberensis DNA(从母牛分离ffewl，英国)。使用该DNA作为模板，用标识为SEQ.ID.NO.149的0.5μM有义引物和标识为SEQ.ID.NO.150的0.5μM反义引物，Phusion HF缓冲液和各0.2mMdNTP进行PCR反应。在该构建体中，在基因的5’末端序列检测到的所编码的第一个甲硫氨酸作为起始甲硫氨酸，并且除了SbfI限制位点外还包括框内终止密码子。在3分钟变性前加入2U Phusion聚合酶(Finnzymes Oy，Espoo，芬兰)。反应为如下：98℃10秒、45℃30秒和72℃1分钟的35个循环，和72℃8分钟的最终延伸。得到1346bp PCR片段并使用TOPO TA Cloning试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)连接到TOPO质粒并测序。C.aberensis木糖异构酶(CaXYLA)基因具有标识为SEQ.ID.NO.151的核苷酸序列。通过该基因编码的蛋白质的推导的氨基酸序列以SEQ.ID.NO.152给出。
类似于前面描述的从野生型马克斯克鲁维氏酵母株系得到马克斯克鲁维氏酵母基因组DNA。以标准方案使用Failsafe聚合酶(Epicenter)，用基因组DNA作为模板和使用标识为SEQ.ID.NO.153和SEQ.ID.NO.154的引物分离马克斯克鲁维氏酵母Ura3基因(KmURA3)以及约750bp Ura3启动子区和约250bp Ura3终止子区。PCR条件为95℃5分钟，95℃30秒、55℃30秒和68℃2分钟的15个循环，接着为95℃30秒和68℃2.5分钟的25个循环，最后为以68℃8分钟的生成平端的循环。将所得～1.8kb PCR产物克隆到pCR-XL-TOPO载体(Invitrogen)中并测序验证。所得质粒称作pSO90。所克隆的KmURA3基因的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.155。将质粒pSO90用SphI消化并凝胶分离～1.8kbp KmURA3区，并将其连接到类似消化并用虾碱性磷酸酶处理的质粒pCM9(实施例1I，图9)的～4570bp片段。所得质粒(pSO91，图35)含有KmURA3选择基因、KmPDC1启动子、SbfI位点和ScCYC1终止子。
将来自上面的含有CaXYLA的质粒消化并凝胶分离含有CaXYLA基因的～1.4kbp片段。将质粒pSO91类似消化并用虾碱性磷酸酶处理以得到6376bp片段。用HC T4连接酶(Invitrogen)连接这些片段以形成质粒(pSO99，图36)，其含有处于KmPDC1启动子和ScCYC1终止子控制下的KmUra3选择基因和CaXYLA基因。
培养相应于CD806(实施例6B)的马克斯克鲁维氏酵母菌落。离心20ml细胞，并在将质粒用AatII和BsmBI消化(不纯化)后，用标准电穿孔方法用质粒pSO99进行转化。将100μL细胞铺平板在SC-Ura板上并允许其在37℃生长直到形成菌落。将这些菌落在第二个SC-Ura板上划线，其中所有菌落都显示出次生生长。通过PCR用标识为SEQ.ID.NO.156和SEQ.ID.NO.157的引物对转化体筛选完整KmURA3基因(用质粒pSO99插入)的存在，还用标识为SEQ.ID.NO.158和SEQ.ID.NO.159的引物筛选CaXYLA基因的内部区域。CD1103含有CaXYLA基因、完整KmURA3基因和受破坏的KmURA3基因。CD1106含有CaXYLA基因和受破坏的KmURA3。
实施例15B：用株系CD1103和CD1106(实施例15A)进行厌氧发酵
用株系CD1103和1106分别接种含有100ml培养基(20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、100g/L葡萄糖)的带挡板的摇瓶并在35℃和250rpm振荡下过夜温育。～14小时后收获细胞，并将每种株系的4g/L细胞干重加入到含有45ml酵母蛋白胨、50g/L D-木糖、7.5g/L CaCO3和10mM MgCl2的单独的50ml Falcon螺旋盖管中。将所述管在30℃70rpm振荡下厌氧培养65小时。在那时株系1103产生超过9g/L乙醇，且株系1106产生超过7g/L乙醇。通过裂解来自生长期的细胞测定XI活性。测量XI活性并发现对于株系1103和1106的每一种为约83mU/mg。
实施例16A：克隆多形拟杆菌木糖异构酶(BtXYLA)基因(pSO89，图37)
从Washington University(St.Louis，MO)Department ofMolecular Biology and Pharmacology得到多形拟杆菌基因组DNA。以标准方案使用Pfx聚合酶(Stratagene)，用基因组DNA作为模板和使用标识为SEQ.ID.NO.160和SEQ.ID.NO.161的引物分离BtXLYA基因。PCR条件为95℃3分钟；95℃30秒、60℃30秒和68℃2分钟的15个循环，接着是95℃30秒和68℃2.5分钟的20个循环，最后为68℃8分钟的产生平端的循环。将所得～1.4kb PCR产物克隆到pCR-XL-TOPO载体(Invitrogen)中并测序验证。所得质粒称作pSO89(图37)。所克隆的BtXYLA基因的核苷酸和推导的氨基酸序列分别为SEQ.ID.NO.162和SEQ.ID.NO.163。
实施例16B：产生含有BtXYLA和KmURA3选择基因的质粒(pSO96，图38)
SbfI消化后从质粒pSO89凝胶提取～1.4kb BtXYLA基因并将其连接到质粒pSO91(实施例16A，图35)的相似消化的6376bp片段。所得质粒(pSO96，图38)含有KmURA3选择基因、处于KmPDC1启动子控制下的BtXYLA基因和ScCYC1终止子。
实施例16C：通过用质粒pSO96(实施例16B，图38)转化相应于CD806(实施例6B)的株系产生马克斯克鲁维氏酵母突变体(CD1089-1096)
培养相应于CD806(实施例6B)的马克斯克鲁维氏酵母菌落。离心20ml细胞并用标准电穿孔方法用质粒pSO96进行转化。整合前用AatII和BsmBI消化质粒pSO96。将100μl细胞铺平板在Sc-Ura板上并允许在37℃生长直到形成菌落。将菌落在Sc-Ura的次级板上划线。使用标识为SEQ.ID.NO.156和SEQ.ID.NO.157的引物，通过PCR筛选转化体中完整KmURA3基因的存在。用标识为SEQ.ID.NO.164和SEQ.ID.NO.165的引物进行BtXYLA终止密码子上游和刚好在ScCYC1终止子内的～450bp区域的PCR筛选。在对天然KmURA3和BtXYLA基因都检验为阳性的转化体中，选择8个并分别称作CD1089-1096。
为测定木糖异构酶活性，将株系在30℃、250rpm在YPD(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、100g/L右旋糖)中生长～14小时。根据Y-PER(Pierce#78990)的方案裂解细胞。使用Advanced Protein AssayReagent(Cysoskeleton#ADV01)，以BSA作为标准测定总蛋白质。株系CD806和CD1089-1096的木糖异构酶活性如下：
Figure BSA00000722505800591
CD1089和CD1092的较高活性可能是由于整合了BtXYLA基因的多个拷贝或者整合的优选位点。
实施例16D：株系CD1089-1096(实施例16C)的摇瓶表征
将株系CD806和CD1089-1096的单个菌落分别接种由10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和100g/L右旋糖组成的100ml培养基以进行生长。细胞在30℃生长14小时，之后收集细胞并测定细胞干重。将每种培养物的1.4g/L细胞干重加入到含有10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、50g/L D-木糖、7.5g/L CaCO3和10mM MgCl2的单独的50ml Falcon管中。在30℃及70rpm振荡下温育这些培养物。约每24小时取出液体培养基样品用于HPLC分析。72小时后，该厌氧发酵的结果显示在下表中。
在微需氧摇瓶发酵研究中，株系CD1089和CD1092在30℃和70rpm发酵约7小时后产生最多约1g乙醇。
低氧木糖培养结束时将株系CD1089-1096铺平板在YPX板上并置于厌氧室中2天。在这些条件下除了CD1095外的所有株系都显示出厌氧生长，其中株系CD1089和CD1092显示出最大的厌氧生长。
实施例17：株系CD804(实施例4D)、CD805(实施例5E)和CD806(实施例6B)在含有木糖和外部加入的商用酶葡萄糖异构酶的培养基中的摇瓶发酵
来自YPD琼脂板的株系CD804、CD805和CD806分别接种在含有50mL YPD并补加50μg/ml G418的250ml带挡板摇瓶中至OD600为0.1并在33℃及250rpm振荡下生长16小时。确定残留葡萄糖保留在每个瓶中并且因此确定细胞处于指数生长期后，通过离心收获每种株系的0.5g/L细胞干重当量，并分别重悬浮在含有47.5mL YP并补加50g/L D-木糖的250mL带挡板摇瓶中。将2.5ml葡萄糖异构酶(Gensweet SGI；Genencor Inc.，CA)(也称作木糖异构酶)加入摇瓶中并在33℃及70rpm生长。对于对照，将株系CD804、805和806的每一种的0.5g/L细胞干重当量分别重悬浮在含有50mL YP并补加50g/LD-木糖的250mL带挡板摇瓶中，其中省去了葡萄糖异构酶。也在33℃及70rpm下温育这些摇瓶。在各种时间间隔取出样品并通过过滤除去细胞。通过HPLC方法分析培养物上清液的木糖、木糖醇和乙醇。
25小时后，来自含有葡萄糖异构酶的瓶的株系CD804(实施例4D)已经消耗了15g/L D-木糖并产生约4.7g/L木糖醇和1g/L乙醇。相反，在葡萄糖异构酶存在下，株系CD805(实施例5C)和CD806(实施例6B)每种已经消耗了25g/L D-木糖。此时株系CD805产生约1.9g/L木糖醇和7.1g/L乙醇。此时株系CD806产生约1.8g/L木糖醇和6.8g/L乙醇。似乎所述株系以非常高的速率消耗木酮糖，这在啤酒糖酵母中没有观察到。在啤酒糖酵母TMB3001中，非氧化性戊糖磷酸途径控制木酮糖的发酵速率但是不控制木糖的发酵速率。FEM Yeast Res.2002Aug；2(3)：277-82.Johansson B，Hahn-Hagerdal B)。不加入葡萄糖异构酶的情况下，株系CD804、CD805和CD806的每一种都非常缓慢地消耗木糖。
实施例18：用自复制质粒pCM48(图40)转化相应于CD806(实施例6B)的株系以导入PXYLA基因；培养所得株系
使用标识为SEQ.ID.NO.166和SEQ.ID.NO.167的引物，用质粒pCM29(实施例8A，图21)作为模板通过PCR扩增含有KmPDC1启动子、PXYLA基因和ScCYC1终止子的盒。设计这些引物以整合入PacI和MluI限制位点。热循环条件为94℃2分钟的最初温育，然后为94℃30秒、50℃30秒和70℃3分钟的30个循环。然后是70℃8分钟的最终温育。将产物用上面的限制酶消化并将所得2.804kbp片段连接到通过类似消化称作pSO57的质粒(图39)(含有pKD1自复制位点)所得的片段，以产生质粒pCM48(图40)。用EcoRI和SbfI对转化体进行限制酶切作图，并将两个送去测序。对完整PXYLA编码区测序并证实两个转化体上的所述序列都与质粒pCM29上的序列相同。
用标准电穿孔方法将2μg未消化的质粒pCM48转化到相应于CD806(实施例6B)的株系中。在YPX中回收细胞4小时，将其铺平板在含有300μg/ml G418和150μg/ml潮霉素的YPX板上，并在37℃温育2天。这产生大量转化体。将几个转化体在相同板上再次划线并在37℃温育数天。选择四个转化体并接种在250ml带挡板摇瓶中的～100ml YPX中，并在37℃及250rpm振荡下温育。包括株系CD861并以相同方式制备生物量。17小时后，将每种的2gcdw接种到含有50mL培养基(10g/L酵母提取物、20g/L酵母蛋白胨、50g/L木糖、7.5g/LCaCO3、10mM MgCl2和pH7.0)的250ml带挡板摇瓶中。四种转化体在约40小时后产生约9-12.3g/L乙醇。亲本株系不产生乙醇。
通过离心收集10mL过夜培养物并送出进行酶测定。四种转化体的木糖异构酶活性为456到531mU/mg。
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Claims (10)

1.基因修饰酵母细胞，其具有整合到其基因组中的功能性外源木糖异构酶基因，其中所述外源木糖异构酶基因(a)与SEQ.ID.NO.162至少90％同源，或(b)编码与SEQ.ID.NO.163至少90％同源的木糖异构酶，或(c)与SEQ.ID.NO.151至少80％同源，但与SEQ.ID.NO.58的同源性不超过95％，或(d)产生与SEQ.ID.NO.152至少80％同源，但与SEQ.ID.NO.59的同源性不超过95％的酶，并且所述外源木糖异构酶基因可操作地连接在酵母细胞中有功能的启动子和终止子序列，且所述经修饰的酵母细胞还具有天然基因的缺失或破坏，所述天然基因产生催化木糖向木糖醇转化的酶。
2.权利要求1的基因修饰酵母细胞，其中所述产生催化木糖向木糖醇转化的酶的天然基因是功能性木糖还原酶基因。
3.权利要求1或2的基因修饰酵母细胞，其还具有功能性天然木糖醇脱氢酶基因的缺失或破坏。
4.权利要求1-3任一项的基因修饰酵母细胞，其超表达功能性木酮糖激酶。
5.权利要求4的基因修饰酵母细胞，其含有可操作地连接在酵母细胞中有功能的启动子和终止子序列的功能性外源木酮糖激酶基因。
6.权利要求5的基因修饰酵母细胞，其中所述功能性外源木酮糖激酶基因是啤酒糖酵母木酮糖激酶基因。
7.权利要求1-6任一项的基因修饰酵母细胞，其属于克鲁维氏酵母属、假丝酵母属、毕赤氏酵母属、酒香酵母属、管囊酵母属或糖酵母属。
8.发酵方法，其中在发酵条件下在发酵液体培养基中培养权利要求1-7任一项的细胞，所述发酵液体培养基包含木糖、木聚糖或者木糖的其他寡聚体。
9.权利要求8发酵方法，其中产生作为主要发酵产物的乙醇。
10.权利要求8-9任一项的发酵方法，其中所述发酵液体培养基还包括己糖。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI551688B (zh) * 2015-02-04 2016-10-01 遠東新世紀股份有限公司 發酵纖維素水解液來生成乙醇的方法

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1294728B1 (it) 1997-09-12 1999-04-12 Biopolo S C A R L Ceppi di lievito per la riproduzione di acido lattico
PT1468093E (pt) 2002-01-23 2009-04-15 Royal Nedalco B V Fermentação de açúcares pentose
PL1781772T3 (pl) * 2004-07-16 2017-03-31 Dsm Ip Assets B.V. Metaboliczne modyfikowanie fermentujących ksylozę komórek eukariotycznych
US20150328347A1 (en) 2005-03-24 2015-11-19 Xyleco, Inc. Fibrous materials and composites
US7708214B2 (en) 2005-08-24 2010-05-04 Xyleco, Inc. Fibrous materials and composites
ZA200711038B (en) 2005-06-02 2009-06-24 Cargill Inc Genetically modified yeast of the species Issatchenkia orientalis and closely related species and fermentation processes using same
EP1929009A2 (en) 2005-09-22 2008-06-11 Tate & Lyle Ingredients Americas, Inc. Improved strains for the production of organic acids
JP5121070B2 (ja) 2005-11-23 2013-01-16 ネイチャーワークス・エル・エル・シー Ｌ−又はｄ−ラクタート：フェリチトクロームｃ酸化還元酵素遺伝子が機能しない乳酸産生酵母
BRPI0709607B1 (pt) 2006-03-13 2018-05-08 Cargill Inc cédulas de levedura tendo via rompida de diidroxi acetona fosfato para glicerol e processo de fermentação"
WO2008048513A2 (en) * 2006-10-13 2008-04-24 Rowan University Ethanol resistant and furfural resistant strains of e. coli fbr5 for production of ethanol from cellulosic biomass
CN101463328B (zh) * 2007-12-19 2011-06-29 中国科学院微生物研究所 一株利用木糖发酵产乙醇的代谢工程酵母菌
US8101808B2 (en) 2007-12-27 2012-01-24 Gevo, Inc. Recovery of higher alcohols from dilute aqueous solutions
US8455239B2 (en) 2007-12-23 2013-06-04 Gevo, Inc. Yeast organism producing isobutanol at a high yield
US8440449B2 (en) * 2008-09-30 2013-05-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Transformed Saccharomyces cerevisiae engineered for xylose utilization
CA2964245C (en) * 2008-11-21 2020-10-27 Universiteit Stellenbosch Yeast expressing cellulases for simultaneous saccharification and fermentation using cellulose
GB0822937D0 (en) 2008-12-16 2009-01-21 Terranol As Microorganism
WO2010074577A1 (en) 2008-12-24 2010-07-01 Royal Nedalco B.V. Xylose isomerase genes and their use in fermentation of pentose sugars
US20100311137A1 (en) 2009-06-08 2010-12-09 Ut-Battelle, Llc Microorganisms Having Enhanced Tolerance To Inhibitors and Stress
WO2010151525A1 (en) * 2009-06-22 2010-12-29 Gevo, Inc. Yeast organisms for the production of isobutanol
WO2011006126A2 (en) * 2009-07-09 2011-01-13 Verdezyne, Inc Engineered microorganisms with enhanced fermentation activity
CN102791858B (zh) 2009-12-22 2014-11-26 株式会社丰田中央研究所 木糖异构酶及其利用
US8846343B2 (en) * 2010-02-09 2014-09-30 Yamaguchi University High-expression promoter derived from Kluyveromyces marxianus
US9096675B2 (en) * 2010-04-21 2015-08-04 Dsm Ip Assets B.V. Cell suitable for fermentation of a mixed sugar composition
WO2011149353A1 (en) 2010-05-27 2011-12-01 C5 Yeast Company B.V. Yeast strains engineered to produce ethanol from acetic acid and glycerol
CA2801577A1 (en) 2010-06-03 2011-12-08 Mascoma Corporation Yeast expressing saccharolytic enzymes for consolidated bioprocessing using starch and cellulose
JP5590140B2 (ja) * 2010-11-11 2014-09-17 トヨタ自動車株式会社 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
CA2834053C (en) 2010-11-18 2019-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Yeast strains engineered to produce ethanol from glycerol
BR112013012130A2 (pt) 2010-11-22 2017-10-31 Cargill Inc composições e métodos para titulação aumentada de etanol a partir de biomassa
EP2668281A4 (en) 2011-01-25 2015-08-26 Cargill Inc COMPOSITIONS AND METHODS OF SUCCINATE MANUFACTURE
CN102174549B (zh) 2011-02-22 2012-10-10 山东大学 一种编码木糖异构酶的核酸分子及其编码的木糖异构酶
WO2012125027A1 (en) 2011-03-14 2012-09-20 Dsm Ip Assets B.V. Yeast strains that ferment uronic acids
EP2697252B1 (en) * 2011-04-11 2016-08-10 Cargill, Incorporated Compositions and methods for increased ethanol production from biomass
EP2546336A1 (en) 2011-07-11 2013-01-16 DSM IP Assets B.V. Yeast strains that consume uronic acids and produce fermentation products such as ethanol
CN102304541A (zh) * 2011-08-17 2012-01-04 中国药科大学 一种含组成型启动子pPGK和G418抗性基因的酿酒酵母表达载体及其构建方法
US9988649B2 (en) 2011-11-30 2018-06-05 Dsm Ip Assets B.V. Yeast strains engineered to produce ethanol from acetic acid and glycerol
CA2860761A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Toray Industries, Inc. Method for producing chemical substance
CA2860756A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Toray Industries, Inc. Method for producing chemical substance
EA201400836A8 (ru) 2012-01-23 2016-03-31 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Получение дитерпена
CN102719481B (zh) * 2012-06-14 2014-11-05 中国科学院微生物研究所 一种将多个基因同时导入微生物基因组的方法
KR101576186B1 (ko) * 2012-06-26 2015-12-10 한국생명공학연구원 에탄올 생산 경로가 봉쇄된 클루이베로마이세스 막시아누스 균주 및 이의 용도
WO2014018757A1 (en) 2012-07-25 2014-01-30 Cargill Incorporated Yeast cells having reductive tca pathway from pyruvate to succinate and overexpressing an exogenous nad(p)+ transhydrogenase enzyme
IN2015DN01042A (zh) 2012-08-28 2015-06-26 Dsm Ip Assets Bv
IN2015DN01041A (zh) 2012-08-28 2015-06-26 Dsm Ip Assets Bv
EP2890784A1 (en) 2012-08-29 2015-07-08 Lallemand Hungary Liquidity Management LLC Expression of enzymes in yeast for lignocellulose derived oligomer cbp
US8748152B1 (en) 2012-09-14 2014-06-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Prevotella ruminicola xylose isomerase and co-expression with xylulokinase in yeast for xylose fermentation
US20140178954A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 E I Du Pont De Nemours And Company Expression of xylose isomerase activity in yeast
US8669076B1 (en) 2013-03-11 2014-03-11 E I Du Pont De Nemours And Company Cow rumen xylose isomerases active in yeast cells
US9187743B2 (en) 2013-03-11 2015-11-17 E I Du Pont De Nemours And Company Bacterial xylose isomerases active in yeast cells
JP6027559B2 (ja) 2013-03-28 2016-11-16 株式会社豊田中央研究所 キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質及びその利用
TW201437367A (zh) 2013-03-29 2014-10-01 Far Eastern New Century Corp 可利用五碳糖及六碳糖生產乳酸之酵母菌
FI20135333L (fi) * 2013-04-05 2014-10-06 Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy Hapon / happojen ja alkoholin tuotto sokereista käyttämällä hiivaa
EP3004366B1 (en) 2013-05-31 2019-02-27 DSM IP Assets B.V. Microorganisms for diterpene production
EP3885443A1 (en) 2013-07-15 2021-09-29 DSM IP Assets B.V. Diterpene production
WO2015014959A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Dsm Ip Assets B.V. Recovery of steviol glycosides
CN104419716B (zh) * 2013-08-27 2017-12-29 天津大学 一种标准化、高精度、通用的功能模块构建方法
AR097480A1 (es) 2013-08-29 2016-03-16 Dsm Ip Assets Bv Células de levadura convertidoras de glicerol y ácido acético con una conversión de ácido acético mejorada
CN103421698B (zh) * 2013-09-05 2015-04-22 中国科学技术大学 木糖醇高温高产工程菌株的构建及应用
WO2015160257A1 (en) 2014-04-18 2015-10-22 Moralco B.V. Use of acetaldehyde in the fermentative production of ethanol
BR102014027233A2 (pt) * 2014-10-30 2016-05-24 Biocelere Agroindustrial Ltda cassete de expressão, micro-organismo geneticamente modificado para expressão de xilose isomerase, processo para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e biocombustível e/ou bioquímicos produzidos
EP3862426A3 (en) 2015-03-16 2021-11-17 DSM IP Assets B.V. Udp-glycosyltransferases
CA2979957A1 (en) 2015-03-23 2016-09-29 Dsm Ip Assets B.V. Udp-glycosyltransferases from solanum lycopersicum
US11344051B2 (en) 2015-04-03 2022-05-31 Dsm Ip Assets B.V. Steviol glycosides
WO2016170045A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Geranylgeranyl pyrophosphate synthase
EP3320104B1 (en) 2015-07-10 2021-11-10 DSM IP Assets B.V. Method for preparing a steviol glycoside composition
US9951326B2 (en) 2015-07-13 2018-04-24 MARA Renewables Corporation Enhancing microbial metabolism of C5 organic carbon
US10844363B2 (en) 2015-08-05 2020-11-24 Cargill, Incorporated Xylose isomerase-modified yeast strains and methods for bioproduct production
WO2017025649A1 (en) 2015-08-13 2017-02-16 Dsm Ip Assets B.V. Steviol glycoside transport
EP3359654B1 (en) 2015-10-05 2022-01-05 DSM IP Assets B.V. Kaurenoic acid hydroxylases
AU2016361425B2 (en) 2015-11-24 2021-04-01 Cargill Incorporated Genetically modified yeasts and fermentation processes using genetically modified yeasts
WO2017101060A1 (en) * 2015-12-17 2017-06-22 Evonik Degussa (China) Co., Ltd. Gene cassette for homologous recombination knock-out in yeast cells
CN109415716A (zh) 2016-04-08 2019-03-01 纳幕尔杜邦公司 用于酵母的阿拉伯糖异构酶
KR101827822B1 (ko) 2016-06-07 2018-03-23 강원대학교 산학협력단 자일리톨 생산능이 향상된 클루이베로마이세스 마르시아누스 36907-fmel1 (kctc18459p) 및 이를 이용한 자일리톨의 생산방법
CA3033243A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Dsm Ip Assets B.V. Crystallization of steviol glycosides
US11878992B2 (en) 2016-08-09 2024-01-23 Dsm Ip Assets B.V. Crystallization of steviol glycosides
WO2018078014A1 (en) 2016-10-27 2018-05-03 Dsm Ip Assets B.V. Geranylgeranyl pyrophosphate synthases
EP3551751A1 (en) 2016-12-08 2019-10-16 DSM IP Assets B.V. Kaurenoic acid hydroxylases
CN110382685A (zh) 2016-12-21 2019-10-25 创新生物科学公司 用于提高木糖吸收的表达梅奇酵母木糖转运蛋白的生物和方法
WO2018114995A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Dsm Ip Assets B.V. Fermentation process for producing steviol glycosides
CN110892068B (zh) 2017-06-27 2024-03-08 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 Udp-糖基转移酶
WO2019036202A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Cargill, Incorporated ISSATCHENKIA ORIENTALIS HAPLOID GENETICALLY MODIFIED
EP3775219A1 (en) 2018-03-27 2021-02-17 Basf Se Xylose metabolizing yeast
CN112424218A (zh) 2018-04-30 2021-02-26 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 甜菊糖苷转运
US11788053B2 (en) 2020-06-15 2023-10-17 Melio Peptide Systems Inc. Microorganisms and methods for reducing bacterial contamination
WO2022084482A1 (en) 2020-10-22 2022-04-28 Dsm Ip Assets B.V. Microorganisms for diterpene production

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6410302B1 (en) * 1998-04-20 2002-06-25 Forskarpatent I Syd Ab Genetically engineered yeast and mutants thereof for the efficient fermentation of lignocellulose hydrolysates
US6475768B1 (en) * 1999-04-09 2002-11-05 Forskarpatent I Syd Ab Xylose isomerase with improved properties

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL39710A (en) 1972-06-19 1975-04-25 Imi Inst For Res & Dev Recovery of acids from aqueous solutions by solvent extraction
US4771001A (en) 1986-03-27 1988-09-13 Neurex Corp. Production of lactic acid by continuous fermentation using an inexpensive raw material and a simplified method of lactic acid purification
US5866382A (en) 1990-04-06 1999-02-02 Xyrofin Oy Xylose utilization by recombinant yeasts
US5210296A (en) 1990-11-19 1993-05-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Recovery of lactate esters and lactic acid from fermentation broth
US5132456A (en) 1991-05-07 1992-07-21 The Regents Of The University Of California Sorption of carboxylic acid from carboxylic salt solutions at PHS close to or above the pKa of the acid, with regeneration with an aqueous solution of ammonia or low-molecular-weight alkylamine
FI913197A0 (fi) * 1991-07-01 1991-07-01 Xyrofin Oy Nya jaeststammar med reducerad foermaoga att metabolisera xylitol, foerfarande foer bildande av dessa och deras anvaendning vid framstaellning av xylitol.
US5420304A (en) 1992-03-19 1995-05-30 Biopak Technology, Ltd. Method to produce cyclic esters
AT398982B (de) 1993-02-18 1995-02-27 Vogelbusch Gmbh Verfahren zur abtrennung und reinigung von milchsäure
US5510526A (en) 1993-06-29 1996-04-23 Cargill, Incorporated Lactic acid production, separation and/or recovery process
FR2712147B1 (fr) 1993-11-08 1996-02-02 Agronomique Inst Nat Rech Produit alimentaire, obtention et application à la fabrication de jus de fruits ou de vin.
US5789210A (en) 1993-11-08 1998-08-04 Purdue Research Foundation Recombinant yeasts for effective fermentation of glucose and xylose
IL109003A (en) 1994-03-16 1999-09-22 Yissum Res Dev Co Process and extractant composition for extracting water-soluble carboxylic and mineral acids
IN191596B (zh) 1996-05-06 2003-12-06 Purdue Research Foundation
US6717014B1 (en) * 1996-06-28 2004-04-06 Fmc Corporation Processes for preparing haloamines and tertiary aminoalkylorganometallic compounds
IT1294728B1 (it) 1997-09-12 1999-04-12 Biopolo S C A R L Ceppi di lievito per la riproduzione di acido lattico
US6762339B1 (en) 1999-05-21 2004-07-13 3M Innovative Properties Company Hydrophilic polypropylene fibers having antimicrobial activity
US6485947B1 (en) 1999-05-21 2002-11-26 Cargill Dow Polymers, Llc Production of lactate using crabtree negative organisms in varying culture conditions
AU2001282174A1 (en) * 2000-07-13 2002-01-30 Danisco Sweeteners Oy Method for the production of xylitol
JP2004521619A (ja) 2000-11-22 2004-07-22 カージル ダウ ポリマーズ エルエルシー 有機生成物の合成のための方法及び材料
CA2474152A1 (en) 2001-11-23 2003-06-19 Cargill Dow Llc Methods and materials for the production of organic products in cells of candida species
PT1468093E (pt) * 2002-01-23 2009-04-15 Royal Nedalco B V Fermentação de açúcares pentose
ES2290466T3 (es) 2002-05-30 2008-02-16 Natureworks Llc Metodos y materiales para la produccion de acido d-lactico en levadura.
SE0302421D0 (sv) * 2003-09-11 2003-09-11 Forskarpatent I Syd Ab Construction of new xylose utilizing Saccharomyces cerevisiae strain
ZA200711038B (en) * 2005-06-02 2009-06-24 Cargill Inc Genetically modified yeast of the species Issatchenkia orientalis and closely related species and fermentation processes using same
JP5121070B2 (ja) * 2005-11-23 2013-01-16 ネイチャーワークス・エル・エル・シー Ｌ−又はｄ−ラクタート：フェリチトクロームｃ酸化還元酵素遺伝子が機能しない乳酸産生酵母
JP5219074B2 (ja) * 2008-01-24 2013-06-26 独立行政法人産業技術総合研究所 キシロース発酵能が優れた六炭糖・五炭糖同時発酵酵母およびそれを用いたエタノールの高効率生産方法
BR112012003241A2 (pt) * 2009-08-12 2015-09-01 Gevo Inc Localização de via de isobutanol citosólico para a produção de isobutanol

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6410302B1 (en) * 1998-04-20 2002-06-25 Forskarpatent I Syd Ab Genetically engineered yeast and mutants thereof for the efficient fermentation of lignocellulose hydrolysates
US6475768B1 (en) * 1999-04-09 2002-11-05 Forskarpatent I Syd Ab Xylose isomerase with improved properties

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. L. TRÄFF,等: "Deletion of the GRE3 Aldose Reductase Gene and Its Influence on Xylose Metabolism in Recombinant Strains of Saccharomyces cerevisiae Expressing the xylA and XKS1 Genes", 《APPL. ENVIRON. MICROBIOL.》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI551688B (zh) * 2015-02-04 2016-10-01 遠東新世紀股份有限公司 發酵纖維素水解液來生成乙醇的方法

Also Published As

Publication number Publication date
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EP2338895B1 (en) 2013-08-14
ES2426966T3 (es) 2013-10-28
AU2004236724B2 (en) 2008-07-10
JP4711955B2 (ja) 2011-06-29
EP2345662B1 (en) 2016-06-22
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US7943366B2 (en) 2011-05-17
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CA2524387A1 (en) 2004-11-18

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