BR112013026193A2 - composições e métodos para a produção aumentada de etanol a partir de biomassa - Google Patents

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BR112013026193A2
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Joshua Lundorff
Hans Liao
Ana Negrete-Raymond
Pirkko Suominen
Aristos Aristidou
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Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO AUMENTADA DE ETANOL A PARTIR DE BIOMASSA O presente pedido de patente apresenta a identificação dos novos genes transportadores de xilose de KHT105 de K. marxianus e RAG4, assim como a identificação de um novo kit de genes da rota de fosfato de pentose de I. orientalis. O presente pedido de patente também apresenta uma série de células de levedura geneticamente modificadas que compreendem várias combinações das rotas de fermentação de arabinose, rotas de fermentação de xilose, rotas de fosfato de pentose, e/ou de genes transportadores de xilose e os métodos de cultivo dessas células para produzir o etanol em meios de fermentação que contêm xilose.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-
ÇÕES E MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO AUMENTADA DE ETANOL A PARTIR DE BIOMASSA".
REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE 5 O presente pedido de patente reivindica a prioridade para o Pe- dido de Patente Provisório dos Estados Unidos nº. 61/474.035, depositado em 11 de abril de 2011, cuja descrição é aqui incorporada na sua íntegra a título de referência.
ANTECEDENTES Um bocado de trabalho tem sido despendido nos anos recentes para desenvolver métodos econômicos para a geração de etanol a partir de biomassa. O uso da biomassa para gerar o etanol para combustível apre- senta várias vantagens em relação ao uso de fontes mais tradicionais de material de partida. Os materiais crus potenciais são abundantes e variados, o uso desses materiais de partida não diverge da fonte de alimento e eles exibem potencialmente um menor alcance do carbono. Embora a biomassa propicie um substrato atraente para a pro- dução do etanol, ela também apresenta vários desafios. Em primeiro lugar, a biomassa contém celulose, a qual pode ser decomposta em açúcares de hexose tais como a glicose e a hemicelulose, que pode ser decomposta em açúcares de pentose tais como a arabinose e a xilose. Muitos dos micro- organismos usados tradicionalmente na fermentação de etanol não têm a capacidade de fermentar os açúcares de hexose e de pentose em etanol. Em segundo lugar, ao contrário das fontes mais tradicionais do material de partida de etanol (por exemplo, milho, cana de açúcar), a biomassa inclui componentes estruturais de fontes de plantas. Devido ao fato que o material da fonte é estrutural e mais difícil de decompor, a biomassa requer mais pro- cessamento para gerar os monômeros de açúcar que funcionam como um substrato da fermentação. Em terceiro lugar, o hidrolisato que resulta do pré- tratamento da biomassa apresenta um ambiente inóspito para os micro- organismos da fermentação. Várias espécies bacterianas têm a capacidade de fermentar a-
çúcares de pentose em etanol, mas essas espécies produzem em geral uma mistura de produtos em lugar de um único produto. Frequentemente, um ou mais desses produtos são nocivos às bactérias. Além disso, as bactérias podem exibir taxas drasticamente reduzidas de fermentação no ambiente 5 inóspito do hidrolisato de material de plantas. As leveduras são em geral consideradas como os candidatos mais atraentes para a fermentação de etanol em escala industrial do que as bactérias. No entanto, muito poucas leveduras têm a capacidade de fermen- tar açúcares de pentose em etanol. Várias modificações genéticas foram introduzidas em espécies diferentes de leveduras em uma tentativa de supe- rar esse problema, mas nenhuma dessas cepas modificadas previamente desenvolvidas provou ser inteiramente satisfatória para a produção em grande escala de etanol a partir de biomassa. Portanto, há uma necessidade no estado da técnica quanto a novas cepas de levedura geneticamente mo- dificadas que tenham a capacidade de fermentar biomassa em etanol.
SUMÁRIO São aqui providas em determinadas modalidades os polinucleo- tídeos KHT105 e RAG4 isolados. Em algumas dessas modalidades, os poli- nucleotídeos codificam um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2 (KHT105) ou 4 (RAG4), ou um polipeptídeo que com- preende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2 ou 4. Em determinadas modalidades, os polinucleotídeos compreendem a sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 1 ou 3, ou uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 1 ou 3. Em outras modalida- des, os polinucleotídeos codificam um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2 ou 4, onde o polipeptídeo codificado consegue transportar a xilose para uma célula de levedura. Em algumas dessas modalidades, uma célula de levedura que su- perexpressa o polinucleotídeo consome uma quantidade maior de glicose em relação à xilose do que uma célula de levedura idêntica que não super- expressa o polinucleotídeo.
Em determinadas modalidades, os polinucleotí- deos compreendem uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 70% de identidade de sequência em relação à sequência de nucleotídeos das 5 SEQ ID NOs: 1 ou 3. São aqui providos em determinadas modalidades os polipeptí- deos KHT105 e RAG4 isolados.
Em algumas dessas modalidades, os poli- peptídeos compreendem a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2 (KHT105) ou 4 (RAG4), ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação às SEQ ID NOs: 2 ou 4. Em outras modalidades, os polipeptídeos compreendem uma sequência de ami- noácidos com pelo menos 70% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2 ou 4 e conseguem transpor- tar a xilose para uma célula de levedura.
Em algumas dessas modalidades, uma célula de levedura que superexpressa o polipeptídeo consome uma quantidade maior de glicose em relação à xilose do que uma célula de leve- dura idêntica que não superexpressa o polipeptídeo.
São aqui providos em determinadas modalidades os polinucleo- tídeos RPE, RKI, TKL e TAL isolados.
Em algumas dessas modalidades, os polinucleotídeos codificam um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 34 (RPE), 40 (RKI), 46 (TKL), ou 52 (TAL), ou um polipep- tídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência em relação às SEQ ID NOs: 34, 40, 46, ou 52. Em determinadas modalidades, os polinucleotídeos compreendem a se- quência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 33, 39, 45, ou 51, ou uma se- quência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 33, 39, 45, ou 51. São aqui providos em determinadas modalidades os polipeptí- deos RPE, RKI, TKL e TAL isolados.
Em algumas dessas modalidades, os polipeptídeos compreendem a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 34 (RPE), 40 (RKI), 46 (TKL), ou 52 (TAL), ou uma sequência de aminoáci- dos com pelo menos 80% de identidade de sequência em relação às SEQ ID
NOs: 34, 40, 46, ou 52. São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que superexpressam um ou mais genes transportadores de xilose.
Em algumas dessas modalidades, o gene trans- 5 portador de xilose superexpresso é um gene de KHT105 ou RAG4 que codi- fica um polipeptídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO: 2 ou à SEQ ID NO: 4, respectivamente.
Em determi- nadas modalidades, as células de levedura geneticamente modificadas per- tencem à classe I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modalida- des as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades estão células de levedura geneticamente modificadas que compreendem uma rota ativa de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose, em que as células compreendem um ou mais genes da rota de fermentação de arabi- nose exógenos selecionados do grupo que consiste em genes AI, RK e RE.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneticamente modi- ficadas pertencem à classe I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modalidades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que superexpressam um ou mais genes transportadores de xilose e compreendem uma rota ativa de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose, em que as células compre- endem um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK e RE.
Em determina- das modalidades, as células de levedura geneticamente modificadas perten- cem às classes I. orientalis/P. fermentas e em algumas dessas modalidades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que superexpressam um ou mais genes transportadores de xilose e compreendem uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose, em que as células compreendem um ou mais genes da rota de fermentação de xilose exóge-
nos selecionados do grupo que consiste nos genes XR, XDH e XK.
Em de- terminadas modalidades, as células de levedura geneticamente modificadas pertencem às classes I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas mo- dalidades as células são de I. orientalis. 5 São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que compreendem uma rota ativa de a- rabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose e uma rota ati- va de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose, em que as células compreendem um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK e RE e um ou mais genes da rota de fermentação de xilose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes XR, XDH e XK.
Em determi- nadas modalidades, as células de levedura geneticamente modificadas per- tencem às classes I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modali- dades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que superexpressam um ou mais genes transportadores de xilose e compreendem uma rota ativa de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose e uma rota ativa de fermenta- ção de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose, em que as células compreendem um ou mais genes da rota de fermentação de arabi- nose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK e RE e um ou mais genes da rota de fermentação de xilose exógenos seleciona- dos do grupo que consiste nos genes XR, XDH e XK.
Em determinadas mo- dalidades, as células de levedura geneticamente modificadas pertencem às classes I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modalidades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que superexpressam um ou mais genes transportadores de xilose e compreendem uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose, em que as células compreendem um ou mais genes da rota de fermentação de xilose exóge-
nos selecionados do grupo que consiste nos genes XI e XK.
Em determina- das modalidades, as células de levedura geneticamente modificadas perten- cem às classes I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modalida- des as células são de I. orientalis. 5 São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que compreendem uma rota ativa de a- rabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose e uma rota ati- va de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose, em que as células compreendem um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK e RE e um ou mais genes da rota de fermentação de xilose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes XI e XK.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneticamente modificadas pertencem às classes I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modalidades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que superexpressam um ou mais genes transportadores de xilose e compreendem uma rota ativa de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose e uma rota ativa de fermenta- ção de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose, em que as células compreendes um ou mais genes da rota de fermentação de arabino- se exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK e RE e um ou mais genes da rota de fermentação de xilose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes XI e XK.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneticamente modificadas pertencem às classes I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modalidades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que compreendem uma rota ativa de a- rabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose e uma rota ati- va de fosfato de pentose não oxidante para converter o 5-fosfato de xilulose mais o 5-fosfato de ribose em F6P e G3P, em que as células compreendem um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose exógenos selecio- nados do grupo que consiste nos genes AI, RK ou RE e um ou mais genes da rota ativa de fosfato de pentose não oxidante selecionados do grupo que consiste nos genes TKL e TAL.
Em determinadas modalidades, as células 5 também compreendem um ou mais genes da rota de fosfato de pentose não oxidante exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes RPE e de RKI.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneticamente modificadas pertencem às classes I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modalidades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que superexpressam um ou mais genes transportadores de xilose, compreendem uma rota ativa de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose e compreendem uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para converter o 5-fosfato de xilulo- se mais o 5-fosfato de ribose em F6P e G3P, em que as células compreen- dem um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose exógenos se- lecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK ou RE e um ou mais genes da rota de fosfato de pentose não oxidante exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes TKL e TAL.
Em determinadas modalidades, as células também compreendem um ou mais genes da rota de fosfato de pentose não oxidante exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes RPE e de RKI.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneticamente modificadas pertencem às classes I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modalidades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que superexpressam um ou mais genes transportadores de xilose, compreendem uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose e compreendem uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para converter o 5-fosfato de xilulose mais o 5-fosfato de ribose em F6P e G3P, em que as células com- preendem um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK ou RE, um ou mais genes da rota de fermentação de xilose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes XR, XDH e XK e um ou mais genes da rota de fosfa- to de pentose não oxidante exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes TKL e TAL.
Em determinadas modalidades, as células também 5 compreendem um ou mais genes da rota de fosfato de pentose não oxidante exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes RPE e RKI.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneticamente modifica- das pertencem às classes I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modalidades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades de levedura geneticamente modificadas que compreendem uma rota ativa de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose, uma rota ativa de fer- mentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose e uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para converter o 5-fosfato de xilulose mais o 5-fosfato de ribose em F6P e a G3P, em que as células com- preendem um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK ou RE, um ou mais genes da rota de fermentação de xilose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes XR, XDH e XK e um ou mais genes da rota de fosfa- to de pentose não oxidante exógenos selecionados dos grupo que consiste nos genes TKL e TAL.
Em determinadas modalidades, as células também compreendem um ou mais genes da rota de fosfato de pentose não oxidante exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes RPE e RKI.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneticamente modifica- das pertencem às classes I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modalidades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que superexpressam um ou mais genes transportadores de xilose, compreendem uma rota ativa de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose, compreendem uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose e compreendem uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para con-
verter o 5-fosfato de xilulose mais o 5-fosfato de ribose em F6P e G3P, em que as células compreendem um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK ou RE, um ou mais genes da rota de fermentação de xilose exógenos sele- 5 cionados do grupo que consiste em genes de XR, de XDH e de XK e um ou mais genes da rota de fosfato de pentose não oxidante exógenos seleciona- dos do grupo que consiste nos genes TKL e TAL.
Em determinadas modali- dades, as células também compreendem um ou mais genes da rota de fos- fato de pentose não oxidante exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes RPE e RKI.
Em determinadas modalidades, as células de levedu- ra geneticamente modificadas pertencem às classes I. orientalis/P. fermen- tans e em algumas dessas modalidades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que superexpressam um ou mais genes transportadores de xilose, compreendem uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose e compreendem uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para converter o 5-fosfato de xilulose mais o 5-fosfato de ribose em F6P e G3P, em que as células com- preendem um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK ou RE, um ou mais genes da rota de fermentação de xilose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes XI e XK e um ou mais genes da rota de fosfato de pentose não oxidante exógenos selecionados do grupo que consiste enos genes TKL e TAL.
Em determinadas modalidades, as células também com- preendem um ou mais genes da rota de fosfato de pentose não oxidante exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes RPE e RKI.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneticamente modifica- das pertencem às classes I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modalidades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que compreendem uma rota ativa de a- rabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose, uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose e uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para converter o 5-fosfato de xilulose mais o 5-fosfato de ribose em F6P e G3P, em que as células compreendem um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose exó- 5 genos selecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK ou RE, um ou mais genes da rota de fermentação de xilose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes XI e XK e um ou mais genes da rota de fosfa- to de pentose não oxidante exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes TKL e TAL.
Em determinadas modalidades, as células também compreendem um ou mais genes da rota de fosfato de pentose não oxidante exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes RPE e RKI.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneticamente modifica- das pertencem às classes I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modalidades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que superexpressam um ou mais genes transportadores de xilose, compreendem uma rota ativa de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose, compreendem uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose e compreendem uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para con- verter o 5-fosfato de xilulose mais o 5-fosfato de ribose em F6P e G3P, em que as células compreendem um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK ou RE, um ou mais genes da rota de fermentação de xilose exógenos sele- cionados do grupo que consiste nos genes XI e XK e um ou mais genes da rota de fosfato de pentose não oxidante exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes TKL e TAL.
Em determinadas modalidades, as célu- las também compreendem um ou mais genes da rota de fosfato de pentose não oxidante exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes RPE e RKI.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneticamente modificadas pertencem às classes I. orientalis/P. fermentans e em algumas dessas modalidades as células são de I. orientalis.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que superexpressam um ou mais genes transportadores de xilose, compreendem uma rota ativa de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose, compreendem uma rota ativa 5 de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose, e/ou compreendem uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para converter o 5-fosfato de xilulose mais o 5-fosfato de ribose em F6P e G3P, em que as células também compreendem uma supressão ou uma decompo- sição de um ou mais genes que codificam as enzima envolvidas em uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose através de intermediários de xilitol e D-xilulose.
Em determinadas modalidades, as células compreendem uma supressão ou uma decomposi- ção de um ou mais genes de AR/XR, arabitol 4-desidrogenase, xililose redu- tase, ou XDH.
Em determinadas modalidades, o gene de AR/XR suprimido ou decomposto codifica um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 69, ou 71, e/ou compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à região de codifi- cação da sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 63, 65, 67, ou 70. Em determinadas modalidades, o gene de xilulose redutase suprimido ou de- composto codifica um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 e/ou compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 50% de iden- tidade de sequência em relação à região de codificação da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 57. Em determinadas modalidades, o gene de XDH suprimido ou decomposto codifica um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 60 ou 62 e/ou compreende uma sequência de nucleotí- deos com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à região de codificação da sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 59 ou 61. São aqui providas em determinadas modalidades células de le-
vedura geneticamente modificadas que superexpressam um ou mais genes transportadores de xilose, compreendem uma rota ativa de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose, compreendem uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose, 5 e/ou compreendem uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para converter o 5-fosfato de xilulose mais o 5-fosfato de ribose em F6P e G3P, em que as células também compreendem uma supressão ou uma decompo- sição de um ou mais genes de ALD ou ADH.
Em determinadas modalidades, o gene de ALD suprimido ou decomposto codifica um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 73 e/ou compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à região de codificação da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 72. Em determi- nadas modalidades, o gene de ADH suprimido ou decomposto codifica um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 75 ou 85 e/ou compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 50% de identidade de se- quência em relação à região de codificação da sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 74 ou 84. São aqui providos em determinadas modalidades métodos de fermentação que utilizam uma ou mais das células de levedura genetica- mente modificadas aqui providas.
Em determinadas modalidades, o meio de fermentação contém xilose.
Em algumas dessas modalidades, o meio con- tém pelo menos 10 g/l de xilose de um hidrolisato de biomassa de planta e em determinadas modalidades a xilose é o açúcar mais abundante no meio.
São aqui providos em determinadas modalidades métodos para a produção de etanol ao usar uma ou mais das células de levedura geneti- camente modificadas aqui providas.
Em determinadas modalidades, as célu- las são cultivadas em meios que contêm xilose.
Em algumas dessas modali- dades, o meio contém pelo menos 10 g/l de xilose de um hidrolisato de bio- massa de planta e em determinadas modalidades a xilose é o açúcar mais abundante no meio.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1: Rotas de levedura para o metabolismo da xilose e da arabinose.
Figura 2: Fermentação de L-arabinose em etanol pelas cepas 5 1822, JY30.1 e JY30.2. Figura 3: Fermentação de arabinose emetanol pelas cepas 3922, 3936, 3937 e 3408 em meio YP com 20 g/l de arabinose.
Figura 4: Fermentação de xilose em etanol pelas cepas 3922, 3936, 3937 e 3408 em meio YP com 10 g/l de dextrose, 40 g/l de xilose e 10 g/l de arabinose.
Figura 5: Fermentação de xilose em etanol pelas cepas 3922, 3936, 3937 e 3408 em meio YP com 20 g/l de dextrose, 80 g/l de xilose e 10 g/l de arabinose.
Figura 6: Fermentação de arabinose pelas cepas 3922, 3936, 3937 e 3408 em meio YP com 10 g/l de dextrose, 40 g/l de xilose e 10 g/l de arabinose.
Figura 7: Fermentação de xilose em etanol pela cepa yJY19 em meio YP com 20 g/l de glicose e 55 g/l de xilose.
Figura 8: Fermentação de xilose em etanol pela cepa yJY20 em meio YP com 20 g/l de glicose e 55 g/l de xilose.
Figura 9: Fermentação de xilose em etanol pela cepa yJLJ77 em meio YP com 20 g/l de glicose e 55 g/l de xilose.
Figura 10: Fermentação de xilose pelas cepas 2973, 3097 e yJY28. Figura 11: Fermentação de xilose pelas cepas 2973, 3097 e yJY28. Figura 12: Produção de etanol pelas cepas 2973, 3097 e yJY28. Figura 13: Fermentação de xilose e dextrose em etanol pelas cepas 3415 e 3416 em meio CSH DMDX a 30%. Figura 14: Fermentação de arabinose em etanol pelas cepas 3408 e 3812 em meio YP com 40 g/l de arabinose e 10 g/l de dextrose.
Figura 15: Fermentação de xilose em etanol pelas cepas 3937 e
12038 em meio YP com 20 g/l de dextrose, 80 g/l de xilose e 10 g/l de arabi- nose.
Figura 16: Fermentação de arabinose pelas cepas 3937 e 12038 em meio YP com 20 g/l de dextrose, 80 g/l de xilose e 10 g/l de arabinose. 5 Figura 17: Fermentação de xilose em etanol pelas cepas 3937 e 12038 em meio YP com 10 g/l de dextrose, xilose de 40 g/l e 10 g/l de arabi- nose.
Figura 18: Fermentação de arabinose pelas cepas 3937 e 12038 em meio YP com 10 g/l de dextrose, xilose de 40 g/l e 10 g/l de arabinose.
Figura 19: Fermentação de xilose em etanol pelas cepas 3489 e 3861 em meio YP com 20 g/l de dextrose e 80 g/l de xilose.
Figura 20: Produção de acetato pelas cepas 3489 e 3861 em meio YP com 20 g/l de dextrose e 80 g/l de xilose.
Figura 21: Fermentação de xilose em etanol pelas cepas 3489 e 3861 em meio YP com 20 g/l de dextrose e 80 g/l de xilose.
Figura 22: Produção de acetato pelas cepas 3489 e 3861 em meio YP com 20 g/l de dextrose e 80 g/l de xilose.
Figura 23: Fermentação de xilose em etanol pelas cepas 3489 e 3861 em meio YP com 20 g/l de dextrose e 80 g/l de xilose.
Figura 24: Fermentação de xilose em etanol pelas cepas 4084 e 4085 em meio CSH a 50%. Figura 25: Fermentação de xilose em etanol pelas cepas 4083, 4085 e 4086 em meio CSH a 50%. Figura 26: Produção de etanol pelas cepas 12053, 12124 e 12125 em meio CSH a 50% com 20 g/l de dextrose e 80 g/l de xilose ou 70 g/l de dextrose e 40 g/l de xilose.
Figura 27: Fermentação de xilose pelas cepas 12053, 12124 e 12125 em meio CSH a 50% com 20 g/l de dextrose e 80 g/l de xilose ou 70 g/l de dextrose e 40 g/l de xilose.
Figura 28: Consumo de arabinose pelas cepas 12038, yACN168, yACN170 e yACN172 em meio DM com 20 g/l de dextrose, 35 g/l de xilose e 35 g/l de arabinose.
Figura 29: Consumo de arabinose pelas cepas 12038, yACN174, yACN176 e yACN178 em meio DM com 20 g/l de dextrose, 35 g/l de xilose e 35 g/l de arabinose. Figura 30: Consumo de xilose pelas cepas 3937, 12215 e 12216 5 em meio YP com 20 g/l de dextrose, 80 g/l de xilose e 10 g/l de arabinose. Figura 31: Produção de etanol pelas cepas 3937, 12215 e 12216 em meio YP com 20 g/l de dextrose, 80 g/l de xilose e 10 g/l de arabinose. Figura 32: Consumo de arabinose pelas cepas 3937, 12215 e 12216 em meio YP com 50 g/l de arabinose. Figura 33: Fermentação de glicose e xilose em etanol pelas ce- pas 3118, 3082 e 3862 em meio YP com 20 g/l de glicose e 80 g/l de xilose. Figura 34: Fermentação de glicose e xilose em etanol pelas ce- pas 3083 e 3352 em meio YP com 20 g/l de dextrose e 80 g/l de xilose. Figura 35: Fermentação de glicose e xilose em etanol pelas ce- pas 3356 e 12293 em meio YP com 20 g/l de dextrose, 80 g/l de xilose e 10 g/l de arabinose.
DESCRIÇÃO DETALHADA A descrição da invenção a seguir presta-se meramente a ilustrar várias modalidades da invenção. Dessa maneira, as modificações específi- cas discutidas não devem ser interpretadas como limitações no âmbito da invenção. Será aparente ao elemento versado na técnica que várias equiva- lências, mudanças e modificações podem ser feitas sem que se desvie do âmbito da invenção e deve ser compreendido que tais modalidades equiva- lentes devem ser aqui incluídas. A menos que esteja indicado de alguma outra maneira, todos os números que expressam concentrações dos componentes, condições da fermentação, desempenho da fermentação, e assim por diante, usados no relatório descritivo devem ser compreendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Por conseguinte, a menos que esteja indicado de alguma outra maneira, os parâmetros numéricos indicados no relatório descritivo são aproximações que podem variar dependendo pelo menos da técnica analítica específica. Qualquer valor numérico contém ine-
rentemente determinados erros que resultam necessariamente do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições de teste.
Todas as referências aqui citadas são incorporadas a título de referência em sua totalidade. 5 Abreviaturas: ADH desidrogenase de álcool; AI/araA, arabinose isomerase; ALD, desidrogenase de aldeído; AR, redutase de aldose;CIB2, L-(+)-lactato- citocromo c oxidoredutase; CIC, iso-2-citocromo c; DHAP, diidróxi acetona P; ENO1, enolase 1; E4P, 4-fosfato de eritrose; F6P, 6-fosfato de frutose; GAL6, aminopeptidase de cisteína; GAPDH, gliceraldeído-3-fosfato desidro- genase 3; G3P, 3-fosfato de gliceraldeído; G3PDH, glicerol-3-fosfato desi- drogenase; PDC1, piruvato de decarboxilase 1; PGK, fosfoglicerato de qui- nase; PPP, rota de fosfato de pentose; RE/araD, ribulose 5-fosfato de 4- epimerase; RK/araB, ribulocinase; RKI, ribose 5-fosfato de cetol-isomerase; RPE, 3-epimerase 5-fosfato de ribulose; S7P, 7-fosfato de sedoheptulose; TAL, transaldolase; TDH3, desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato; TEF1, fator-1 de alongamento de tradução; TEF2, fator-2 de alongamento de tradu- ção; TKL, transcetolase; TPI, triosefosfato de isomerase; URA3, decarboxi- lase de 5'-fosfato de orotidina; XDH, desidrogenase de xilitol; XI isomerase de xilose; XK, xiluloquinase; XR, redutase de xilose.
São aqui providas células de levedura geneticamente modifica- das para a produção de etanol, os métodos para a produção dessas células de levedura e os métodos de uso dessas células para a produção de etanol.
A espécie ideal de levedura para a produção em escala industri- al de etanol a partir de biomassa deve exibir uma resistência a ambientes de pH baixo, a capacidade de fermentar açúcares de hexose e pentose em eta- nol e a resistência aos compostos inibidores presentes no hidrolisato de ma- terial de planta e resultantes da fermentação, incluindo acetato, HMF, furfu- ral, fenólicos, aldeídos, cetonas e o próprio etanol.
Saccharomices cerevisiae e a maior parte de outras de espécies de levedura têm a capacidade de fermentar açúcares de hexose em etanol.
No entanto, a maioria das espécies de levedura não consegue fermentar açúcares de pentose tais como a arabinose e a xilose.
Essas espécies de levedura que têm a capacidade de metabolizar açúcares de pentose fazem isso através de uma rota complexa.
As rotas convencionais de levedura para o metabolismo da xilose e da arabinose (os dois açúcares os mais comuns 5 de pentose na biomassa celulósica) utilizam um intermediário de xilitol.
A D- xilose é reduzida em xilitol pelo redutase de xilose (XR). A arabinose é con- vertida em xilitol através de um processo de três etapas.
A L-arabinose é reduzida em L-arabitol pela redutase da aldose (AR), o L-arabitol é converti- do em L-xilulose pela 4-desidrogenase de L-arabitol e a L-xilulose é conver- tida em xilitol pela redutase de L-xilulose.
Em ambas as rotas, o xilitol é oxi- dado em D-xilulose pela desidrogenase de xilitol (XDH) e a D-xilulose é fos- forilada pela xiluloquinase (XK) para produzir a D-xilulose 5-P.
A D-xilulose 5-P resultante entra na rota de fosfato de pentose (PPP), que gera o 6- fosfato de frutose (F6P) e 3-fosfato de gliceraldeído (G3P), ambos os quais entram no ciclo glicolítico.
Essa rota é ilustrada na Figura 1. O piruvato que resulta da glicólise é convertido em acetaldeído e CO2 pelo piruvato de des- carboxilase e o acetaldeído é reduzido em etanol pela desidrogenase de ál- cool (ADH). Uma vez que as redutases da rota de utilização de arabinose fúngica utilizam NADF como redutor e as desidrogenases são específicas para NAD+, um desequilíbrio do cofator resulta no crescimento anaeróbico lento na L-arabinose e em níveis baixos de produção de etanol mesmo que o processo seja neutro na redox.
Ao contrário da levedura, as bactérias não utilizam um interme- diário de xilitol para metabolizar a arabinose.
Nas bactérias, a L-arabinose é convertida em L-ribulose pela isomerase de L-arabinose (AI). A L-ribulose é convertida em 5-fosfato de L-ribulose pela L-ribuloquinase (RK), que é então convertida em D-5-fosfato de xilulose pelo L-ribulose-fosfato de 4-epimerase (RE). Nenhumas dessas etapas enzimáticas requer um cofator de NAD ou de NADH, o que significa que a rota bacteriano da arabinose não tem pro- blemas de desequilíbrio de cofator complicados.
Foram feitas tentativas an- teriores no sentido de utilizar a rota bacteriana de arabinose em levedura.
Os genes de AI, RK e RE das fontes bacterianas foram incorporados em S. ce- revisiae, e a cepa de levedura geneticamente modificada resultante exibiu a capacidade de fermentar arabinose em etanol (Becker and Boles Appl.
Envi- ron Microbiol 69:4144 (2003)). No entanto, a S. cerevisiae tem uma tolerân- 5 cia limitada ao acetato livre e a outros inibidores comuns nos hidrolisatos.
Foram feitas tentativas anteriores no sentido de gerar espécies adicionais de levedura que tenham a capacidades de fermentar açúcares de pentose e sejam tolerantes aos inibidores de hidrolisatos.
Foi gerada uma cepa de I. orientalis que continha um knockout [inativação] dos genes de ADH, ADHa e ADHb putativos, e também superexpressou um gene de A- DH1 putativo.
A cepa de levedura resultante mostrou uma maior capacidade de fermentar a xilose em etanol.
No entanto, ela não tinha a capacidade de fermentar a arabinose.
Tal como aqui apresentado, os genes RK AI (araA), RK (araB) e RE (araD) da rota bacteriana da arabinose de Bacteroides thetaiotaomicron, de Escherichia coli, Lactobacillus plantarum e Bacillus licheniformis foram incorporados em uma cepa de Issatchenkia orientalis em várias combina- ções (Exemplo 1). Os genes bacterianos eram tipicamente, mas nem sem- pre, otimizados com códons para I. orientalis.
Cada uma das cepas resultan- tes exibiu a atividade de AI, RK, e/ou RE apropriada (Exemplo 2). Várias ce- pas que contêm um conjunto completo de genes da rota de arabinose bacte- rianos (isto é, pelo menos uma cópia de cada um dos genes AI, RK e RE) foram testadas quanto à sua capacidade de fermentar a arabinose.
Essas cepas exibiram um consumo de arabinose e uma produção de etanol a partir de arabinose (Exemplo 3). Os resultados aqui apresentados confirmam que os genes da rota de arabinose bacterianos são ativos quando expressos em I. orientalis.
Um conjunto completo de genes da rota de arabinose de B. the- taiotaomicron foi incorporado em uma cepa de I. orientalis que tinha sido previamente projetada geneticamente para fermentar a xilose em etanol a fim de criar uma cepa da rota dupla com a capacidade de fermentar a xilose e a arabinose (Exemplo 4). As cepas da rotas duplas resultantes exibiram a capacidade de fermentar a arabinose e a xilose em etanol e ambas produzi- ram mais etanol do que as cepas de controle que com tinham somente a xilose ou somente os genes da rota de arabinose (Exemplo 5). No entanto, a utilização da xilose foi diminuída nas cepas das rotas duplas versus a cepa 5 só de xilose, até mesmo nos meios que não contêm a arabinose.
Além dis- so, o consumo da arabinose não começou até que a dextrose e a xilose esti- vessem esgotadas em sua maior parte.
Cepas adicionais de I. orientalis fo- ram geradas, as quais continham genes araB de B. thetaiotaomicron e de L. citreum otimizados com códons (Exemplo 6). Essas cepas exibiram uma uti- lização da xilose e uma produção de etanol melhoradas versus uma cepa que contém o gene de B. thetaiotaomicron otimizado com códons.
Tal como aqui apresentado, o genoma de K. marxianus foi exa- minado para identificar transportadores potenciais de açúcar (Exemplo 7). Dois genes transportadores de açúcar de K. marxianus putativos, KHT105 e RAG4, foram caracterizados.
Ambos os genes foram integrados nas cepas de I. orientalis que tinham sido projetadas geneticamente previamente para conter uma rota de xilose básica (XI, XK) a fim de avaliar o efeito da expres- são do transportador putativo na utilização da xilose (Exemplo 8). As cepas resultantes exibiram uma maior coconsumo de glicose e de xilose, de modo que uma segunda cópia de cada gene transportador foi integrada nas célu- las.
As células que contêm duas cópias do gene KHT105 exibiram uma utili- zação de xilose e uma produção de etanol maiores do que a cepa ou cepas paternas que contêm duas cópias do gene RAG4. Os efeitos da expressão de KHT105 foram ainda testados ao in- tegrar duas cópias do gene em uma cepa de I. orientalis que contém a en- genharia mais avançada de xilose, incluindo a superexpressão dos genes da rota de pentose não oxidante transaldolase (TAL), ribose 5-fosfato de cetol- isomerase (RKI) e 3-epimerase 5-fosfato de ribulose (RPE) (Exemplo 9). Nos fermentadores com meios de hidrolisato, a cepa que expressa KHT105 exi- biu um aumento de 80% no consumo de xilose e na produção de etanol ver- sus uma cepa do controle.
Para avaliar o efeito da expressão de KHT105 no consumo de arabinose, uma única cópia do gene foi integrada no locus S141G4546 de uma cepa de I. orientalis contendo genes da rota de arabinose (Exemplo 10). S141G4546 é um homólogo da desidrogenase de butano diol e da desidro- genase de xilitol.
A cepa resultante exibiu um ligeiro aumento no consumo 5 de arabinose e na produção de etanol versus uma cepa paterna.
Com base nos dados que mostram que o transportador KHT105 aumentou o consumo de xilose e de arabinose, duas cópias do gene KHT105 foram integradas no locus S141G4546 das cepas de I. orientalis da rotas duplas descritas acima (Exemplo 11). As cepas que contêm o transpor- tador KHT105 exibiram uma produção de etanol e um consumo de xilose e de arabinose maiores do que a cepa paterna (Exemplo 12). Os benefícios da expressão de KHT105 eram particularmente aparentes nos meios que con- têm níveis mais elevados de açúcar.
Para avaliar métodos adicionais para melhorar a produção do etanol em I. orientalis, uma cepa de knockout de deidrogenase de aldeído (ALD) foi desenvolvida.
A I. orientalis tem três homólogos principais para os genes ALD4, ALD5 e ALD6 de S. cerevisiae: S141G5680 ("ALD5680"), S141G9161 ("ALD9161") e S141G6502 ("ALD6502"). Os knockouts visaram ALD5680, que exibe uma expressão aumentada quando as células são culti- vadas em xilose.
Ambas as cópias de ALD5680 foram inativadas em uma cepa de I. orientalis que tinha sido previamente projetada geneticamente para fermentar a xilose em etanol (Exemplo 13). A cepa de knockout ALD5680 exibiu um consumo de xilose e uma produção de etanol maiores e uma menor produção de acetato sob determinadas condições, mas os resul- tados eram parcialmente dependentes das condições da fermentação preci- sas usadas (Exemplo 14). Cópias adicionais do gene KHT105 de K. marxianus foram inte- gradas em uma cepa de I. orientalis que tinha sido previamente projetada geneticamente para conter duas cópias de KHT105 no locus S141G9091 (homólogo de ADH) (Exemplo 15). As cópias adicionais de KHT105 foram integradas nos loci S141G4546 ou ALD5680, e o efeito do maior número de cópias de KHT105 e knockout de S141G4546/ALD5680 no consumo de a-
çúcar e na produção de etanol em meio de hidrolisato foi avaliado.
Entre as cepas de knockout de S141G4546 e ALD5680, a presença de uma quarta cópia do gene KHT105 aumentou o consumo de xilose e a produção de eta- nol versus as cepas que contêm somente três cópias do gene, com as cepas 5 de knockout de ALD exibindo resultados ligeiramente melhores do que as cepas de knockout de S141G4546. Os efeitos da superexpressão de KHT105 e/ou de knockout de ALD5680 foram avaliados em seguida em uma cepa de I. orientalis resisten- te a etanol.
A superexpressão de KHT105 resultou em um aumento significa- tivo na produção de etanol e consumo de xilose no meio definido com baixo teor de dextrose, mas teve somente um ligeiro efeito no meio elevado de elevado teor de dextrose (Exemplo 16). Os genes araD de Bifidobacterium animalis e de Lactococcus lactis (Exemplo 17) e os genes araA de Lactobacillus sakei e de B. thetaiota- omicron (Exemplo 18) foram integrados nas cepas da rotas duplas de I. ori- entalis que superexpressam KHT105 para avaliar o seu efeito na fermenta- ção de arabinose.
Essas cepas exibidas um maior consumo de arabinose versus as cepas paternas.
Tal como aqui apresentado, novas sequências de genes TAL, RKI, TKL e RPE de I. orientalis sequências foram identificadas.
As cópias exógenas desses genes foram integradas em I. orientalis para avaliar o efei- to de sua superexpressão no consumo de xilose e na produção de etanol (Exemplos 19-21). As cepas resultantes exibiram um aumento na utilização de xilose e na produção de etanol versus as cepas paternas.
São aqui providos em determinadas modalidades os polinucleo- tídeos transportadores KHT105 e RAG4 isolados.
Em determinadas modali- dades, esses polinucleotídeos isolados compreendem uma região de codifi- cação que codifica um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 2 ou 4, respectivamente.
Em algumas dessas modalidades, os polinucleotídeos compreendem a região de codificação da sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 1 ou 3. Em outras modalidades, os polinucleotídeos compreendem uma sequência de nucleotí-
deos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à região de codificação da sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 1 ou 3. Em algumas dessas modalidades, os polinucleotídeos compreendem uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 95%, pelo menos 96%, 5 pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência em relação à região de codificação da sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 1 ou 3. Em determinadas modalidades, os polinucleotídeos KHT105 e RAG4 isolados aqui providos compreendem uma região de codificação que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 2 ou 4, respectivamente.
Em al- gumas dessas modalidades, o polipeptídeo codificado compreende uma se- quência de aminoácidos com pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de iden- tidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 2 ou 4. Em determinadas modalidades, os polinucleotídeos isolados compreendem uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à região de codificação da se- quência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 1 ou 3. Em algumas dessas modalidades, os polinucleotídeos isolados compreendem uma se- quência de nucleotídeos que têm pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência em relação à região de codificação da sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 1 ou 3. Em determinadas modalidades, os polinucleotídeos KHT105 e RAG4 isolados aqui providos compreendem uma região de codificação que codifica um polipeptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais em relação à sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 2 ou 4, em que uma célula de levedura que superexpressa o polinucleotídeo con- some uma quantidade maior de glicose em relação à xilose do que uma cé- lula idêntica que não superexpressa o polinucleotídeo.
Similarmente, em de-
terminadas modalidades os polinucleotídeos aqui providos compreendem uma região de codificação que codifica um polipeptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais em relação à sequência de aminoácidos indi- cada nas SEQ ID NOs: 2 ou 4, em que o polipeptídeo codificado tem a ca- 5 pacidade de transportar a xilose para uma célula de levedura.
Em algumas dessas modalidades, os polinucleotídeos compreendem uma região de codi- ficação que codifica um polipeptídeo com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou de pelo menos 90% de identida- de de sequência em relação à sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 2 ou 4. Em algumas dessas modalidades, os polinucleotídeos com- preendem uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 90% de identi- dade de sequência em relação à região de codificação da sequência de nu- cleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 1 ou 3. São aqui providos em determinadas modalidades os polinucleo- tídeos de RPE, RKI, TKL e TAL de I. orientalis isolados.
Em determinadas modalidades, esses polinucleotídeos isolados compreendem uma região de codificação que codifica um polipeptídeo que tem a sequência de aminoáci- dos indicada nas SEQ ID NOs: 34, 40, 46, ou 52, respectivamente.
Em al- gumas dessas modalidades, os polinucleotídeos compreendem a região de codificação da sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 33, 39, 45, ou 51. Em outras modalidades, os polinucleotídeos compreendem uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em relação à região de codificação da sequência de nucleotídeos indi- cada nas SEQ ID NOs: 33, 39, 45, ou 51. Em algumas dessas modalidades, os polinucleotídeos compreendem uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência em relação à região de codificação da sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 33, 39, 45, ou 51. Em determinadas modalidades, os polinucleorídeos RKI, TKL e TAL de I. orientalis isolados aqui providos compreendem uma região de co-
dificação que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em re- lação à sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 34, 40, 46, ou 52, respectivamente.
Em algumas dessas modalidades, o polipeptídeo codi- 5 ficado compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de se- quência em relação à sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 34, 40, 46, ou 52. Em determinadas modalidades, os polinucleotídeos isola- dos compreendem uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em relação à região de codificação da se- quência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 33, 39, 45, ou 51. Em algumas dessas modalidades, os polinucleotídeos isolados compreendem uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência em relação à região de codificação da sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 33, 39, 45, ou 51. São aqui providos em determinadas modalidades construtos que compreendem um ou mais dos polinucleotídeos KHT105, RAG4, RKI de I. orientalis, TKL de I. orientalis e/ou TAL de I. orientalis isolados aqui providos.
O termo "construto" tal como aqui empregado refere-se a uma sequência de DNA que é usada para transformar uma célula.
O construto pode ser, por exemplo, um plasmídio ou vetor circular, uma parte de um plasmídio ou um vetor circular (tal como um produto da digestão de enzima de restrição), um plasmídio ou vetor linearizado, ou um produto de PCR preparado ao usar um plasmídio ou um DNA genômico como um molde.
Além de um ou mais dos polinucleotídeos aqui providos, um construto pode compreender um ou mais elemento reguladores (por exemplo, promotores, terminais) ligados de ma- neira operativa à sequência de polinucleotídeos.
Tal como aqui empregado, o termo "promotor" refere-se a uma sequência não transladada localizada a montante (isto é, 5') do códon do começo da translação de um gene (em geral dentro de cerca de 1 a 1000 pares base (bp), de preferência dentro de cerca de 1 a 500 bp) que controla o começo da transcrição do gene.
O termo "terminal" tal como aqui empregado refere-se a uma sequência não transla- dada localizada a jusante (isto é, 3') do códon de acabamento da translação 5 de um gene (em geral dentro de cerca de 1 a 1.000 bp, de preferência den- tro de cerca de 1 a 500 bp e especialmente dentro de cerca de 1 a 100 bp) que controla o final da transcrição do gene.
Um promotor ou um terminador é "ligado de maneira operativa" a um gene se a sua posição no genoma em relação àquela do gene for tal que o promotor ou terminal, conforme as cir- cunstâncias, executa a sua função de controle transcricional.
Os promotores e os terminais apropriados são descritos, por exemplo, nos documentos de patente WO99/14335, WO00/71738, WO02/42471, WO03/102201, WO03/102152 e WO03/049525 (todos aqui incorporados a título de referên- cia em sua totalidade). Um construto também pode compreender um ou mais componentes adicionais incluindo, por exemplo, um ou mais sítios de ligação e/ou um ou mais genes marcadores de seleção, ligados opcional- mente a um ou mais elemento reguladores.
Um "gene marcador de seleção" é um gene que codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e/ou o crescimento da célula transformada em um meio de cultura seletivo e, por- tanto, pode ser usado para aplicar a pressão de seleção à célula.
São aqui providos em determinadas modalidades os polipeptí- deos KHT105 e RAG4 isolados.
Em determinadas modalidades, esses poli- peptídeos compreendem a sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 2 ou 4. Em outras modalidades, os polipeptídeos compreendem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 2 ou 4. Em algumas dessas modalidades, os polipeptídeos compreendem uma se- quência de aminoácidos com pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de iden- tidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 2 ou 4. Em ainda outras modalidades, os polipeptídeos com- preendem uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequên-
cia de pelo menos 70% em relação à sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 2 ou 4 e têm a capacidade de transportar a xilose para uma célula de levedura. Similarmente, em determinadas modalidades os polipeptídeos aqui providos compreendem uma sequência de aminoácidos 5 com uma identidade de sequência de pelo menos 70% em relação à se- quência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 2 e 4 e uma célula de levedura que superexpressa o polipeptídeo consome uma quantidade maior de glicose em relação à xilose do que uma célula idêntica que não superex- pressa o polipeptídeo. Em algumas dessas modalidades, os polipeptídeos compreendem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 90% de identidade de sequên- cia em relação à sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 2 ou
4. São aqui providos em determinadas modalidades os polipeptí- deos RPE, RKI, TKL e TAL de I. orientalis isolados. Em determinadas moda- lidades, esses polipeptídeos compreendem a sequência de aminoácidos in- dicada nas SEQ ID NOs: 34, 40, 46, ou 52, respectivamente. Em outras mo- dalidades, os polipeptídeos compreendem uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em relação à se- quência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 34, 40, 46, ou 52. Em algumas dessas modalidades, os polipeptídeos compreendem uma sequên- cia de aminoácidos com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 34, 40, 46 ou 52. As porcentagens da identidade de sequência para as sequên- cias de polinucleotídeos ou aminoácidos podem ser calculadas pelos méto- dos conhecidos no estado da técnica, tal como, por exemplo, ao usar o soft- ware BLAST (National Center for Biological Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool)versão 2.2.1 com parâmetros padrão. As sequências que têm uma contagem de identidade de pelo menos 90%, ao usar o algo- ritmo BLAST versão 2.2.1 com parâmetros de opção, são consideradas co-
mo dotadas de pelo menos 90% de identidade de sequência.
O software BLAST está disponível junto à NCBI, Bethesda, Maryland.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que compreendem um ou mais genes de 5 KHT105 e/ou RAG4. Em determinadas modalidades, esses genes compre- endem a sequência de nucleotídeos os polinucleotídeos KHT105 e/ou RAG4 aqui apresentados.
Similarmente, em determinadas modalidades os genes transportadores de xilose codificam um transportador de xilose que compre- ende a sequência de aminoácidos dos polipeptídeos KHT105 e/ou RAG4 aqui apresentados.
Em determinadas modalidades, as células geneticamen- te modificadas exibem um grau mais elevado de transporte de xilose do que as células do tipo selvagem correspondentes.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que têm pelo menos uma rota ativa de fermentação de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulo- se.
Uma célula de levedura que tem uma "rota ativa de fermentação de ara- binose" tal como aqui empregada produz as enzimas ativas necessárias pa- ra catalisar cada reação em uma rota da fermentação de arabinose e, por- tanto, tem a capacidade de converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose quando cultivada sob condições de fermentação na presença de arabinose.
Uma célula de levedura que tem uma rota ativa de fermentação de arabino- se compreende um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose.
Um "gene da rota de fermentação de arabinose" tal como aqui empregado refe- re-se à região de codificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima envolvida em uma rota ativa de fermentação de arabinose.
Em determinadas modalidades, as células de levedura aqui providas têm uma rota ativa de fermentação de arabinose que converte a arabinose em 5- fosfato de xilulose sem prosseguir através de um intermediário de arabitol, xilulose, xilitol ou xilulose.
Em algumas dessas modalidades, as células de levedura têm uma rota ativa de fermentação de arabinose que converte a arabinose em 5-fosfato de xilulose através de intermediários de ribulose e 5- fosfato de ribulose.
Nestas modalidades, as células de levedura compreen-
dem pelo menos uma cópia de cada uma dos genes da rota de fermentação de arabinose AI, RK e RE.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que têm pelo menos uma rota ativa de 5 fermentação de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulo- se e que também compreendem um ou mais genes transportadores de xilo- se.
Em determinadas modalidades, a rota ativa fermentação de arabinose converte a arabinose em 5-fosfato de xilulose através de intermediários de ribulose e 5-fosfato de ribulose, e nessas modalidades as células compreen- dem pelo menos uma cópia de cada um dos genes da rota da fermentação de arabinose AI, RK e RE.
Em determinadas modalidades, os genes trans- portadores de xilose compreendem a sequência de nucleotídeos de um ou mais polinucleotídeos KHT105 e/ou RAG4 aqui apresentados.
Similarmente, em determinadas modalidades os genes transportadores de xilose codificam um transportador de xilose que compreende a sequência de aminoácidos de um ou mais dos polipeptídeos KHT105 e/ou RAG4 aqui apresentados.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneti- camente modificadas aqui providas compreendem uma rota ativa de fermen- tação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose.
Uma célula de levedura que tem uma "rota ativa de fermentação de xilose" tal como aqui empregado produz as enzimas ativas necessárias para catalisar cada rea- ção em uma rota de fermentação de xilose e, portanto, tem a capacidade de converter a xilose em 5-fosfato de xilulose quando cultivada sob condições de fermentação na presença de xilose.
Uma célula de levedura que tem uma rota ativa de fermentação de xilose compreende um ou mais genes da rota de fermentação de xilose.
Um "gene da rota de fermentação de xilose" tal como aqui empregado refere-se à região de codificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima envolvida em uma rota ativa de fermentação de xilose.
Em determinadas modalidades, uma rota ativa de fermentação de xilose converte a xilose em 5-fosfato de xilulose através de intermediários de xilitol e xilulose.
Nessas modalidades, as células de leve- dura compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes da rota de fermentação de xilose XR, XDH e XK.
Em outras modalidades, uma rota ati- va de fermentação de xilose converte a xilose em 5-fosfato de xilulose atra- vés de apenas um intermediário de xilulose.
Nessas modalidades, as células de levedura compreendem pelo menos uma cópia de cada uma dos genes 5 da rota de fermentação de xilose (XI) e XK de isomerase de xilose.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que têm pelo menos uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose e que também compreendem um ou mais genes transportadores de xilose.
Em determinadas modalidades, a rota de fermentação de xilose converte a xilo- se em 5-fosfato de xilulose através de intermediários de xilitol e xilulose e em algumas dessas modalidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes XR, XDH e XK da rota de fermentação de xilo- se.
Em outras modalidades, a rota ativa de fermentação de xilose converte a xilose em 5-fosfato de xilulose através de apenas um intermediário de xilulo- se e em algumas dessas modalidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes XI e XK da rota de fermentação de xilose.
Em determinadas modalidades, os genes transportadores de xilose compre- endem a sequência de nucleotídeos de um ou mais polinucleotídeos de KHT105 e/ou RAG4 aqui apresentados.
Similarmente, em determinadas modalidades os genes transportadores de xilose codificam um transportador de xilose que compreende a sequência de aminoácidos de um ou mais dos polipeptídeos de KHT105 e/ou RAG4 daqui apresentados.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que têm pelo menos uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose e que também compreendem uma rota ativa de fermentação de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose.
Em determinadas modalida- des, a rota de fermentação de xilose converte a xilose em 5-fosfato de xilulo- se através de intermediários de xilitol e xilulose e em algumas dessas moda- lidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes XR, XDH e XK da rota de fermentação de xilose.
Em outras modali-
dades, a rota ativa de fermentação de xilose converte a xilose em 5-fosfato de xilulose através de um apenas intermediário de xilulose e em algumas dessas modalidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes XI e XK da rota de fermentação de xilose.
Em determi- 5 nadas modalidades, a rota ativa de fermentação de arabinose converte a arabinose em 5-fosfato de xilulose através de intermediários de ribulose e 5- fosfato de ribulose, e nessas modalidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes AI, RK e RE da rota de fermenta- ção de arabinose.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que têm pelo menos uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose e que também compreendem um ou mais genes transportadores de xilose e uma rota ativa de fermentação de arabinose para converter a arabinose em 5- fosfato de xilulose.
Em determinadas modalidades, a rota ativa de fermenta- ção de xilose converte a xilose em 5-fosfato de xilulose através de interme- diários de xilitol e xilulose e em algumas dessas modalidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes XR, XDH e XK da rota de fermentação de xilose.
Em outras modalidades, a rota ativa de fermentação de xilose converte a xilose em 5-fosfato de xilulose através de apenas um intermediário de xilulose, e em algumas dessas modalidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes XI e XK da rota de fermentação de xilose.
Em determinadas modalidades, os genes transportadores de xilose compreendem a sequência de nucleotídeos de um ou mais polinucleotídeos de KHT105 e/ou RAG4 aqui apresentados.
Simi- larmente, em determinadas modalidades os genes transportadores de xilose codificam um transportador de xilose que compreende a sequência de ami- noácidos de um ou mais dos polipeptídeos de KHT105 e/ou de RAG4 aqui apresentados.
Em determinadas modalidades, a rota ativa de fermentação de arabinose converte a arabinose em 5-fosfato de xilulose através de inter- mediários de ribulose e 5-fosfato de ribulose, e nessas modalidades as célu- las compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes AI, RK e
RE da rota de fermentação de arabinose.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneti- camente modificadas aqui providas compreendem uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante.
Uma célula de levedura que tem uma "rota ativa 5 de fosfato de pentose não oxidante" tal como aqui empregado produz as enzima ativas necessárias para converter o 5-fosfato de xilulose mais o 5- fosfato de ribose em F6P e G3P.
Uma célula de levedura que tem uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante compreende um ou mais genes não oxidantes da rota de fosfato de pentose.
Um "gene não oxidante da rota de fosfato de pentose" tal como aqui empregado refere-se à região de codifica- ção de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima envolvida em uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante.
Em determinadas modalidades, uma célula de levedura que tem uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante compreende pelo menos uma cópia de cada um dos genes não oxidantes TKL e TAL da rota do fosfato de pentose.
Em algumas dessas modalidades, a célula de levedura também compreende uma ou mais cópias dos genes RPE e RKI da rota ativa de fosfato de pentose não oxidante.
Em determinadas modalidades, uma célula de levedura que tem uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante compreende pelo menos uma cópia de um gene RPE, RKI, TKL e/ou TAL de I. orientalis, e em deter- minadas modalidades esses genes compreendem a sequência de DNA dos polinucleotídeos de RPE, RKI, TKL e/ou TAL aqui apresentados e/ou codifi- cam um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos dos po- lipeptídeos de RPE, RKI, TKL e/ou TAL aqui apresentados.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que têm pelo menos uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para converter o 5-fosfato de xilulose mais o 5-fosfato de ribose em F6P e G3P e que também compreendem uma rota ativa de fermentação de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose.
Em determinadas modalidades, as células compreendem pelo menos uma cópia dos genes não oxidantes TKL e TAL da rota de fosfato de pentose e em determinadas modalidades as células também compreendem pelo menos uma cópia dos genes não oxidantes RPE e RKI da rota de fosfa- to de pentose.
Em determinadas modalidades, os genes TKL, TAL, RPE e RKI compreendem a sequência de nucleotídeos de um ou mais dos polinu- cleotídeos de TKL, TAL, RPE e/ou RKI aqui apresentados.
Similarmente, em 5 determinadas modalidades os genes TKL, TAL, RPE e RKI codificam os po- lipeptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos de um ou mais dos polipeptídeos de TKL, TAL, RPE e/ou RKI aqui apresentados.
Em de- terminadas modalidades, a rota ativa de fermentação de arabinose converte a arabinose em 5-fosfato de xilulose através de intermediários de ribulose e 5-fosfato de ribulose, e nessas modalidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes AI, RK e RE da rota de fermenta- ção de arabinose.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que têm pelo menos uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para converter o 5-fosfato de xilulose mais o 5-fosfato de ribose em F6P e G3P e que também compreendem um ou mais genes transportadores de xilose e uma rota ativa de fermentação de arabi- nose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose.
Em determinadas modalidades, as células compreendem pelo menos uma cópia dos genes não oxidantes TKL e TAL da rota do fosfato de pentose e em determinadas modalidades as células também compreendem pelo menos uma cópia dos genes não oxidantes RPE e RKI da rota de fosfato de pentose.
Em determi- nadas modalidades, os genes TKL, TAL, RPE e RKI compreendem a se- quência de nucleotídeos de um ou mais dos polinucleotídeos de TKL, TAL, RPE e/ou RKI aqui apresentados.
Similarmente, em determinadas modali- dades os genes TKL, TAL, RPE e RKI codificam os polipeptídeos que com- preendem a sequência de aminoácidos de um ou mais dos polipeptídeos de TKL, TAL, RPE e/ou RKI aqui apresentados.
Em determinadas modalidades, os genes transportadores de xilose compreendem a sequência de nucleotí- deos de um ou mais dos polinucleotídeos de KHT105 e/ou RAG4 aqui apre- sentados.
Similarmente, em determinadas modalidades os genes transpor- tadores de xilose codificam um transportador de xilose que compreende a sequência de aminoácidos de um ou mais dos polipeptídeos de KHT105 e/ou RAG4 aqui apresentados.
Em determinadas modalidades, a rota ativa de fermentação de arabinose converte a arabonise em 5-fosfato de xilulose através de intermediários de ribulose e 5-fosfato de ribulose, e nessas moda- 5 lidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes AI, RK e RE da rota de fermentação de arabinose.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que têm pelo menos uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para converter o 5-fosfato de xilulose mais o 5-fosfato de ribose em F6P e G3P e que também compreendem um ou mais genes transportadores de xilose e uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose.
Em determinadas modalida- des, as células compreendem pelo menos uma cópia dos genes não oxidan- tes TKL e TAL da rota de fosfato de pentose e em determinadas modalida- des as células também compreendem pelo menos uma cópia dos genes não oxidantes RPE e RKI da rota de fosfato de pentose.
Em determinadas moda- lidades, os genes TKL, TAL, RPE e RKI compreendem a sequência de nu- cleotídeos de um ou mais dos polinucleotídeos de TKL, TAL, RPE, e/ou RKI aqui apresentados.
Similarmente, em determinadas modalidades os genes TKL, TAL, RPE e RKI codificam os polipeptídeos que compreendem a se- quência de aminoácidos de um ou mais dos polipeptídeos de TKL, TAL, RPE e/ou RKI aqui apresentados.
Em determinadas modalidades, a rota ativa de fermentação de xilose converte a xilose em 5-fosfato de xilulose através de intermediários de xilitol e xilulose e em algumas dessas modalidades as cé- lulas compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes XR, XDH e XK da rota de fermentação de xilose.
Em outras modalidades, a rota ativa de fermentação de xilose converte a xilose em 5-fosfato de xilulose através de apenas um intermediário de xilulose e em algumas dessas modalidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes XI e XK da rota de fermentação de xilose.
Em determinadas modalidades, os ge- nes transportadores de xilose compreendem a sequência de nucleotídeos de um ou mais dos polinucleotídeos de KHT105 e/ou RAG4 aqui apresentados.
Similarmente, em determinadas modalidades os genes transportadores de xilose codificam um transportador de xilose que compreende a sequência de aminoácidos de um ou mais dos polipeptídeos de KHT105 e/ou RAG4 aqui apresentados. 5 São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que têm pelo menos uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para converter o 5-fosfato de xilulose mais o 5-fosfato de ribose em F6P e G3P e que também compreendem uma rota ativa de fermentação de arabinose para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose e uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose.
Em determinadas modalidades, as células compre- endem pelo menos uma cópia dos genes não oxidantes TKL e TAL da rota de fosfato de pentose e em determinadas modalidades as células também compreendem pelo menos uma cópia dos genes não oxidantes RPE e RKI da rota de fosfato de pentose.
Em determinadas modalidades, os genes T- KL, TAL, RPE e RKI compreendem a sequência de nucleotídeos de um ou mais dos polinucleotídeos de TKL, TAL, RPE e/ou RKI aqui apresentados.
Similarmente, em determinadas modalidades os genes TKL, TAL, RPE e RKI codificam os polipeptídeos que compreendem a sequência de aminoáci- dos de um ou mais dos polipeptídeos de TKL, TAL, RPE e/ou RKI aqui apre- sentados.
Em determinadas modalidades, a rota ativa de fermentação de arabinose converte a arabinose em 5-fosfato de xilulose através de interme- diários de ribulose e 5-fosfato de ribulose, e nessas modalidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes AI, RK e RE da rota de fermentação de arabinose.
Em determinadas modalidades, a rota ativa de fermentação de xilose converte a xilose em 5-fosfato de xilulose a- través de intermediários de xilitol e xilulose e em algumas dessas modalida- des as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes XR, XDH e XK da rota de fermentação de xilose.
Em outras modalidades, a rota ativa de fermentação de xilose converte a xilose em 5-fosfato de xilulose através de apenas um intermediário de xilulose e em algumas dessas moda- lidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes XI e XK da rota de fermentação de xilose.
São aqui providas em determinadas modalidades células de le- vedura geneticamente modificadas que têm pelo menos uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante para converter o 5-fosfato de xilulose mais o 5 5-fosfato de ribose em F6P e G3P e que também compreendem um ou mais genes transportadores de xilose, uma rota ativa de fermentação de arabino- se para converter a arabinose em 5-fosfato de xilulose e uma rota ativa de fermentação de xilose para converter a xilose em 5-fosfato de xilulose.
Em determinadas modalidades, as células compreendem pelo menos uma cópia dos genes não oxidantes TKL e TAL da rota de fosfato de pentose e em de- terminadas modalidades as células também compreendem pelo menos uma cópia dos genes não oxidantes RPE e RKI da rota de fosfato de pentose.
Em determinadas modalidades, os genes TKL, TAL, RPE e RKI compreendem a sequência de nucleotídeos de um ou mais dos polinucleotídeos de TKL, TAL, RPE e/ou RKI aqui apresentados.
Similarmente, em determinadas mo- dalidades os genes TKL, TAL, RPE e RKI codificam os polipeptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos de um ou mais dos polipeptí- deos de TKL, TAL, RPE e/ou RKI aqui apresentados.
Em determinadas mo- dalidades, os genes transportadores de xilose compreendem a sequência de nucleotídeos de um ou de mais dos polinucleotídeos de KHT105 e/ou RAG4 aqui apresentados.
Similarmente, em determinadas modalidades os genes transportadores de xilose codificam um transportador de xilose que compre- ende a sequência de aminoácidos de um ou mais polipeptídeos de KHT105 e/ou RAG4 aqui apresentados.
Em determinadas modalidades, a rota ativa de fermentação de arabinose converte a arabinose em 5-fosfato de xilulose através de intermediários de ribulose e 5-fosfato de ribulose, e nessas moda- lidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes AI, RK e RE da rota de fermentação de arabinose.
Em determinadas modalidades, a rota ativa de fermentação de xilose converte a xilose em 5- fosfato de xilulose através de intermediários de xilitol e xilulose e em algu- mas dessas modalidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes XR, XDH e XK da rota de fermentação de xilose.
Em outras modalidades, a rota ativa de fermentação de xilose converte a xilose em 5-fosfato de xilulose através de apenas um intermediário de xilulose e em algumas dessas modalidades as células compreendem pelo menos uma cópia de cada um dos genes XI e XK da rota de fermentação de xilose. 5 A rota de fermentação de arabinose, o transportador de xilose, a rota de fermentação de xilose e os genes não oxidantes da rota de fosfato de pentose nas células de levedura geneticamente modificadas aqui provi- das podem ser endógenos ou exógenos. "Endógenos" tal como aqui empre- gado no que diz respeito a componentes genéticos tais como genes, promo- tores e sequências de terminadores significa que o componente genético está presente em uma localização particular no genoma de uma forma nativa de uma célula de levedura particular. "Exógeno" tal como aqui empregado no que diz respeito a componentes genéticos significa que o componente genético não está presente em uma localização particular no genoma de uma forma nativa de uma célula de levedura particular. "Nativa" tal como aqui empregado no que diz respeito a uma célula de levedura refere-se a uma célula de levedura do tipo selvagem de uma espécie particular de leve- dura. "Nativa" tal como aqui empregado no que diz respeito a uma rota me- tabólica refere-se a uma rota metabólica que existe e é ativa em uma célula de levedura nativa.
Um componente genético exógeno pode ter uma sequência nati- va ou não nativa.
Um componente genético exógeno com uma sequência nativa compreende uma sequência idêntica (além das mutações de indivíduo a indivíduo que não afetam a função) a um componente genético que está presente no genoma de uma célula nativa (isto é, o componente genético exógeno é idêntico a um componente genético endógeno). No entanto, o componente exógeno está presente em uma localização diferente no geno- ma da célula hospedeira em relação àquela do componente endógeno.
Por exemplo, um gene XI exógeno que é idêntico a um gene XI endógeno pode ser introduzido em uma célula de levedura, resultando em uma célula modi- ficada com um número (aumentado) não nativo de cópias do gene XI.
Um componente genético exógeno com uma sequência não nativa compreende uma sequência que não é encontrada no genoma de uma célula nativa.
Por exemplo, um gene XI exógeno de uma espécie particular pode ser introduzi- do em uma célula de levedura de uma outra espécie.
Um gene exógeno é integrado de preferência no genoma da célula hospedeira de uma maneira 5 funcional, o que significa que tem a capacidade de produzir uma proteína ativa na célula hospedeira.
No entanto, em determinadas modalidades o ge- ne exógeno pode ser introduzido na célula como parte de um vetor que é mantido estàvel no citoplasma do hospedeiro.
Em determinadas modalidades, as células de levedura aqui pro- vidas compreendem um ou mais genes exógenos da rota de fermentação de arabinose, transportador de xilose, rota de fermentação de xilose, ou da rota de fosfato de pentose não oxidantes.
Em determinadas modalidades, as cé- lulas de levedura geneticamente modificadas aqui apresentadas compreen- dem um único gene exógeno.
Em outras modalidades, as células de levedu- ra compreendem múltiplos genes exógenos.
Nessas modalidades, as células de levedura podem compreender múltiplas cópias de um único gene exóge- no e/ou cópias de dois ou mais genes exógenos diferentes.
As células de levedura que compreendem múltiplos genes exógenos podem compreender qualquer número de genes exógenos.
Por exemplo, essas células de levedu- ra podem compreender de 1 a 20 genes exógenos e em determinadas mo- dalidades preferidas podem compreender de 1 a 7 genes exógenos.
Múlti- plas cópias de um gene exógeno podem ser integradas em um único locus de maneira tal que ficam adjacentes umas às outras.
Alternativamente, elas podem ser integradas em vários loci dentro do genoma da célula hospedeira.
Uma célula de levedura tal como aqui provida pode compreender somente um tipo de gene exógeno ou genes exógenos de apenas uma rota.
Por e- xemplo, os genes exógenos em uma célula de levedura podem ser limitados aos genes da rota de fermentação de arabinose ou aos genes transportado- res de xilose.
Alternativamente, uma célula de levedura pode compreender genes exógenos de duas ou mais rotas ou de uma ou mais rotas em combi- nação com um gene transportador de xilose exógeno.
Por exemplo, uma célula de levedura pode compreender um ou mais genes exógenos da rota de fermentação de arabinose e um ou mais genes transportadores de xilose exógenos.
Em determinadas modalidades, as células de levedura aqui pro- vidas compreendem um ou mais genes endógenos da rota de fermentação 5 de arabinose, transportador de xilose, rota de fermentação de xilose e rota de fosfato de pentose não oxidantes.
Em algumas dessas modalidades, as células podem ser projetadas geneticamente para superexpressar um ou mais desses genes endógenos, o que significa que as células modificadas expressam o gene endógeno em um nível mais elevado do que uma célula nativa sob pelo menos algumas condições.
Em algumas dessas modalida- des, o gene endógeno que é superexpresso pode ser operativamente ligado a um ou mais elementos reguladores exógenos.
Por exemplo, um ou mais promotores fortes exógenos nativos ou não nativo podem ser introduzidos em uma célula de uma maneira tal que é ligado operativamente a um ou mais genes endógenos.
Os genes da rota de fermentação de arabinose, transportador de xilose, rota de fermentação de xilose e/ou da rota de fosfato de pentose não oxidantes nas células de levedura geneticamente modificadas aqui providas podem ser operativamente ligados a um ou mais elementos reguladores tais como um promotor ou um terminador.
Tal como aqui empregado, o termo "promotor" refere-se a uma sequência não traduzida localizada a montante (isto é, 5') em relação ao códon do começo da tradução de um gene (de mo- do geral dentro de cerca de 1 a 1.000 pares base (bp), de preferência dentro de cerca de 1 a 500 bp) que controla o início da transcrição do gene.
O ter- mo "terminador" tal como aqui empregado refere-se à sequência não tradu- zida localizada a jusante (isto é, 3') em relação ao códon do final da tradução de um gene (de modo geral dentro de cerca de 1 a 1.000 bp, de preferência dentro de cerca de 1 a 500 bp e especialmente dentro de cerca de 1 a 100 bp) que controla o final da transcrição do gene.
Um promotor ou um termina- dor é "ligado operativamente" a um gene se a sua posição no genoma em relação àquela do gene for tal que o promotor ou o terminandor, conforme as circunstâncias, executa a sua função de controle transcricional.
Os promoto-
res e os terminadores apropriados são descritos, por exemplo, nos documentos de patente WO99/14335, WO00/71738, WO02/42471, WO03/102201, WO03/102152 e WO03/049525 (todos aqui incorporados a título de referên- cia em sua totalidade). 5 Os elementos reguladores ligados a genes da rota de fermenta- ção de arabinose, transportador de xilose, rota de fermentação de xilose, ou rota de fosfato de pentose não oxidantes nas células de levedura aqui provi- das podem ser endógenos ou exógenos. Por exemplo, um gene da rota de fermentação de arabinose ou um gene transportador de xilose exógeno pode ser introduzido em uma célula de levedura de maneira tal que fica sob o con- trole transcricional de um promotor e/ou um terminador endógeno. Alternati- vamente, o gene da rota de fermentação de arabinose ou transportador de xilose exógeno pode ser ligado a um ou mais elementos reguladores exóge- nos. Por exemplo, um gene exógeno pode ser introduzido na célula como parte de um construto de expressão de gene que compreende um ou mais elementos reguladores exógenos. Em determinadas modalidades, os ele- mentos reguladores exógenos, ou pelo menos as partes funcionais de ele- mentos reguladores exógenos, podem compreender sequências nativas. Em outras modalidades, os elementos reguladores exógenos podem compreen- der sequências não nativas. Nessas modalidades, os elementos reguladores exógenos podem compreender uma sequência com um grau relativamente elevado de identidade de sequência em relação a um elemento regulador nativo. Por exemplo, um gene exógeno pode ser ligado a um promotor ou um terminador exógeno que tem uma identidade de sequência de pelo me- nos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo me- nos 90% em relação a um promotor ou um terminador nativo. As porcenta- gens de identidade de sequência para as sequências de nucleotídeos ou aminoácidos podem ser calculadas pelos métodos conhecidos no estado da técnica, tal como, por exemplo, ao usar o software BLAST (National Center for Biological Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool) versão
2.2.1 com parâmetros padrão. Por exemplo, uma sequência que tem uma contagem de identidade de pelo menos 90% ao usar o algoritmo de BLAST versão 2.2.1 com parâmetros padrão é considerada como dotada de pelo menos 90% de identidade de sequência.
O software BLAST está disponível junto à NCBI, Betesda, Maryland.
Nessas modalidades em que múltiplos genes exógenos são introduzidos em uma célula hospedeira, cada gene e- 5 xógeno pode estar sob o controle de um elemento regulador diferente, ou dois ou mais genes exógenos podem estar sob o controle dos mesmos ele- mentos reguladores.
Por exemplo, onde um primeiro gene exógeno é ligado a um primeiro elemento regulador, um segundo gene exógeno também pode ser ligado ao primeiro elemento regulador, ou pode ser ligado a um segundo elemento regulador.
O primeiro e o segundo elementos reguladores podem ser idênticos ou compartilhar de um grau elevado de identidade de sequên- cia, ou podem ser completamente não relacionados entre si.
Os exemplos dos promotores que podem ser ligados a um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose, transportador de xilose, rota de fermentação de xilose, ou da rota de fosfato de pentose não oxidan- tes nas células de levedura aqui providas incluem, mas sem ficar a eles limi- tados, promotores para os genes de piruvato de descarboxilase 1 (PDC1), enolase 1 (ENO1), fator 1 ou 2 de alongamento de tradução (TEF1, TEF2), quinase de fosfoglicerato (PGK), XR, XDH, L-(+)-lactato-citocrome c oxido- redutase (CIB2), gliceraldeído-3-fosfato de desidrogenase 3 (GAPDH/TDH3) e orotidine 5'-fosfato de descarboxilase (URA3). Nesses exemplos, os genes podem ser ligados a promotores endógenos ou exógenos para os genes PDC1, PGK, XR, XDH, CIB2, TEF1, TEF2, ENO1, TDH3 ou URA3. Onde os promotores são exógenos, eles podem ser idênticos a ou compartilhar de um grau elevado de identidade de sequência (isto é, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99%) com os promotores nativos para os ge- nes PDC1, ENO1, TEF1, TEF2, PGK, XR, XDH, CIB2, TDH3 ou URA3. Os exemplos dos terminadores que podem ser ligados a um ou mais genes da rota de fermentação de arabinose, transportador de xilose, rota de fermentação de xilose, ou da rota de fosfato de pentose não oxidan- tes nas células de levedura aqui providas incluem, mas sem ficar a eles limi-
tados, terminadores para os genes PDC1, XR, XDH, TAL, TKL, RKI, CIB2 ou genes iso-2-citocrome c (CIC) ou a família de galactose dos genes (especi- almente o terminador GAL10). Nesses exemplos, os genes podem ser liga- dos a terminais endógenos ou exógenos para os genes PDC1, XR, XDH, 5 TAL, TKL, RKI, CIB2 ou CIC ou genes da família da galactose.
Onde os ter- minais são exógenos, eles podem ser idênticos a ou compartilhar de um grau elevado de identidade de sequência (isto é, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99%) com os terminais nativos para os genes PDC1, XR, XDH, TAL, TKL, RKI, CIB2 ou CIC ou genes da família da galac- tose.
Em determinadas modalidades, os genes são ligados a um terminador que compreende uma parte funcional de um gene GAL10 nativo que é nativo para a célula hospedeira ou uma sequência que compartilha uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% com um terminador GAL10 nativo.
Os genes exógenos podem ser introduzidos em uma célula de levedura hospedeira através de qualquer método conhecido no estado da técnica.
Nas modalidades preferidas, os genes são integrados no genoma da célula hospedeira.
Os genes exógenos podem ser integrados no genoma de uma maneira visada ou aleatória.
Nas modalidades em que o gene é in- tegrado de uma maneira visada, ele pode ser integrado nos loci para um ge- ne particular, de maneira tal que a integração do gene exógeno é acoplada à supressão ou aa decomposição de um gene nativo.
Por exemplo, a introdu- ção de um gene exógeno da rota de fermentação de arabinose, transporta- dor de xilose, da rota de fermentação de xilose, ou da rota de fosfato de pen- tose não oxidante pode ser acoplada à supressão ou aa decomposição de um ou mais genes que codificam as enzimas envolvidas em outras rotas do produto de fermentação.
Alternativamente, o gene exógeno pode ser inte- grado em uma parte do genoma que não corresponde a um gene.
A integração e/ou a supressão visadas podem utilizar um cons- truto de integração.
O termo "construto" tal como aqui usado refere-se a uma sequência de DNA que é usada para transformar uma célula.
O construto pode ser, por exemplo, um plasmídio ou um vetor circular, uma parte de um plasmídio ou um vetor circular (tal como um produto da digestão de enzima de restrição), um plasmídio ou um vetor linearizado, ou um produto de PCR preparado ao usar um plasmídio ou um DNA genômico como um molde.
Os 5 métodos para transformar uma célula de levedura com uma construto exó- geno são descritos, por exemplo, nos documentos de patente WO99/14335, WO00/71738, WO02/42471, WO03/102201, WO03/102152 e WO03/049525. Um construto de integração pode ser montado ao usar duas sequências de DNA alvo clonado de um sítio de inserção alvo.
As duas sequências de DNA alvo podem ser contíguas ou não contíguas no genoma hospedeiro nativo.
Neste contexto, "não contíguas" significa que as sequências de DNA não são imediatamente adjacentes uma à outra no genoma nativo, mas ao invés disso são separadas de preferência por uma região que deve ser suprimida.
As sequências "contíguas" tal como aqui empregado são diretamente adja- centes uma à outra no genoma nativo.
Onde a integração visada tem que ser acoplada à supressão ou aa decomposição de um gene alvo, o construto de integração também pode ser indicado como um construto de supressão.
Em um construto de supressão, uma das sequências alvo pode incluir uma região 5' para o promotor do gene alvo, toda ou uma parte da região do promotor, toda ou uma parte da sequência de codificação do gene alvo, ou qualquer combinação destes.
A outra sequência alvo pode incluir uma região 3' para o terminador do gene alvo, toda ou uma parte da região do termina- dor, e/ou toda ou uma parte de sequência de codificação do gene alvo.
Onde a integração visada não deve ser acoplada à supressão ou aa decomposi- ção de um gene nativo, as sequências alvo são selecionadas de maneira tal que a inserção de uma sequência de intervenção não rompe a expressão nativa do gene.
Um construto de integração ou de supressão é preparado de maneira tal que as duas sequências alvo são orientadas na mesma direção com relação uma à outra tal como aparecem de modo nativo no genoma da célula hospedeira.
Onde um construto de integração ou de supressão é usa- do para introduzir um gene exógeno em uma célula hospedeira, um cassete de expressão do gene é clonado no construto entre as duas sequências do gene alvo para permitir a expressão do gene exógeno.
O cassete de expres- são do gene contém o gene exógeno e também pode incluir uma ou mais sequências reguladoras tais como promotores ou terminadores ligados ope- rativamente ao gene exógeno.
Também podem ser construídos construtos 5 de supressão que não contêm um cassete de expressão de gene.
Tais cons- trutos são destinados a suprimir ou romper uma sequência de genes sem a inserção de um gene exógeno.
Um construto de integração ou de supressão pode compreender um ou mais cassetes marcadores de seleção clonados no construto entre as duas sequências de genes alvo.
O cassete marcador de seleção contém pelo menos um gene marcador de seleção que permite a seleção dos trans- formantes.
Os transformantes bem sucedidos irão conter o gene marcador de seleção, que propicia célula transformada com sucesso pelo menos uma característica que provê uma base para a seleção.
Os genes marcadores de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióti- cos ou a outras toxinas (por exemplo, resistência à bleomicina ou à zeomici- na (por exemplo, gene ble de Streptoalloteichus hindustanus), a aminoglico- sídeos tais como G418 ou à canamicina (por exemplo, gene de resistência à canamicina de transposon Tn903), ou à higromicina (por exemplo, gene de resistência a antibiótico de aminoglicosídeo de E. coli)), (b) deficiências au- xotróficas de complemento de célula (por exemplo, deficiências em leucina (por exemplo, gene LEU2 de K. marxianus), uracil (por exemplo, gene URA- 3 de K. marxianus, S. cerevisiae, ou I. orientalis), ou triptofano (por exemplo, gene TRP de K. marxianus, S. cerevisiae, ou I. orientalis)), (c) permitem que a célula sintetize os nutrientes críticos não disponíveis nos meios simples, ou (d) conferem a capacidade para que a célula cresça em uma fonte de carbo- no particular (por exemplo, o gene MEL5 de S. cerevisiae, que codifica a enzima alfa-galactosidase (melibiose) e confere a capacidade de crescer em melibiose como a única fonte de carbono). Os marcadores de seleção prefe- ridos incluem o gene URA3, o gene de resistência à zeocina, o gene de re- sistência a G418, o gene MEL5 e o gene de resistência à higromicina.
Um outro marcador de seleção preferido é um cassete do gene CIB2, contanto que a célula hospedeira não contenha de modo nativo tal gene ou que o(s) seu(s) gene(s) CIB2 nativo(s) é(são) primeiramente suprimido(s) ou decom- posto(s). Um gene marcador de seleção é ligado operativamente a uma ou mais sequências de promotor e/ou de terminador que são operáveis na célu- 5 la hospedeira.
Em determinadas modalidades, essas sequências de promo- tor e/ou de terminador são as sequências de promotor e/ou de terminador exógenas que são incluídas no cassete marcador de seleção.
Os promoto- res e os terminadores apropriados são tal como descrito acima.
Em outras modalidades, um construto de integração ou de su- pressão pode não conter um cassete marcador de seleção, mas pode no entanto permitir a seleção dos transformantes com base na superexpressão de um gene exógeno (no caso de construtos de inserção) ou a supressão de um gene endogeno (no caso de construtos de supressão). Por exemplo, on- de um construto de integração compreende um ou mais gene exógenos da rota de fermentação de arabinose, os transformantes podem ser seleciona- dos com base em sua capacidade de crescer em arabinose.
Um construto de integração ou de supressão é usado para trans- formar a célula hospedeira.
A transformação pode ser realizada ao usar, por exemplo, métodos de eletroporação e/ou de transformação química (por e- xemplo, baseada em cloreto de cálcio, acetato de lítio, etc.). A seleção ou a escolha baseada na presença ou na ausência do marcador de seleção po- dem ser executadas para identificar transformantes bem sucedidos.
Em transformantes bem sucedidos, um evento de recombinação homóloga no locus do sítio alvo resulta na decomposição ou na supressão da sequência do sítio alvo.
Onde o construto visa um gene nativo para a supressão ou a decomposição, todo o ou uma parcela gene nativo alvo, seu promotor e/ou seu terminador podem ser suprimidos durante esse evento de recombina- ção.
O cassete de expressão, o cassete marcador de seleção e qualquer outro material genético entre as sequências alvo no construto de integração são introduzidos no genoma hospedeiro no locus que corresponde às se- quências alvo.
A análise por meio de PCR ou a análise Southern podem ser executadas para confirmar que ocorreu a inserção/supressão desejada.
Em algumas modalidades, a transformação da célula pode ser efetuada ao usar o DNA de dois ou mais construtos, produtos de PCR, ou uma combinação dos mesmos, ao invés de um único construto ou produto de PCR.
Nessas modalidades, a extremidade 3' de um fragmento de inte- 5 gração se sobrepõe com a extremidade 5' de um outro fragmento de inte- gração.
Em um exemplo, um construto irá conter a primeira sequência do locus da sequência alvo e uma parte não funcional do cassete do gene mar- cador, ao passo que o outro irá conter a segunda sequência do locus da se- quência alvo e uma segunda peça não funcional do cassete do gene marca- dor.
As partes do cassete do gene marcador são selecionadas de maneira tal que podem ser combinadas para formar um cassete completo.
A célula é transformada com essas partes simultaneamente, resultando na formação de um marcador completo, funcional ou de um cassete de gene estrutural.
Os transformantes bem sucedidos podem ser selecionados com base na característica conferida pelo marcador de seleção.
Em um outro exemplo, o marcador de seleção reside em um fragmento mas as sequências alvo estão em fragmentos separados, de modo que os fragmentos de integração têm uma grande probcapacidade de integrar no sítio de interesse.
Em outras modalidades, a transformação de três DNAs lineares pode ser usada para integrar o material genético exógeno.
Nessas modalidades, um fragmento se sobrepõe na extremidade 5' com um segundo fragmento e na extremidade 3' com um terceiro fragmento.
Um construto de integração ou de supressão pode ser projetado de maneira tal que o gene marcador de seleção e alguns ou todos os seus elementos reguladores podem se tornar suprimidos espontaneamente em consequência de um evento de recombinação homólogo subsequente.
Uma maneira conveniente de realizar isto consiste em projetar o construto de ma- neira tal que o gene marcador de seleção e/ou os elementos reguladores sejam flanqueados por sequências de repetição.
As sequências de repetição são sequências de DNA idênticas, nativa ou não nativas à célula hospedeira e orientadas no construto na mesma direção umas com respeito às outras.
As sequências de repetição são vantajosamente de cerca de 25 a 1.500 bp de comprimento e não têm que codificar para coisa alguma.
A inclusão das sequências de repetição permite que ocorra um evento de recombinação homóloga, o que resulta na supressão do gene marcador de seleção e de uma das sequências de repetição.
Uma vez que a recombinação homóloga 5 ocorre com uma frequência relativamente baixa, pode ser necessário cultivar transformantes para diversos círculos em meios não seletivos para permitir que a recombinação homóloga espontânea ocorra em algumas das células.
As células em que o gene marcador de seleção ficou suprimido espontane- amente podem ser selecionadas ou escolhidas com base na sua perda de característica de seleção conferida pelo gene marcador de seleção.
Em de- terminados casos, a expressão de uma enzima recombinase pode realçar a recombinação entre os sítios repetidos.
Um gene exógeno da rota de fermentação de arabinose, trans- portador de xilose, da rota de fermentação de xilose, ou da rota de fosfato de pentose não oxidante nas células de levedura modificadas aqui providas po- de ser derivado de um gene de origem de qualquer organismo de origem apropriado.
Por exemplo, um gene exógeno pode ser derivado de uma fonte de levedura, fúngica, bacteriana, de planta, de inseto, ou de mamífero.
Tal como aqui empregado, um gene exógeno que é "derivado" de um gene de origem nativo codifica um polipeptídeo que 1) é idêntico a um polipeptídeo codificado pelo gene nativo, 2) compartilha da identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% com um polipeptídeo codificado pelo gene nativo, e/ou 3) tem a mesma função em uma rota de fermentação de arabinose, uma rota de fer- mentação de xilose, ou na rota de fosfato de pentose não oxidante ou no transporte de xilose como polipeptídeo codificado pelo gene nativo.
Por e- xemplo, um gene transportador de xilose que seja derivado de um gene KHT105 de K. marxianus pode codificar um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, um polipeptídeo com uma i- dentidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos
95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 2, e/ou um polipeptídeo que tem a capacidade de transportar xilose para uma célula de levedura.
Um gene derivado de um gene nativo pode compreender uma sequência de nucleotídeos com uma 5 identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à região de codifica- ção do gene nativo.
Em determinadas modalidades, um gene derivado de um gene nativo pode compreender uma sequência de nucleotídeos que é idêntica à região de codificação do gene de origem.
Por exemplo, um gene transportador de xilose que é derivado de um gene KHT105 de K. marxianus pode compreender a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1. Em determinadas modalidades das células de levedura modifi- cadas aqui providas, um gene exógeno da rota de fermentação de arabino- se, transportador de xilose, da rota de fermentação de xilose, ou da rota de fosfato de pentose não oxidante pode ser derivado da espécie de levedura hospedeira.
Por exemplo, onde a célula hospedeira é de I. orientalis, um ge- ne exógeno pode ser derivado de um gene de I. orientalis.
Nessas modali- dades, o gene exógeno pode compreender uma sequência de nucleotídeos idêntica à região de codificação do gene nativo, de maneira tal que a incor- poração do gene exógeno na célula hospedeira aumenta o número de có- pias de uma sequência nativa do gene e/ou muda o nível de regulação ou da expressão do gene se estiver sob o controle de um promotor que é diferente do promotor que dirige a expressão do gene em uma célula do tipo selva- gem.
Em outras modalidades, o gene exógeno pode compreender uma se- quência de nucleotídeos que difira da região de codificação de um gene na- tivo, mas no entanto codifica um polipeptídeo que é idêntico ao polipeptídeo codificado pelo gene nativo.
Em ainda outras modalidades, o gene exógeno pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipep- tídeo com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação a 5 um polipeptídeo codificado por um ou mais genes nativos.
Em algumas des- sas modalidades, o gene exógeno compreende uma sequência de nucleotí- deos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à região de codificação de um ou mais genes nativo.
Em ainda outras modali- dades, o gene exógeno da rota de fermentação de arabinose, transportador de xilose, da rota de fermentação de xilose, ou da rota de fosfato de pentose não oxidante pode codificar um polipeptídeo que tem uma identidade de se- quência de menos de 50% para um polipeptídeo codificado por um gene na- tivo da rota de fermentação de arabinose, transportador de xilose, da rota de fermentação de xilose, ou da rota de fosfato de pentose não oxidante mas que no entanto tem a mesma função que o polipeptídeo nativo em uma rota de fermentação de arabinose, de fermentação de xilose, ou de fosfato de pentose não oxidante (isto é, a capacidade de catalisar a mesma reação en- tre intermediários da reação) ou transporte de xilose (isto é, a capacidade de transportar xilose para uma célula). Em outras modalidades, um gene exógeno da rota de fermenta- ção de arabinose, transportador de xilose, da rota de fermentação de xilose, ou da rota de fosfato de pentose não oxidante pode ser derivado de uma espécie que é diferente daquela da célula de levedura hospedeira.
Em al- gumas dessas modalidades, o gene exógeno pode ser derivado de uma es- pécie de levedura diferente do que aquela da célula hospedeira.
Por exem- plo, onde a célula hospedeira é de I. orientalis, o gene exógeno pode ser derivado de S. cerevisiae.
Em outras modalidades, o gene exógeno pode ser derivado de uma fonte fúngica, bacteriana, de planta, de inseto, ou de mamí- fero.
Por exemplo, onde a célula hospedeira é de I. orientalis, o gene exóge- no pode ser derivado de uma fonte bacteriana tal como E. coli.
Nas modali-
dades em que o gene exógeno é derivado de uma fonte que não de levedu- ra, a sequência de genes exógenos pode ser otimizado por códon para a expressão em uma célula de levedura hospedeira.
Nas modalidades em que o gene exógeno da rota de fermenta- 5 ção de arabinose, transportador de xilose, da rota de fermentação de xilose, ou da rota de fosfato de pentose não oxidante é derivado de uma espécie que não a espécie da célula hospedeira, o gene exógeno pode codificar um polipeptídeo idêntico a um polipeptídeo codificado por um gene nativo do organismo de origem.
Em algumas dessas modalidades, o gene exógeno pode ser idêntico a um gene nativo do organismo de origem.
Em outras mo- dalidades, o gene exógeno pode compartilhar da identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à região de codificação de um gene nativo do orga- nismo de origem.
Em outras modalidades, o gene exógeno pode codificar um polipeptídeo que compartilha da identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% com um polipeptídeo codificado por um gene nativo do organismo de origem.
Em algumas dessas modalidades, o gene exógeno pode compreen- der uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à região de codificação de um ou mais genes nati- vos do organismo de origem.
Em ainda outras modalidades, o gene exógeno pode codificar um polipeptídeo que tem a identidade de sequência de menos de 50% para um polipeptídeo codificado por um gene nativo do organismo de origem, mas que no entanto tem a mesma função que o polipeptídeo na- tivo do organismo de origem em uma rota de fermentação de arabinose nati- va, uma rota de fermentação de xilose, ou na rota de fosfato de pentose não oxidante ou no transporte de xilose.
Um gene exógeno de origem pode ser sujeitado à mutagênese se for necessário prover uma sequência de codifica-
ção que começa com o códon de partida eucariótico usual (ATG), ou para outras finalidades.
Um " gene de isomerase de arabinose", "gene de AI" ou "gene de araA" tal como aqui empregado refere-se a qualquer gene que codifica 5 um polipeptídeo com atividade de isomerase de arabinose, o que significa a capacidade de catalisar a conversão de arabinose em ribulose.
Em determi- nadas modalidades, um gene de AI pode ser derivado de uma fonte bacteri- ana.
Por exemplo, um gene de AI pode ser derivado de um gene araA1 de B. thetaiotaomicron que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 6, um gene araA2 de B. thetaiotaomicron que codifica a se- quência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 8, um gene AI de L. sakei que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 10, um gene Al de L. plantarum que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 81, ou um gene AI de B. licheniformis que codifica a sequên- cia de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 83. Em outras modalidades, o gene pode codificar uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 81, ou 83. Em determinadas modalidades, um gene A1 derivado de B. thetaiotaomicron, L. sakei, L. plantarum ou B. licheniformis pode compreender a sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 80, ou 82, ou uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de nucleotídeos indi- cada nas SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 80, ou 82. Um "gene de ribuloquinase", "gene de RK" ou "gene de araB" tal como aqui empregado refere-se a qualquer gene que codifica um polipeptí- deo com atividade de ribuloquinase, o que significa a capacidade de catali- sar a conversão de ribulose em 5-fosfato de ribulose.
Em determinadas mo- dalidades, um gene de RK pode ser derivado de uma fonte bacteriana.
Por exemplo, um gene de RK pode ser derivado de um gene RK de B. thetaiota- omicron que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 12 ou um gene RK de Leuconostoc citreum que codifica a sequência de a- minoácidos indicada na SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, o gene 5 pode codificar uma sequência de aminoácidos com uma identidade de se- quência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 12 ou 14. Em determinadas modalidades, um gene RK derivado de B. thetaiotaomicron ou de L. citreum pode compreender a sequência de nu- cleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 11, 86, ou 13, ou uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% à sequên- cia de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 11, 86, ou 13. Um "gene de ribulose-fosfato de 4-epimerase", "gene de RE" ou "gene de araD" tal como aqui empregado refere-se a qualquer gene que co- difica um polipeptídeo com atividade de ribulose-fosfato de 4-epimerase, o que significa a capacidade de catalisar a conversão de 5-fosfato de ribulose em 5-fosfato de xilulose.
Em determinadas modalidades, um gene RE pode ser derivado de uma fonte bacteriana.
Por exemplo, um gene RE pode ser derivado de um gene RE de B. thetaiotaomicron que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 16, em um gene RE de B. animalis que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 18, em um gene RE de L. lactis que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 20, em um gene RE de E. coli que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 77, ou em um gene RE de L. planta- rum que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 79. Em outras modalidades, o gene pode codificar uma sequência de aminoáci- dos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 16, 18, 20, 77, ou 79. Em de- terminadas modalidades, um gene RE derivado de B. thetaiotaomicron, B. animalis, L. lactis, E. coli, ou L. plantarum pode compreender a sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 15, 17, 19, 76, ou 78, ou uma se- 5 quência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 15, 17, 19, 76, ou 78. Um "gene de isomerase de xilose" ou "um gene XI" tal como a- qui empregado refere-se a qualquer gene que codifica um polipeptídeo com atividade de isomerase de xilose, o que significa a capacidade de catalisar a conversão de xilose em xilulose.
Em determinadas modalidades, um gene XI pode ser derivado de uma fonte bacteriana.
Por exemplo, um gene XI pode ser derivado de um gene XI de B. thetaiotaomicron que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 22. Em outras modalidades, o gene pode codificar uma sequência de aminoácidos com uma identidade de se- quência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em determinadas modalidades, um gene XI derivado de B. the- taiotaomicron pode compreender a sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 21, ou uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de nucleotídeos indi- cada na SEQ ID NO: 21. Um "gene de xiluloquinase" ou "gene XK" tal como aqui empre- gado refere-se a qualquer gene que codifica um polipeptídeo com atividade de xiluloquinase, o que significa a capacidade de catalisar a conversão de xilulose em 5-fosfato de xilulose.
Em determinadas modalidades, um gene XK pode ser derivado de uma fonte de levedura.
Por exemplo, o gene XK pode ser derivado de um gene XK de I. orientalis que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 24, de um gene XK de S. cerevisi- ae que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 26, ou de um gene XK de K. marxianus que codifica a sequência de aminoácidos 5 indicada na SEQ ID NO: 28. Em outras modalidades, o gene pode codificar uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo me- nos 99% em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 24, 26, ou 28. Em determinadas modalidades, o gene XK derivado de I. orientalis, S. cerevisiae ou K. marxianus pode compreender a sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 23, 25, ou 27 ou uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 23, 25, ou 27. Um "gene de redutase de xilose" ou "gene XR" tal como aqui empregado refere-se a qualquer gene que codifica um polipeptídeo com ati- vidade de redutase de xilose, o que significa a capacidade de catalisar a conversão de xilose em xilitol.
Em determinadas modalidades, um gene XR pode ser derivado de uma fonte de levedura.
Por exemplo, o gene XR pode ser derivado de um homólogo de XR/AR de I. orientalis que codifica a se- quência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 71 ou um gene XR de Pi- chia stipitis que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 30. Em outras modalidades, o gene pode codificar uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 71 ou 30. Em determinadas modalidades, o gene XR derivado de I. orientalis ou de P. stipitis pode com- preender a sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 70 ou 29 ou uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 70 ou 29. 5 Um "gene de desidrogenase de xilitol" ou "gene XDH" tal como aqui empregado refere-se a qualquer gene que codifica um polipeptídeo com atividade de desidrogenase de xilitol, o que significa a capacidade de catali- sar a conversão de xilitol em xilulose.
Em determinadas modalidades, um gene XDH pode ser derivado de uma fonte de levedura.
Por exemplo, o ge- ne XDH pode ser derivado de um homólogo de XDH de I. orientalis que codi- fica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 60 ou um gene XDH de P. stipitis que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 32. Em outras modalidades, o gene pode codificar uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 60 ou 32. Em determinadas modalidades, o gene XDH derivado de I. orientalis ou de P. stipitis pode compreender a sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 59 ou 31 ou uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 59 ou 31. Um "gene de 3-epimerase 5-fosfato de ribulose" ou "gene RPE" tal como aqui empregado refere-se a qualquer gene que codifica um polipep- tídeo com atividade de 3-epimerase 5-fosfato de ribulose, o que significa a capacidade de catalisar a conversão de 5-fosfato de xilulose em 5-fosfato de ribulose.
Em determinadas modalidades, um gene RPE pode ser derivado de uma fonte de levedura.
Por exemplo, o gene RPE pode ser derivado de um gene RPE de I. orientalis que codifica a sequência de aminoácidos indi- cada na SEQ ID NO: 34, de um gene RPE de S. cerevisiae que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 36, ou de um gene RPE de K. marxianus que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 38. Em outras modalidades, o gene pode codificar uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo 5 menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 34, 36, ou 38. Em determina- das modalidades, o gene RPE derivado de I. orientalis, S. cerevisiae ou K. marxianus pode compreender a sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 33, 35, ou 37 ou uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de nu- cleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 33, 35, ou 37. Um "gene de cetol-isomerase 5-fosfato de ribose" ou "gene RKI" tal como aqui empregado refere-se a qualquer gene que codifica um polipep- tídeo com atividade de cetol-isomerase 5-fosfato de ribose, o que significa a capacidade de catalisar a conversão de 5-fosfato de ribulose em 5-fosfato de ribose.
Em determinadas modalidades, um gene RKI pode ser derivado de uma fonte de levedura.
Por exemplo, o gene RKI pode ser derivado de um gene RKI de I. orientalis que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 40, de um gene RKI de S. cerevisiae que codificam a se- quência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 42, ou de um gene RKI de K. marxianus que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 44. Em outras modalidades, o gene pode codificar uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 40, 42, ou 44. Em determina- das modalidades, o gene RKI derivado de I. orientalis, S. cerevisiae ou K. marxianus pode compreender a sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 39, 41, ou 43 ou uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de nu- cleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 39, 41, ou 43. 5 Um "gene de transcetolase" ou "gene TKL" tal como aqui em- pregado refere-se a qualquer gene que codifica um polipeptídeo com a ativi- dade de transcetolase, o que significa a capacidade de catalisar a conversão de 5-fosfato de xilulose e 5-fosfato de ribose em G3P e 7-fosfato de sedo- heptulose (S7P) e a conversão de 5-fosfato de xilulose e 4-fosfato de eritro- se em F6P e G3P. Em determinadas modalidades, um gene TKL pode ser derivado de uma fonte de levedura. Por exemplo, o gene TKL pode ser deri- vado de um gene TKL de I. orientalis que codifica a sequência de aminoáci- dos indicada na SEQ ID NO: 46, de um gene TKL de S. cerevisiae que codi- fica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 48, ou de um gene TKL de K. marxianus que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 50. Em outras modalidades, o gene pode codificar uma se- quência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 46, 48, ou
50. Em determinadas modalidades, o gene TKL derivado de I. orientalis, S. cerevisiae ou K. marxianus pode compreender a sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 45, 47, ou 49 ou uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 45, 47, ou 49. Um "gene de transaldolase" ou "gene TAL" tal como aqui em- pregado refere-se a qualquer gene que codifica um polipeptídeo com a ativi- dade de transaldolase, o que significa a capacidade de catalisar a conversão de G3P e de S7P em 4-fosfato de eritrose (E4P) e F6P. Em determinadas modalidades, um gene TAL pode ser derivado de uma fonte de levedura. Por exemplo, o gene TAL pode ser derivado de um gene TAL de orientalis que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 52, de um ge- ne TAL de S. cerevisiae que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 54, ou de um gene TAL de K. marxianus que codifica a se- 5 quência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 56. Em outras modalida- des, o gene pode codificar uma sequência de aminoácidos com uma identi- dade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 52, 54, ou 56. Em determinadas modalidades, o gene TAL de I. orientalis, S. cerevisiae ou K. marxianus pode compreender a sequên- cia de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 51, 53, ou 55 ou uma se- quência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à sequência de nucleotídeos indicada nas SEQ ID NOs: 51, 53, ou 55. Em determinadas modalidades, as células de levedura geneti- camente modificadas aqui providas também compreendem uma supressão ou uma decomposição de um ou mais genes nativos.
A "supressão ou de- composição" no que diz respeito a um gene nativo significa que toda a regi- ão de codificação do gene é eliminada (supressão) ou a região de codifica- ção do gene, de seu promotor e/ou a região de seu terminador é modificada (tal como ppor meio de supressão, inserção ou mutação) de maneira tal que o gene não produz mais uma enzima ativa, produz uma quantidade intensa- mente reduzida (redução de pelo menos 75%, de preferência uma redução de pelo menos 90%) de uma enzima ativa, ou produz uma enzima com uma atividade intensamente reduzida (pelo menos 75% reduzida, de preferência pelo menos 90% reduzida). Em determinadas modalidades, a supressão ou a decomposição de um ou mais genes nativos resulta em uma supressão ou uma decompo- sição de um ou mais rotas metabólicas nativas.
A "supressão ou decomposi-
ção" no que diz respeito a uma rota metabólica significa que o rota é inope- rante ou então exibe uma atividade que é reduzida em pelo menos 75%, pe- lo menos 85% ou pelo menos 95% em relação à rota nativa.
Em determinadas modalidades, a supressão ou a decomposição 5 do gene nativo pode ser realizada por evolução forçada, por mutagênese ou por métodos de engenharia genética, seguidos pela seleção ou escolha a- propriada para identificar os mutantes desejados.
Em determinadas modali- dades, a supressão ou a decomposição de um gene nativo da célula hospe- deira pode ser acoplada à incorporação de um ou mais genes exógenos na célula hospedeira, isto é, os genes exógenos podem ser incorporados ao usar um construto de integração da expressão do gene que também é um construto de supressão.
Em outras modalidades, a supressão ou a decom- posição pode ser realizada ao usar um construto de supressão que não con- tém um gene exógeno ou através de outros métodos conhecidos no estado da técnica.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneti- camente modificadas aqui providas compreendem uma supressão ou uma decomposição de um ou mais genes nativos que codificam uma enzima en- volvida em uma rota ativa de fermentação de arabinose que converte a ara- binose em 5-fosfato de xilulose através de intermediários de arabitol, xilulo- se, xilitol e xilulose.
Nessas modalidades, as células podem compreender uma supressão ou uma decomposição de um ou mais genes AR, de arabitol 4-desidrogenase, de redutase de xilulose ou XDH nativos.
Nas modalidades em que as células têm uma rota ativa de fermentação de arabinose que con- verte a arabinose em 5-fosfato de xilulose através de intermediários de ribu- lose e 5-fosfato de ribulose, a supressão ou a decomposição de um ou mais genes AR, de arabitol 4-desidrogenase, de redutase de xilulose ou XDH re- sulta em um aumento na quantidade de arabinose que entra na rota de in- termediário de ribulose/5-fosfato de ribulose.
Em determinadas modalidades que em que a célula modificada de levedura é de I. orientalis, as células po- dem compreender uma supressão ou uma decomposição de um homólogo do gene de redutase de xilulose que codifica a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 58, um homólogo do gene XDH que codifica a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 60 ou 62, e/ou um homólogo do gene XR/AR que codifica a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 69, ou 71. Em determinadas modalidades em que as células compreendem uma 5 supressão ou uma decomposição de um homólogo do gene de redutase de xilulose, o gene fica localizado no locus S141G8160 e/ou compreende a se- quência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 57 ou uma sequência de nucleotí- deos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à SEQ ID NO: 57. Em determinadas modalidades em que as células compre- endem uma supressão ou uma decomposição de um homólogo do gene XDH, o gene fica localizado no locus S141G4546 ou S141G7675 e/ou com- preende a sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 59 ou 61 ou uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação às SEQ ID NOs: 59 ou 61. Em determinadas modalidades em que as células compreendem uma supressão ou uma decomposição de um homólogo do gene AR/XR, o gene fica localizado no locus S141G725, S141G4738, ou S141g1158-1159, ou S141G8885 e/ou compreende a se- quência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 63, 65, 67, ou 70 ou uma se- quência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação às SEQ ID NO.: 63. 65, 67, ou 70. Em determinadas modalidades, as células de levedura geneti- camente modificadas aqui providas compreendem uma supressão ou uma decomposição de um ou mais genes nativos que codificam uma enzima en- volvida em uma rota ativa de fermentação de xilose que converte a xilose em 5-fosfato de xilulose através de intermediários de xilitol e D-xilulose.
Nessas modalidades, as células podem compreender uma supressão ou uma de-
composição de um ou mais genes XDH ou XR nativos. Nas modalidades em que as células têm uma rota ativa de fermentação de xilose que converte a xilose em 5-fosfato de xilulose sem um intermediário de xilitol (isto é, ao con- verter a xilose diretamente em xilulose), a supressão ou decomposição de 5 um ou mais genes XDH ou XR resulta em um aumento na quantidade de xilose que entra na rota de intermediário só de xilulose. Em determinadas modalidades que em que a célula modificada de levedura é de I. orientalis, as células compreendem uma supressão ou uma decomposição de um ho- mólogo do gene XDH que codifica a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 60 ou 62 e/ou um homólogo do gene AR/XR que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, 66, 68, 69, ou 71. Em determinadas mo- dalidades em que as células compreendem uma supressão ou uma decom- posição de um homólogo do gene XDH, o gene fica localizado no locus S141G7675 ou S141G4546 e/ou compreende a sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 59 ou 61 ou uma sequência de nucleotídeos com uma i- dentidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação às SEQ ID NOs: 59 ou 61. Em determinadas modalidades em que as células compreendem uma supressão ou uma decomposição de um homólogo do gene AR/XR, o gene fica localizado no locus S141G725, S141G4738, S141g1158-1159, ou S141G8885 e/ou compreende a sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 63, 65, 67, ou 70 ou uma sequência de nucleotídeos com uma identi- dade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação às SEQ ID NOs: 63, 65, 67, ou
70. Em determinadas modalidades, as células de levedura geneti- camente modificadas aqui providas compreendem uma supressão ou uma decomposição de um ou mais genes nativos que codificam uma enzima que desvia o carbono da produção do etanol. Nessas modalidades, as células podem compreender uma supressão ou uma decomposição de um ou mais genes ALD ou ADH.
Em determinadas modalidades em que a célula modifi- cada de levedura é de I. orientalis, as células compreendem uma supressão ou uma decomposição de um gene ALD que codifica a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 73 (ALD5680) e/ou de um gene ADH que codifica a 5 sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 75 ou 85. Em determinadas modalidades em que as células compreendem uma supressão ou uma de- composição de um gene ALD, o gene ALD fica localizado no locus S141G5680 e/ou compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 72 ou uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% em relação à SEQ ID NO: 72. Em determinadas modalidades em que as células compreendem uma supressão ou uma decomposição de um gene ADH, o gene ADH fica localizado no locus S141G9091 ou S141G1202 e/ou compreende a sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 74 ou 84 ou uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 97% ou pelo menos 99% em relação às SEQ ID NOs: 74 ou 84. As células de levedura geneticamente modificadas aqui providas podem ser selecionadas de uma variedade de espécies de levedura.
Em determinadas modalidades, as células de levedura geneticamente modifica- das aqui providas são célula de levedura que não de Saccharomices.
Em algumas dessas modalidades, as células de levedura são células de levedu- ra crabtree-negativas e em algumas dessas modalidades as células de leve- dura pertencem à classe I. orientalis/Pichia fermentans.
A classe I. orienta- lis/P. fermentans é a classe mais terminal que contem pelo menos as espé- cies I. orientalis, Pichia galeiformis, Pichia sp.
YB-4149 (designação da NRRL), Candida ethanolica, Pichia deserticola, Pichias membranifaciens e Pichia fermentans.
Os membros da classe I. orientalis/P. fermentans são identificados pela análise do domínio D1/D2 variável do DNA 26S ribossomal da espécie de levedura, ao usar o método descrito por Kurtzman e Robnett em "Identification and Phylogeny os Ascomycetous Yeats from Analysis of Nuclear Large Subunit (26S) Ribosomal DNA Partial Sequences", Antonie van Leeuwenhoek 73:331-371, 1998, aqui incorporado a título de referência (consultar especialmente a página 349). A análise do domínio D1/D2 variável 5 de DNA 26S ribossomal das centenas de ascomicetes revelou que a classe I. orientalis/P. fermentans contém espécies muito proximamente relaciona- das.
Os membros da classe I. orientalis/P. fermentans exibem uma similari- dade maior no domínio D1/D2 variável do DNA 26S ribossomal a outros membros da classe do que à espécie de levedura fora da classe.
Portanto, outros membros da classe I. orientalis/P. fermentans podem ser identificados pela comparação dos domínios D1/D2 de seu DNA ribossomal respectivo e pela comparação àquele de outros membros da classe e da espécie proxi- mamente relacionada fora da classe, ao usar os métodos de Kurtzman e Robnett.
Em determinadas modalidades, as células de levedura genetica- mente modificadas aqui providas pertencem ao gênero Issatchenkia e em algumas dessas modalidades as células de levedura são de I. orientalis.
Quando caracterizada pela primeira vez, a espécie I. orientalis foi designada pelo nome Pichia kudriavzevii.
A anamorfa (forma assexual) de I. orientalis é conhecida como Candida krusei.
Numerosos sinônimos adicionais para a espécie I. orientalis foram listados em outras partes (Kurtzman and Fell, The Yeats, a Taxonomic Study.
Section 35. Issatchenkia Kudriavtsev, páginas 222-223 (1998)). I. orientalis e outros membros da classe I. orientalis/P. fer- mentans exibem determinadas características que os tornam ideais para a fermentação de etanol a partir de biomassa, incluindo a tolerância a um pH baixo, etanol, alta temperatura (40°C ou mais) e vá rios inibidores presentes no hidrolisato.
Em determinadas modalidades, são providos processos de fer- mentação em que uma célula de levedura geneticamente modificada tal co- mo aqui provido é cultivada sob condições de fermentação.
Em algumas dessas modalidades, o processo de fermentação resulta na produção de etanol.
Por conseguinte, são aqui providos em determinadas modalidades métodos para a produção de etanol ao cultivar uma célula de levedura gene-
ticamente modificada tal como aqui provido com um ou mais açúcares de pentose e/ou hexose.
Em determinadas modalidades dos processos e dos métodos aqui providos, os meios usados para o cultivo das células de levedura gene- 5 ticamente modificadas aqui providas compreendem um ou mais açúcares que não a glicose que são fermentáveis pelas células.
Em algumas dessas modalidades, os açúcares que não a glicose podem ser a xilose, o xilano, um outro oligômero de xilose, e/ou uma arabinose.
Esses açúcares que não a glicose podem ser hidrolisatos de um biomassa contendo hemicelulose, tal como um hidrolisato de biomassa de planta.
Os meios também podem com- preender a glicose e/ou oligômeros ou polímeros de glicose.
Onde açúcares multiméricos estão presentes, pode ser necessário adicionar enzimas ao caldo de fermentação para digerir esses açúcares no açúcar monomérico correspondente.
Em determinadas modalidades do processo e dos métodos aqui providos, os meios usados para o cultivo das células de levedura genetica- mente modificadas aqui providas é um meio contendo xilose e em algumas dessas modalidades a xilose é derivada de um hidrolisato de biomassa de planta.
Em determinadas modalidades, a xilose pode estar presente no meio a uma concentração de cerca de 0 a cerca de 150 g/l no início da fermenta- ção (isto é, ou antes do ponto em que as células são adicionadas ao meio) e/ou em vários pontos no tempo durante o processo de fermentação.
Em algumas dessas modalidades, a xilose pode estar presente no meio a uma concentração de pelo menos cerca de 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 75 g/l, 100 g/l ou 125 g/l.
Em determinadas modalidades, o meio pode compre- ender um ou mais açúcares além da xilose, incluindo um ou mais açúcares de pentose e/ou hexose.
Em algumas dessas modalidades, a xilose pode consistir em cerca de 10 a cerca de 95% do teor total de açúcar do meio no início da fermentação e/ou em vários pontos no tempo durante o processo de fermentação.
Em algumas dessas modalidades, a xilose pode consistir em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% do teor total do açúcar do meio.
Em determinadas modalidades, as cé-
lulas de levedura geneticamente modificadas podem fermentar um ou mais dos açúcares adicionais presentes no meio em etanol.
Em determinadas modalidades do processo e dos métodos aqui providos, os meios são meios sintéticos, tal como um meio de extrato de le- 5 vedura/peptona e em algumas dessas modalidades os meios podem conter acetato.
Em outras modalidades, os meios são meios sintéticos definidos e em algumas dessas modalidades os meios podem conter acetato.
Em de- terminadas modalidades, os meios compreendem alguma porcentagem de hidrolisato de biomassa, tal como o hidrolisato de palha de milho.
Nessas modalidades, o hidrolisato pode estar presente no meio em qualquer lugar de cerca de 10% a 100% do volume médio total.
Em algumas dessas moda- lidades, o hidrolisato pode ser pré-tratado.
Por exemplo, o hidrolisato pode ser pré-tratado com um ou mais ácidos ou enzimas a fim de decompor par- cialmente o material de partida.
Em determinadas modalidades, o hidrolisato é um hidrolisato não destoxificado.
Nas modalidades em que o meio com- preende o hidrolisato a menos de 100%, o restante do meio pode compre- ender um ou mais agentes de diluição incluindo um meio sintético ou água.
Em determinadas modalidades, o cultivo das células aqui provi- das para produzir etanol pode ser dividido em fases.
Por exemplo, o proces- so de cultura de células pode ser dividido em uma fase de cultivo, uma fase de produção e uma fase de recuperação.
Um elemento versado na técnica irá reconhecer que essas condições podem ser variadas com base em fato- res tais como a espécie de levedura que está sendo usada, a rota específica de fermentação utilizada pela levedura, o rendimento desejado, ou outros fatores.
Em determinadas modalidades dos processos e dos métodos aqui providos, as células são cultivadas a uma temperatura de cerca de 20°C a cerca de 60°C.
Em algumas dessas modalidades , a fermentação o- corre a uma temperatura que varia de cerca de 30°C a cerca de 50°C e em algumas dessas modalidades a fermentação ocorre a uma temperatura de cerca de 35°C a cerca de 45°C.
A temperatura pode s er variada por todo o processo de fermentação.
A fermentação pode ser realizada aerobicamente, microaerobi- camente, substancialmente anaerobicamente, ou anaerobicamente.
Caso seja desejado, a taxa de absorção de oxigênio pode ser variada por toda a fermentação como um controle do processo (consultar, por exemplo, o do- 5 cumento de patente WO03/102200). Em determinadas modalidades preferi- das, a fermentação pode ocorrer sob condições microaeróbicas, que são caracterizadas por uma taxa de absorção de oxigênio de cerca de 2 a cerca de 25 mmol/l/h.
Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar melhor a in- venção reivindicada e não devem ser interpretados como limitadores do âm- bito da invenção.
Até ao ponto em que os materiais específicos são mencio- nados, é meramente para finalidades de ilustração e não se prestam a limitar a invenção.
O elemento versado na técnica pode desenvolver meios equiva- lentes ou reagentes sem o exercício da capacidade inventiva e sem se des- viar do âmbito da invenção.
Deve ser compreendido que muitas variações podem ser feitas nos procedimentos aqui descritos enquanto ainda continu- am dentro dos limites da presente invenção.
A intenção dos autores da pre- sente invenção é que tais variações sejam incluídas dentro do âmbito da invenção.
Exemplos Exemplo 1: Integração de genes da rota de arabinose de B. the- taiotaomicron, L. plantarum, E. coli e B. licheniformis em I. orientalis: Genes do tipo selvagem ou AI (araA), RK (araB) e RE (araD) o- timizados com códons de B. thetaiotaomicron, L. plantarum, E. coli e B. li- cheniformis foram incorporados na cepa 1822 de I. orientalis (uma cepa re- sistente ao ácido láctico) para determinar se eles conferiram a capacidade de utilizar a arabinose.
Exemplo 1A: Integração de araB de B. thetaiotaomicron em um locus XR de I. orientalis: O gene araB de B. thetaiotaomicron foi otimizado com códons para a expressão em I. orientalis ao usar uma tabela de uso de códons de I. orientalis para a retrotradução (SEQ ID NO: 12). O gene araB otimizado com códons toi sintetizado de modo que contivesse um sítio de restrição XbaI na extremidade 5' e em um sítio de restrição PacI na extremidade 3'. O produto de PCR foi purificado com gel e clonado no vetor TOPO PCR2.1. O arranjo em sequência das inserções para múltiplos clones resultou na identificação 5 de um clone com a sequência de DNA desejada.
O gene araB de B. thetaiotaomicron sob o controle do promotor ENO1 de I. orientalis foi clonado em um plasmídio que contém um termina- dor PDC de I. orientalis, um primeiro cassete marcador de seleção URA3 (promotor/gene/terminador de URA3) e uma segunda cópia do promotor de URA3 a jusante do terminador para gerar o plasmídio pHJJ2. As regiões a montante e a jusante do locus do gene XYL1 de I. orientalis (XR) foram clonadas contiguamente, separadas por um sítio de restrição de NotI, em um vetor de clonagem para formar o plasmídio pHJJ1. Um fragmento NotI de pHJJ2 que contém o promotor ENO1, o gene araB e o cassete da seleção URA3 foi ligado a pHJJ1 para formar pHJJ3 (orientação 1) e pHJJ18 (orientação 2). pHJJ3 e pHJJ18 foram linearizados pela digestão sequencial com ApaI e SacI.
O DNA linearizado foi transformado na cepa 2762 de I. orientalis (ura3∆ ura3∆) e as células foram chapeadas no meio ScD-ura.
As colônias transformadas foram purificadas no meio ScD-ura e a integração na posição XIL1 foi confirmada por meio de PCR.
A cepa 2762 transformada com pHJJ3 formou a cepa yHJJ1 (2903), ao passo que a cepa 2762 trans- formada com pHJJ18 formou a cepa yHJJ2 (2902). As cepas 2902 e 2903 foram cultivadas durante toda a noite em meio IPD e chapeadas no meio ScD-FOA para selecionar as cepas em que o marcador URA3 tinha sido laçado através de recombinação entre as regi- ões do promotor URA3. As colônias resultantes foram purificadas em meio IPD e foram testadas no meio ScD-ura para confirmar a perda de URA3. As colônias também foram confirmadas pela colônia de PCR.
O derivado ura- da cepa 2902 foi nomeado como cepa yHJJ3 (2904) e o derivado ura- da cepa 2903 foi nomeado como cepa yHJJ4 (2905). A expressão do gene araB foi confirmada ao usar qPCR.
O RNA foi purificado da cepa paterna e da cepa 2902 ao usar um kit de RNA da ZymoResearch.
Um kit de RT-PCR da Epicentre MasterAmp foi usado com os primers de araB e actina para a amplificação do RNA.
Os araBs integran- tes exibiram Cts de cerca de 14 versus cerca de 34 para a cepa 1822 e 18 5 para a actina.
Exemplo 1B: Integração de araD de B. thetaiotaomicron em um locus AR de I. orientalis: O gene araD de B. thetaiotaomicron foi otimizado com códons para a expressão em I. orientalis (SEQ ID NO: 15) e clonado em PCR2.1- TOPO tal como descrito acima no Exemplo 1A exceto pelo fato que foi usa- do o sistema ClonTech Genome Advantage2 PCR ao invés de polimerase de DNA rTth.
Devido ao fato que todos os seis clones arranjados em se- quência tinham pelo menos um erro de nucleotídeo, a extremidade 5' sem erro (fragmento de XbaI/PstI) de um clone foi unida com a extremidade 3' sem erro (fragmento de PstI/PacI) de um segundo clone através de digestão e ligação.
O gene resultante foi digerido com XbaI e PacI e ligado em pHJJ3 similarmente cortado, criando o vetor pHJJ5. pHJJ5 conteve o promotor ENO1, o gene araD e o terminador PDC.
Um fragmento de NotI que contem o promotor ENO1, o gene araD, o terminador PDC e o locus URA3 de pHJJ5 foi ligado ao vetor pHJJ4 para gerar os vetores pHJJ9 (orientação 1) e pHJJ10 (orientação 2). pHJJ4 continha regiões a montante e a jusante do locus S141G725 de I. orientalis (AR, "AXR1"). pHJJ9 foi linearizado por meio de digestão sequencial com SacI e ApaI, liberando um fragmento que continha o promotor ENO1, o gene a- raD, o terminador PDC, o cassete URA3 e as sequências alvo de AXR1. Os fragmentos de integração foram transformados na cepa 2904 de I. orientalis tal como descrito acima no Exemplo 1A.
As colônias transformadas foram purificadas no meio ScD-ura e a PCR foi executada para confirmar a inte- gração no locus AXR1. A cepa 2904 transformada com pHJJ9 linearizado produziu as cepas yHJJ7 (2908) e yHJJ8 (2909), cada uma das quais tem uma cópia de araB e uma cópia de araD de B. thetaiotaomicron.
A cepa 2908 foi cultivada durante toda a noite em meio IPD e chapeada no meio ScD-FOA para selecionar as cepas em que o marcador URA3 tinha sido laçado.
As colônias resultantes foram purificadas no meio IPD e foram testadas no meio ScD-ura para confirmar a auxotrofia de uracil.
As colônias também foram confirmadas por meio de PCR de colônia.
Os de- 5 rivados de Ura- da cepa 2908 eram as cepas yHJJ13 (3009) e yHJJ14 (3010). pHJJ10 foi linearizada por meio de digestão sequencial com Sa- cI e ApaI, liberando um fragmento que continha o promotor ENO1, o gene araD, o terminador PDC, o cassete URA3 e as sequências alvo de AXR1. Os fragmentos de integração foram transformados na cepa 3009 de I. orientalis.
As colônias transformadas foram purificadas no meio ScD-ura e a PCR foi executada para confirmar a integração no locus AXR1. A cepa 3009 trans- formada com pHJJ10 linearizada produziu a cepa yHJJ15 (3011), contendo uma cópia de araB e das duas cópias de araD de B. thetaiotaomicron.
A expressão do araD foi confirmada ao usar qPCR.
O RNA foi purificado a partir das cepas 2908 (araB/araD) e 2904 (araB) ao usar uma extração de ácido e fenol.
O DNA genômico foi eliminado ao usar um kit de RNA livre de DNA da ZymoResearch e o DNA foi obtido a partir de 4 µg de RNA ao usar Transcriptase Reversa Promega.
O DNA genômico da cepa 2908 para o uso como um padrão foi isolado ao usar um kit de DNA genômi- co Yeastar da ZymoResearch.
A QPCR foi executada ao usar primers de SYBR Green PCR Master Mix da Applied Biosystems e araD e actina.
Os integrantes de araD revelaram cerca de seis vezes mais expressão de araD que a expressão de actina, versus nenhuma expressão na cepa de controle de araB.
O marcador URA3 de yHJ15 (3011) foi laçado ao cultivar as cé- lulas durante toda a noite em meio IPD e ao chapear em placas de ScD- FOA.
As colônias foram selecionadas por meio de PCR de colônia para iden- tificar as colônias que perderam o marcador de seleção mas mantiveram o restante da inserção de araD e tal colônia foi nomeada como yJY21. Foi con- firmado mais tarde que a cópia de araB do B. thetaiotaomicron foi perdida durante o evento de laço, de modo que a cepa yJY21 tinha somente as duas cópias de araD.
Exemplo 1C: Integração de araA de B. thetaiotaomicron em um locus XDH de I. orientalis: O gene araA de B. thetaiotaomicron foi otimizado com códons 5 para a expressão em I. orientalis tal como descrito acima no Exemplo 1A (SEQ ID NO: 5) e sintetizado.
A mutagênese dirigida em sítio foi usada para corrigir os erros do nucleotídeo no gene montado.
Um clone que contém o vetor com a sequência desejada de genes foi nomeado como pJY13. Uma ligação de três partes foi executada ao usar um fragmento de XbaI/PacI que contém o gene araA de B. thetaiotaomicron, um fragmento de XhoI/PacI de um vetor de clonagem contém as sequências alvo de XYL2 (XDH), um terminador PDC e um cassete de seleção URA3 e um fragmento de XhoI/XbaI que contém o promotor TDH3 de I. orientalis.
O plasmídio re- sultante pJY15 continha o promotor TDH3, o gene Araa de B. thetaiotaomi- cron, o terminador PDC e o cassete marcador URA3 flanqueado pelas se- quências alvo de XYL2. O plasmídio pJY15 foi digerido com ApaI e KpnI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado na cepa 2904 do Exemplo 1A (contem o gene araB de B. thetaiotaomicron no locus XIL1). As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR de colônia para identificar as colônias com integração no locus desejado e tal cepa foi no- meada como yJY16. A cepa yJY16 continha uma cópia de cada um dos ge- nes araB e araA de B. thetaiotaomicron e foi usada para testar a atividade de AI em relação a outras fontes do gene araA.
O fragmento de integração linearizado de pJY15 também foi transformado na cepa yJY21 do Exemplo 1B (contém duas cópias do gene araD de B. thetaiotaomicron no locus S141G725). As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR de colônia para identificar as colônias com integração no locus XYL2 e tal cepa foi nomeada como yJY22. A cepa yJY22 continha uma cópia do gene araA de B. thetaiotaomicron e duas có- pias do gene araD de B. thetaiotaomicron.
O marcador URA3 em yJY22 foi laçado por meio do chapeamen-
to em placas de ScD-FOA.
As colônias foram selecionadas por meio de PCR para identificar as colônias que perderam o marcador de seleção mas manti- veram o restante da inserção de araA e tal colônia foi nomeada como yJY23. A cepa yJY23 foi transformada com o fragmento de integração 5 de ApaI/KpnI a partir de pJY15 e as colônias de ura+ foram selecionadas por meio de PCR para identificar as colônias com integração no locus desejado.
Tal cepa foi nomeada como yJY24, a qual tinha duas cópias de cada um dos genes araA e araD de B. thetaiotaomicron.
O marcador URA3 da cepa yJY24 foi laçado por meio de chape- amento de célula em placas de ScD-FOA.
As colônias foram selecionadas por meio de PCR para identificar as colônias que perderam o marcador de seleção mas mantiveram o restante da inserção e tal colônia foi nomeada como yJY29. O plasmídio pHJJ3 (Exemplo 1A) foi digerido com ApaI e SacI para liberar o fragmento de integração que contém o gene araB de B. thetai- otaomicron e o DNA linearizado foi transformado na cepa yJY29. As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR para identificar as colônias com integração no sítio XIL1 e tal cepa foi nomeada como iJY30 (3409). A cepa 3409 tinha duas cópias de cada um dos genes araA e araD de B. the- taiotaomicron e uma cópia do gene araB.
O marcador URA3 da cepa 3409 foi laçado por meio de chape- amento de células em placas de ScD-FOA.
As colônias foram selecionadas por meio de PCR para identificar as colônias que perderam o marcador de seleção mas mantiveram o restante da inserção e tal colônia foi nomeada como yJY31. O fragmento linearizado da integração de pHJJ3 foi transfor- mado na cepa yJY31 a fim de inserir uma segunda cópia do gene araB no sítio XIL1. As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR para identificar as colônias com integração no locus desejado e tal cepa foi no- meada como cepa yJY33 (3410). Uma região do DNA que contém o promotor TEF1 foi amplifica- da a partir do DNA genômico de I. orientalis de modo que a extremidade 5' contivesse um sítio de restrição de XhoI e a extremidade 3' contivesse um sítio de XbaI.
O produto de PCR cortado de XhoI/XbaI foi ligado nos plasmí- dios pHJJ3 e pHJJ18 (Exemplo 1A) que tinham sido digeridos similarmente para liberar o promotor ENO1. As colônias transformadas com a ligação fo- ram selecionadas por meio de PCR para a inserção desejada e confirmadas 5 por meio do arranjo em sequência.
Esses vetores, que continham o gene araB de B. thetaiotaomicron sob o controle do promotor ENO1, foram nome- ados como pHJJ33 (derivado de pHJJ3) e pHJJ35 (derivado de pHJJ18). O plasmídio pHJJ33 foi digerido com ApaI e SacI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado na cepa yJY29. As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR para iden- tificar as colônias com integração no sítio XIL1 e tal cepa foi nomeada como yHJJ40 (3406). A cepa 3406 continha duas cópias dos genes araA e araD de B. thetaiotaomicron e de uma cópia de araB sob o controle do promotor TEF1. O marcador URA3 de 3406 foi laçado ao cultivar as células durante toda a noite em YPD e por meio de chapeamento em placas de ScD-FOA.
As colônias foram selecionadas por meio de PCR para identificar as colônias que perderam o marcador de seleção mas mantiveram o restante da inser- ção.
Tal colônia foi nomeada como yHJJ44. O plasmídio pHJJ35 foi digerido com ApaI e SacI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado na cepa yHJJ44 para inserir TEF1:araB em um segundo locus XIL1. As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR para identificar as colônias com integração correta e tal cepa foi nomeada como cepa yHJJ47 (3408). A cepa 3408 continha duas cópias de cada um dos ge- nes araA, araD e araB de B. thetaiotaomicron, com o araB sob controle do promotor TEF1. Exemplo 1D: A integração de araD de E. coli no locus da cepa AR de I. orientalis contendo araB de B. thetaiotaomicron: O gene araD de E. coli (SEQ ID NO: 76) foi amplificado a partir do DNA genômico da cepa MG1655 de modo que a extremidade 5' do gene contivesse um sítio de restrição de XbaI e a extremidade 3' contivesse um sítio de restrição de PacI.
O produto de PCR foi purificado com gel e digerido com XbaI e PacI.
O fragmento resultante foi ligado em pHJJ18 (Exemplo 1A)
do qual o gene araB de B. thetaiotaomicron tinha sido digerido com XbaI e PacI.
As colônias que têm a inserção desejada de araD de E. coli foram con- firmadas por meio de PCR e o DNA do plasmídio foi isolado (pHJJ12). O fragmento que contém o promotor ENO1, o gene araD de E. coli, o termina- 5 dor de PDC e o cassete marcador URA3 foi digerido de pHJJ12 com NotI e ligado em pHJJ4 digerido com NotI (as sequências alvo AXR1 separadas por um sítio NotI) para obter os vetores pHJJ14 (orientação 1) e pHJJ19 (orien- tação 2). O plasmídio pHJJ14 foi digerido com ApaI e SacI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado na cepa 2904 (Exemplo 1A). As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR para identificar as colônias com integração no locus desejado e tal cepa foi nomeada como yHJJ9 (3005). Exemplo 1E: Integração de araD de L. plantarum no locus da cepa AR de I. orientalis contendo araB de B. thetaiotaomicron: O gene araD de L. plantarum foi otimizado com códons para a expressão em I. orientalis ao usar uma tabela de uso de códons de I. orien- talis para a retrotradução e foi sintetizado de modo que contivesse um sítio de restrição de XbaI na extremidade 5' e em um sítio de restrição de PacI na extremidade 3' (SEQ ID NO: 78). O produto de PCR de araD de L. plantarum foi purificado com gel e digerido com XbaI e PacI.
Os fragmentos resultantes foram ligados em pHJJ18 (Exemplo 1A) do qual o gene araB de B. thetaiota- omicron tinha sido digerido com XbaI e PacI.
As colônias que têm a inserção araD de L. plantarum desejada foram confirmadas por meio de PCR e o DNA do plasmídio foi isolado (pHJJ13). O fragmento que contém o promotor ENO1, o gene araD de L. plantarum, o terminador de PDC e o cassete mar- cador URA3 foi digerido de pHJJ13 com NotI e ligado a pHJJ4 digerido com Notl (as sequências alvo de AXR1 separadas por um sítio de NotI) para ob- ter os vetores pHJJ15 (orientação 1) e pHJJ20 (orientação 2). O plasmídio pHJJ15 foi digerido com ApaI e SacI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado na cepa 2904 (Exemplo 1A). As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR para identificar as colônias com integração no locus AXR1 e tal cepa foi no- meada como yHJJ11 (3007). Exemplo 1F: Integração de araA de L. plantarum no locus da ce- pa XDH de I. orientalis contendo araB de B. thetaiotaomicron: 5 O gene araA de L. plantarum foi otimizado com códons para a expressão em I. orientalis ao usar uma tabela de uso de códons de I. orien- talis para a retrotradução e foi sintetizado de modo que contivesse um sítio de restrição de XbaI na extremidade 5' e em um sítio de restrição de PacI na extremidade 3' (SEQ ID NO: 80). O DNA foi clonado com TOPO e o plasmí- dio com a sequência desejada foi nomeado como pJY14. Uma ligação de três partes foi executada ao usar um fragmento de XbaI/PacI de pJY14 que contém o gene araA de L. plantarum, um frag- mento de XhoI/PacI que contém as sequências alvo de XYL2 (XDH), um terminador PDC de I. orientalis e um cassete de seleção de URA3 e um fragmento de XhoI/XbaI que contém o promotor TDH3 de I. orientalis.
O plasmídio resultante pJY17 continha o promotor TDH3, o gene araA de L. plantarum, o terminador de PDC e o cassete marcador URA3 flanqueado pelas sequências alvo de XYL2. O plasmídio pJY17 foi digerido com ApaI e KpnI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado na cepa 2904 (Exemplo 1A). As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR para identificar as colônias com integração no locus XYL2 e tal cepa foi no- meada como yJY17. Exemplo 1G: Integração de araA de B. licheniformis no locus da cepa XDH de I. orientalis contendo araB de B. thetaiotaomicron: O gene araA de B. licheniformis de 1,5 Kb foi otimizado com có- dons para a expressão em I. orientalis ao usar uma tabela de uso de códons de I. orientalis para a retrotradução e construído de modo que contivesse um sítio de restrição de XbaI na extremidade 5' e em um sítio de restrição de PacI na extremidade 3' (SEQ ID NO: 82).O produto de PCR foi clonado em um vetor TOPO e a mutagênese dirigida foi usada para corrigir três erros de nucleotídeo.
O plasmídio resultante pJY23 continha o gene araA de B. liche-
niformis otimizado com o códon correto.
Uma ligação de três partes foi executada ao usar um fragmento de XbaI/PacI de pJY23 que contém araA de B. licheniformis, um fragmento de XhoI/PacI de um vetor de clonagem que contém as sequências alvo de 5 XYL2 (XDH), um terminador de PDC e um cassete de seleção de URA3 e um fragmento de XhoI/XbaI que contem o promotor TDH3 de I. orientalis.
O plasmídio resultante pJY24 continha o promotor TDH3, o gene Arad de B. licheniformis, o terminador de PDC e o cassete marcador URA3 flanqueado pelas sequências alvo de XYL2. O plasmídio pJY24 foi digerido com ApaI e KpnI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado na cepa 2904(Exemplo 1A). As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR para identificar as colônias com integração no locus XYL2 e tal cepa foi nomeada como yJY18. As cepas geneticamente modificadas de I. orientalis geradas nos Exemplos 1A a 1G são resumidas na Tabela 1.
Tabela 1: Nome da cepa araA araB araD Fonte -- -- -- No. de cópias 0 0 0 2762 (cepa paterna) Promotor -- -- -- Localização -- -- -- Fonte -- B. thetaiotaomicron -- No. de cópias -- 1 -- yHJJ2/2902 (ura+), yHJJ3/2904 (ura-) Promotor -- ENO1 -- Localização -- Locus XYL1 --
75/118 Fonte -- B. thetaiotaomicron -- No. de cópias 0 1 0 yHJJ1/2903 (ura+), yHJJ4/2905 (ura-) Promotor -- ENO1 -- Localização -- Lócus XYL1 -- Fonte -- B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron yHJJ7/2908 (ura+), yHJJ8/2909 (ura+), No. de cópias 0 1 1 yHJJ13/3009 (ura-), yHJJ14/3010 (ura-) Promotor -- ENO1 ENO1 Localização -- Lócus XYL1 Lócus AXR1 Fonte -- B. thetaiotaomicron E. coli No. de cópias 0 1 1 yHJJ9/3005 Promotor -- ENO1 ENO1 Localização -- Lócus XYL1 Lócus AXR1 Fonte -- B. thetaiotaomicron L. plantarum No. de cópias 0 1 1 yHJJ11/3007 Promotor -- ENO1 ENO1 Localização -- Lócus XYL1 Lócus AXR1 Fonte -- B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron No. de cópias 0 1 2 yHJJ15/3011 Promotor -- ENO1 ENO1 Localização -- Lócus XYL1 Locus AXR1
Tabela 1 (continuação) Nome da cepa araA araB araD Fonte B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron -- No. de cópias 1 1 0 yJY16 Promotor TDH3 ENO1 -- Localização Lócus XYL2 Lócus XYL1 -- Fonte L. plantarum B. thetaiotaomicron -- No. de cópias 1 1 0 yJY17 Promotor TDH3 ENO1 -- Localização Lócus XYL2 Lócus XYL1 -- Fonte B. licheniformis B. thetaiotaomicron -- No. de cópias 1 1 0
76/118 yJY18 Promotor TDH3 ENO1 -- Localização Lócus XYL2 Lócus XYL1 -- Fonte -- -- B. thetaiotaomicron No. de cópias 0 0 2 yJY21 Promotor -- -- ENO1 Localização -- -- Lócus AXR1 Fonte B. thetaiotaomicron -- B. thetaiotaomicron No. de cópias 1 0 2 yJY22 (ura+), yJY23 (ura-) Promotor TDH3 -- ENO1 Localização Lócus XYL2 -- Lócus AXR1 Fonte B. thetaiotaomicron -- B. thetaiotaomicron No. de cópias 2 0 2 yJY24 (ura+), yJY29 (ura-) Promotor TDH3 -- ENO1 Localização Lócus XYL2 -- Lócus AXR1 Fonte B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron No. de cópias 2 1 2 yHJJ40/3406 (ura+), yHJJ44 (ura-) Promotor TDH3 TEF1 ENO1 Localização Lócus XYL2 Lócus XYL1 Lócus AXR1
Tabela 1 (continuação) Nome da cepa araA araB araD Fonte B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron No. de cópias 2 2 2 yHJJ47/3408 Promotor TDH3 TEF1 ENO1 Localização Lócus XYL2 Lócus XYL1 Lócus AXR1 Fonte B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron No. de cópias 2 1 2 yJY30/3409 (ura+), yJY31 (ura-) Promotor TDH3 ENO1 ENO1 Localização XYL2 locus Lócus XYL1 Lócus AXR1
77/118 Fonte B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron No. de cópias 2 2 2 yJY33/3410 Promotor TDH3 ENO1 ENO1 Localização Lócus XYL2 Lócus XYL1 Lócus AXR1
Exemplo 2: Análise da atividade das cepas RK, RE e AI de I. ori- entalis que contêm os genes araA, araB, e/ou araD bacterianos: As cepas geradas no Exemplo 1 foram testadas quanto à ativi- dade de RK, RE e AI. 5 Exemplo 2A: Análise da atividade de RK: RK catalisa a conversão dependente de ATP de L-ribulose em L- 5-fosfato de ribulose, produzindo ADP.
A atividade de RK é seguida pela regeneração de ATP com PEP catalisada pelo piruvato de quinase.
Essa reação produz o piruvato, que é reduzido em lactato com NADH e lactato de desidrogenase.
Os ensaios continham 30 mM de Tris HCl, pH 7.5, 3,3 mM de MgCl2, 0,3 mM de EDTA, 1,7 mM de PEP, 0,7 mM de ATP, >4 U/ml de cada um de piruvato de quinase e lactato de desidrogenase (PK + LDH previa- mente misturados da Sigma), 2 mM de ribulose, 0,5 mM de NADH, e extrato de célula.
Nos ensaios iniciais, a D-ribulose foi usada como um substrato.
Nos ensaios posteriores, foi usada a L-ribulose (ZuChem). Devido ao nível em geral elevado da expressão dessa enzima, os extratos foram diluídos 10 vezes em 50 mM de NaTES, pH 7,0, 100 mM de NaCl, 0,1 mM de MnCl2, 0,01% (v/v) de Tween 20. A reação foi executada à temperatura ambiente e a mudança na absorbância a 340 nm foi monitorada por 10 minutos a inter- valos de 15 segundos.
Os ensaios foram realizados em cavidades de micro- título com um volume final do ensaio de 200 µl.
A reação foi iniciada pela adição de NADH sozinho ou com L-ribulose.
O valor de ∆A340 medido foi convertido em mM ao usar um comprimento de trajetória eficaz de 0,576 cm (determinado ao medir a absorbância de uma solução de NADH sob essas condições versus aquela medido em uma cubeta de 11 cm e ao aplicando a lei de Beer). Nos ensaios com a D-ribulose como substrato, uma atividade específica líquida de 1,0 unidades/mg de proteína foi medida em extratos crus da cepa 2902 (1 cópia de araB de B. thetaiotaomicron). Nos ensaios com a L-ribulose como substrato, a atividade específica de RK nos extratos da cepa 3409 (1 cópia de araB de B. thetaiotaomicron, 2 cópias de cada um dos genes araA e araD de B. thetaiotaomicron) era de 1,4 unidade/MG de proteína.
Devido ao fato que o ensaio de RK mede a produção de ADP que pode resultar de qualquer atividade de quinase, ele tem uma atividade 5 elevada de fundo na ausência de L-ribulose (cerca de 1/3 tanto quanto na presença de L-ribulose). Essa atividade de fundo está presente na cepa pa- terna e não aumenta quando a L-ribulose é adicionada aos ensaios com ex- tratos dessas células.
A atividade de fundo não é diminuída substancialmen- te nos extratos dialisados, sugerindo que as quinases utilizam substratos macromoleculares tais como proteínas ou ácidos nucleicos.
Nas atividades específicas listadas acima, a atividade de fundo na ausência do substrato é subtraída da atividade medida na presença de L-ribulose.
Exemplo 2B: Análise da atividade de RE: RE reconverte a L-ribulose 5-P e a D-xilulose 5-P.
A L-ribulose 5-P não é comercialmente disponível e desse modo precisa ser produzida em uma reação separada ou em uma reação acoplada por RK.
Uma vez que RK de B. thetaiotaomicron é altamente expressa e/ou ativa em I. orientalis, os extratos das células com RK têm em geral o excesso um excesso RK em relação à atividade de RE, o que significa que elas produzem um excesso de L-ribulose 5-P a partir de L-ribulose e ATP.
A D-xilulose 5-P é detectada em um esquema de reação acopla- da ao adicionar D-ribose 5-P e TKL mais tiamina PP para gerar S7P mais G3P; ao converter G3P em diidróxi acetona P (DHAP) com isomerase de triosefosfato (TPI); e ao reduzir DHAP em glicerol 3-P com glicerol 3-P desi- drogenase dependente de NADH (G3PDH). A atividade de RE é acoplada desse modo à oxidação de NADH.
As enzimas de acoplamento são adicio- nadas de modo exógeno, mas também estão provavelmente presentes no extrato, o que não deve afetar os resultados uma vez que elas todas devem estar em um excesso em relação à atividade de RE.
Os ensaios continham 50 mM de Tris HCl, pH 7,5, 3,3 mM de MgCl2, 2 mM de ATP, 0,1 mM de TPP, 1 mM de D-ribose 5-P, 0,05 U/ml de transcetolase, 4,5 U/ml de TPI, 1,5 U/ml de G3PDH, 4 mM de L-ribulose e
0,5 mM de NADH.
A reação foi executada à temperatura ambiente e a mu- dança na absorbância a 340 nm foi monitorada por 10 minutos a intervalos de 15 segundos.
Os ensaios foram realizados em cavidades de microtítulo com um volume final do ensaio de 200 µl.
A reação foi iniciada pela adição 5 de NADH sozinho ou com L-ribulose.
O valor de ∆A340 medido foi converti- do em mM ao usar um comprimento de trajetória eficaz de 0,576 cm (deter- minado ao medir a absorbância de uma solução de NADH sob essas condi- ções versus aquela medida em uma cubeta de 11 cm e ao aplicar a lei de Beer). Depois que a atividade de fundo foi subtraída, a cepa 2908 de I. orientalis, que continha cópias simples dos genes araB e araD de B. thetaio- taomicron, tinham 0,022 U/mg de atividade de RE.
A cepa 3005, que conti- nha araD de E. coli e araB de B. thetaiotaomicron, tinha uma atividade simi- lar à cepa 2908. A cepa 3007, que continha araD de L. plantarum e araB de B. thetaiotaomicron, tinha cerca da metade da atividade específica das ou- tras duas cepas.
Exemplo 2C: Análise da atividade de AI: Os ensaios de AI continham 100 mM de Na TES, pH 7,0, 0,3 mM de MnCl2, 37,5 unidades/ml de desidrogenase de sorbitol (SIGMA S3764), 0,5 mM de NADH, 66,7 mM de L-arabinose, e extrato de célula.
A reação foi realizada à temperatura ambiente e a mudança na absorbância a 340 nm foi monitorada por 10 minutos a intervalos de 15 segundos.
Os en- saios foram realizados em cavidades de microtítulo a um volume final do ensaio de 200 µl.
A reação foi iniciada pela adição de NADH sozinho ou com L-arabinose.
O valor de ∆A340 medido foi convertido em mM ao usar um comprimento de trajetória eficaz de 0,576 cm (determinado ao medir a ab- sorbância de uma solução de NADH sob essas condições versus aquela medido em uma cubeta de 11 cm e ao aplicar a lei de Beer). A cepa yJY16 (1 cópia cada de um de araA e araB de B. thetaio- taomicron) exibiu uma atividade específica de 0,045 unidade/mg, ao passo que yJY17 (uma cópia de cada uma de araA de L. plantarum e araB de B. thetaiotaomicron) e yJY18 (uma cópia de cada um de araA de B. lichenifor-
mis e araB de B. thetaiotaomicron) exibiram atividades específicas de 0,012 e 0,010 unidades/mg, respectivamente.
As atividades significativamente mais altamente específicas foram medidas nos extratos das células que con- têm duas cópias de araA de B. thetaiotaomicron (yJI24 e 3409), que podem 5 ser uma reflexão da instabilidade de heterocromossomas em I. orientalis.
A atividade de AI nos extratos da cepa 3409 que contém a rota de arabinose completa era de 0,24 U/mg.
Esse número era mais elevado do que medido na experiência preliminar por diversas razões: essa cepa conti- nha duas cópias do gene araA de B. thetaiotaomicron integrado em vez de uma; a quantidade de desidrogenase de sorbitol da enzima de acoplamento foi otimizada; e o crescimento da célula e a extração da proteína foram me- lhorados.
Exemplo 3: Caracterização de cepas de I. orientalis contendo genes da rota de arabinose de B. thetaiotaomicron: Duas cepas irmãs de 3409 (iJY30.1 e iJY30.2) e a cepa 1822 (cepa paterna) foram testadas quanto à sua capacidade de fermentar a ara- binose em etanol.
As cepas iJY30.1 e JY30.2 continham cópias de todos os três genes da rota de arabinose de B. thetaiotaomicron (duas cópias de cada um de araA e araD, uma cópia de araB). As células foram cultivadas em YP mais 40 g/l de arabinose a 37°C e a 100 rpm.
Depois de 132 horas, ambas as cepas da rota de arabinose de B. thetaiotaomicron consumiram cerca de 22 g/l de arabinose enquanto produziram cerca de 4 g/l de etanol (Figura 2). Exemplo 4: Integração de genes da rota de arabinose de B. the- taiotaomicron em cepa de I. orientalis projetada geneticamente para utilizar a xilose: A cepa 3489 de I. orientalis tinha sido projetada previamente pa- ra fermentar a xilose em etanol.
A cepa 3489 continha quatro cópias de um gene exógeno que codifica XI de B. thetaiotaomicron., duas cópias de um gene exógeno nativo que codifica XK, duas cópias de cada um dos genes da rota de fosfato de pentose não oxidantes exógenos nativos TAL, RKI e RPE e duas cópias de um gene ADH1 exogeno nativo, tudo sob o controle de promotores glicolíticos exógenos nativos fortes.
A construção dessa cepa também incluiu supressões de genes para XR, XDH, S141G725, S141G4738, S141g1158-1159, S141G8160 e GAL6. A cepa 3489 não tinha capacidade de fermentar arabinose em etanol.
Portanto, os genes araA e araD de B. thetaiotaomicron foram inseridos na cepa 3489 no sítio de um 5 homólogo putativo de ADH de I. orientalis (SEQ ID NO: 74, locus S141G9091) e o gene araB de B. thetaiotaomicron foi inserido no sítio de um segundo homólogo de ADH (SEQ ID NO: 84, locus S141G1202). Exemplo 4A: Construção do vetor de inserção de araA e araD de B. thetaiotaomicron: Para gerar um vetor de inserção com o gene araA de B. thetaio- taomicron ligado ao promotor TDH3 de I. orientalis e ao terminador de TAL, um fragmento de XhoI/PacI do vetor pJY39 que contém o terminador de TAL, os sítios alvo XIL1 e um cassete de seleção URA3 foi ligado a um fragmento de XhoI/PacI de pJY15 (exemplo 1C) contendo o promotor TDH3 de I. orientalis e o gene araA de B. thetaiotaomicron.
Os plasmídios das co- lônias transformadas com a mistura de ligação foram selecionados por di- gestões da enzima de restrição com HindIII e SphI e o plasmídio correto foi nomeado como pLUN111. Para combinar os genes araA e araD em um único plasmídio, um fragmento de AscI/ApaI de pLUN111 contendo o promotor TDH3 de I. orientalis, o gene araD de B. thetaiotaomicron, o terminador TAL de I. orien- talis, o cassete de seleção URA3 e a sequência alvo a jusante foi ligada a um fragmento de AscI/ApaI de pJY33, que continha a cadeia principal do vetor, a sequência alvo a montante, o promotor ENO1 de I. orientalis, o gene araD de B. thetaiotaomicron e o terminador PDC de I. orientalis.
Os plasmí- dios das colônias transformadas com a ligação foram selecionados para a inserção desejada por meio de digestão de restrição.
O plasmídio resultante, pLUN112, continha o gene araA de B. thetaiotamicron sob o controle do promotor TDH3 e o gene araD de B. thetaiotaomicron sob o controle do promotor ENO1. Um fragmento de NotI de pLUN112 contendo os genes araA e araD e seus elementos reguladores, bem como o cassete de seleção URA3,
foi ligado ao vetor pHJJ22 cortado com Notl. pHJJ22 continha as regiões a montante e a jusante do gene 9091 separadas por um sítio de NotI.
Desse modo, a ligação inseriu araA/araD entre as 9091 sequências de flanqueio.
As colônias que resultam da transformação da ligação foram selecionadas 5 para a presença da inserção desejada por meio de PCR de colônia.
Os plasmídios foram isolados para os clones que têm os produtos previstos de PCR e os plasmídios isolados foram selecionados para a orientação da in- serção de araA/araD ao usar uma digestão de restrição de SfI.
Os plasmí- dios foram nomeados como pLUN113 (orientação 1) e pLUN114 (orientação 2). Exemplo 4B: Construção do vetor de inserção araB de B. thetai- otaomicron: Para gerar um vetor de inserção com o gene araB de B. thetaio- taomicron ligado ao promotor ENO1 entre as regiões de flanqueio de gene 1202, pHJJ74 cortado com Notl, um vetor que contém as sequências alvo a montante e a jusante separadas por um sítio de NotI, foi ligado à inserção de NotI de pHJJ2 (Exemplo 1A), que continha o promotor ENO1 de I. orientalis, o gene araB de B. thetaiotaomicron, o terminador PDC de I. orientalis e o cassete de seleção URA3. O DNA do plasmídio foi isolado das colônias transformadas com a ligação e selecionado por meio de digestão com SphI e XhoI.
Os plasmídios foram nomeados como pLUN125 (orientação 1) e pLUN126 (orientação 2). Para gerar um vetor de inserção com o gene araB ligado ao promotor TEF1 entre as regiões de flanqueio de gene 1202, pHJJ74 cortado com Notl foi ligado à inserção NotI de pHJJ33 (Exemplo 1C), que continha o promotor TEF1 de I. orientalis, o gene araB de B. thetaiotaomicron, o termi- nador PDC de I. orientalis e o cassete de seleção URA3. O DNA do plasmí- dio foi isolado das colônias transformadas com a ligação e selecionado por meio de digestão com SphI e XhoI.
Os plasmídios foram nomeados como pLUN127 (orientação 1) e pLUN128 (orientação 2). Exemplo 4C: Integração de araA e araD de B. thetaiotaomicron na cepa 3514 de I. orientalis
A cepa yHJJ84 de I. orientalis (3514), um derivado de ura- da cepa 3489, foi transformada com pLUN113 linearizado com ApaI/SacI (E- xemplo 4A) e chapeada no meio de ScD-ura.
O DNA genômico dos trans- formantes purificados foi selecionado por meio de PCR e os clones identifi- 5 cados como contendo um cassete de araA/araD corretamente inserido foram nomeados como yARA21. O gene marcador URA3 de yARA21 foi laçado ao cultivar células durante toda a noite em YPD e por meio de chapeamento em placas de ScD-FOA.
O DNA genômico preparado de colônias laço foi selecionado por meio de PCR através de ambas as junções de integração e uma colônia (yARA22) foi identificada como tendo retido a integração mas perdido o gene URA3. Essa colônia foi chapeada em placas de ScD-ura para verificar a falta de crescimento sem suplemento de uracil.
O segundo cassete da integração de araA/araD foi adicionado a yARA22 por meio de transformação com pLUN114 linearizado com A- paI/SacI (Exemplo 4A). Os transformantes foram selecionados em placas de ScD-ura e a única colônia foi purificada.
As duas junções para cada locus foram selecionadas em reações de PCR separadas.
Os clones identificados como contendo ambas as cópias de araA/araD inseridos corretamente foram nomeados como yARA25. O gene marcador URA3 de yARA25 foi laçado ao cultivar as cé- lulas durante toda a noite em YPD e por meio de chapeamento em placas de ScD-FOA.
As colônias laço foram selecionadas em duas reações de PCR separadas para identificar as colônias que mantiveram a integração deseja- da.
Esses clones foram chapeados em ScD-ura para verificar a falta do crescimento sem suplementação de uracil.
Os clones de laço corretos foram nomeados como yARA26. Exemplo 4D: Integração de araB de B. thetaiotaomicron na cepa yARA26 de I. orientalis: Para integrar a primeira cópia do gene araB de B. thetaiotaomi- cron ligado ao promotor ENO1, a cepa iARA26 de I. orientalis (Exemplo 4C) foi transformada com pLUN125 linearizado com ApaI/SacI (Exemplo 4B). Os transformantes foram selecionados em placas de ScD-ura e selecionados por meio de PCR através de ambas as junções de integração.
Os clones identificados como contendo o fragmento de ENO1:araB inseridos no locus 1202 foram nomeados como yARA29. 5 Para integrar a primeira cópia do gene araB de B. thetaiotaomi- cron ligado ao promotor TEF1, a cepa yARA26 de I. orientalis (Exemplo 4C) foi transformada com pLUN127 linearizado com ApaI/SacI (Exemplo 4B). Os transformantes foram selecionados em placas de ScD-ura e selecionados por meio de PCR através de ambas as junções de integração.
Os clones identificados como contendo o fragmento de TEF1:araB inseridos no locus 1202 foram nomeados como yARA30. Para laçar o gene de marcador URA3 de yARA29 e de yARA30, ambas as cepas foram cultivadas em YPD durante toda a noite e chapeadas em um meio de ScD-FOA.
As colônias simples de yARA29 foram lisadas e foram selecionadas em duas reações de PCR separadas.
Para os laços de yARA30, o DNA genômico foi preparado e selecionado em duas reações de PCR separadas.
As colônias de laço foram selecionadas por meio de PCR para identificar aquelas que tinham perdido o gene URA3 mas tinham manti- do a integração de araB.
Essas cepas foram chapeadas em replicata em ScD-ura para verificar a falta de crescimento sem uracil.
Os laços corretos de yARA29 foram nomeados como yARA33 e os laços corretos de yARA30 foram nomeados como yARA34. Para integrar a segunda cópia de araB ligada ao promotor E- NO1, a cepa yARA33 foi transformada com pLUN126 linearizado com A- paI/SacI (Exemplo 4B). Os transformantes foram selecionados em ScD-ura e selecionados em reações de PCR separadas para verificar ambas as jun- ções do evento de integração.
Os clones identificados como contendo a se- gunda cópia de ENO1:araB integrados corretamente foram designados co- mo cepa yARA36 (3936). Esses clones continham duas cópias de cada um dos genes araA, araB e araD de B. thetaiotaomicron, com os genes araB sob o controle do promotor ENO1. Para integrar a segunda cópia do araB ligada ao promotor TEF1,
a cepa iARA34 foi transformada com o fragmento de integração linearizado de pLUN128 digerido com ApaI/SacI (Exemplo 4B). O DNA genômico de transformantes de ura+ foram purificados e selecionados em reações de PCR separadas para verificar ambas as junções do evento de integração. 5 Os clones identificado como contendo a segunda cópia do gene TEF1:araB integrada corretamente foram designados como cepa yARA38 (3937). Esses clones continham duas cópias cada de um dos genes araA, araB e araD de B. thetaiotaomicron, com os genes araB sob o controle do promotor TEF1. As cepas geneticamente modificadas de I. orientalis geradas nos exemplos 4C e 4D são resumidas na Tabela 2.
Tabela 2: Nome da cepa araA araB araD 3489 (ura+), 3514/yHJJ84 (ura-) Fonte -- -- -- (cepa paterna de fermentação de xilose) No. de cópias 0 0 0 Promotor -- -- -- Localização -- -- -- yARA21 (ura+), yARA22 (ura-) Fonte B. thetaiotaomicron -- B. thetaiotaomicron No. de cópias 1 0 1 Promotor TDH3 -- ENO1 Localização 9091 -- 9091 yARA25 (ura+), yARA26 (ura-) Fonte B. thetaiotaomicron -- B. thetaiotaomicron No. de cópias 2 0 2
87/118 Promotor TDH3 -- ENO1 Localização 9091 -- 9091 yARA29 (ura+), yARA33 (ura-) Fonte B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron No. de cópias 2 1 2 Promotor TDH3 ENO1 ENO1 Localização 9091 1202 9091 yARA30 (ura+), yARA34 (ura-) Fonte B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron No. de cópias 2 1 2 Promotor TDH3 TEF1 ENO1 Localização 9091 1202 9091 3936/yARA36 Fonte B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron No. de cópias 2 2 2 Promotor TDH3 ENO1 ENO1 Localização 9091 1202 9091 3937/yARA38 (ura+), yLUN011 (ura-) Fonte B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron B. thetaiotaomicron No. de cópias 2 2 2 Promotor TDH3 TEF1 ENO1 Localização 9091 1202 9091
Exemplo 5: Caracterização das cepas de I. orientalis utilizando xilose projetadas geneticamente para conter genes da rota de arabinose de B. thetaiotaomicron: As cepas da rota dual de I. orientalis 3936 (Exemplo 4D; duas 5 cópias de cada um de TDH3:araA, ENO1:araB e ENO1:araD) e 3937 (E- xemplo 4D; duas cópias de cada um de TDH3:araA, TEF1:araB e E- NO1:araD) foram caracterizadas ao usar uma experiência em frasco de agi- tação.
As cepas de controle para essas experiências eram a cepa 3408 da rota de arabinose (Exemplo 1C) e a cepa yHJJ169 da rota de xilose (3922). A cepa 3922 contém a mesma base genética que a cepa 3489 (a cepa que utiliza xilose a partir da qual as cepas 3936 e 3937 foram derivadas), junto com as supressões nos sítios 9091 e 1202 que serviram como um sítio de integração para genes da rota de arabinose nas cepas da rota dual.
Desse modo, a única diferença genética entre a cepa 3922 e as cepas da rota dual 3936/3937 é a presença dos genes da rota de arabinose nestas últimas.
Todas as cepas foram cultivadas aerobicamente durante toda a noite em YP com 20 g/l de arabinose e a quantidade de cultura necessária para inoculação até um OD600 = 0,8 foi calculada.
O volume calculado da cultura foi centrifugado a 4.000 rpm por quatro minutos e a pelota de célula foi resuspensa em 500 µl de YP + 20 g/l de arabinose.
Isto foi usado para inocular frascos de agitação fermentativa até OD600 = 0,8. Devido ao cres- cimento residual em YP, esse protocolo foi suficiente para coletar biomassa suficiente para inocular a cepa 3922. As cepas 3936 e 3937 se comportaram de modo similar a ou li- geiramente melhor do que a cepa 3408 no que diz respeito ao consumo de arabinose e à produção de etanol (Figura 3), em que cada cepa consome cerca de 12-14 g de arabinose em 145 horas e produz cerca de 3-4 g/l de etanol.
Tal como esperado, a cepa 3922 não consumiu arabinose nem pro- duziu etanol.
Esses resultados confirmaram que as rotas de arabinose exó- gena nas cepas 3936 e 3937 estavam completas e conferiram a essas ce- pas a capacidade de fermentar a arabinose em etanol.
Todas as quatro cepas foram caracterizadas em seguida no meio YP que contém 20 g/l de dextrose, 80 g/l de xilose e 10 g/l de arabino- se ou 10 g/l de dextrose, 40 g/l de xilose e 10 g/l de arabinose.
As cepas 3936 e 3937 exibiram a capacidade de fermentar a xilose em etanol e se comportaram similarmente à cepa de controle 3922 no meio com menor teor 5 de açúcar (Figura 4). No meio com maior teor de açúcar, no entanto, a utili- zação de xilose foi diminuída nas cepas da rota dual em comparação à cepa 3922 da rota de xilose (Figura 5). Essa diminuição na utilização de xilose foi observada até mesmo nos meios que não contêm arabinose, indicando que uma das enzimas da rota de arabinose é responsável pela utilização diminu- ída de xilose.
O consumo de arabinose nas cepas da rota dual pareceu come- çar somente depois que a dextrose e a xilose eram esgotadas.
Nos meios com menor teor de xilose, as cepas da rota dual usaram cerca de 5 g/l de arabinose, mas esse nível de consumo requereu cerca de 160 horas uma vez que a arabinose foi consumida somente depois que a xilose foi esgotada (Figura 6). Nos meios com maior teor de xilose, o últimos 5 g de xilose não foram consumidos e nenhuma arabinose foi desse modo utilizada.
Exemplo 6: Utilização de L. citreum e gene araB de B. thetaiota- omicron otimizado com códon: A avaliação das cepas que têm rotas parciais de arabinose mos- trou que o efeito inibidor da rota na utilização de xilose resultou principal- mente da ação do gene araB.
Foram identificados araBs alternativos que têm uma atividade menor do que o araB otimizado com códon de B. thetaio- taomicron.
Um gene araB de B. thetaiotaomicron não otimizado com códon e um gene araB de L. citreum tiveram cerca de 1/100º e 1/33º da atividade do gene araB de B. thetaiotaomicron otimizado com códon, respectivamente.
Duas cópias de araBs de B. thetaiotaomicron otimizados com códons ou a- raBs de L. citreum foram integradas na cepa iARA26 (Exemplo 4C; contem duas cópias de araA e araD de B. thetaiotaomicron), resultando nas cepas 12216 e 12215, respectivamente.
Essas cepas foram testadas, junto com a cepa 3937 de controle, em meio YP com açúcares misturados (20 g/l de dex- trose, 80 g/l de xilose e 10 g/l de arabinose) e em um meio YP com 50 g/l de arabinose.
No meio de açúcares misturados, as cepas 12215 e 12216 exibi- ram uma utilização de xilose e uma produção de etanol melhores do que a cepa 3937 (Figuras 30 e 31). No meio contendo somente arabinose, a cepa 3937 teve um uso ligeiramente mais rápido de arabinose do que as cepas 5 12215 ou 12216 (Figura 32). Exemplo 7: Identificação de genes transportadores de xilose de K. marxianus: As cepas de I. orientalis projetadas geneticamente para a utiliza- ção de xilose não utilizam a xilose como uma fonte de carbono até que a vasta maioria da glicose no meio tenha sido utilizada.
Isto poderia ser devido à baixa absorção de xilose na célula em relação à absorção de glicose.
Se este fosse o caso, deveria ser esperado que as modificações que aumentam a absorção de xilose em células de levedura também aumentariam a utiliza- ção de xilose.
O genoma de K. marxianus foi selecionado para transportadores de açúcar não caracterizados a fim de avaliar o impacto desses transporta- dores no consumo de xilose.
Dois dos genes transportadores putativos iden- tificados nessa seleção, KHT105 e RAG4, foram selecionados para um es- tudo adicional.
As combinações BLAST mais próximas para ambos esses genes eram transportadores de hexose.
A sequência de nucleotídeos da região de codificação do gene KHT105 é indicada na SEQ ID NO: 1 e a se- quência de aminoácidos codificada pelo gene é indicada na SEQ ID NO: 2. A sequência de nucleotídeos da região de codificação do gene RAG4 é indica- da na SEQ ID NO: 3 e a sequência de aminoácidos codificada pelo gene é indicada na SEQ ID NO: 4. Exemplo 8: Caracterização de genes transportadores de xilose de K. marxianus: A análise BLAST dos genes transportadores de açúcar de K. marxianus putativos do Exemplo 7 indicou que ambos os genes compartilha- ram de seu grau mais elevado de homologia com os transportadores de he- xose.
Para determinar se os transportadores de açúcar codificados por estes genes também tinham a capacidade de transportar açúcares de pentose tais como a xilose, os genes foram clonados e caracterizados por vários ensaios de utilização de xilose.
Ambos os genes foram amplificados de DNA genômico de K. marxianus ao usar primers que continham sítios de restrição de XbaI e PacI 5 e os genes foram clonados com TOPO e arranjados em sequência.
Os ge- nes transportadores foram digeridos dos vetores de TOPO com XbaI e PacI e ligados ao vetor similarmente cortado pHJJ16, gerando os plasmídios pJY20 (KHT105) e pJY21 (RAG4). O vetor pHJJ16 contém uma sequência ARS de I. orientalis, o que permite a manutenção do plasmídio no citoplasma hospedeiro, de um promotor de PDC a montante do sítio de clonagem de XbaI-PacI e um marcador de seleção de URA3. As cepas de fermentação de xilose yJY15 (3250) e yJLJ70 de I. orientalis (3099) foram transformadas com os plasmídios pJY20, pJY21 e pHJJ16 (controle). Antes da transformação, a cepa 3250 continha duas có- pias de cada um de um gene XI exógeno de B. thetaiotaomicron, de um ge- ne endógeno XK nativo e de um gene XK exógeno de sequência nativa.
A cepa 3099 teve as mesmas mudanças genéticas que a cepa 3250, com du- as cópias adicionais do gene XI de B. thetaiotaomicron.
As cepas de I. orien- talis que contêm os genes XI e XK haviam mostrado previamente que exi- bem a utilização de xilose e a produção de etanol (consultar, por exemplo, o documento de patente WO04/099381). As células transformadas foram cha- peadas com xilose como a única fonte de carbono e o crescimento foi avali- ado.
Os transformantes exibiram um crescimento maior em placas de xilose em 48 horas versus a cepa de controle, indicando que ambos os genes fun- cionaram no transporte de xilose e que o transporte de xilose era um fator limitador na utilização de xilose em I. orientalis.
O plasmídio pJY27 foi gerado ao ligar um fragmento de XhoI/PacI de um vetor de integração AXR1 que contém o terminador PDC de I. orientalis e o cassete de seleção URA3 e um fragmento de XhoI/PacI que contém o promotor PDC de I. orientalis e o gene transportador KHT105 de K. marxianus.
O plasmídio resultante foi digerido com SacI e ApaI e os fragmentos de integração linearizados foram transformados na cepa 3099 de
I. orientalis.
As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR de para identificar as células com a integração desejada ao usar primers exter- nos de 5’ e 3' AXR1 em combinação com um primer homólogo ao promotor de PDC ou ao cassete de URA3. Uma das colônias positivas foi nomeada 5 como yJY19. O plasmídio pJY28 foi gerado ao ligar um fragmento de XbaI/PacI de um vetor de integração AXR1 que contém o promotor PDC de I. orientalis, o terminador, o cassete de seleção de URA3 e as sequências alvo de AXR1 e um fragmento de XbaI/PacI que contém o gene RAG4 de K. marxianus.
O fragmento de integração foi liberado pela digestão de pJY28 com ApaI e KpnI e os fragmentos de integração linearizados foram transfor- mados na cepa 3099 de I. orientalis.
As colônias de Ura+ foram seleciona- das por meio de PCR de colônia para identificar as células com a integração desejada no locus AXR1; tal colônia foi nomeada como yJY20. yJI19, yJY20 e a cepa 2973 de I. orientalis (versão de ura+ da cepa 3099) foram cultivadas em um meio que contém 20 g/l de glicose e 55 g/l de xilose a um pH 4,8. Ambas as cepas do transportador exibiram um consumo concomitante de glicose e xilose, ao passo que a cepa 2973 só consumiu xilose depois que a glicose foi esgotada (Figuras 7-9). Com base nesses resultados, uma segunda cópia de cada gene transportador foi integrada no genoma.
O marcador URA3 nas células yJY19 e yJY20 foi laçado por meio de chapeamento dessas cepas em placas de ScD-FOA.
As colônias foram selecionadas por meio de PCR de colônia para identificar as colônias que mantiveram a integração mas perderam o gene URA3. Uma das cepas positivas que resultaram de yJY19 foi nomeada como yJY25 e uma das cepas positivas que resultaram de yJY20 foi nomeada co- mo yJY26. Uma segunda cópia do cassete de expressão KHT105 de pJY27 foi integrada, tal como descrito acima, na cepa yJY25. As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR de colônia para identificar as células com a integração desejada no sítio AXR1 e tal clone foi nomeado como cepa yJY27 (3097). O marcador URA3 na cepa 3097 foi laçado por meio de cha-
peamento em placas de ScD-FOA após o cultivo durante toda a noite.
As colônias foram selecionadas por meio de PCR de colônia para confirmar a retenção da integração de KHT105 e uma das cepas de ura- resultantes foi nomeada como yJY32. A yJY32 foi transformada com o DNA linearizado que 5 contém o locus de URA3 do tipo selvagem e as colônias de ura+ foram sele- cionadas por meio de PCR de colônia para identificar as colônias com a in- tegração correta.
Uma dessas cepas que têm URA3 em seu locus original foi nomeada como yJY34 (3081). Desse modo, havia três cepas separadas que contêm duas cópias do gene KHT105: 3097 (ura+), yJY32 (ura -) e 3081 (u- ra+). Uma segunda cópia do cassete de expressão RAG4 de pJY28 foi integrada, tal como descrito acima, na cepa yJY26. As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR de colônia para identificar as células com a inserção desejada no sítio AXR1 e tal clone foi nomeado como cepa yJY28. As cepas 3097 (duas cópias de KHT105), yJY28 (duas cópias de RAG4) e 2973 (paterna) foram cultivadas durante toda a noite em YPD a 37°C e a 250 rpm.
As culturas noturnas foram colhid as e resuspensas até um OD600 alvo de 3,0 em um meio YP + 40 g/l de glicose + 40 g/l de xilose (pH 4,8, 37ºC, 100 rpm). A cepa 3097 exibiu um consumo concomitante de glicose/xilose maior do que a cepa 2973 de controle quando a concentração de glicose estava abaixo de 20 g/l (Figura 10). Toda a glicose foi consumida em cerca de cinco horas pela cepa 2973, versus cerca de oito horas para as cepas 3097 e yJY28. A xilose foi utilizado a uma razão mais rápida pelas cepas 3097 e yJY28 versus o pai depois que toda a glicose tinha sido consumida (Figura 11). A combinação de um consumo concomitante maior e velocida- des mais rápidas de utilização de xilose conduziu a uma produção maior de etanol na cepa 3097 (Figura 12). A cepa 3097 produziu 29 g/l de etanol em 25 horas com 7 g/l de xilose restantes.
A cepa 2973 de controle produziu 24 g/l de etanol em 25 horas com 13 g/l de xilose restantes.
A cepa yJY28 pro- duziu 22 g/l de etanol com 16 g/l de xilose restantes.
Esses resultados mos-
traram que a incorporação do gene transportador KHT105 aumentou a pro- dutividade de etanol de uma mistura de substrato de glicose/xilose.
As cepas de I. orientalis que contêm genes transportadores de K. marxianus são resumidas na Tabela 3.
Tabela 3: Nome da cepa Cepa Gene transportador No. de Localização paterna cópias da inserção 2973 (ura+), 3099/yJLJ70 (ura-) (cepa paterna de fermenta- -- -- 0 -- ção de xilose) yACN55 (ura-) -- -- 0 -- (cepa paterna de fermentação de xilose com os genes TAL, RKI e RPE) 3408/yHJJ47 (ura+), yJY39 (ura-) -- -- 0 -- (cepa paterna com rota de arabinose de B. thetaiotaomicron completa, supressão de XYL1 XYL2, e AXR1)
95/118 3937/yARA38 (ura+), yLUN011 (ura-) -- -- 0 -- (cepa paterna com rota de arabinose de B. thetaiotaomicron completo, supressão de 9091 e 1202) 12053/yGP44 (ura+), yLUN027 (ura-) -- -- 0 -- (cepa paterna tolerante a etanol) yJY19 (ura+), yJY25 (ura-) 3099 KHT105 de K. marxianus 1 AXR1 (1) yJY20 (ura+), yJY26 (ura-) 3099 RAG4 de K. marxianus 1 AXR1 (1) 3097/yJY27 (ura+), yJY32 (ura-), 3081/yJY34 (URA3 reintegra- yJY25 KHT105 de K. marxianus 2 AXR1 (2) do no lócus original) yJY28 yJY26 RAG4 de K. marxianus 2 AXR1 (2) yACN59 (ura+), yACN60 (ura+), yACN67 (ura-), yACN68 (ura-) yACN55 KHT105 de K. marxianus 1 9091 (1) 3415/yACN71 (ura+), yACN72 (ura+), yACN74 (ura-), yACN75 yACN67 KHT105 de K. marxianus 2 9091 (2) (ura-), 4141 3849 (ura+), yHJJ172 (ura-) (2X ADH1) 3415 KHT105 de K. marxianus 2 9091 (2) 4014 (ura+), yHJJ182 (ura-), 4084 yHJJ172 KHT105 de K. marxianus 3 9091 (2), S141G4546 (1) 4083 (ura+), yLUN005 (ura-) yHJJ172 KHT105 de K. marxianus 3 9091 (2), ALD5680 (1) 4085 yHJJ182 KHT105 de K. marxianus 4 9091 (2), S141G4546 (2) 4086/yLUN007 (ura+), 4117 (ura-) yLUN005 KHT105 de K. marxianus 4 9091 (2), ALD5680 (2) 12037/yLUN013 4117 KHT105 de K. marxianus 6 9091 (2), ALD5680 (2), S141G4546 (2)
Tabela 3: Nome da cepa Cepa Gene transportador No. de Localização paterna cópias da inserção 3812/yARA19 yJY39 KHT105 de K. marxianus 1 S141G4546 (1) yLUN031 (ura+), yLUN033 (ura-) yLUN027 KHT105 de K. marxianus 1 ALD5680 (1) 12125/yLUN036 yLUN033 KHT105 de K. marxianus 2 ALD5680 (2) yLUN015 (ura+), yLUN016 (ura-) yLUN011 KHT105 de K. marxianus 1 S141G4546 (1) 12038/yLUN018 yLUN016 KHT105 de K. marxianus 2 S141G4546 (2)
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Exemplo 9: Integração do gene transportador KHT105 de K. marxianus em uma cepa da rota de xilose de I. orientalis mais avançada: Uma cepa de I. orientalis modificada que contém o transportador KHT105 de K. marxianus em combinação com e rota de utilização de xilose 5 XI/XK, a superexpressão dos genes de fosfato de pentose não oxidante e a inativação do gene 9091 foi analisada quanto à sua capacidade de fermentar a xilose e a glicose em etanol em relação a uma cepa comparável sem o transportador.
Um fragmento de NotI que contém o cassete URA3 foi introduzi- do no sítio NotI de pHJJ22 (Exemplo 4A) para criar os 9091 plasmídios de supressão pHJJ27 (orientação 1) e pHJJ28 (orientação 2). Um fragmento NotI do vetor pJY27 (Exemplo 8) que contém o promotor de PDC de I. orientalis, o gene KHT105 transportador de K. marxi- anus, o terminador de PDC de I. orientalis e o cassete de seleção URA3 foi clonado em pHJJ22 (Exemplo 4A) para criar os vetores de expressão KHT105 de pHJJ22 (orientação 1) e pHJJ24 (orientação 2). O pHJJ23 foi digerido com ApaI e KpnI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado em células yACN55. yACN55 é uma cepa de ura- que contém quatro cópias de um gene exógeno XI de B. thetaiotaomicron, duas cópias de um gene XK exógeno de sequên- cia nativa e duas cópias de cada um dos genes exógenos da rota de fosfato de pentose-pentose de sequência nativa (TAL, RKI, RPE) além das cópias endógenas de genes XK, TAL, TKL, RPE e RKI.
O ura+ paterno de yACN55 é a cepa 3356/yACN53. Os transformantes foram selecionados e purificados em placas de ScD-ura.
As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR de colônia para a integração correta no locus 9091. Dois isolatos foram nomea- dos como yACN59 e yACN60. A cepa yACN59 foi cultivada durante toda a noite em YPD e chapeada em placas de ScD-FOA para laçar o gene URA3. PCR de colônia foi usada para confirmar a retenção da integração e dois isolatos foram nomeados como yACN67 e yACN68. O pHJJ24 foi digerido com ApaI e KpnI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado em células yACN67. Os transformantes foram selecionados e purificados em placas de ScD-ura.
As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR de colônia para a integração correta.
Dois isolatos foram nomeados como cepas yACN71 5 (3415) e yACN72. A cepa 3415 foi cultivada durante toda a noite em YPD e chapeada em placas de ScD-FOA para laçar o gene URA3. PCR de colônia foi usada para confirmar a integração correta no locus 9091 e dois de tais isolatos foram nomeados como yACN74 e yACN75. O pHJJ28 foi digerido com ApaI e SacI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado em células yACN55. Os transformantes foram selecionados e purificados em placas de ScD-ura.
As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR de colônia para a integração correta no locus 9091 e dois de tais isolatos foram nomeados como yACN61 e yACN62. A cepa yACN61 foi cultivada durante toda a noite no meio YPD e chapeada em placas de ScD-FOA para laçar o gene URA3. PCR de colônia foi usada para confirmar a retenção da integração; dois de tais isolatos foram nomeados como yACN69 e yACN70. O pHJJ27 foi digerido com ApaI e SacI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado em células yACN69. Os transformantes foram selecionados e purificados em placas de ScD-ura.
As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR de colônia para a integração correta no locus 9091 e tal isolato foi nomeado como cepa yACN73 (3416). As cepas 3415 (2 cópias de KHT105, ambas as cópias de 9091 suprimidas) e 3416 (ambas as cópias de 9091 suprimidas) foram caracteri- zadas nos fermentadores para o desempenho em meio de hidrolisato.
Os laços da biomassa das placas de YPD foram usados para inocular frascos tampados de 250 ml que contêm 100 ml de meio definido (DMDX) contendo 20 g/l de dextrose e 80 g/l de xilose e o pH ajustado em cerca de 5,0. O meio definidos continha a ureia como uma fonte de nitrogênio e um tampão de 0,2 M MES.
As células foram incubadas a 250 rpm e a 37°C por 15-24 horas e foram colhidas na fase exponencial de crescimento quase tardia.
As culturas foram misturadas com o material de glicerol a 80% e separadas em alíquo- tas de 1 ml. 50 a 400 µl de cada alíquota foram transferidos a 100 ml do meio em um frasco de agitação de 250 ml, incubados a 250 rpm e a 37°C por 15-24 horas e colhidos no crescimento exponencial quase tardio.
As a- 5 mostras de 35 a 40 ml foram colhidas e inoculadas nos vasos de fermenta- ção de batelada que contêm vários meios de hidrolisato.
As amostras foram colhidas a intervalos de 4 a 8 horas durante toda a fermentação e testadas quanto a OD600 ao usar um espectrofotômetro e quanto aos substratos e níveis do produto ao usar análises de HPLC.
A cepa 3415 exibiu um aumento de 80% no consumo de xilose e na taxa da produção de etanol em meio DMDX de hidrolisato de palha de milho a 30% (CSH) a um pH 5,8 (Figura 13). Esses resultados confirmam que a expressão de KHT105 aumenta o consumo de xilose e o título do eta- nol em I. orientalis cultivado sob condições fermentativa em meios de hidroli- sato.
Similarmente, um aumento de 75% na taxa de produção de etanol foi visto para 3415 em relação a 3416 em um meio de hidrolisato a 15% (CSH a 15% de 5 g/l de DMDX de ácido acético) a um pH 4,9. Exemplo 10: Efeito de KHT105 de K. marxianus no consumo de arabinose em cepas de I. orientalis contendo araA, araB e araD de B. thetai- otaomicron: Uma única cópia do gene KHT105 de K. marxianus foi integrada na cepa 3408 de I. orientalis (Exemplo 1C; contém duas cópias de cada um dos genes araA, araB e araD de B. thetaiotaomicron inseridos nos loci XYL2, XIL1 e AXR1) no locus S141G4546 para avaliar respectivamente o efeito do transportador no consumo de arabinose.
O locus S141G4546 tem uma ho- mologia em relação às desidrogenases de sorbitol, butano diol e glicerol.
O pSK1 é um vetor que contém as regiões a montante e a jusan- te para o locus S141G4546, separadas por um sítio de restrição de NotI.
O pSKJ1 digerido com NotI foi ligado ao fragmento de NotI de pJY27 (Exemplo 8) que contém o gene promotor de PDC de I. orientalis, KHT105 de K. mar- xianus, terminador de PDC de I. orientalis e cassete de seleção de URA3. O DNA do plasmídio das colônias transformadas com a ligação foi selecionado por meio de digestão de restrição.
Os plasmídios com a inserção desejada foram nomeados como pLUN108 (orientação 1) e pLUN109 (orientação 2). O pLUN108 foi digerido com ApaI e SacI para liberar o fragmen- to de integração e o DNA linearizado foi transformado em células yJY39 (a 5 cepa ura- derivada da cepa 3408/yHJJ47). Os transformantes foram selecio- nados e purificados em placas de ScD-ura.
O DNA genômico isolado das colônias foi selecionado por meio de PCR para identificar as colônias que têm KHT105 introduzido no locus S141G4546 e tal cepa foi identificada co- mo iARA19 (3812). A cepa 3812 foi testada para a utilização da arabinose em uma experiência em frasco de agitação.
As células foram cultivadas durante toda a noite em 50 ml de YPD e inoculadas em 50 ml de YP + 40 g/l de arabinose e 10 g/l de dextrose.
Os frascos de agitação em duplicata foram inoculados até um OD600 = 0,4 e cultivados a 37°C e a 100 rpm.
A cepa ura+ paterna, cepa 3408, foi empregada como controle.
A dextrose foi esgotada por todas as cepas antes de 25 horas.
A adição de uma única cópia do gene KHT105 resultou em um aumento pe- queno na utilização de arabinose (~5 g a mais do que a cepa paterna) e um rendimento ligeiramente mais elevado de etanol depois de 100 horas (Figura 14). Exemplo 11: Integração do gene transportador KHT105 de K. marxianus no locus S141G4546 de uma cepa da rota dual de I. orientalis: O gene transportador KHT105 de K. marxianus foi integrado no derivado ura- da cepa 3937 de I. orientalis (Exemplo 4D; contém duas cópias de cada um dos genes araA, araB e araD de B. thetaiotaomicron inseridos nos loci 9091, 1202 e 9091, respectivamente), que tinham exibido a capaci- dade de fermentar a xilose e a arabinose em etanol (Exemplo 5). Foi construído um cassete de integração que contém o gene transportador KHT105 de K. marxianus entre as regiões de flanqueio S141G4546. Para construir o vetor de integração, o fragmento de NotI que contêm um promotor de PDC, um gene KHT105, um terminador de PDC e um cassete da seleção URA3 foi ligado a pSK1 desfosforilado cortado com
NotI, (vetor TOPO com S141G4546 a montante e a jusante separados pelo sítio de NotI). As colônias transformadas com a ligação foram selecionadas por meio de PCR quanto à direcionalidade e os vetores com a inserção de- sejada foram nomeados como pHJJ86 (orientação 1) e pHJJ87 (orientação 5 2). O pHJJ87 foi digerido com ApaI e SacI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado em iLUN011 (versão ura- da cepa 3937). As colônias de transformantes foram selecionadas e purifica- das em placas de ScD-ura e selecionadas em duas reações de PCR sepa- radas Os clones que exibiram produtos de PCR que indicam a integração correta de KHT105 no locus S141G4546 foram designados como yLUN015. O yLUN015 foi cultivado durante toda a noite em YPD e chapea- do em placas de ScD-FOA.
As colônias de laço foram purificadas em placas de YPD e selecionadas em duas reações de PCR separadas.
Um clone foi identificado como tendo mantido a integração mas perdido o gene URA3. Essa cepa (yLUN016) foi chapeada em repliocata em SCD-ura para confir- mar a incapacidade de crescer sem uracil O pHJJ86 foi digerido com ApaI e SacI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado em yLUN016. Os trans- formantes foram selecionados e purificados em placas de ScD-ura e sele- cionados por meio de PCR através de todas as quatro junções de integra- ção.
Os clones identificado como contendo ambas as cópias do gene KHT105 integrado no locus S141G4546 foram designados como cepa yLUN018 (12038). Exemplo 12: Caracterização da cepa da rota dual de L. orientalis que contém duas cópias do gene transportador de KHT105 de K. marxia- nus: A capacidade da cepa 12038 de I. orientalis (Exemplo 11) e da sua cepa parental 3937 de fermentar a arabinose e a xilose em etanol foi avaliada em experiências em frasco de agitação.
As cepas foram cultivadas a 37°C e a 100 rpm em: 1) YP + 20 g/l de dextrose, 80 g/l de xilose e 10 g/l de arabinose, pH 5,1 (YP20D/80X/10A), ou então em 2) YP + 10 g/l de dex-
trose, 40g/l de xilose e 10 g/l de arabinose, pH 5,1 (YP10D/40X/10A). No meio de YP20D/80X/10A, a cepa 12038 exibiu um aumento significativo no consumo de xilose versus a cepa parental 3937 (Figura 15). Esse aumento no consumo de xilose correspondeu a um aumento na produ- 5 ção de etanol (Figura 15). As taxas de consumo de xilose na cepa 12038 nesse meio eram similares àquelas vistas em cepas de levedura sem a rota bacteriana de arabinose (por exemplo, a cepa 3922). A cepa 12038 come- çou o consumo de arabinose mais cedo na fermentação, provavelmente de- vido a um esgotamento mais adiantado de xilose, e usou a cerca de 40% mais de arabinose em comparação à cepa parental 3937 (Figura 16). O aumento nas taxas de consumo de xilose para a cepa 12038 em relação à sua cepa paterna não foi tão grande no meio de YP10D/ 40X/10A quanto no meio com maior teor de açúcar (Figura 17). A cepa 12038 exibiu outra vez um consumo adiantado de arabinose e um aumento no total de arabinose usada, mas com uma vantagem menor do que aquela que foi vista no meio com maior teor de açúcar (Figura 18). Esses resultados estabelecem que as células de levedura que contêm genes bacterianos da rota de arabinose e de xilose e o gene trans- portador KHT105 têm a capacidade de fermentar a arabinose e a xilose em etanol de uma maneira eficiente.
Exemplo 13: Construção da cepa knockout ALD5680 de I. orien- talis: A desidrogenase do aldeído (ALD) converte unidirecionalmente o acetaldeído em acetato e a expressão de ALD pode desviar o carbono da produção de etanol.
A atividade de ALD é muito importante para o funciona- mento do desvio de PDH na levedura; a redução da atividade de ALD pode fazer com que a levedura utilize mais acetato do meio.
Em S. cerevisiae, as duas principais ALDs são codificadas pelos genes ALD4 e ALD6. Em I. ori- entalis, os homólogos de ALD incluem S141G5680 ("ALD5680"), S141G9161 ("ALD9161") e S141G6502 ("ALD6502"), em que ALD9161 exi- be a expressão média mais elevada.
ALD6502 é mais similar a ALD3 de S. cerevisiae, que pode funcionar no metabolismo de β-alanina e parece ser citoplásmico com base na sequência de proteínas.
ALD5680 e ALD9161 codificam proteínas com uma sequência líder típica e a expressão de ambos foi realçada com crescimento em xilose e diminuiu pela adição de acetato.
A sequência de nucleotídeos da região de codificação de ALD5680 é indicada 5 na SEQ ID NO: 72 e a sequência do polipeptídeo de ALD5680 é indicada na SEQ ID NO: 73. As tentativas de inativar o locus ALD9161 em I. orientalis foram mal sucedidas, sugerindo que esse locus pode ser essencial.
No en- tanto, ambas as cópias do locus ALD5680 foram inativadas na cepa 3489 de I. orientalis (previamente projetada geneticamente para fermentar a xilose em etanol) para avaliar o efeito na utilização de açúcar e de acetato e na produção de etanol.
As regiões a montante e a jusante de ALD5680 foram amplifica- das a partir do DNA genômico de I. orientalis e os fragmentos resultantes foram purificados com gel.
O fragmento a jusante foi digerido com ApaI e NotI e o fragmento a montante foi digerido com NotI e SacI.
Os fragmentos digeridos foram ligados ao vetor de TOPO cortado com ApaI/SacI em uma ligação de três partes.
As colônias transformadas com a ligação foram sele- cionadas por meio de PCR para a inserção correta e a sequência de inser- ção foi confirmada pelo arranjo em sequência do DNA.
Esse plasmídio foi nomeado como pHJJ75. Um fragmento de NotI que contém o cassete de seleção URA3 foi ligado a pHJJ75 cortado com NotI.
As colônias transfor- madas com a ligação foram selecionadas quanto à direcionalidade de inser- ção.
Os vetores que representam as duas orientações foram nomeados co- mo pHJJ78 e pHJJ79. O pHJJ79 foi cortado com ApaI e SacI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado na cepa 3514, um deri- vado ura- da cepa 3489. Os transformantes foram listados para a purificação e selecionados por meio de PCR para a integração correta no locus ALD5680. yHJJ114 foi identificado como contendo uma cópia do knockout de ALD5680. yHJJ114 foi cultivado durante toda a noite em YPD e chapeado no meio de ScD-FOA para selecionar para laços do gene URA3. Dois isola- tos ura- resultantes foram confirmados por meio de PCR como tendo manti-
do o knockout de ALD5680. Esses isolatos foram nomeados como yHJJ118 e yHJJ119. O pHJJ78 foi cortado com ApaI e SacI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado em yHJJ118. Os trans- 5 formantes de Ura+ foram listados para a purificação e as únicas colônias foram selecionadas por meio de PCR para a integração correta no locus ALD5680. As cepas yHJJ123 e yHJJ124 (3861) foram identificadas como tendo ambas as cópias de ALD5680 suprimidas.
Exemplo 14: Caracterização da cepa de knockout ALD5680 de I. orientalis: As cepas de knockout ALD5680 do Exemplo 13 foram avaliadas para determinar o efeito da inativação.
A utilização de açúcar e a produção ou a utilização de acetato foram examinadas ao usar experiências em fras- cos de agitação em meios sem acetato a uma aeração de 100 e 135 rpm com acetato a uma aeração de 135 rpm.
A cepa 3861 (knockout de ambas as cópias de ALD5680) e a cepa 3489 paterna foram cultivadas no meio YP com 20 g/l de dextrose e 80 g/l de xilose, pH 4,8 a 37°C, ou meio YP com 20 g/l de dextrose, 80 g/l de xilose, 4 g/l de acetato, pH 5,1 a 37°C.
A cepa de supressão ALD5680 exibiu uma produção menor de acetato no meio sem acetato a 100 rpm, embora a cepa paterna apenas formasse 0,49 g/l de acetato sob essas condição (Tabela 4). A cepa de su- pressão ALD5680 não mostrou nenhum benefício significativo no que diz respeito à utilização de açúcar (Figura 19). Tabela 4: Xilitol (g/l) Arabitol (g/l) Glicerol (g/l) Acetato (g/l) Cepa 3489 1,42 0,61 2,43 0,49 Cepa 3861 1,29 0,81 2,38 0,06
A cepa de supressão ALD5680 também exibiu uma produção menor de acetato a 135 rpm (Figura 20). A cepa paterna formou mais de 1 g/l de acetato linearmente, ao passo que a cepa de supressão apenas for- mou acetato depois que toda a xilose tinha esgotado.
Sob essas condições, a cepa de knockout exibiu uma utilização de xilose e uma produção de eta-
nol maiores do que a cepa paterna, terminando a xilose cerca de 30 horas antes da cepa paterna (Figura 21). Os subprodutos produzidos por cada ce- pa são resumidos na Tabela 5. Tabela 5: Xilitol (g/l) Arabitol (g/l) Glicerol (g/l) Cepa 3489 2,02 0,26 1,33 Cepa 3861 1,56 0,47 2,51
5 Em meios sintéticos com acetato, a cepa de supressão não exi- biu uma vantagem consistente.
Usou lentamente o acetato para cerca das primeiras 48 horas, mas então começou a produzir acetato (Figura 22, Tabe- la 6). A utilização de xilose foi relativamente linear até 68 horas e foi então interrompida (Figura 23). Por outro lado, a utilização de acetato pela cepa paterna aumentou em cerca de 48 horas e a utilização de xilose permaneceu constante no final da fermentação (Figuras 22-23). Tabela 6: Cepa Xilitol (g/l) Arabitol (g/l) Glicerol (g/l) Acetato (g/l) yHJJ82/3489 1,06 1,25 0,62 2,18 Strain 3861 1,24 0,26 0,53 3,72
A cepa de supressão ALD5680 exibiu uma vantagem significati- va em meios à base de hidrolisato. 19 cepas diferentes que têm várias modi- ficações ou mutações de engenharia genética foram testadas no meio de hidrolisato de palha de milho de DM20D80X a 50% (CSH) a um pH 6,2, a 37°C e a 100 rpm.
Os dois traços que conferiram o m aior benefício à produ- ção de etanol nesse meio foram a superexpressão de KHT105 e a supres- são de ALD5680. Esses resultados mostram que a supressão de ALD5680 pode conferir uma capacidade maior de fermentar a xilose em etanol e de reduzir a produção de acetato pelo hospedeiro, mas que essas vantagens são po- tencialmente dependentes dos meios e das condições de aeração específi- cas.
Essas vantagens são particularmente significativas durante a cultura em meios à base de hidrolisato.
Exemplo 15: Introdução de cópias adicionais do gene transpor-
tador KHT105 de K. marxianus nas cepas de knockout S141G9091, S141G4546 e S141G5680 de I. orientalis: As cepas de I. orientalis foram projetadas geneticamente para conter em qualquer lugar de duas a seis cópias do gene KHT105 de K. mar- 5 xianus.
A cepa 3849, que é equivalente à cepa 3489 com a adição de duas cópias do gene KHT105 integradas no locus 9091, foi usada como cepa pa- terna.
O DNA de plasmídio do vetor pHJJ86 (Exemplo 11; contém o promotor de PDC, o gene KHT105, o terminador de PDC e o cassete de se- leção URA3 entre as regiões de flanqueio S141G4546) foi linearizado por meio de digestão de restrição e o DNA linearizado foi transformado na cepa yHJJ172 (derivado ura- da cepa 3849) para produzir a cepa 4014, a qual continha três cópias do gene KHT105. A terceira cópia do gene foi integrada no sítio S141G4546. A cepa de controle 4141 também foi construída.
A cepa 4141 continha o marcador URA3 no lugar de uma terceira cópia de KHT105 no sítio S141G4546. Os vetores usados para construir essa cepa foram pro- duzidos ao ligar um fragmento de NotI que contém o cassete marcador U- RA3 em pSK1 cortado com NotI (Exemplo 10). As colônias de E. coli trans- formadas com a ligação foram selecionadas por meio de PCR e os vetores pHJJ88 (orientação 1) e pHJJ89 (orientação 2) foram identificados como contendo o cassete marcador URA3 em orientações opostas.
O pHJJ88 li- nearizado foi transformado em yHJJ172 tal como descrito previamente para obter a cepa 4141. A cepa 4014 foi cultivada durante toda a noite em YPD e chape- ada em placas de Scx-FOA.
As colônias de laço foram selecionadas por meio de PCR e a cepa de laço correta foi nomeada como yHJJ182. Uma quarta cópia de KHT105 foi integrada no locus S141G4546 de yHJJ182 pela transformação com pHJJ87 linearizado (Exemplo 11; contém o promotor de PDC, o gene KHT105, o terminador de PDC e o cassete da seleção URA3 entre as regiões de flanqueio S141G4546). Os transformantes foram confir- mados por meio de PCR para terem KHT105 integrado em ambos os loci S141G4546. Esses clones foram nomeados como cepa 4085. A cepa de controle 4084, que continha o marcador de URA3 em S141G4546 ao invés de uma terceira e uma quarta cópias de KHT105, foi produzida ao transfor- mar um derivado ura- da cepa 4141 (yHJJ180) com pHJJ89 linearizado e selecionando em placas de ScD-ura.
Os transformantes foram selecionados 5 por meio de PCR em todas as quatro junções de integração para confirmar que duas cópias do marcador URA3 foram integradas corretamente no locus S141G4546. O plasmídio pHJJ93, que continha um cassete de expressão KHT105 entre as regiões de flanqueio ALD5680 (orientação 1), foi digerido com ApaI e SacI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado em células yHJJ172. As colônias foram selecionadas e puri- ficadas em placas de ScD-ura e selecionadas por meio de PCR através de ambas as junções de integração para confirmar a integração do cassete de expressão KHT105 no locus ALD5680. Esses clones foram nomeados como cepa 4083. O marcador de URA3 na cepa 4083 foi laçado ao ser cultivado durante toda a noite em YPD e por meio de chapeamento em meio de ScX- FOA.
As colônias resultantes foram selecionadas para confirmar a retenção da integração e os clones positivos foram chapeados em replicata em ScD- ura para confirmar a ausência de crescimento em meios sem uracil.
Esses laços foram nomeados como yLUN005. O plasmídio pHJJ94, que continha um cassete de expressão KHT105 entre as regiões de flanqueio ALD5680 (orientação 2), foi digerido com ApaI e SacI para liberar o fragmento de integração e o DNA linearizado foi transformado em células yLUN005. As colônias foram selecionadas e pu- rificadas em placas de ScD-ura e selecionadas através de ambas as junções de integração para confirmar a integração no locus ALD5680. Os clones con- firmados por meio de PCR como contendo cópias de KHT105 em ambos os loci ALD5680 foram designados como cepa yLUN007 (4086). As experiências em frascos de agitação foram realizadas para avaliar a fermentação de xilose nas várias cepas.
Em uma experiência, as cepas 4084 (knockout de 2X KHT105, 2X S141G4546) e 4085 (knockout de 4X KHT105, 2X S141G4546) foram cultivadas a 37°C e a 100 rpm em um meio de DM20D80X 50% CSH, pH 6,2. As taxas de consumo de xilose e produção de etanol foram aumentadas pelas cópias adicionais de KHT105 (Figura 24). Os subprodutos produzidos por cada cepa são resumidos na Tabela 7. 5 Tabela 7: Xilitol (g/l) Arabitol (g/l) Glicerol (g/l) Acetato (g/l) Cepa 4084 5,90 BDL 4,70 4,38 Cepa 4085 3,90 0,76 5,44 4,21
As cepas 4083 (3X KHT105, knockout de 1X ALD5680), 4085 (knockout de 4X KHT105, 2X S141G4546) e dois clones da cepa 4086 (knockout de 4X KHT105, 2X ALD5680) foram caracterizados ao usar as mesmas condições de frasco de agitação.
Os resultados são resumidos na Tabela 8 e na Figura 25. A adição de uma quarta cópia de KHT105 em com- binação com a supressão ALD5680 aumentou substancialmente as taxas de consumo de xilose e os títulos de etanol em relação a quatro cópias do gene KHT105 combinado com a supressão de S141G4546 (Figura 25). Os dois clones da cepa 4086 produziram cerca de 29 g/l de etanol em 140 horas, ao passo que a cepa 4085 e a cepa 3849 paterna (dados não mostrados) atingi- ram os seus títulos máximos de 17-18 g/l sob as mesmas condições nesse ponto no tempo.
A supressão de ALD5680 também conduziu a um consumo intensificado de acetato.
A cepa 4086 tinha uma produção aumentada de glicerol e de arabitol, junto com a produção reduzida de xilitol (Tabela 8). Tabela 8: Xilitol (g/l) Arabitol (g/l) Glicerol (g/l) Acetato (g/l) Cepa 4083 5,26 BDL 3,72 3,50 Cepa 4085 5,68 BDL 4,69 3,75 Clone No. 1 da cepa 4086 2,53 1,28 7,27 2,09 Clone No. 3 da cepa 4086 2,78 1,47 7,32 1,95
Exemplo 16: Adição de KHT105 e/ou supressão de ALD5680 em uma cepa de I. orientalis tolerante ao etanol: A cepa yGP44 de I. orientalis (12053) é um mutante tolerante ao etanol obtido pela mutagênese e pela seleção da cepa 3489, seguidas pela engenharia do knockout de S141G1202. O marcador de seleção URA3 foi laçado pela cepa 12053 sob cultivo durante toda a noite em YPD e com cha- peamento no meio de ScD-FOA.
As colônias foram selecionadas por meio de PCR e chapeadas em meio de ScD-ura para confirmar a perda do gene URA3. As colônias positivas para o laço foram nomeadas como cepa 5 yLUN027. Para inserir URA3 no primeiro locus de ALD5680, os fragmentos linearizados da integração do plasmídio pHJJ78 (Exemplo 13) foram trans- formados em yLUN027. Os transformantes foram selecionados em placas de ScD-ura e selecionados por meio de PCR através de ambas as junções de integração para identificar os transformantes positivos para ambos os produ- tos da junção de PCR.
Tal transformante foi nomeado como yLUN030. O marcador URA3 de yLUN030 foi laçado ao ser cultivado durante toda a noite em YPD e com chapeamento em placas de ScD-FOA.
As colônias foram selecionadas por meio de PCR e quanto à ausência de crescimento em pla- cas de ScD-ura para identificar aquelas que tinham mantido a supressão de ALD5680 mas tinham perdido o gene URA3. Três de tais colônias foram nomeadas como cepa yLUN032. Para inativar o segundo locus de ALD5680, o DNA de plasmídio de pHJJ79 (Exemplo 13) foi digerido com ApaI e SacI e os fragmentos de integração linearizados foram transformados em iLUN032. Os transforman- tes foram selecionados em placas de ScD-ura e selecionados por meio de PCR através de ambas as junções de integração para ambos os loci.
Dois transformantes foram identificados, os quais eram positivos para todos os produtos de junção PCR.
Esses transformantes foram nomeados como cepa yLUN035 (12124). Para inserir o transportador de KHT105 no primeiro locus ALD5680, o DNA do plasmídio de pHJJ93 (Exemplo 15) foi digerido com ApaI e SacI e os fragmentos de integração linearizados foram transformados em yLUN027. Os transformantes foram selecionados em placas de ScD-ura e selecionados por meio de PCR através de ambas as junções de integra- ção.
Quatro transformantes foram identificados, os quais eram positivos para todos os produtos da junção de PCR.
Esses transformantes foram nomea-
dos como cepa yLUN031. O marcador URA3 de yLUN031 foi laçado ao ser cultivado du- rante toda a noite em YPD e com chapeamento em placas de ScD-FOA.
As colônias foram selecionadas por meio de PCR e quanto à ausência de cres- 5 cimento em placas de ScD-ura para identificar aquelas que tinham mantido o fragmento de integração KHT105 no sítio ALD5680 mas tinham perdido o marcador URA3. Tal colônia foi nomeada como cepa yLUN033. Para adicionar a segunda cópia de KHT105 a iyUN033, o DNA do plasmídio de pHJJ94 (Exemplo 15) foi digerido com ApaI e SacI e os fragmentos de integração linearizados foram transformados em yLUN033. Os transformantes foram selecionado em placas de ScD-ura e selecionados por meio de PCR através de ambas as junções de integração para ambos os loci.
Quatro transformantes foram identificados, os quais eram positivos para todos os produtos da junção de PCR.
Esses transformantes foram nomea- dos como cepa yLUN036 (12125). As cepas 12124 (ambos os loci ALD5680 inativados), 12125 (2X KHT105, ambos os loci ALD5680 inativados) e 12053 (paterno) foram carac- terizados por frascos de agitação em meio de hidrolisato DM + de palha de milho a 50% com duas concentrações diferentes de açúcar.
Um jogo de frascos de agitação foi rodado com 20 g/l de dextrose e 80 g/l de xilose, ao passo que o segundo continha 70 g/l de dextrose e 40 g/l de xilose.
O pH de todos os meios era 5,7. Os frascos de agitação foram inoculados a um OD600 = 0,1 inicial e cultivados a 100 rpm e a 37°C . Nos frascos de agitação com menor teor de dextrose/maior teor de xilose, a superexpressão de KHT105 propiciou uma vantagem significati- va no que diz respeito à produção de etanol (Figura 26) e ao consumo de xilose (Figura 27). A supressão de ALD5680 propiciou um aumento de 25% no título de etanol, ao passo que a combinação dessa supressão com a su- perexpressão de KHT105 propiciou um aumento de cerca de 125%. Essas vantagens foram muito menos pronunciadas nos meios definidos de maior teor de dextrose/menor teor de xilose.
Exemplo 17: Integração de araD de B. animalis e L. lactis em I.
orientalis e caracterização de cepas resultantes: Devido à atividade relativamente baixa de REs previamente tes- tados, genes araD alternativos foram clonados e ensaiados quanto à ativida- de e o desempenho em meios contendo arabinose.
Essas sequências de RE 5 foram derivadas de B. animalis (SEQ ID NO: 18) e de L. lactis (SEQ ID NO: 20) e do códon otimizado para a expressão em I. orientalis (SEQ ID NOs: 17 e 19, respectivamente). Os genes araD de B. animalis e de L. lactis otimiza- dos com códons foram integrados no sítio cyb2B da cepa 12038 (Tabela 3; Exemplos 11 e 12) ao usar métodos similares àqueles descritos acima no Exemplo 1. O knockout de cyb2b tinha sido mostrado previamente como não dotado de nenhum efeito fenotípico sob condições relevantes de teste.
A cepa 12038 foi selecionada como a cepa paterna de modo que o transporte e a atividade de araB fossem menos provavelmente limitadores.
A cepa resultante yACN170 continha uma cópia de araD de B. animalis e duas cópias de araD de B. thetaiotaomicron, ao passo que a cepa yACN172 continha uma cópia de araD de L. lactis e duas cópias de araD de B. thetaiotaomicron.
A cepa yACN168 continha uma cópia de araD de B. thetaiotaomicron integrada no sítio de cyb2b, para um total de três cópias.
Todas as três cepas foram avaliadas em frascos de agitação quanto à fer- mentação de arabinose em relação à cepa parental.
Os meios de teste usa- dos eram meios definidos com 20 g/l de dextrose, 35 g/l de xilose, 35 g/l de arabinose, 0,2M MES e 7 g/l de acetato, pH 5,0. As células foram cultivadas a 37°C e a 125 rpm e amostradas com o passar do tem po para substratos e produtos.
Sob essas condições, yACN170 e yACN172 tinham aumentado significativamente o consumo de arabinose em comparação à cepa paterna e a yACN168 (Figura 28). Exemplo 18: Integração de araA de L. sakei e de um araA alter- nativo de B. thetaiotaomicron em I. orientalis: As enzimas celulase usadas na hidrólise da celulose têm pH i- deais de cerca de 4-5,5 e temperaturas ideais de cerca de 40-50°C.
As en- zimas da rota que demonstram uma atividade elevada sob essas condições podem propiciar um benefício ao desempenho fermentativo.
AI/araA de Lac-
tobacillus sakei mostraram recentemente que têm um pH ideal de 5-7, man- tendo 80% da atividade máxima a um pH de 3 e estabilidade de temperatura até 40°C (Rhimi Bioresour Technol 101:9171 (2010)). B. thetaiotaomicron tem uma segunda isomerase de arabinose 5 putativa (araA2, SEQ ID NOs: 7/8) que é somente 17% homóloga em uma base de aminoácidos ao gene araA dessa espécie que foi usada nos exem- plos precedentes.
Esse homólogo é mais curto em 35 aminoácidos, a jusan- te de uma L-arabinofuranosidase e similar a isomerases de L-arabinose de Pedobacter e Rhizobium.
AraA de L. sakei e arA2 de B. thetaiotaomicron foram integrados no sítio cyb2B da cepa 12038 ao usar métodos similares àqueles descritos acima no Exemplo 1. A cepa resultante yACN176 continha uma cópia de araA de L. sakei e duas cópias de araA de B. thetaiotaomicron, ao passo que a cepa yACN178 continha uma cópia de arA2 de B. thetaiotaomicron e duas cópias de araA de B. thetaiotaomicron.
A cepa yACN174 continha uma cópia de araD de B. thetaiotaomicron integrada no sítio de cyb2b, para um total de três cópias.
Todas as três cepas foram avaliadas em frascos de agi- tação quanto à fermentação de arabinose em relação à cepa parental.
Os meios de teste usados eram meios definidos com 20 g/l de dextrose, 35 g/l de xilose, 35 g/l de arabinose, 0,2M MES e 7 g/l de acetato, pH 5,0. As célu- las foram cultivadas a 37°C e a 125 rpm e amostrada s com o passar do tempo para substratos e produtos.
Sob essas condições, yACN176 e yACN178 tinham aumentado significativamente o consumo de arabinose em comparação à cepa paterna e a yACN174 (Figura 29). Exemplo 19: Integração de genes exógenos TAL de I. orientalis em I. orientalis: Os genes TAL de sequência nativa de I. orientalis foram incorpo- rados na cepa 3099 de I. orientalis (Exemplo 8) para determinar se a super- expressão dessa enzima aumentou a fermentação de xilose em etanol.
Para construir um vetor de expressão de TAL, a região de codifi- cação do gene TAL de I. orientalis (SEQ ID NO: 51) mais 400 bp a jusante do gene foram amplificados do DNA genômico de I. orientalis do tipo selva-
gem.
O produto de PCR foi clonado em pCR-Blunt II-TOPO para formar o plasmídio pACN1 e a sequência foi verificada.
Um fragmento de EcoRI/XbaI de pACN1 que contém o gene TAL e o terminador foi ligado similarmente a um fragmento de vetor cortado que contém o cassete de seleção de URA3 e 5 um promotor de PDC de I. orientalis para formar o plasmídio pACN3. Um fragmento de NotI de pACN3 que contém o promotor, TAL, o terminador e o cassete de URA3 foi ligado com pHJJ4 cortado com NotI (sequências alvo de AXR1, Exemplo 1B) para formar os plasmídios pACN5 (orientação 1) e pACN7 (orientação 2). Para construir uma cepa que superexpressa TAL, a cepa 3099 foi transformada com DNA linearizado de pACN7 e chapeada em placas de ScD-ura.
As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR de colô- nia através de ambas as junções de integração; um isolato com a inserção desejada foi nomeado como yACN3. A cepa yACN3 foi chapeada em placas de ScD-FOA para laçar o gene URA3. PCR de colônia foi usada para con- firmar a retenção da integração desejada; tal isolato de ura- foi nomeado como yACN7. A cepa yACN7 foi transformada com DNA linearizado de pACN5 e chapeada em placas de ScD-ura.
As colônias de Ura+ foram sele- cionadas por meio de PCR de colônia através de todas as junções de inte- gração; um isolato com a inserção desejada em ambos os loci AXR1 foi no- meado como yACN11 (3082). Uma cepa de controle, 3862, foi gerada ao suprimir ambas as cópias do locus AXR1 na cepa 3099 sem superexpressão do cassete de TAL1. O construto de supressão usado para obter essa cepa continha o cassete de seleção URA3 entre as sequências alvo de AXR1. As cepas foram caracterizadas em frascos de agitação ao usar meio YP de 20 g/l de glicose e 80 g/l de xilose a um pH 4,8. As culturas inici- ais (meio de 25 ml em frasco de 125 ml) foram cultivadas durante o dia a 250 rpm.
As culturas noturnas (meio de 50 ml em frasco de 250 ml) foram inoculadas a um OD de 0,00002 e cultivadas a 230 rpm e a 35°C.
Na manhã seguinte, todas as culturas tinham ODs de 3,8-5,3. Os frascos de produção (meio de 50 ml em frascos de 125 ml) foram inoculados a um OD de 0,1 e cultivados a 37°C e a 100 rpm.
As amostras foram am ostradas com o passar do tempo, centrifugadas e os sobrenadantes foram filtrados e analisados ao usar HPLC.
A cepa paterna 3118 (versão ura+ de 3099 antes do laço do marcador) e a cepa de controle 3862 do sítio de inserção produziram 20-21 5 g/l de etanol em 55 horas, ao passo que a cepa 3082 produziu 28 g/l no mesmo período (Figura 33). Em todas as três cepas, a glicose foi esgotada por nove horas.
A formação adicional de etanol na cepa 3082 foi correlacio- nada com um consumo aumentado de xilose.
A cepa 3082 produziu menos xilitol durante toda a fermentação e níveis mais elevados de glicerol e arabi- tol.
A formação de metabólitos é resumida na Tabela 9. Tabela 9: Xilitol (g/l) Glicerol (g/l) Arabitol (g/l) Cepa 3118 2,2 0,9 0,4 Cepa 3082 1,2 2,0 1,3 Cepa 3862 2,0 1,0 0,5
Exemplo 20: Integração de genes RKI exógenos de I. orientalis em I. orientalis: Genes RKI de sequência nativa de I. orientalis foram incorpora- dos na cepa yACN23 de I. orientalis para determinar se a superexpressão dessa enzima aumentou a fermentação de xilose em etanol.
Para construir um vetor de integração que visa o sítio GAL6, as regiões de flanqueio 5’ e 3’ do gene GAL6 (SEQ ID NO: 87) foram amplifica- das a partir do DNA genômico de I. orientalis do tipo selvagem.
Os fragmen- tos de PCR foram clonados em pCR-Blunt II-TOPO para formar os plasmí- dios pACN25 (região a montante) e pACN26 (região a jusante) e foram veri- ficados quanto à sequência.
Um fragmento de ApaI/NotI de pACN25, con- tendo a região a montante e um fragmento de SacI/NotI de pACN26, con- tendo a região a jusante, foram ligados a pCRII cortado com ApaI/SacI para formar o plasmídio pACN29. Para construir um vetor de expressão de RKI, a região de codifi- cação do gene RKI de I. orientalis (SEQ ID NO: 39) mais 400 bp a jusante do gene foi amplificada a partir do DNA genômico de I. orientalis do tipo selva- gem.
O produto de PCR foi clonado em pCR-Blunt II-TOPO para formar os plasmídios pACN27 e pACN28 e foram verificados quanto à sequência.
O pedaço de EcoRI/XbaI de pACN27 que contém o gene RKI e o terminador foi ligado similarmente em um fragmento do vetor cortado que contém o cas- sete de seleção URA3 e um promotor de PDC de I. orientalis (fragmento de 5 EcoRI/XbaI de pHJJ2, Exemplo 1A) para formar o plasmídio pACN31. O fragmento de NotI de pACN31 foi ligado com pACN29 cortado com NotI (se- quências alvo de GAL6) para formar os plasmídios pACN44 (orientação 1) e pACN45 (orientação 2). A cepa yACN23 é um derivado da cepa 3082 (Exemplo 19) que contém um supressão para o locus S141G4738 ("AXR4"). Para construir uma cepa que superexpressa RKI, a cepa yACN23 foi transformada com DNA linearizado de pACN44 e chapeada em placas de ScD-ura.
As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR de colônia através de ambas as junções de integração.
Um isolato com a inserção desejada foi nomeado como yACN25. A cepa yACN25 foi chapeada no meio de ScD-FOA para la- çar o gene URA3. PCR de colônia através de ambas as junções de integra- ção foi usada para confirmar a retenção da inserção; tal isolato de ura- foi nomeado como yACN35. A cepa yACN35 foi transformada com DNA lineari- zado de pACN43. As colônias de Ura+ foram selecionadas por meio de PCR de colônia através de todas as junções de integração; um isolato com a in- serção desejada em ambos os loci AXR4 foi nomeado como yACN45 (3352). A caracterização da cepa 3352 e da cepa 3083 paterna de ura+ (versão de ura+ de yACN23 com o URA3 no locus AXR4) foi feita em fras- cos de agitação tal como descrito no Exemplo 19. A cepa 3352 exibiu uma taxa de crescimento maior e uma OD600 máxima em comparação à cepa paterna.
Em 24 horas, a cepa 3083 estava em sua OD600 máxima de 9,3, ao passo que a cepa 3352 tinha atingido uma densidade ótica de 13,5. A cepa 3352 usou 20 g/l mais xilose em 52 horas do que a cepa paterna (Figu- ra 34). O aumento na utilização de xilose resultou em níveis mais elevados de etanol, com a cepa 3352 produzindo 36,1 g/l de etanol em 52 horas ver- sus 26,9 g/l para o pai (aumento de 34%). Em comparação à cepa 3083, a cepa 3352 exibiu níveis menores de arabitol (0,3 versus 1,0 g/l) e de glicerol
(0,2 versus 1,5 g/l). Exemplo 21: Integração de genes TKL exógenos de I. orientalis em I. orientalis: Genes TKL de sequência nativa de I. orientalis foram incorpora- 5 dos na cepa yACN55 de I. orientalis (Exemplo 9) para determinar se a su- perexpressão dessa enzima aumentou a fermentação de xilose em etanol.
Para construir um cassete de decomposição de AXR4, as regi- ões de flanqueio 5' e 3' de S141G4738 foram amplificadas a partir do DNA genômico de I. orientalis do tipo selvagem.. Os fragmentos de PCR foram clonados em uma cadeia principal do vetor de pCRII com um sítio de NotI entre os fragmentos a montante e a jusante e sítios de restrição singulares nas extremidades a montante 5' e a jusante 3'. O plasmídio resultante foi verificado quanto à sequência e foi nomeado como pACN19. Para construir um vetor de expressão TKL de I. orientalis, a regi- ão de codificação do gene TKL de I. orientalis. (SEQ ID NO: 45) foi amplifi- cada a partir do DNA genômico de I. orientalis e clonada em um vetor que contém o promotor TDH3 de I. orientalis, o terminador TKL, o cassete mar- cador URA3 e as sequências alvo de AXR4 de maneira tal que o gene TKL ficou exatamente a jusante do promotor TDH3. O vetor resultante foi vberifi- cado quanto à sequência e foi nomeado como pHJJ113. Um segundo vetor que tem o cassete da expressão na orientação oposta em relação às se- quências alvo foi obtido ao ligar o fragmento de pHJJ113 NotI que contém o cassete de expressão com um fragmento de NotI que contém uma cadeia principal do vetor e as sequências alvo de AXR4. A orientação e a inserção desejadas foram confirmadas por meio de PCR nas colônias de E. coli trans- formadas com essa ligação.
O vetor de expressão de TKL resultante foi no- meado como pHJJ114. Para construir uma cepa que superexpressa TKL de I. orientalis, o DNA linearizado de pHJJ113 foi transformado em yACN55 (derivado ura- da cepa 3356). As colônias simples foram listadas para a purificação e as colônias simples de cada raia foram emendadas a ScD-ura.
As colônias fo- ram selecionadas para a integração desejada por meio de PCR através de ambas as junções de integração.
Uma cepa que tem o cassete de superex- pressão de TKL no sítio AXR4 foi nomeada como yHJJ221. Clones de yHJJ221 foram cultivados em YPD e chapeados no meio de ScD-FOA para o laço do marcador.
As colônias simples foram lista- 5 das para a purificação e as colônias simples de cada raia foram emendadas a YPD.
O laço do marcador e a retenção da integração de TKL foram con- firmados por meio de PCR de colônia através de ambas as junções de inte- gração.
Tal cepa de ura- foi nomeada como yHJJ226. O DNA linearizado de pHJJ114 foi transformado em yHJJ226 e a transformação foi chapeada em meio de ScD-ura.
As colônias simples foram isoladas e confirmadas por meio de PCR através de todas as junções de integração.
A cepa final que contem cópias de TKL de I. orientalis em ambos os loci AXR4 foi nomeada como cepa yHJJ242 (12293). Uma caracterização de frasco de agitação foi executada para comparar a cepa paterna 12293 e a cepa de superexpressão de TKL 12293. O meio usado para esta avaliação foi o meio YP que contém 20g/l de dex- trose, 80g/l de xilose e 10g/l de arabinose, a um pH 5,15. As células de uma placa de ScD-ura fresca foram usadas para inocular um frasco de agitação primário (meio de 50 ml em um frasco de 250 ml). Os frascos foram cultiva- dos a 250 rpm a 37°C por cerca de 7 horas.
As célu las da semente primária foram usadas então para inocular um frasco de semente secundário (meio de 50 ml em um frasco de 250 ml). A OD600 de inoculação alvo para esses frascos era de 5 x 10-6. Esses frascos foram cultivados durante toda a noite a 37°C e a 250 rpm.
As células de sementes secundár ias foram usadas para inocular os frascos de produção a uma OD600 inicial de 0,2. A OD600 das sementes secundárias variou de 4,4 a 7,2 quando os inóculos foram toma- dos.
Os frascos de produção foram incubados a 37°C e a uma aeração de 100 rpm, com as amostras tomadas uma a duas vezes por dia.
Depois de usar uma porção da amostra para determinar a OD, o restante das amostras foi turbilhonado e os sobrenadantes filtrados foram analisados por meio de HPLC.
A cepa 12293 mostrou uma grande melhoria nas taxas de con-
sumo de xilose e produção de etanol versus a cepa 3356 paterna (Figura 35). Toda a xilose foi consumida pela cepa 12293 durante as primeiras 50 horas da fermentação.
Para a cepa 3356, cerca de 11 g de xilose permane- ceram no meio depois de 120 horas disso.
Além, vários subprodutos foram 5 reduzidos na cepa 12293 em relação a 3356: o xilitol passou de 2,8 g/l para 1,5 g/l, o acetato de 2,8 para 1,1 g/l e o arabitol de 1,9 para 0 g/l.
Tal como indicado acima, o acima exposto presta-se meramente a ilustrar várias modalidades da presente invenção.
As modificações especí- ficas discutidas acima não devem ser interpretadas como limitações no âm- bito da invenção.
Será aparente ao elemento versado na técnica que vários equivalentes, mudanças e modificações podem ser feitos sem se desviar do âmbito da invenção e deve ser compreendido que tais modalidades equiva- lentes devem ser aqui incluídas.

Claims (67)

REIVINDICAÇÕES
1. Polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de iden- tidade de sequência em relação a uma sequência de aminoácidos selecio- 5 nada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos indicadas na SEQ ID NO: 2 e na SEQ ID NO: 4.
2. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequên- cias de aminoácidos indicadas na SEQ ID NO: 2 e na SEQ ID NO: 4.
3. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito polinucleotídeoo compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação a uma se- quência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas regiões de codificação das sequências de nucleotídeos indicadas na SEQ ID NO: 1 e na SEQ ID NO: 3.
4. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 3, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos sele- cionada do grupo que consiste nas regiões de codificação das sequências de nucleotídeos indicadas na SEQ ID NO: 1 e na SEQ ID NO: 3.
5. Polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com uma identidade de se- quência de 70% em relação a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos indicadas na SEQ ID NO: 2 e na SEQ ID NO: 4, em que o dito polipeptídeo tem a capacidade de transportar a xilose para uma célula de levedura.
6. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 5, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 70% em relação a uma se- quência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas sequências de nucleotídeos indicadas nas SEQ ID NOs: 1 e 3.
7. Polipeptídeo isolado, o qual compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas se- quências de aminoácidos indicadas na SEQ ID NO: 2 e na SEQ ID NO: 4.
8. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 7, em 5 que o dito polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecio- nada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos indicadas na SEQ ID NO: 2 e na SEQ ID NO: 4.
9. Polipeptídeo isolado, o qual compreende uma sequência de aminoácidos em identidade de sequência de 70% em relação a uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos indicadas na SEQ ID NO: 2 e na SEQ ID NO: 4, em que o dito polipeptídeo tem a capacidade de transportar a xilose para uma célula de levedura.
10. Polinucleotídeo isolado, o qual codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com uma identidade de se- quência de pelo menos 80% em relação a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos indica- das nas SEQ ID NOs: 34, 40, 46 e 52.
11. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 10, em que o dito polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequên- cias de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 34, 40, 46 e 52.
12. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 10, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em relação a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas regiões de codificação das sequências de nucleotídeos indicadas nas SEQ ID NOs: 33, 39, 45 e 51.
13. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 12, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas regiões de codificação das sequên- cias de nucleotídeos indicadas nas SEQ ID NOs: 33, 39, 45 e 51.
14. Polipeptídeo isolado, o qual compreende uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em re- lação a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 34, 40, 46 e 52. 5
15. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 14, em que o dito polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecio- nada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 34, 40, 46 e 52.
16. Célula de levedura geneticamente modificada, a qual super- expressa um polipeptídeo transportador de xilose que compreende uma se- quência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 2 e na SEQ ID NO: 4.
17. Célula de levedura geneticamente modificada que compre- ende uma rota ativa de fermentação de arabinose, em que a dita célula compreende um ou mais genes exógenos da rota de fermentação de arabi- nose selecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK e RE.
18. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 16, que também compreende uma rota ativa de fermen- tação de arabinose, em que a dita célula compreende um ou mais genes exógenos da rota de fermentação de arabinose selecionados do grupo que consiste nos genes AI, RK e RE.
19. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, que também compreende uma rota ativa de fermentação de xilose, em que a dita célula compreende um ou mais genes exógenos da rota de fermentação de xilose selecionados do grupo que consiste nos genes XR, XDH e XK.
20. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, que também compreende uma rota ativa de fermentação de xilose, em que a dita célula compreende um ou mais genes exógenos da rota de fermentação de xilose selecionados do grupo que consiste nos genes XI e XK.
21. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, que também compreende uma rota ativa de fosfato de pentose não oxidante, em que a dita célula compreende um ou mais genes exógenos da rota de fosfato de pentose não 5 oxidante selecionados do grupo que consiste nos genes TKL e TAL.
22. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 ou 18 a 21, em que o dito polipep- tídeo transportador de xilose compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos indica- das na SEQ ID NO: 2 e na SEQ ID NO: 4.
23. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 ou 18 a 21, em que o dito polipep- tídeo transportador de xilose é expresso a partir de um polinucleotídeo transportador de xilose que compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação a uma se- quência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas regiões de codificação das sequências de nucleotídeos indicadas na SEQ ID NO: 1 e na SEQ ID NO: 3.
24. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 23, em que o dito polinucleotídeo transportador de xilo- se compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas regiões de codificação das sequências de nucleotídeos indica- das na SEQ ID NO: 1 e na SEQ ID NO: 3.
25. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, em que o gene AI codifica um polipeptídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 81 e 83.
26. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 25, em que o gene AI compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ
ID NOs: 5, 7, 9, 80 e 82.
27. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, em que o gene RK codifica um polipeptídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência em rela- 5 ção a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 12 e na SEQ ID NO: 14.
28. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 27, em que o gene RK compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 11, 86 e 13.
29. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, em que o gene RE codifica um polipeptídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência em rela- ção a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 16, 18, 20, 77 e 79.
30. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 29, em que o gene RE compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 15, 17, 19, 76 e 78.
31. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 19 ou 21, em que o gene XR codifica um polipeptídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 30.
32. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 31, em que o gene XR compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 29.
33. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 19 ou 21, em que o gene XDH codifica um polipeptídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 32.
34. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 33, em que o gene XDH compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à 5 sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 31.
35. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, em que o gene XI codifica um polipeptídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 22.
36. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 35, em que o gene XI compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 21.
37. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, em que o gene XK codifica um polipeptídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência em rela- ção a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 24, 26 e 28.
38. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 37, em que o gene XK compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência em relação a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 23, 25 e 27.
39. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 21, em que o gene TKL codifica um polipeptídeo com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em relação a uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 46, 48 e 50.
40. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 39, em que o gene TKL compreende uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em re- lação a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 45, 47 e 49.
41. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 21, em que o gene TAL codifica um polipeptídeo com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em relação a uma se- 5 quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 52, 54 e 56.
42. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 41, em que o gene TAL compreende uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em re- lação a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 51, 53 e 55.
43. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 21, em que a dita célula também compreende um ou mais genes exógenos não oxidantes das rotas de fosfato de pentose sele- cionados do grupo que consiste nos genes RPE e RKI.
44. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 43, em que o gene RPE codifica um polipeptídeo com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em relação a uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 34, 36 e 38.
45. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 44, em que o gene RPE compreende uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em re- lação a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 33, 35 e 37.
46. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 43, em que o gene RKI codifica um polipeptídeo com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em relação a uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 40, 42 e 44.
47. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 46, em que o gene RKI compreende uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 80% em re- lação a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39, 41 e 43.
48. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo 5 com qualquer uma das reivindicações 16 a 47, em que a dita célula de leve- dura também compreende uma supressão ou uma decomposição de um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em genes de AR/XR, arabi- tol 4-desidrogenase, redutase de xilulose e XDH.
49. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 48, em que o gene de AR/XR codifica um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação a uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 69 e 71.
50. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 49, em que o gene de AR/XR compreende uma se- quência de nucleotídeos com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas regiões de codificação das sequências de nucleotídeos indica- das nas SEQ ID NOs: 63, 65, 67 e 70.
51. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 48, em que o gene de redutase de xilulose codifica um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 58.
52. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 51, em que o gene de redutase de xilulose compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 50% de identidade de se- quência em relação à região de codificação da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 57.
53. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 48, em que o gene de XDH codifica um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação a uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID
NOs: 60 e 62.
54. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 53, em que o gene de XDH compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 50% de identidade de sequência em rela- 5 ção a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas regiões de codificação das sequências de nucleotídeos indicadas nas SEQ ID NOs: 59 e 61.
55. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 54, em que a dita célula de leve- dura também compreende uma supressão ou uma decomposição de um ou mais genes exógenos selecionados do grupo que consiste nos genes de ALD e ADH.
56. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 55, em que o gene de ALD codifica um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 73.
57. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 56, em que o gene de ALD compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 50% de identidade de sequência em rela- ção à região de codificação da sequência de nucleotídeos indicada na SEQ ID NO: 72.
58. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 55, em que o gene de ADH codifica um polipeptídeo com pelo menos 50% de identidade de sequência em relação a uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 75 e 85.
59. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 58, em que o gene de ADH compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 50% de identidade de sequência em rela- ção a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas regiões de codificação das sequências de nucleotídeos indicadas nas SEQ ID NOs: 74 e 84.
60. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 59, em que a dita célula de leve- dura pertence às classes de I. orientalis/P. fermentans.
61. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo 5 com a reivindicação 60, em que a dita célula de levedura é de I. orientalis.
62. Processo de fermentação em que uma célula de levedura geneticamente modificada TAC como definida em qualquer uma das reivin- dicações 16 a 59, é cultivada em um meio de fermentação que compreende a xilose.
63. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 62, em que o dito meio de fermentação compreende pelo menos 10 g/l de xilose de um hidrolisato de biomassa de planta.
64. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 63, em que a xilose é o açúcar mais abundante no dito meio de fermentação.
65. Método para a produção de etanol a partir de um meio con- tendo xilose, o qual compreende o cultivo de uma célula de levedura geneti- camente modificada tal como definida em qualquer uma das reivindicações 16 a 59, no meio contendo xilose.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, em que o dito meio contendo xilose compreende pelo menos 10 g/l de xilose de um hidroli- sato de biomassa de planta.
67. Método, de acordo com a reivindicação 66, em que a xilose é o açúcar mais abundante no dito meio.
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