JPWO2011099263A1 - クルイベロマイセス・マルシアヌス由来の高発現プロモーター - Google Patents

クルイベロマイセス・マルシアヌス由来の高発現プロモーター Download PDF

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Abstract

本発明は、クルイベロマイセス・マルシアヌス由来の新規な高発現プロモーターであるＧＡＬ１プロモーター、該高発現プロモーターを含む組換えポリヌクレオチド、該組換えポリヌクレオチドを含むベクター、該組換えポリヌクレオチド又は該ベクターを酵母に導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いた目的遺伝子の高発現方法、該形質転換体を用いた目的遺伝子産物の製造方法を提供するものである。本発明の高発現プロモーターを利用することを特徴とする。

Description

本発明は、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）由来の新規な高発現プロモーター、該プロモーターを含む組換えポリヌクレオチド、該組換えポリヌクレオチドを含むベクター、該組換えポリヌクレオチド又は該ベクターを酵母に導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いた目的遺伝子の高発現方法、該形質転換体を用いた目的遺伝子産物の製造方法に関する。
近年の遺伝子組換え技術の進展とともに、様々な有用なタンパク質の生産を、大腸菌等の微生物を用いて行うことが可能となった。しかし、真核生物由来の異種タンパク質遺伝子を、大腸菌を宿主として発現させると、正常なプロセシングや糖鎖の付加などの翻訳後の正常な修飾が行われないという問題があることが知られている。そのため、真核生物である酵母が、宿主として比較的利用されている。宿主酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ハンゼヌラ・アノマーラ、クルイベロマイセス・ラクティスなどが知られている（例えば特許文献１参照）。しかし、宿主としての酵母における異種タンパク質の発現量には改善の余地があった。
異種タンパク質遺伝子を宿主にて発現させる際には、宿主内で機能するプロモーターの制御下にその異種タンパク質遺伝子を作動可能に配置した組換えポリヌクレオチドを宿主内に導入し、その形質転換体内においてその異種タンパク質を発現させる。プロモーターの転写活性は、異種タンパク質の発現効率を大きく左右することから、転写活性の高いプロモーターが一般的に用いられている。また、異種タンパク質遺伝子の発現は、所望のタイミングで誘導することが好ましい。形質転換体を利用した発酵生産では、まず形質転換体をなるべく多く増殖させた後、その異種タンパク質を発現させると、その異種タンパク質の生成効率が高まるからである。転写活性が高く、かつ、誘導可能なプロモーターとして、ガラクトース誘導性プロモーターがよく知られている。ガラクトース誘導性プロモーターとは、グルコース欠乏時においてガラクトースによって誘導されるプロモーターであり、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等においては、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ２プロモーター、ＧＡＬ３プロモーター、ＧＡＬ５プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター等の、ガラクトース代謝遺伝子（ＧＡＬ遺伝子）のプロモーター（ＧＡＬプロモーター）がよく用いられている（例えば特許文献２参照）。
ところで、クルイベロマイセス・マルシアヌスは、耐熱性酵母である（例えば、非特許文献１及び２）。通常の酵母でエタノール発酵をする場合、発酵熱によって発酵液の温度が上昇していくため、エタノール発酵を持続させるには発酵液を冷却しなければならなかった。そのため、エタノール発酵を工業的に行うには、大規模な冷却設備と、その冷却に要する多大なエネルギーコストが不可欠となる。しかし、クルイベロマイセス・マルシアヌスは４８℃もの高温でも増殖が可能であるため（非特許文献３及び４）、そのような冷却設備やエネルギーコストを必要とせずに、効率的なエタノール発酵が可能となる。このクルイベロマイセス・マルシアヌスのＧＡＬプロモーターの配列についてはこれまで知られていなかった。
特開２００８−２９２３９号公報 特開２００７−８９５１２号公報
Bioresource Technology (2007) 98, 3367-3374 Appl. Microbiol. Biotechnol. (2008) 79, 339-354 Applied and Environmental Microbiology (2008) 74, 7514-7521 Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 85, 861-867
本発明は、クルイベロマイセス・マルシアヌス由来の新規な高発現プロモーターであるＧＡＬ１プロモーター、該高発現プロモーターを含む組換えポリヌクレオチド、該組換えポリヌクレオチドを含むベクター、該組換えポリヌクレオチド又は該ベクターを酵母に導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いた目的遺伝子の高発現方法、該形質転換体を用いた目的遺伝子産物の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、クルイベロマイセス・マルシアヌスからＧＡＬ１プロモーターを単離することに成功し、このプロモーターがクルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて目的遺伝子を顕著に高発現させ得ること、さらには、サッカロマイセス・セレビシエにおいても目的遺伝子を高発現させ得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）（ａ）配列番号１に示されるポリヌクレオチド：（ｂ）上記の（ａ）のポリヌクレオチドに対して８０％以上の同一性を有し、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド：（ｃ）配列番号２に示されるポリヌクレオチド：（ｄ）上記の（ｃ）のポリヌクレオチドに対して８０％以上の同一性を有し、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド：（ｅ）配列番号３に示されるポリヌクレオチド：及び、（ｆ）上記の（ｅ）のポリヌクレオチドに対して８０％以上の同一性を有し、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド：のいずれかのポリヌクレオチドからなる高発現プロモーターに関する。
また、本発明は、（２）上記（１）に記載の高発現プロモーターと、その制御下に作動可能に配置された目的遺伝子とを含む組換えポリヌクレオチドに関する。
さらに、本発明は、（３）上記（２）に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
また、本発明は、（４）上記（２）に記載の組換えポリヌクレオチド又は上記（３）に記載のベクターを、酵母に導入して得られることを特徴とする形質転換体や、（５）酵母が、サッカロマイセス属酵母及びクルイベロマイセス属酵母からなる群から選択されるいずれかの酵母であることを特徴とする上記（４）に記載の形質転換体や、（６）酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ及びクルイベロマイセス・マルシアヌスから選択されるいずれかの酵母であることを特徴とする上記（４）に記載の形質転換体に関する。
さらに、本発明は、（７）上記（４）〜（６）のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする目的遺伝子の高発現方法に関する。
また、本発明は、（８）上記（４）〜（６）のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程と、培養して得られた形質転換体から目的遺伝子産物を回収する工程とを含むことを特徴とする目的遺伝子産物の製造方法に関する。
本発明の高発現プロモーターは、クルイベロマイセス・マルシアヌスだけでなく、他の酵母においても、目的遺伝子を高発現させることができる。例えば、本発明の高発現プロモーターをサッカロマイセス・セレビシエで用いると、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１０プロモーターよりも目的遺伝子を高発現させることができる。したがって、本発明の高発現プロモーターを用いると、目的遺伝子産物を効率よく製造することも可能となる。
クルイベロマイセス・マルシアヌスにおけるＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＧＡＬ７プロモーターのプロモーター構造を示す図である。 クルイベロマイセス・マルシアヌスのＧＡＬ１プロモーター（ＫｍＧＡＬ１プロモーター）のプロモーター構造を示す図である。 ＫｍＧＡＬ１プロモーターの部位を特定するための発現解析試験の結果を示す図である。 クルイベロマイセス・マルシアヌス又はサッカロマイセス・セレビシエにおける、ＫｍＧＡＬ１プロモーターの発現解析試験の結果を示す図である。
１．本発明のプロモーター
本発明の高発現プロモーターは、（Ａ）配列番号１、２若しくは３に示されるポリヌクレオチドからなるか、又は、（Ｂ）これらのポリヌクレオチドの変異体であって、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチドからなることを特徴とする。配列番号１に示されるポリヌクレオチドは、クルイベロマイセス・マルシアヌス由来のＧＡＬ１プロモーターであり、配列番号２に示されるポリヌクレオチドは、クルイベロマイセス・マルシアヌス由来のＧＡＬ７プロモーターであり、配列番号３に示されるポリヌクレオチドは、クルイベロマイセス・マルシアヌス由来のＧＡＬ１０プロモーターである。かかる本発明の高発現プロモーターは、クルイベロマイセス・マルシアヌスだけでなく、他の酵母においても、目的遺伝子を高発現させることができる。
上記（Ｂ）の、配列番号１、２又は３に示されるポリヌクレオチドの変異体であって、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチドからなるプロモーター（以下、特に「本発明の変異体プロモーター」とも表示する。）としては、（ａ）配列番号１、２又は３に示されるポリヌクレオチドに対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有し、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド：
（ｂ）配列番号１、２又は３に示されるポリヌクレオチドにおいて、１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなり、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド：
（ｃ）配列番号１、２又は３に示されるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド：
上記（ｂ）における「１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドを意味する。
上記（ｃ）における「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、８０％以上、好ましくは８５％以上の同一性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。上記（ｃ）における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」としては、プローブとして使用するポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと一定以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げることができ、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを好適に例示することができる。
なお、配列番号１に示されるポリヌクレオチドの７５８位〜７７４位、７７９位〜７９５位、８０４位〜８２０位、８２５位〜８４１位、８６０位〜８７６位；配列番号２に示されるポリヌクレオチドの７１８位〜７３４位、７５３位〜７６９位、７７４位〜７９０位、７９９位〜８１５位、８２０位〜８３６位；配列番号３に示されるポリヌクレオチドの９３９位〜９５５位、９５４位〜９７０位、９８８位〜１００４位；は、それぞれ、転写因子であるＧＡＬ４の結合部位である。
上記（Ａ）の配列番号１、２若しくは３に示されるポリヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列が明らかとなったので、例えば、鋳型としてクルイベロマイセス・マルシアヌスのゲノムＤＮＡを用い、該ヌクレオチド配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるＰＣＲ反応によって、または該ヌクレオチド配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特開２００８−２３７０２４号公報）に開示された方法により取得できる。
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて常法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ ＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ ２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して常法に従って行なうことができる。
また、前述の本発明の変異体プロモーターにおけるポリヌクレオチドの変異体は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１、２又は３に示されるポリヌクレオチドに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらポリヌクレオチドに変異を導入することにより、ポリヌクレオチドの変異体を取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。
本発明の高発現プロモーターは、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有する。あるポリヌクレオチドがある酵母においてプロモーター活性を有するかどうかは、例えばそのポリヌクレオチドの下流にレポーター遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドを作製する工程、その組換えポリヌクレオチドをその酵母に形質転換して形質転換酵母を得る工程、その形質転換酵母におけるそのレポーター遺伝子の発現の程度を測定する工程を含む周知のレポーターアッセイ等により容易に確認することができる。
上記の「クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母」における「クルイベロマイセス・マルシアヌス以外の酵母」としては、クルイベロマイセス・マルシアヌス以外の種類の酵母である限り、特に制限されず、クルイベロマイセス・ラクティス等の、クルイベロマイセス・マルシアヌス以外のクルイベロマイセス属酵母；サッカロマイセス・セレビシエ等のサッカロマイセス属酵母；カンジダ・アルビカンス等のカンジダ属酵母；ジゴサッカロマイセス・ロキシー等のジゴサッカロマイセス属酵母；シゾサッカロマイセス・ポンベ等のシゾサッカロマイセス属酵母；ピキア・パストリス等のピキア属酵母；などを好適に例示することができ、中でも、クルイベロマイセス・ラクティス等の、クルイベロマイセス・マルシアヌス以外のクルイベロマイセス属酵母；サッカロマイセス・セレビシエ等のサッカロマイセス属酵母；をより好適に例示することができ、中でも、サッカロマイセス・セレビシエ等のサッカロマイセス属酵母をさらに好適に例示することができ、サッカロマイセス・セレビシエを特に好適に例示することができる。
本発明の高発現プロモーターや、後述の本発明の目的遺伝子の高発現方法おける「高発現」や、後述の本発明の目的遺伝子産物の製造方法における「高効率」には、（Ｘ）宿主がクルイベロマイセス・マルシアヌスの場合については、かかるプロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＧａｌ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％ガラクトース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）が、２５０００以上、好ましくは２８０００以上、より好ましくは３２０００以上、さらに好ましくは３４０００以上であることや、（Ｙ）宿主がクルイベロマイセス・マルシアヌス以外の酵母（好適にはサッカロマイセス・セレビシエ）である場合については、かかるプロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをその酵母に導入して得られた形質転換体を、ＹＰＧａｌ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％ガラクトース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）が、１５００以上、好ましくは２０００以上、より好ましくは２５００以上、さらに好ましくは３０００以上であることを好適に含み、さらには、上記（Ｘ）であり、かつ、上記（Ｙ）であることをより好適に含む。
本発明の高発現プロモーターや、後述の本発明の目的遺伝子の高発現方法おける「高発現」や、後述の本発明の目的遺伝子産物の製造方法における「高効率」の他の例としては、かかるプロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＧａｌ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％ガラクトース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）が、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１０プロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをサッカロマイセス・セレビシエに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＧａｌ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％ガラクトース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）に対して、割合として、１０倍以上、好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは３０倍以上、さらにより好ましくは４０倍以上、最も好ましくは５０倍以上であることを好適に含む。
本発明の高発現プロモーターや、後述の本発明の目的遺伝子の高発現方法おける「高発現」や、後述の本発明の目的遺伝子産物の製造方法における「高効率」のさらなる他の例としては、かかるプロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結した組換えポリヌクレオチドをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＧａｌ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％ガラクトース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）が、該組換えポリヌクレオチドをサッカロマイセス・セレビシエに導入して得られた形質転換体を、ＹＰＧａｌ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％ガラクトース）にて２８℃、４８時間振盪培養したときの培養液中の分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）に対して、割合として、２倍以上、好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上、最も好ましくは５倍以上であることを好適に含む。
本発明におけるポリヌクレオチドとしては、相補的な二本鎖ポリヌクレオチドを好適に例示することができ、中でも相補的な二本鎖ＤＮＡを特に好適に例示することができる。
２．本発明の組換えポリヌクレオチド
本発明の組換えポリヌクレオチドは、本発明の高発現プロモーターと、その制御下に作動可能に配置された目的遺伝子とを含むことを特徴とする。本発明の組換えポリヌクレオチドは、本発明の高発現プロモーターの活性化を通じて、その目的遺伝子がコードする目的遺伝子産物（タンパク質やペプチド）をガラクトース誘導的に高発現させることができる。
本発明において、「本発明の高発現プロモーターの制御下に作動可能に配置された目的遺伝子」とは、本発明の高発現プロモーターに転写因子が結合することにより、その目的遺伝子の発現が誘導されるように、本発明の高発現プロモーターと、その目的遺伝子とが連結されていることを意味する。上記「目的遺伝子」としては、任意の遺伝子であればよいが、なんらかの有用なタンパク質をコードする有用タンパク質遺伝子を好適に例示することができる。有用タンパク質遺伝子としては、セルラーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子等の糖化酵素遺伝子や、ウイルスワクチンタンパク質の遺伝子を好適に例示することができる。
３．本発明の組換えポリヌクレオチドを含むベクター
本発明の組換えポリヌクレオチドを含むベクターは、上記の本発明の組換えポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。本発明のベクターは、宿主酵母において、本発明の組換えポリヌクレオチドを保持したり、目的遺伝子を発現させるために酵母を形質転換したりすることができる。本発明におけるベクターは、直鎖状であってもよいし、環状であってもよい。宿主酵母がクルイベロマイセス・マルシアヌスである場合は、直鎖状のベクターであっても染色体上において高頻度で組換えを生じさせることができ、その結果、形質転換することができる。また、環状のベクターの場合、さらに自己複製配列を含んでいれば、該ベクターは酵母細胞内にて自律複製し、酵母細胞内で保持され、その結果、形質転換することができる。
上記ベクターは、酵母細胞内で目的遺伝子を発現させることが可能であるものである限り特に制限されず、環状のプラスミドベクターとしては、例えばｐＫＤ１等を好適に例示することができる。
４．本発明の形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明の組換えポリヌクレオチド、又は、本発明のベクターを、酵母に導入して得られることを特徴とする。本発明の形質転換体は、その細胞内で目的遺伝子をガラクトース誘導的に高発現することができ、本発明の形質転換体を培養することによって、目的遺伝子産物を効率的に生成させることができる。
本発明の形質転換体を作製する際に用いる酵母の種類としては、特に制限されず、クルイベロマイセス・マルシアヌス、クルイベロマイセス・ラクティス等のクルイベロマイセス属酵母；サッカロマイセス・セレビシエ等のサッカロマイセス属酵母；カンジダ・アルビカンス等のカンジダ属酵母；ジゴサッカロマイセス・ロキシー等のジゴサッカロマイセス属酵母；シゾサッカロマイセス・ポンベ等のシゾサッカロマイセス属酵母；ピキア・パストリス等のピキア属酵母；などを好適に例示することができ、中でも、クルイベロマイセス・マルシアヌス、クルイベロマイセス・ラクティス等のクルイベロマイセス属酵母；サッカロマイセス・セレビシエ等のサッカロマイセス属酵母；をより好適に例示することができ、中でも、目的遺伝子の発現量が特に高く、目的遺伝子産物の生成効率が特に高い点で、クルイベロマイセス・マルシアヌスを特に好適に例示することができる。また、クルイベロマイセス・マルシアヌスは、耐熱性を有しているため、発酵熱を冷却する設備やエネルギーコストを必要とせずに、効率的なエタノール発酵が可能となる点で好ましい。
本発明の組換えポリヌクレオチド、又は、本発明のベクターの酵母への導入方法としては、特に制限されず、ウイルスベクターを利用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法等の生物学的方法；エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、超音波遺伝子導入法等の物理的方法；リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の化学的方法；などの公知の方法を例示することができ、中でも簡便であって汎用性が高い点でリポフェクション法を好適に例示することができる。また、本発明の組換えポリヌクレオチド、又は、本発明のベクターがその酵母へ導入されたかどうかは、目的遺伝子として、又は、目的遺伝子に加えて、マーカー遺伝子を本発明の組換えポリヌクレオチドや本発明のベクターにマーカー遺伝子を挿入しておき、形質転換体におけるそのマーカー遺伝子の発現を確認するなどして容易に確認することができる。
５．本発明の目的遺伝子の高発現方法
本発明の目的遺伝子の高発現方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする。「本発明の形質転換体を培養する方法」としては、その形質転換体が増殖し得る限り特に制限されないが、例えばその形質転換体が増殖可能な温度条件下（例えば２５〜３３℃、好ましくは２８〜３０℃）、ＹＰＤ培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％グルコース）にて、適当な時間（例えば１〜１０日間、好ましくは１〜５日間、より好ましくは１〜３日間）、振盪培養する方法を好適に例示することができる。
６．本発明の目的遺伝子産物の製造方法
本発明の目的遺伝子産物の製造方法は、本発明の形質転換体を培養する工程と、培養して得られた形質転換体から目的遺伝子産物を回収する工程とを含むことを特徴とする。かかる製造方法によれば、目的遺伝子産物を高効率で製造することができる。「培養して得られた形質転換体から目的遺伝子産物を回収する」方法としては、目的遺伝子産物を回収し得る限り特に制限されず、クロマトグラフィーを利用した方法、タグを利用した方法などの公知の方法を例示することができる。
［クルイベロマイセス・マルシアヌスからのＫｍＧＡＬ１プロモーターの単離］
本発明者らは、クルイベロマイセス・マルシアヌス DMKU3-1042株のゲノム配列をGenome Sequencer FLX System（ロシュ・ダイアグノスティクス社）でドラフトゲノム配列を取得した。しかし、１回目のシーケンスでは、ＧＡＬの部分配列しか得られなかった。そこで、さらに高性能なGenome Sequencer FLX Titanium（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いることによって、ようやくドラフトゲノム配列を取得することができた。本発明者らは、クルイベロマイセス・マルシアヌスからガラクトース誘導性プロモーターを取得するために、サッカロマイセス・セレビシエ由来の公知のＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７などの配列情報に基づいて、クルイベロマイセス・マルシアヌスのドラフトゲノム配列の検索を行った。その結果、クルイベロマイセス・マルシアヌスのドラフトゲノム配列中に、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＡＬプロモーターと比較的高い同一性を有する配列を見い出し、その配列を単離した。単離したこの配列のプロモーター構造を図１に示す。図１に示されるように、ＧＡＬ１プロモーターとは逆向きに、ＧＡＬ１０プロモーター、ＧＡＬ７プロモーターが配置されており、ＧＡＬ１プロモーターとＧＡＬ１０プロモーターの間にＧＡＬ４結合部位が見い出された。なお、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおけるこれらのＧＡＬ１プロモーター（ＫｍＧＡＬ１プロモーター）、ＧＡＬ１０プロモーター（ＫｍＧＡＬ１０プロモーター）、ＧＡＬ７プロモーター（ＫｍＧＡＬ１プロモーター）の配置は、サッカロマイセス・セレビシエのこれらのプロモーターの既知の配置と同様であった。なお、今回単離した配列中のＧＡＬ１様プロモーターを用いた後述の実施例２や実施例３の実験により、今回単離したクルイベロマイセス・マルシアヌス由来のＧＡＬプロモーター群は、ＧＡＬプロモーターであることが示された。
［ＫｍＧＡＬ１プロモーターの部位の特定］
ＫｍＧＡＬ１プロモーターの部位を特定するために、以下のような発現解析試験をおこなった。
まず、ＫｍＧＡＬ１プロモーターを含むと考えられる１．４ｋｂのＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−１４００〜０に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−１４００と命名した。次に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を２００ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−１２００〜０に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−１２００と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を４００ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−１０００〜０に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−１０００と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を５８０ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−８２０〜０に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−８２０と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を６２５ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−７７５〜０に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−７７５と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を６５０ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−７５０〜０に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−７５０と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を８００ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−６００〜０に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−６００と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を１０００ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−４００〜０に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−４００と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を１２００ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−２００〜０に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−２００と命名した。
分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子がＧＡＬ１プロモーターの下流に作動可能に連結してあるテンプレート、及び、前述のＫｍＧＡＬ１−１４００等の９種類のＤＮＡ配列を利用してＰＣＲ合成した。これにより、前述のＫｍＧＡＬ１−１４００等の９種類のＤＮＡ配列のそれぞれの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子が作動可能に連結された、ＫｍＧＡＬ１−１４００−ＣＬｕｃ等の９種類の組換えＤＮＡを得た。得られた９種類の組換えＤＮＡを、それぞれクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入し、それぞれについて形質転換体を合計９種類得た。その９種類（１種類につき２クローンずつ）の形質転換体をＹＰＤ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％グルコース）にて２８℃、４８時間振盪培養した後、各種の形質転換体につき、培養液５μｌをサンプル採取し、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ：Relative Luciferase Unit）を測定した。また、ＹＰＤ液体培地に代えて、ＹＰＧａｌ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％ガラクトース）を用いて同様の振盪培養を行い、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量を測定した。これらの結果を図３に示す。なお、ＫｍＧＡＬ１−１４００等のプロモーター名のところに２本ずつ記載された棒グラフのうち、左側はＹＰＤ液体培地（グルコース培地）を用いた場合における、２クローンの平均値を示し、右側はＹＰＧａｌ液体培地（ガラクトース培地）を用いた場合における、２クローンの平均値を示す。図３の結果から分かるように、ＫｍＧＡＬ１−１４００、ＫｍＧＡＬ１−１２００、ＫｍＧＡＬ１−１０００、ＫｍＧＡＬ１−８２０、ＫｍＧＡＬ１−７７５を用いた場合は、ＣＬｕｃの相対発現量、及び、培地中のガラクトースによる誘導率のいずれもきわめて高かったが、ＫｍＧＡＬ１−７５０、ＫｍＧＡＬ１−６００、ＫｍＧＡＬ１−４００、ＫｍＧＡＬ１−２００を用いた場合は、ＫｍＧＡＬ１−１４００等を用いた場合と比較して、ＣＬｕｃの相対発現量がかなり低下した。この結果から、図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−７７５〜７５０に相当する部分がプロモーター活性に特に重要であることが示され、ＫｍＧＡＬ１プロモーターの部位が特定された。なお、本明細書中の「活性量」は「相対発現量」と同義である。
［ＫｍＧＡＬ１プロモーターの発現解析］
ＫｍＧＡＬ１プロモーターが、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて目的遺伝子をどの程度発現させることができるのか、及び、クルイベロマイセス・マルシアヌス以外の酵母において目的遺伝子をどの程度発現させることができるのかを調べるために、以下のような発現解析試験をおこなった。
まずは、ＵＲＡ３−５’４０−ＫｍＧＡＬ１０ｃ２プライマー（配列番号４）及び１５ＧＫｍＧＡＬ１＋２２ｃプライマー（配列番号５）と、クルイベロマイセス・マルシアヌス由来の染色体ゲノムを用いたＰＣＲにより、ＫｍＧＡＬ１プロモーター（ＫｍＧＡＬ１ｐ）の配列を得た。
次に、以下の４つの形質転換体を、公知の形質転換法により、作製した。
（１）ＫｍＧＡＬ１ｐの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結したＫｍＧＡＬ１ｐ−ＣＬｕｃをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた形質転換体（図４の右端のＫｍＧＡＬ１ｐ）。
（２）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＡＬ１０プロモーターの下流に、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子を作動可能に連結したＳｃＧＡＬ１０ｐ−ＣＬｕｃをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入して得られた形質転換体（図４の右から２番目のＳｃＧＡＬ１０ｐ）。
（３）ＫｍＧＡＬ１ｐ−ＣＬｕｃをサッカロマイセス・セレビシエに導入して得られた形質転換体（図４の右から３番目のＫｍＧＡＬ１ｐ）。
（４）ＳｃＧＡＬ１０ｐ−ＣＬｕｃをサッカロマイセス・セレビシエに導入して得られた形質転換体（図４の左端のＳｃＧＡＬ１０ｐ）。
これらの各形質転換体を、それぞれＹＰＤ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％グルコース）にて２８℃、４８時間振盪培養した後、各種の形質転換体につき、培養液５μｌをサンプル採取し、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）を測定した。また、ＹＰＤ液体培地に代えて、ＹＰＧａｌ液体培地（１質量％酵母エキス、２質量％ポリペプトン、２質量％ガラクトース）を用いて同様の振盪培養を行い、分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃの相対発現量を測定した。これらの結果を図４に示す。なお、ＫｍＧＡＬ１ｐ等のプロモーター名のところに２本ずつ記載された棒グラフのうち、左側はＹＰＤ液体培地（グルコース培地）を用いた場合における、２クローンの平均値を示し、右側はＹＰＧａｌ液体培地（ガラクトース培地）を用いた場合における、２クローンの平均値を示す。
図４の結果から分かるように、ＫｍＧＡＬ１プロモーターは、サッカロマイセス・セレビシエにおいてもガラクトース誘導的に発現すること、しかもＫｍＧＡＬ１プロモーターをサッカロマイセス・セレビシエにおいて用いた場合のＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）（ガラクトース誘導下）が、ＳｃＧＡＬ１０プロモーターを用いた場合と比較して、割合として、約５倍にも上昇していた。一般的には、宿主の属する種とは異なる種に属する生物から単離したプロモーターが、その宿主においてプロモーターとして機能しないことの方が多い。しかも、宿主由来のプロモーターを超える発現量をその他の生物のプロモーターが発揮することは通常無い。したがって、クルイベロマイセス・マルシアヌス由来のＧＡＬ１プロモーターが、サッカロマイセス・セレビシエにおいて、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＡＬ１０プロモーターよりも５倍もの高い発現性を示したことは稀な現象であるといえる。
さらに、ＫｍＧＡＬ１プロモーターをクルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いた場合のＣＬｕｃの相対発現量（ＲＬＵ／ＯＤ・μｌ）（ガラクトース誘導下）は、ＳｃＧＡＬ１０プロモーターをサッカロマイセス・セレビシエにおいて用いた場合のＣＬｕｃ相対発現量（ガラクトース誘導下）と比較して、割合として５０倍以上にも上昇していた。このことから、ＫｍＧＡＬ１プロモーターが有するこの高発現性は、顕著であるといえる。
本発明は、目的遺伝子の高発現や目的遺伝子産物の高生成の分野において特に有用に利用することができる。
【０００５】
［００１６］
［図１］クルイベロマイセス・マルシアヌスにおけるＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＧＡＬ７プロモーターのプロモーター構造を示す図である。
［図２］クルイベロマイセス・マルシアヌスのＧＡＬ１プロモーター（ＫｍＧＡＬ１プロモーター）のプロモーター構造を示す図である。
［図３］ＫｍＧＡＬ１プロモーターの部位を特定するための発現解析試験の結果を示す図である。
［図４］クルイベロマイセス・マルシアヌス又はサッカロマイセス・セレビシエにおける、ＫｍＧＡＬ１プロモーターの発現解析試験の結果を示す図である。
発明を実施するための形態
［００１７］
１．本発明のプロモーター
本発明の高発現プロモーターは、（Ａ）配列番号１、２若しくは３に示されるポリヌクレオチドからなるか、又は、（Ｂ）これらのポリヌクレオチドの変異体であって、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチドからなることを特徴とする。配列番号１に示されるポリヌクレオチドは、クルイベロマイセス・マルシアヌス由来のＧＡＬ１プロモーターであり、配列番号２に示されるポリヌクレオチドは、クルイベロマイセス・マルシアヌス由来のＧＡＬ１０プロモーターであり、配列番号３に示されるポリヌクレオチドは、クルイベロマイセス・マルシアヌス由来のＧＡＬ７プロモーターである。かかる本発明の高発現プロモーターは、クルイベロマイセス・マルシアヌスだけでなく、他の酵母においても、目的遺伝子を高発現させることができる。
［００１８］
上記（Ｂ）の、配列番号１、２又は３に示されるポリヌクレオチドの変異体であって、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチドからなるプロモーター（以下、特に「本発明の変異体プロモーター」とも表
【００１５】
ＫｍＧＡＬ１プロモーターの部位を特定するために、以下のような発現解析試験をおこなった。
［００４２］
まず、ＫｍＧＡＬ１プロモーターを含むと考えられる１．４ｋｂのＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−１４００〜−１に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−１４００と命名した。次に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を２００ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−１２００〜−１に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−１２００と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を４００ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−１０００〜−１に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−１０００と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を５８０ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−８２０〜−１に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−８２０と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を６２５ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−７７５〜−１に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−７７５と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を６５０ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−７５０〜−１に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−７５０と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を８００ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−６００〜−１に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−６００と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を１０００ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−４００〜−１に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−４００と命名した。同様に、ＫｍＧＡＬ１−１４００の５’末端を１２００ｂａｓｅ欠失させたＤＮＡ配列（図２のＫｍＧＡＬ１プロモーター構造の−２００〜−１に相当する配列）を用意し、ＫｍＧＡＬ１−２００と命名した。
［００４３］
分泌型ルシフェラーゼＣＬｕｃ遺伝子がＧＡＬ１プロモーターの下流に作

Claims (8)

  1. 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる高発現プロモーター：
    （ａ）配列番号１に示されるポリヌクレオチド：
    （ｂ）上記の（ａ）のポリヌクレオチドに対して８０％以上の同一性を有し、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド：
    （ｃ）配列番号２に示されるポリヌクレオチド：
    （ｄ）上記の（ｃ）のポリヌクレオチドに対して８０％以上の同一性を有し、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド：
    （ｅ）配列番号３に示されるポリヌクレオチド：
    （ｆ）上記の（ｅ）のポリヌクレオチドに対して８０％以上の同一性を有し、かつ、クルイベロマイセス・マルシアヌス及びそれ以外の少なくとも１種以上の酵母においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
  2. 請求項１に記載の高発現プロモーターと、その制御下に作動可能に配置された目的遺伝子とを含む組換えポリヌクレオチド。
  3. 請求項２に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
  4. 請求項２に記載の組換えポリヌクレオチド又は請求項３に記載のベクターを、酵母に導入して得られることを特徴とする形質転換体。
  5. 酵母が、サッカロマイセス属酵母及びクルイベロマイセス属酵母からなる群から選択されるいずれかの酵母であることを特徴とする請求項４に記載の形質転換体。
  6. 酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ及びクルイベロマイセス・マルシアヌスから選択されるいずれかの酵母であることを特徴とする請求項４に記載の形質転換体。
  7. 請求項４〜６のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする目的遺伝子の高発現方法。
  8. 請求項４〜６のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程と、培養して得られた形質転換体から目的遺伝子産物を回収する工程とを含むことを特徴とする目的遺伝子産物の製造方法。
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