KR20150039104A

KR20150039104A - 유전체 상의 표지자 유전자의 발현을 이용한 ｄｎａ 조각 삽입 방법

Info

Publication number: KR20150039104A
Application number: KR20140130327A
Authority: KR
Inventors: 정유경; 방두희; 박진환; 서한나; 정재환; 조광명
Original assignee: 삼성전자주식회사; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-01
Filing date: 2014-09-29
Publication date: 2015-04-09

Abstract

표적 서열을 세포의 유전체에 삽입하는 방법에 의하면, 표지자의 발현 여부를 이용한 양성 선택 또는 음성 선택을 통해 미생물에 표적 서열의 삽입 효율을 증가시키고 삽입 여부를 빠르게 선별 또는 검출할 수 있다.

Description

유전체 상의 표지자 유전자의 발현을 이용한 ＤＮＡ 조각 삽입 방법{Method for inserting DNA fragments to genome by using marker gene expression}

본 명세서에 개시된 표지자 유전자를 이용하여 DNA 조각을 삽입할 수 있는 방법에 관한 것이다.

유전체(genome)를 조작하여 원하는 형질의 유전체 변형 생물체를 만드는 기술은 고전적인 변형 유전체에 기반한 분자생물학적 연구이나, 최근의 박테리아를 이용한 바이오 연료, 생화학 물질 등을 생산하는 것 등에서 많이 이용되고 있다. 이러한 유전체 조작은 여러 개의 뉴클레오티드(nucleotide) 뿐만 아니라, 유전자 크기 수준의 DNA 조각을 삽입, 치환, 또는 결실시킬 수 있다.

일반적으로 그람 음성 박테리아 유전체 상으로의 DNA 조각의 삽입은 람다 박테리오파지의 Red 단백질들(exo, beta, gamma)을 이용할 수 있다. 이를 위해서는 선형으로 디자인된 삽입될 DNA 조각이 필요하고 전기천공법(electroporation)과 같은 방법으로 세포 안으로 삽입시킨다. 그리고 DNA 조각은 유전체 상의 특정 위치로 삽입되기 위한 인접(flanking) 서열을 포함하는데, 인접 서열은 삽입될 특정 위치의 양쪽으로 약 50 bp의 폴리뉴클레오티드 서열로서 DNA 조각의 양쪽 말단 방향으로 포함하게 한다. 전달된 DNA 조각은 Red 단백질 중 exo의 활성으로 인해 이중 가닥에서 단일 가닥으로 변하게 되고 beta의 결합에 의해 세포 내에서 분해되지 않도록 보호된다.

이때, 단일가닥 DNA 조각은 오카자키 절편(Okazaki fragment)의 형태로 세포의 유전체 복제 과정에서 유전체 상으로 삽입된다. 따라서, DNA 조각의 길이가 길어질수록 exo가 단일가닥으로 만드는 것이 비효율적이 되고, 이것은 전체 DNA 조각의 삽입 효율을 저하시키는 것에 직접적으로 연결된다.

삽입 효율을 높이기 위해 DNA 조각에 표지자(marker) 유전자를 포함하게 하여 전체 DNA 조각이 유전체 상으로 삽입시키고, 삽입된 표지자 유전자를 이용하여 탐색하는 방법이 제시된다. 그러나, 이 방법은 삽입되어야 할 DNA 조각의 크기가 오히려 더 커진다는 점에서 효율적이지 못하다. 또한, 일반적으로 표지자 유전자를 선택함에 있어 양성 선택만이 가능한 항생제 저항 유전자를 이용한다. 따라서 DNA 조각을 넣어주는 매회 과정마다 새로운 양성선택이 가능한 표지자 유전자를 이용해야 하지만, 항생제 저항 유전자들의 종류의 한계 등의 이유로 매회 과정마다 새로운 표지자 유전자를 이용하는 것은 현실적인 한계가 있다.

따라서, 종래 기술에 의하더라도, 유전체 상에 기 존재하는 표지자 유전자를 이용하여 삽입해야 하는 DNA 조각의 크기를 줄여 효율을 극대화시키고 이후 변형된 유전체의 탐색을 용이하게 하는 방법이 요구되고 있다.

표적 서열을 세포의 유전체에 삽입하는 방법을 제공한다.

일 양상에 따르면, 표지자가 세포 유전체 내에 존재하는 경우에 표적 서열을 세포의 유전체에 삽입하는 방법이 제공된다.

5'에서 3' 방향으로 제1 인접(flanking) 서열, 제1 표적 서열을 포함하는 제1 영역, 및 제2 인접 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,

상기 세포의 유전체는 5'에서 3' 방향으로 표지자 암호화 영역의 전사 조절 부위를 포함하는 제2 영역 및 표지자 암호화 영역을 포함하는 제3 영역을 포함하는 것이고,

상기 제1 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제2 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 제2 영역의 5' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고,

상기 제2 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제2 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 포함하는, 표적 서열을 세포의 유전체에 삽입하는 방법이 제공된다.

상기 방법은 5'에서 3' 방향으로 제1 인접 서열, 제1 표적 서열을 포함하는 제1 영역, 및 제2 인접 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계를 포함한다.

상기 세포의 유전체는 5'에서 3' 방향으로 표지자 암호화 영역의 전사 조절 부위를 포함하는 제2 영역 및 표지자 암호화 영역을 포함하는 제3 영역을 포함하는 것일 수 있다.

상기 세포는 폴리뉴클레오티드를 삽입하고자 하는 숙주 세포일 수 있다. 예를 들면, 상기 세포는 대장균(E. coli), 효모, 균류, 동물 세포, 또는 식물 세포일 수 있다.

용어 "유전체(genome)"은 생물의 유전 정보 전체를 의미한다. 유전체는 DNA(예를 들어, 염색체) 또는 RNA로 이루어진 것일 수 있고, 세포 핵의 유전체, 미토콘드리아의 유전체, 또는 엽록체의 유전체를 포함한다.

상기 세포의 유전체는 5'에서 3' 방향으로 표지자 암호화 영역의 전사 조절 부위를 포함하는 제2 영역 및 표지자 암호화 영역을 포함하는 제3 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 전사 조절 부위 및 표지자는 세포 내에 존재하는 것일 수 있다.

용어 "전사 조절 부위(transcription regulation site)"는 세포의 유전자의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있는 핵산 세그먼트를 말하고, 용어 "조절 서열(regulatory sequence)"과 교환적으로 사용될 수 있다. 전사 조절 부위는 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 인슐레이터(insulator), 사일렌서(silencer), 또는 전사 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합일 수 있다. 프로모터는 유전자의 전사를 개시하는 DNA 영역을 말하고, 전사를 조절하는 유전자의 앞부분(또는 상류)에 위치한다. 프로모터는 프리브나우 박스(Pribnow box), TATA 박스, BRE(B recognition element), CAAT 박스, 반응 인자(response elements), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 인핸서(enhancer)는 유전자의 전사 수준을 증가시키는 단백질 인자가 결합할 수 있는 DNA 서열을 말한다. 인핸서는 인핸서 박스(enhancer box; E-box) 또는 반응 인자(response elements)를 포함할 수 있다. 인슐레이터는 인핸서와 프로모터 사이의 상호 작용을 블로팅하는 유전적 경계 인자를 말한다. 사일렌서는 유전자의 전사 수준을 감소시키는 단백질 인자가 결합할 수 있는 DNA 서열을 말한다. 전사 조절 부위는 세포 자체에 존재하는 것이거나 또는 외부에서 삽입된 것일 수 있다. 전사 조절 부위는 길이가 약 5 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고 함) 내지 약 1000 nt, 약 10 nt 내지 약 800 nt, 약 15 nt 내지 약 600 nt, 약 20 nt 내지 약 400 nt, 또는 약 25 nt 내지 약 200 nt일 수 있다.

상기 표지자(marker)는 양성 선택, 음성 선택, 또는 이들의 조합이 가능한 유전자일 수 있다. 예를 들면, 표지자는 양성 선택 및 음성 선택이 둘 다 가능한 것일 수 있다. 양성 선택(positive selection)은 예를 들면, 세포에 유전자를 삽입하여 형질전환된 세포를 선택할 때 유전자 산물을 발현하고 있는 세포가 생존하는 선택 조건에서 선택되는 것을 말한다. 양성 선택은 또한 표현형 또는 표지자의 발현에 기초한 세포의 선별일 수 있다. 음성 선택(negative selection)은 예를 들면, 세포에 유전자를 삽입하여 형질전환된 세포를 선택할 때 유전자 산물이 발현됨으로써 사멸되는 선택 조건에서 선택되는 것을 말한다. 음성 선택은 또한 표현형 또는 표지자의 발현의 결여에 기초하여 세포의 선별일 수 있다.

상기 표지자는 막 단백질, 당분해 대사 관련 단백질, DNA 생합성 관련 단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 당분해 대사 관련 단백질은 대사체(metabolite) 또는 당분해(glycolysis) 대사에 요구되는 단백질일 수 있다. DNA 생합성 관련 단백질은 DNA를 생산하기 위해 요구되는 단백질일 수 있다. 상기 막 단백질은 TolC(TolC outer membrane channel) 단백질일 수 있다. TolC 단백질의 발현 여부에 따라, 특정 물질의 수송이 결정되므로, 이의 발현 여부를 통하여 용이하게 표적 단백질의 삽입 여부를 결정할 수 있다. 예를 들면, 표지자로 TolC 단백질을 사용하는 경우, tolC 유전자가 발현되면 SDS(sodium dodecyl sulfate)가 존재한 배지 내에서 막 단백질을 통해 독성 물질이 배출되어 세포가 생존할 수 있다. 또한, tolC 유전자가 발현되지 않으면 Colicin E1이 세포 내로 유입되어 세포가 생존할 수 없다. 예를 들어, 양성 선택에서, 세포는 SDS를 포함하는 배지에서 선택되고, TolC 단백질이 발현된 세포가 SDS를 포함하는 배지에서 생존할 수 있다. 예를 들어, 음성 선택에서, 세포는 Colicin E1을 포함하는 배지에서 선택되고, TolC 단백질이 발현되지 않는 세포가 Colicin E1을 포함하는 배지에서 생존할 수 있다. 상기 당분해 대사 관련 단백질은 GalK(galactokinase) 단백질 또는 MalK(Component of malotse ABC transporter) 단백질일 수 있다. galK 유전자 또는 malK 유전자가 발현되면 세포가 갈락토스(galactose) 또는 말토오스(maltose)를 분해하여 산을 생성하고, 생성된 산으로 인해 배지의 pH가 6.8 이하가 되면 붉은색의 콜로니가 생성되어 양성 선택이 가능하다. 한편, galK 유전자 또는 malK 유전자가 없는 세포는 락토오스(lactose) 대신 펩톤(peptone)을 분해하여 암모니아를 생성하고, 생성된 암모니아로 인해 배지의 pH가 증가하면 흰색의 콜로니가 생성되어 음성 선택이 가능하다. 상기 DNA 생합성 관련 단백질은 ThyA(Thymidylate synthase) 단백질일 수 있다. 예를 들면, 표지자로 ThyA를 사용하는 경우, ThyA 표지자의 양성 선택에서 M9 최소 배지에서 티민(thymine)이 없는 환경에서 살 수 있는지 여부로 선별할 수 있다. 음성 선택에서 티민과 트리메토프림(trimethoprim)이 있는 환경에서 수행되는데 dUMP의 메틸화를 통한 dTMP의 합성에서 부산물로 나오는 디히드로폴레이트(dihydrofolate)의 테트라히드로폴레이트(tetrahydrofolate)로의 전환을 트리메토프림이 막게 된다. 이 경우 세포의 대사에 많이 이용되는 테트라히드로폴레이트의 고갈로 인해 ThyA를 가지고 있는 세포는 죽게 되어 음성 선택이 가능하다.

상기 제1 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제2 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 제2 영역의 5' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것일 수 있다.

상기 제2 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제2 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것일 수 있다.

용어 "인접 서열(flanking sequence)"은 유전자 또는 DNA 단편의 5' 말단 또는 3' 말단에 인접한 DNA 영역을 의미한다. 인접 서열은 길이가 약 2 nt 내지 약 500 nt, 약 20 nt 내지 약 450 nt, 약 2 nt 내지 약 400 nt, 약 2 nt 내지 약 350 nt, 약 2 nt 내지 약 300 nt, 또는 약 2 nt 내지 약 200 nt일 수 있다. 용어 "상동(homology)" 또는 "상동성(homologous)"은 예를 들면 핵산 서열 간에 유사하거나 동일한 것을 말한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열과 상동성인 서열은 상기 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나 또는 상보적인 서열일 수 있다. 인접 서열은 삽입하고자 하는 위치의 5' 말단 또는 3' 말단 방향으로 약 2 nt 내지 약 500 nt, 약 2 nt 내지 약 450 nt, 약 2 nt 내지 약 400 nt, 약 2 nt 내지 약 350 nt, 약 2 nt 내지 약 300 nt, 또는 약 2 nt 내지 약 200 nt의 폴리뉴클레오티드 서열에 상동성이 있는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 인접 서열 및 게놈의 상응하는 상동성 서열의 최소 길이는 약 5 nt 이상, 약 10 nt 이상, 약 20 nt 이상, 약 30 nt 이상, 약 40 nt 이상, 약 50 nt 이상일 수 있다.

표적 유전자는 세포의 유전체에 삽입하고자 하는 유전자를 말한다. 표적 유전자의 발현 산물은 표적 단백질이다.

세포의 유전체에 삽입하는 것은 상동 재조합에 의해 이루어지는 것일 수 있다. 상동 재조합(homologous recombination)은 두 개의 유사하거나 동일한 폴리뉴클레오티드 서열 간에 폴리뉴클레오티드가 교환되는 유전적 재조합을 말한다. 상동 재조합이 일어나는 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상이 동일한 것일 수 있다.

상기 제1 폴리뉴클레오티드의 삽입에 의해 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역 및 제3 영역을 포함하는 세포의 유전체를 생성할 수 있다. 상기 유전체는 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역(제1 폴리뉴클레오티드로부터 유래됨) 및 제3 영역을 포함한다.

상기 방법은 상기 표지자가 발현되지 않은 세포를 선택하여 제1 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 음성 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 음성 선별은 전술한 바와 같다.

상기 방법은 제1 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입한 후에, 5'에서 3' 방향으로 제3 인접 서열, 제2 표적 서열을 포함하는 제4 영역, 표지자 암호화 영역의 전사 조절 부위를 포함하는 제5 영역 및 제4 인접 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,

상기 제3 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제1 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것이고,

상기 제4 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 제2 폴리뉴클레오티드의 삽입에 의해 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제4 영역, 제5 영역, 및 제3 영역을 포함하는 세포의 유전체를 생성할 수 있다. 상기 유전체는 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제4 영역, 제5 영역, 및 제3 영역을 포함한다.

상기 방법은 상기 표지자가 발현되는 세포를 선택하여 제2 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 양성 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 양성 선별은 전술한 바와 같다.

상기 방법은 제2 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입한 후에, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제5 인접 서열, 제3 표적 서열을 포함하는 제6 영역, 및 제6 인접 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서, 상기 제5 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제4 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제5 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고, 상기 제6 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제5 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 제3 폴리뉴클레오티드의 삽입에 의해 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제4 영역, 제6 영역, 및 제3 영역을 포함하는 세포의 유전체를 생성할 수 있다. 상기 유전체는 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제4 영역, 제6 영역, 및 제3 영역을 포함한다.

상기 방법은 표지자가 발현되지 않은 세포를 선택하여 제3 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 음성 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 음성 선별은 전술한 바와 같다.

상기 방법은 제3 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입한 후에, 5'에서 3' 방향으로 제7 인접 서열, 제4 표적 서열의 3' 말단으로부터 5' 방향의 영역을 포함하는 제7 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제8 영역, 및 제8 인접 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,

상기 제7 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제6 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것이고,

상기 제8 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 방법은 제4 폴리뉴클레오티드를 도입한 후에, 5'에서 3' 방향으로 제9 인접 서열, 제4 표적 서열의 5' 말단으로부터 3' 방향의 영역을 포함하는 제9 영역, 및 제10 인접 서열을 포함하는 제5 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,

상기 제4 표적 서열은 상기 제4 표적 서열의 3' 말단 영역과 상기 제4 표적 서열의 5' 말단 영역을 포함하는 것이고,

상기 제9 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제7 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제8 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고,

상기 제10 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제8 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 제4 폴리뉴클레오티드 및 제5 폴리뉴클레오티드의 삽입에 의해 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제4 영역, 제6 영역, 제7 영역, 제9 영역, 및 제3 영역을 포함하는 세포의 유전체를 생성할 수 있다. 상기 유전체는 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제4 영역, 제6 영역, 제7 영역, 제9 영역, 및 제3 영역을 포함한다.

상기 방법은 표지자가 발현된 세포를 선택하여 제4 표적 서열의 3' 말단 영역이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 양성 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 표지자가 발현되지 않은 세포를 선택하여 제4 표적 서열의 5' 말단 영역이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 음성 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 양성 선별 및 음성 선별은 전술한 바와 같다.

일 구체예에 따르면, 전사 인자 및 표지자가 세포 내에 존재하는 경우 세포의 유전체에 표적 유전자를 순차적으로 삽입할 수 있다. 이 경우, 홀수번째 삽입에서는 음성 선택을 하고, 짝수번째 삽입에서는 양성 선택을 번갈아 선택하여, 2개 이상의 표적 유전자의 삽입 여부를 순차적으로 확인할 수 있다. 또한, 표적 유전자의 삽입 효율을 높이기 위해, 도입되는 유전자의 크기를 감소시켜 유전체에 도입할 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자의 단편을 차례로 유전체에 도입할 수 있다.

일 양상에 따르면, 표지자가 세포 유전체 내에 존재하지 않는 경우에 표적 서열을 세포의 유전체에 삽입하는 방법이 제공된다.

5'에서 3' 방향으로 제1 인접 서열, 제1 표적 서열을 포함하는 제1 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제2 영역, 표지자 암호화 영역을 포함하는 제3 영역, 및 제2 인접 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,

상기 제1 인접 서열 및 제2 인접 서열은 세포의 유전체의 삽입 부위의 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드 또는 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 포함하는, 표적 서열을 세포의 유전체에 삽입하는 방법이 제공된다.

인접 서열, 표적 서열, 전사 조절 부위, 표지자 암호화 영역, 세포, 및 세포의 유전체에의 삽입은 전술한 바와 같다.

삽입 부위는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입되는 부위를 말한다.

상기 제1 폴리뉴클레오티드의 삽입에 의해 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제2 영역, 및 제3 영역을 포함하는 세포의 유전체를 생성할 수 있다. 상기 유전체는 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제2 영역, 및 제3 영역을 포함한다.

상기 방법은 상기 표지자가 발현되는 세포를 선택하여 제1 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 양성 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 양성 선별은 전술한 바와 같다.

상기 방법은 제1 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입한 후에, 5'에서 3' 방향으로 제3 인접 서열, 제2 표적 서열을 포함하는 제4 영역, 및 제4 인접 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,

상기 제3 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제1 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 제2 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고,

상기 제4 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제2 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 제2 폴리뉴클레오티드의 삽입에 의해 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제4 영역, 및 제3 영역을 포함하는 세포의 유전체를 생성할 수 있다. 상기 유전체는 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제4 영역, 및 제3 영역을 포함한다.

상기 방법은 상기 표지자가 발현되지 않는 세포를 선택하여 제2 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 음성 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 음성 선별은 전술한 바와 같다.

상기 방법은 제2 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입한 후에, 5'에서 3' 방향으로 제5 인접 서열, 제3 표적 서열을 포함하는 제6 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제5 영역, 및 제6 인접 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,

상기 제5 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제4 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것이고,

상기 제6 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 제3 폴리뉴클레오티드의 삽입에 의해 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제4 영역, 제6 영역, 제5 영역, 및 제3 영역을 포함하는 세포의 유전체를 생성할 수 있다. 상기 유전체는 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제4 영역, 제6 영역, 제5 영역, 및 제3 영역을 포함한다.

상기 방법은 상기 표지자가 발현되는 세포를 선택하여 제3 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 양성 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 양성 선별은 전술한 바와 같다.

상기 방법은 제3 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입한 후에, 5'에서 3' 방향으로 제7 인접 서열, 제4 표적 서열의 3' 말단으로부터 5' 방향의 영역을 포함하는 제7 영역, 및 제8 인접 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,

상기 제7 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제6 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제5 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고,

상기 제8 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제5 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 방법은 제4 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입한 후에, 5'에서 3' 방향으로 제9 인접 서열, 제4 표적 서열의 5' 말단으로부터 3' 방향의 영역을 포함하는 제8 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제9 영역, 및 제10 인접 서열을 포함하는 제5 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,

상기 제9 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제7 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것이고,

상기 제10 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 제4 폴리뉴클레오티드 및 제5 폴리뉴클레오티드의 삽입에 의해 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제4 영역, 제6 영역, 제7 영역, 제8 영역, 제9영역, 및 제3 영역을 포함하는 세포의 유전체를 생성할 수 있다. 상기 유전체는 제1 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 영역, 제4 영역, 제6 영역, 제7 영역, 제8 영역, 제9영역, 및 제3 영역을 포함한다.

상기 방법은 표지자가 발현되지 않은 세포를 선택하여 제4 표적 서열의 3' 말단 영역이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 음성 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 표지자가 발현된 세포를 선택하여 제4 표적 서열의 5' 말단 영역이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 양성 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 음성 선별 및 양성 선별은 전술한 바와 같다.

일 구체예에 따르면, 전사 인자 및 표지자를 세포 외에서 세포 내로 도입하는 경우 세포의 유전체에 표적 유전자를 순차적으로 삽입할 수 있다. 이 경우, 홀수번째 삽입에서는 양성 선택을 하고, 짝수번째 삽입에서는 음성 선택을 번갈아 선택하여, 2개 이상의 표적 유전자의 삽입 여부를 순차적으로 확인할 수 있다. 또한, 표적 유전자의 삽입 효율을 높이기 위해, 도입되는 유전자의 크기를 감소시켜 유전체에 도입할 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자의 단편을 차례로 유전체에 도입할 수 있다.

따라서, 일 구체예에 따른 표적 서열을 세포의 유전체에 삽입하는 방법에 의하면, 표지자의 발현 여부를 이용한 양성 선택과 음성 선택을 통한 미생물에 유전자의 삽입 여부를 빠르게 선별할 수 있다. 또한, 하나의 표지자를 이용하여 다양한 유전자의 삽입 여부를 순차적으로 확인할 수 있으므로, 보다 많은 유전자를 미생물의 유전체 내에 안정적으로 삽입할 수 있다. 이러한 방법으로 유전자가 삽입된 미생물을 선별시 DNA 조각의 삽입 효율을 극대화시킬 수 있다. 이러한 방법을 이용할 시 유전체 상에 목적 유전자의 삽입 여부를 효과적으로 검출할 수 있을 뿐 아니라, 표지자의 재활용으로 삽입되는 유전자의 크기를 줄여, 보다 많은 유전자를 유전체 상에 삽입할 수 있어 산업적으로 활용도가 높다.

도 1은 양성 선택 및 음성 선택을 위한 DNA 조각을 제조하는 방법의 모식도이다.
도 2는 세포 내에 표지자가 존재하는 경우 양성 선택 및 음성 선택을 통해 유전자가 삽입된 세포를 선별하는 방법의 모식도이다.
도 3은 세포 내에 표지자가 없는 경우 양성 선택 및 음성 선택을 통해 유전자가 삽입된 세포를 선별하는 방법의 모식도이다.
도 4는 표적 유전자 pylT,S, pylB 및 pylC,D가 대장균 유전체에 순차적으로 삽입된 것을 PCR에 의하여 확인한 결과이다.
도 5는 표적 유전자 025B, 4hbd 및 cat2가 대장균 유전체에 순차적으로 삽입된 것을 PCR에 의하여 확인한 결과이다.
도 6은 도입되는 유전자를 둘로 나누어 유전체에 순차로 도입하는 방법의 모식도이다.
도 7은 선택 횟수에 따른 유전체 도입 효율(%)을 나타내는 그래프이다(실선: 유전자 크기의 도입, 점선: 작은 단편의 도입).
도 8a 및 도8b은 표적 유전자인 sucD를 둘로 나눈 단편인 sucD-1 및 sucD-2를 각각 유전체에 순차적으로 도입된 것을 PCR에 의하여 확인한 결과이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포내 유전자( tolC )를 표지자로 활용하여 유전체 내에 피로리신( pyrrolysine ) 유전자 클러스터의 삽입

1.1. 표적 유전자로서 피로리신 ( pyrrolysine ) 유전자 클러스터의 선택

피로리신은 하기 화학식을 갖는 아미노산이다.

[화학식 1]

피로리신을 함유하는 단백질을 준비하기 위해, 피로리신을 TAG 코돈에 삽입시키는데 필요한 유전자인 pylT, pylS, pylB, pylC, 및 pylD의 5개 유전자를 피로리신 유전자 클러스터로 사용하여 대장균의 유전체에 순차적으로 삽입하였다. pylT는 피로리신을 TAG 코돈으로 삽입하는 tRNA를 합성하는 유전자, pylS는 피로리신과 tRNA를 연결해주는 피로일실-tRNA 신세타제(pyrrolysyl-tRNA synthetase)이고, pylB, pylC, 및 pylD 유전자는 L-Lysine으로부터 L-피로리신을 합성하는데 필요한 유전자이다. 제1 표적 유전자로 pylT와 pylS를 연결한 pylT,S를 선택하고, 제2 표적 유전자로 pylB를 선택하고, 및 제3 표적 유전자로 pylC 및 pylD를 연결한 pylC,D를 선택하였다.

1.2. 유전체 내 삽입을 위한 DNA 조각의 준비

대장균 내에 존재하는 tolC 유전자를 표지자로 사용하고, 음성 선택 또는 양성 선택을 위한 DNA 조각을 준비하였다.

5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접(flanking) 서열 1(서열번호 1), 제1 표적 유전자인 pylT,S 유전자와 동일한 폴리뉴클레오티드(서열번호 2), 및 인접 서열 2(서열번호 3)를 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 인접 서열 1(서열번호 1)은 대장균 유전체 내 삽입하고자 하는 tolC 유전자의 전사 조절 부위의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 2(서열번호 3)는 대장균 유전체 내 삽입하고자 하는 tolC 유전자의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 1 및 인접 서열 2는 상동 재조합을 위한 homology arm을 이루어, 대장균 유전체의 tolC 유전자의 전사 조절 부위가 결실되고 tolC 유전자의 전사 조절 부위 위치에 제1 표적 유전자인 pylT,S가 삽입되도록 디자인하였다. 제1 표적 유전자인 pylT,S 가 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 표적 유전자인 pylT,S 및 tolC 유전자가 배열된다.

그 다음, 양성 선택을 위한 DNA 조각으로서, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 3(서열번호 4), 제2 표적 유전자인 pylB 유전자와 동일한 폴리뉴클레오티드(서열번호 5), 전사 조절 부위(서열번호 6), 및 인접 서열 4(서열번호 7)를 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 인접 서열 3(서열번호 4)은 제1 표적 유전자인 pylT,S의 3' 말단으로부터 5' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 전사 조절 부위(서열번호 6)은 T7 프로모터와 Untranslated Region(UTR), 및 리보좀 결합 부위(Ribosome Binding Site)를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 4(서열번호 7)는 tolC 유전자의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 3 및 인접 서열 4는 상동 재조합을 위한 homology arm을 이루어, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제2 표적 유전자인 pylB 및 전사 조절 부위가 제1 표적 유전자인 pylT,S와 tolC 사이에 삽입되도록 디자인하였다. 제2 표적 유전자인 pylB 및 전사 조절 부위가 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 표적 유전자인 pylT,S, 제2 표적 유전자인 pylB, 전사 조절 부위, 및 tolC 유전자가 배열된다.

그 다음, 음성 선택을 위한 DNA 조각으로서, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 5(서열번호 8), 제3 표적 유전자인 pylC,D 유전자와 동일한 폴리뉴클레오티드(서열번호 9), 및 인접 서열 6(서열번호 10)를 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 인접 서열 5(서열번호 8)는 삽입된 제2 표적 유전자인 pylB 유전자의 3' 말단으로부터 5' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 6(서열번호 10)은 tolC 유전자의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 5 및 인접 서열 6은 상동 재조합을 위한 homology arm을 이루어, 전사 조절 부위가 결실되고 전사 조절 부위 위치에 제3 표적 유전자인 pylC,D가 삽입되어 되도록 디자인하였다. 제3 표적 유전자인 pylC,D가 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 표적 유전자인 pylT,S, 제2 표적 유전자인 pylB, 제3 표적 유전자인 pylC,D, 및 tolC 유전자가 배열된다.

1.3. 제1 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각을 대장균에 삽입 및 이를 확인하기 위한 음성 선택

실시예 1.2에서 준비된 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접(flanking) 서열 1(서열번호 1), pylT,S를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2), 및 인접 서열 2(서열번호 3)를 포함하는 DNA 조각을 대장균(E. coli)에 삽입하였다. 삽입 방법은 전기 천공법(electroporation)을 이용하였다.

그 후, 대장균을 LB 배지에 배양하였다. 구체적으로 하기와 같이 수행하였다. 엔지니어링 하려는 대장균 균주를 3 ml LB에 접종하였다. 일반적으로 lambda red recombination을 이용하여 DNA 조각을 유전체 속으로 삽입하기 때문에 대장균은 lambda red 단백질을 암호화하는 유전자를 이미 지니고 있는 것을 이용하였다.

lambda red protein coding 유전자의 발현을 막아 background mutation을 줄이기 위해, 600 나노미터의 파장에서 OD(optical density)가 0.6이 될 때까지 30℃에서 배양하였다. 그 후, 42℃에서 15 분간 배양하였다. 본 실험에서 이용한 대장균의 경우 lambda red 단백질을 암호화하는 유전자들은 pL 프로모터에 의해 조절되는데 이 pL 프로모터를 작동시키기 위해서 42℃의 배양을 통해 해당 프로모터에 붙은 억제자(repressor)를 제거하였다.

대장균 배양액 1 ml를 4℃에서 13,000rpm으로 1분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하였다. 펠렛에 1 ml의 증류수로 첨가하여 세포를 세척한 후, 4℃에서 13,000 rpm에서 1 분간 원심분리시켰다. 전기 천공법의 효율을 높이기 위해 세척 단계를 한 번 더 반복하여, 염을 제거하였다. 상층액을 제거한 후, 50 ㎕의 상기 준비된 DNA 단편(약 1,000 ng의 DNA)을 첨가하고 세포들과 혼합하였다. 혼합된 세포에 전기천공법을 수행한 후, 대장균을 3 ml LB 배지에 옮겨 30℃에서 3시간 동안 배양하였다.

배양된 대장균은 음성 선택을 위해 0.1%(v/v) colicin E1을 포함하는 고체 배지에 배양된 대장균을 순차적으로 희석하여 도말한 후 밤새 배양하였다. 표지자가 발현된다면 세포내로 colicin E1가 들어와서 세포에 독성을 나타내므로, colicin E1을 포함하는 배지에서 죽는다. 따라서, 음성 선택이 가능하다.

1.4. 제2 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각을 대장균에 삽입 및 이를 확인하기 위한 양성 선택

상기 제1 표적 유전자가 유전체 상에 삽입된 대장균을 음성 선택을 통해 선별하였다. 실시예 1.2에서 준비된 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 3(서열번호 4), pylB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 5), 전사 조절 부위(서열번호 6), 및 인접 서열 4(서열번호 7)를 포함하는 DNA 조각을 실시예 1.3에 기재된 방법에 따라 대장균에 삽입하고, 배양하였다.

배양된 대장균은 양성 선택을 위해 0.01%(v/v) SDS를 포함하는 고체 배지에 배양된 대장균을 순차적으로 희석하여 도말한 후 밤새 배양하였다. 표지자가 발현된다면 세포 내로 유입된 SDS가 TolC 단백질에 의해 세포 밖으로 배출되어, SDS가 포함된 배지에서 살 수 있다. 따라서, 양성 선택이 가능하다.

1.5. 제3 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각을 대장균에 삽입 및 이를 확인하기 위한 음성 선택

상기 제2 표적 유전자 및 조절인자가 유전체 상에 삽입된 대장균 coli을 양성 선택을 통해 선별하였다. 실시예 1.2에서 준비된 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 5(서열번호 8), pylC,D를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 9), 및 인접 서열 6(서열번호 10)를 포함하는 DNA 조각을 실시예 1.3에 기재된 방법에 따라 대장균에 삽입하고, 배양하였다.

배양된 대장균은 음성 선택을 위해 0.1%(v/v) colicin E1을 포함하는 고체 배지에 배양된 대장균을 순차적으로 희석하여 도말한 후 밤새 배양하였다. 표지자가 발현되면 세포내로 colicin E1가 들어와서 세포에 독성을 나타내므로, colicin E1을 포함하는 배지에서 죽는다. 따라서, 음성 선택이 가능하다.

1.6. 대장균 유전체에 삽입된 표적 유전자의 확인

실시예1.3 내지 1.5에서 삽입한 제1 표적 유전자, 제2 표적 유전자, 및 제3 표적 유전자를 포함하는 대장균을 양성 선택 또는 음성 선택을 통하여 수득하였다. 수득된 대장균의 유전체 상에 제1 표적 유전자, 제2 표적 유전자, 및 제3 표적 유전자가 삽입되었는지를 확인하기 위하여, 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction; PCR) 방법으로 확인하였다.

구체적으로, 밤새 배양한 고체 배지에서 대장균 콜로니를 선택하고 콜로니 PCR을 수행하였다.

제1 표적 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위하여, 제1 표적 유전자인 pylT,S 유전자를 특이적으로 증폭하는 정방향 프라이머 1(서열번호 11) 및 역방향 프라이머 2(서열번호 12)를 사용하였다.

제2 표적 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위하여, 제2 표적 유전자인 pylB 유전자를 특이적으로 증폭하는 정방향 프라이머 3(서열번호 13) 및 역방향 프라이머 4(서열번호 14)를 사용하였다.

제3 표적 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위하여, 제3 표적 유전자인 pylC,D 유전자를 특이적으로 증폭하는 정방향 프라이머 5(서열번호 15) 및 역방향 프라이머 6(서열번호 16)을 사용하였다.

PCR을 위한 반응물의 조성을 하기 표 1에 나타내었다.

2X Taq premix	물	정방향 프라이머 (10 μM)	역방향 프라이머 (10 μM)	주형 (picked colony)
10 ㎕	7 ㎕	1 ㎕	1 ㎕	1 ㎕

PCR은 S-100 Thermal Cycler(Biorad)를 사용하였고, 하기 표 2에 나타낸 PCR 조건으로 수행하였다.

		온도	시간
초기 변성		95℃	3분
35 사이클	변성	95℃	30초
	어닐링	60℃	30초
	신장	72℃	1분 30초
최종 신장		72℃	10분

상기와 같은 PCR 조건으로 반응시킨 반응물을 아가로즈 겔에 전기영동을 하여 대장균 유전체에 삽입된 DNA 조각의 크기를 확인하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 제1 표적 유전자, 제2 표적 유전자, 및 제3 표적 유전자가 대장균의 유전체 상에 삽입되었음을 확인하였다. 또한, 예상되는 크기의 밴드를 보여주는 대장균에 대한 DNA 조각의 서열을 분석하여 DNA 조각이 최종적으로 삽입되었는지 여부를 확인하였다. 그 결과 양성 선택 및 음성 선택을 통하여 선별된 대장균 내에 표적 유전자 서열이 모두 포함되었음을 확인하였다.

실시예 2. 세포내 유전자( tolC )를 표지자로 활용하여 유전체 내에 1,4-부탄디올( butanediol ) 유전자 클러스터의 삽입

2.1. 표적 유전자로서 1,4- 부탄디올 ( butanediol ) 유전자 클러스터의 선택

대장균에서 1,4-부탄디올(butanediol: BDO)을 생산하기 위해, 대장균이 갖고 있지 않는 유전자인 025B(aldehyde dehydrogenase gene), 4HBd(4HB dehydro-genase), 및 cat2(4-hydroxybutyryl-CoA transferase) 유전자를 대장균에 순차적으로 삽입하였다. 제1 표적 유전자로 025B 유전자를 선택하고, 제2 표적 유전자로 4HBd 유전자를 선택하고, 및 제3 표적 유전자로 cat2 유전자를 선택하였다.

2.2. 유전체 내 삽입을 위한 DNA 조각의 준비

5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접(flanking) 서열 7(서열번호 17), 제1 표적 유전자인 025B 유전자와 동일한 폴리뉴클레오티드(서열번호 18), 및 인접 서열 8(서열번호 19)를 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 인접 서열 7(서열번호 17)은 대장균 유전체 내 삽입하고자 하는 tolC 유전자의 전사 조절 부위의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 300 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 8(서열번호 19)은 대장균 유전체 내 삽입하고자 하는 tolC 유전자의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 300 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 7 및 인접 서열 8은 상동 재조합을 위한 homology arm을 이루어, 대장균 유전체의 tolC 유전자의 전사 조절 부위가 결실되고 tolC 유전자의 전사 조절 부위 위치에 제1 표적 유전자인 025B가 삽입되도록 디자인하였다. 제1 표적 유전자인 025B가 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 표적 유전자인 025B 및 tolC 유전자가 배열된다.

그 다음, 양성 선택을 위한 DNA 조각으로서, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 9(서열번호 20), 제2 표적 유전자인 4HBd유전자와 동일한 폴리뉴클레오티드(서열번호 21), 전사 조절 부위(서열번호 6), 및 인접 서열 10(서열번호 22)을 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 인접 서열 9(서열번호 20)은 삽입된 제1 표적 유전자인 025B의 3' 말단으로부터 5' 방향에 위치하는 300 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 전사 조절 부위(서열번호 6)은 T7 프로모터와 Untranslated Region(UTR), 및 리보좀 결합 부위(Ribosome Binding Site)를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 10(서열번호 22)은 tolC 유전자의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 300 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 9 및 인접 서열 10은 상동 재조합을 위한 homology arm을 이루어, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제2 표적 유전자인 4HBd 및 전사 조절 부위가 제1 표적 유전자인 025B와 tolC 사이에 삽입되도록 디자인하였다. 제2 표적 유전자인 4HBd 및 전사 조절 부위가 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 표적 유전자인 025B, 제2 표적 유전자인 4HBd, 전사 조절 부위, 및 tolC 유전자가 배열된다.

그 다음, 음성 선택을 위한 DNA 조각으로서, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 11(서열번호 23), 제3 표적 유전자인 cat2 유전자와 동일한 폴리뉴클레오티드(서열번호 24), 및 인접 서열 12(서열번호 25)를 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 인접 서열 11(서열번호 23)은 삽입된 제2 표적 유전자인 4HBd의 3' 말단으로부터 5' 방향에 위치하는 300 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 12(서열번호 25)는 tolC 유전자의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 300 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 11 및 인접 서열 12는 상동 재조합을 위한 homology arm을 이루어, 전사 조절 부위가 결실되고 전사 조절 부위 위치에 제3 표적 유전자인 cat2가 삽입되어 되도록 디자인하였다. 제3 표적 유전자인 cat2가 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 표적 유전자인 025B, 제2 표적 유전자인 4HBd, 제3 표적 유전자인 cat2, 및 tolC 유전자가 배열된다.

2.3. 제1 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각, 제2 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각, 및 제3 유전자를 포함하는 DNA 조각을 대장균에 순차적인 삽입 및 이를 확인하기 위한 음성 또는 양성 선택

실시예 2.2에서 준비된 DNA 조각을 실시예 1.3 내지 실시예 1.5에 기재된 방법에 따라 제1 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각, 제2 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각, 및 제3 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각을 대장균에 순차적인 삽입하고, 음성 또는 양성 선택하여 대장균을 선별하였다.

2.4. 대장균 유전체에 삽입된 표적 유전자의 확인

실시예 2.3에서 순차적으로 삽입한 제1 표적 유전자, 제2 표적 유전자, 및 제3 표적 유전자를 포함하는 대장균을 양성 선택 또는 음성 선택을 통하여 수득하였다. 수득된 대장균의 유전체 상에 제1 표적 유전자, 제2 표적 유전자, 및 제3 표적 유전자가 삽입되었는지를 확인하기 위하여, PCR 방법으로 확인하였다.

제1 표적 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위하여, 제1 표적 유전자인 025B 유전자를 특이적으로 증폭하는 정방향 프라이머 7(서열번호 26) 및 역방향 프라이머 8(서열번호 27)을 사용하였다.

제2 표적 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위하여, 제2 표적 유전자인 4HBd 유전자를 특이적으로 증폭하는 정방향 프라이머 9(서열번호 28) 및 역방향 프라이머 10(서열번호 29)을 사용하였다.

제3 표적 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위하여, 제3 표적 유전자인 cat2 유전자를 특이적으로 증폭하는 정방향 프라이머 11(서열번호 30) 및 역방향 프라이머 12(서열번호 31)를 사용하였다.

PCR을 위한 반응물의 조성을 하기 표 3에 나타내었다.

PCR은 S-100 Thermal Cycler(Biorad)를 사용하였고, 하기 표 4에 나타낸 PCR 조건으로 수행하였다.

		온도	시간
초기 변성		95℃	3분
35 사이클	변성	95℃	30초
	어닐링	60℃	30초
	신장	72℃	2분 30초
최종 신장		72℃	10분

상기와 같은 PCR 조건으로 반응시킨 반응물을 아가로즈 겔에 전기영동을 하여 대장균 유전체에 삽입된 DNA 조각의 크기를 확인하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 제1 표적 유전자, 제2 표적 유전자, 및 제3 표적 유전자가 대장균의 유전체 상에 삽입되었음을 확인하였다. 또한, 예상되는 크기의 밴드를 보여주는 대장균에 대한 DNA 조각의 서열을 분석하여 DNA 조각이 최종적으로 삽입되었는지 여부를 확인하였다. 그 결과 양성 선택 및 음성 선택을 통하여 선별된 대장균 내에 표적 유전자 서열이 모두 포함되었음을 확인하였다.

실시예 3. 외래에서 삽입된 표지자( tolC ) 유전자를 활용하여 유전체 내에 피로리신( pyrrolysine ) 유전자 클러스터의 삽입

3.1 유전체 내 삽입을 위한 DNA 조각의 준비

표지자 유전자를 외부에서 삽입한 것을 제외하고, 실시예 1에서 수행한 것과 동일한 방법으로 진행하였고, 양성 선택과 음성 선택이 가능한 유전자로 tolC 유전자, galK 유전자, malK 유전자, 또는 thyA 유전자를 사용할 수 있다.

구체적으로, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 13(서열번호 32), 제1 표적 유전자인 pylT,S 유전자와 동일한 폴리뉴클레오티드(서열번호 2), 전사 조절 부위(서열번호 6), 표지자 유전자인 tolC 유전자 (서열번호 33), 및 인접 서열 14(서열번호 34)를 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 전사 조절 부위(서열번호 6)은 T7 프로모터와 Untranslated Region(UTR), 및 리보좀 결합 부위(Ribosome Binding Site)를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 13(서열번호 32)은 대장균 유전체 내 삽입하고자 하는 부분의 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 14(서열번호 34)는 대장균 유전체 내 삽입하고자 하는 부분의 50 뉴클레오티드와 동일하고, 인접 서열 13과 동일한 유전체 부분으로부터 3' 방향으로 이격된 유전체 부분과 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 13 및 인접 서열 14는 상동 재조합을 위한 homology arm을 이루어, 대장균 유전체에 제1 표적 유전자인 pylT,S, 전사 조절 부위, 및 표지자 유전자인 tolC 유전자가 삽입되도록 디자인하였다. 제1 표적 유전자인 pylT,S, 전사 조절 부위, 및 표지자 유전자인 tolC 유전자가 대장균 유전체에 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 pylT,S, 전사 조절 부위, 및 tolC 유전자가 배열된다.

그 다음, 음성 선택을 위한 DNA 조각으로서, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 3(서열번호 4), 제2 표적 유전자인 pylB 유전자와 동일한 폴리뉴클레오티드(서열번호 5), 및 인접 서열 4(서열번호 7)를 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 인접 서열 3(서열번호 4)은 제1 표적 유전자인 pylT,S의 3' 말단으로부터 5' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 4(서열번호 7)는 tolC 유전자의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 3 및 인접 서열 4는 상동 재조합을 위한 homology arm을 이루어, 전사 조절 부위가 결실되고, 전사 조절 부위의 위치에 제2 표적 유전자가 삽입되도록 디자인하였다. 제2 표적 유전자인 pylB 및 전사 조절 부위가 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 표적 유전자인 pylT,S, 제2 표적 유전자인 pylB, 및 tolC 유전자가 배열된다.

그 다음, 양성 선택을 위한 DNA 조각으로서, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 5(서열번호 8), 제3 표적 유전자인 pylC,D 유전자와 동일한 폴리뉴클레오티드(서열번호 9), 전사 조절 부위(서열번호 6), 및 인접 서열 6(서열번호 10)를 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 인접 서열 5(서열번호 8)는 삽입된 제2 표적 유전자인 pylB 유전자의 3' 말단으로부터 5' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 6(서열번호 10)은 tolC 유전자의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 5 및 인접 서열 6은 상동 재조합을 위한 homology arm을 이루어, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제3 표적 유전자인 pylC,D 및 전사 조절 부위가 제2 표적 유전자인 pylB와 tolC 사이에 삽입되도록 디자인하였다. 제3 표적 유전자인 pylC,D 및 전사 조절 부위가 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 표적 유전자인 pylT,S, 제2 표적 유전자인 pylB, 제3 표적 유전자인 pylC,D, 전사 조절 부위, 및 tolC 유전자가 배열된다.

3.2. 제1 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각, 제2 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각, 및 제3 유전자를 포함하는 DNA 조각을 대장균에 순차적인 삽입 및 이를 확인하기 위한 음성 또는 양성 선택

실시예 3.1에서 준비된 DNA 조각을 실시예 1.3 내지 실시예1.5에 기재된 방법에 따라 제1 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각, 제2 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각, 및 제3 유전자를 포함하는 DNA 조각을 대장균에 순차적으로 삽입하였다.

그후, 실시예 1.3 내지 실시예1.5에 기재된 방법에 따라, 제1 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각을 삽입한 대장균은 양성 선택, 제2 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각을 삽입한 대장균은 음성 선택, 및 제3 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각을 삽입한 대장균은 양성 선택으로 대장균을 선택하였다.

3.3. 대장균 유전체에 삽입된 표적 유전자의 확인

실시예3.2에서 삽입한 제1 표적 유전자, 제2 표적 유전자, 및 제3 표적 유전자를 포함하는 대장균을 양성 선택 또는 음성 선택을 통하여 수득하였다. 수득된 대장균의 유전체 상에 제1 표적 유전자, 제2 표적 유전자, 및 제3 표적 유전자가 삽입되었는지를 확인하기 위하여, PCR 방법으로 확인하였다.

PCR을 위한 반응물의 조성을 하기 표 5에 나타내었다.

PCR은 S-100 Thermal Cycler(Biorad)를 사용하였고, 하기 표 6에 나타낸 PCR 조건으로 수행하였다.

상기와 같은 PCR 조건으로 반응시킨 반응물을 아가로즈 겔에 전기영동을 하여 대장균 유전체에 삽입된 DNA 조각의 크기를 확인하였다. 그 결과, 제1 표적 유전자, 제2 표적 유전자, 및 제3 표적 유전자가 대장균의 유전체 상에 삽입되었음을 확인하였다. 또한, 예상되는 크기의 밴드를 보여주는 대장균에 대한 DNA 조각의 서열을 분석하여 DNA 조각이 최종적으로 삽입되었는지 여부를 확인하였다. 그 결과 양성 선택 및 음성 선택을 통하여 선별된 대장균 내에 표적 유전자 서열이 모두 포함되었음을 확인하였다.

실시예 4. 외래에서 삽입된 표지자( tolC ) 유전자를 활용하여 유전체 내에 1,4-부탄디올( butanediol ) 유전자 클러스터의 삽입

4.1. 유전체 내 삽입을 위한 DNA 조각의 준비

표지자 유전자를 외부에서 삽입한 것을 제외하고, 실시예 2에서 수행한 것과 동일한 방법으로 진행하였고, 양성 선택과 음성 선택이 가능한 유전자로 tolC 유전자, galK 유전자, malK 유전자, 또는 thyA 유전자를 사용할 수 있다.

구체적으로, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 13(서열번호 32), 제1 표적 유전자인 025B 유전자와 동일한 폴리뉴클레오티드(서열번호 18), 전사 조절 부위(서열번호 6), 표지자 유전자인 tolC 유전자 (서열번호 32), 및 인접 서열 14(서열번호 34)를 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 전사 조절 부위(서열번호 6)은 T7 프로모터와 Untranslated Region(UTR), 및 리보좀 결합 부위(Ribosome Binding Site)를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 13(서열번호 32)은 대장균 유전체 내 삽입하고자 하는 부분의 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 14(서열번호 34)는 대장균 유전체 내 삽입하고자 하는 부분의 50 뉴클레오티드와 동일하고, 인접 서열 13과 동일한 유전체 부분으로부터 3' 방향으로 이격된 유전체 부분과 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 13 및 인접 서열 14는 상동 재조합을 위한 homology arm을 이루어, 대장균 유전체에 제1 표적 유전자인 025B, 전사 조절 부위, 및 표지자 유전자인 tolC 유전자가 삽입되도록 디자인하였다. 제1 표적 유전자인 025B, 전사 조절 부위, 및 표지자 유전자인 tolC 유전자가 대장균 유전체에 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 025B, 전사 조절 부위, 및 tolC 유전자가 배열된다.

그 다음, 음성 선택을 위한 DNA 조각으로서, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 3(서열번호 4), 제2 표적 유전자인 4HBd 유전자와 동일한 폴리뉴클레오티드(서열번호 21), 및 인접 서열 4(서열번호 7)를 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 인접 서열 3(서열번호 4)은 제1 표적 유전자인 025B의 3' 말단으로부터 5' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 4(서열번호 7)는 tolC 유전자의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 3 및 인접 서열 4는 상동 재조합을 위한 homology arm을 이루어, 전사 조절 부위가 결실되고, 전사 조절 부위의 위치에 제2 표적 유전자가 삽입되도록 디자인하였다. 제2 표적 유전자인 4HBd 및 전사 조절 부위가 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 표적 유전자인 025B, 제2 표적 유전자인 4HBd, 및 tolC 유전자가 배열된다.

그 다음, 양성 선택을 위한 DNA 조각으로서, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 5(서열번호 8), 제3 표적 유전자인 cat2 유전자와 동일한 폴리뉴클레오티드(서열번호 9), 전사 조절 부위(서열번호 6), 및 인접 서열 6(서열번호 10)을 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 인접 서열 5(서열번호 8)는 삽입된 제2 표적 유전자인 4HBd 유전자의 3' 말단으로부터 5' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 6(서열번호 10)은 tolC 유전자의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 50 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 5 및 인접 서열 6은 상동 재조합을 위한 homology arm을 이루어, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제3 표적 유전자인 cat2 및 전사 조절 부위가 제2 표적 유전자인 4HBd와 tolC 사이에 삽입되도록 디자인하였다. 제3 표적 유전자인 cat2 및 전사 조절 부위가 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 표적 유전자인 025B, 제2 표적 유전자인 4HBd, 제3 표적 유전자인 cat2, 전사 조절 부위, 및 tolC 유전자가 배열된다.

4.2. 제1 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각, 제2 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각, 및 제3 유전자를 포함하는 DNA 조각을 대장균에 순차적인 삽입 및 이를 확인하기 위한 음성 또는 양성 선택

실시예 4.1에서 준비된 DNA 조각을 실시예 1.3 내지 실시예1.5에 기재된 방법에 따라 제1 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각, 제2 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각, 및 제3 유전자를 포함하는 DNA 조각을 대장균에 순차적으로 삽입하였다.

그후, 실시예 2.3 및 2.5에 기재된 방법에 따라, 제1 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각을 삽입한 대장균은 양성 선택, 제2 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각을 삽입한 대장균은 음성 선택, 및 제3 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각을 삽입한 대장균은 양성 선택으로 대장균을 선택하였다.

4.3. 대장균 유전체에 삽입된 표적 유전자의 확인

실시예 4.2에서 순차적으로 삽입한 제1 표적 유전자, 제2 표적 유전자, 및 제3 표적 유전자를 포함하는 대장균을 양성 선택 또는 음성 선택을 통하여 수득하였다. 수득된 대장균의 유전체 상에 제1 표적 유전자, 제2 표적 유전자, 및 제3 표적 유전자가 삽입되었는지를 확인하기 위하여, 실시예 1.6에 기재된 방법에 따라 PCR 방법으로 확인하였다.

실시예 5. 표적 유전자의 도입 순서에 따른 표적 유전자의 도입 효율

5.1. 표적 유전자의 도입 순서에 따른 표적 유전자의 도입 효율의 확인

세포내 유전자(TolC)를 표지자로 활용하여 표적 유전자를 순차적으로 도입한 경우, 표적 유전자의 도입 순서에 따른 표적 유전자의 도입 효율을 확인하였다.

구체적으로, 실시예 2에 기재된 방법에 따라, 제1 표적 유전자(025B)를 포함하는 DNA 조각, 제2 표적 유전자를 포함하는 DNA 조각(4HBd), 및 제3 표적 유전자(cat2)를 포함하는 DNA 조각을 대장균에 순차적인 삽입하고, 홀수번째 도입시에는 음성 선택을 하고, 짝수번째 도입시에는 양성 선택을 하여 대장균을 선별하였다.

추가적으로, 제4 표적 유전자로서 CoA-의존적 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제(CoA-dependent succinate-semialdehyde dehydrogenase; SSADH)를 암호화하는 sucD 유전자를 대장균 유전체에 도입하기 위해, sucD 유전자를 포함하는 DNA 조각으로서 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 15(서열번호 35), 제4 표적 유전자인 sucD 유전자와 동일한 폴리뉴클레오티드(서열번호 36), 전사 조절 부위(서열번호 6), 및 인접 서열 16(서열번호 37)을 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 인접 서열 15(서열번호 35)는 삽입된 제3 표적 유전자인 cat2의 3' 말단으로부터 5' 방향에 위치하는 300 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 16(서열번호 37)은 tolC 유전자의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 300 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 제4 표적 유전자인 sucD가 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 표적 유전자인 025B, 제2 표적 유전자인 4HBd, 제3 표적 유전자인 cat2, 제4 표적 유전자인 sucD, 전사인자, 및 tolC 유전자가 배열된다.

실시예 2.3에 기재된 방법에 따라 대장균에 도입하고 양성 선택을 하여 대장균을 선별하였다. 표적 유전자의 도입 효율은 표적 유전자의 선별의 효율로 산출하고 그 결과를 도 7에 실선으로 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 제1 표적 유전자 및 제2 표적 유전자의 도입 효율은 각각 약 69.7% 및 약 98.5%였다. 그러나, 제3 표적 유전자와 제4 표적 유전자의 도입 효율은 각각 약 35.7% 및 약 0%로 현저하게 감소하였다. 따라서, 표적 유전자의 도입 횟수가 증가할수록 표적 유전자의 도입 효율이 감소하는 것을 확인하였다.

5.2. 표적 유전자의 작은 단편의 도입에 의한 표적 유전자의 도입 효율의 확인

표적 유전자의 순차적인 도입에서, 도입 회수가 증가할수록 표적 유전자의 도입 효율이 감소하는 문제를 해결하기 위해, 도 6의 모식도와 같이 sucD를 단편으로 나누어 추가로 도입한 후 유전자 도입 효율을 산출하였다.

구체적으로, 제4 표적 서열로서 sucD의 5' 말단 영역(sucD-1) 및 제5 표적 서열로서 sucD의 3' 말단 영역(sucD-2)을 선택하였다. 제4 표적 서열의 도입을 위한 DNA 조각으로서, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 17(서열번호 38), 제4 표적 유전자인 sucD-1(서열번호 39), 전사 조절 부위(서열번호 6), 인접 서열 18(서열번호 40)을 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. 제5 표적 서열의 도입을 위한 DNA 조각으로서, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 인접 서열 19(서열번호 41), 제4 표적 유전자인 sucD-2(서열번호 42), 전사 조절 부위(서열번호 6), 인접 서열 20(서열번호 43)을 포함하는 DNA 조각을 준비하였다. sucD-2(서열번호 42)는 sucD 유전자 중 sucD-1(서열번호 39)을 제외한 나머지 영역이다.

인접 서열 17(서열번호 38)은 삽입된 제3 표적 유전자인 cat2의 3' 말단 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향에 위치하는 300 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 18(서열번호 37)은 tolC 유전자의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 300 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다.

인접 서열 19(서열번호 41)는 삽입된 제4 표적 유전자인 sucD-1의 3' 말단으로부터 5' 방향에 위치하는 300 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 인접 서열 20(서열번호 43)은 tolC 유전자의 5' 말단으로부터 3' 방향에 위치하는 300 뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드이다.

제4 표적 유전자 및 제5 표적 유전자가 삽입되면, 5' 말단으로부터 3' 방향으로 제1 표적 유전자인 025B, 제2 표적 유전자인 4HBd, 제3 표적 유전자인 cat2, 제4 및 제5 표적 유전자인 sucD, 및 tolC 유전자가 배열된다.

실시예 2.3에 기재된 방법에 따라 대장균에 도입하고 제4 표적 유전자 도입시에는 양성 선택을 하고, 제5 표적 유전자 도입 시에는 음성 선택을 하여 대장균을 선별하였다. 표적 유전자의 도입 효율은 표적 유전자의 선별의 효율로 산출하고 그 결과를 도 7에 점선으로 나타내고, sucD-1 및 sucD-2가 유전체에 순차적으로 도입된 것을 PCR에 의하여 확인한 결과를 도 8a 및 8b에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, sucD 유전자를 제4 표적 유전자 및 제5 표적 유전자로 나누어 유전체에 순차로 도입한 경우, 제4 표적 유전자 및 제5 표적 유전자의 도입 효율은 각각 약 96.6% 및 약 44.7%로 현저하게 증가하였다. 따라서, 도입되는 폴리뉴클레오티드의 길이를 감소시킴으로써 표적 유전자의 도입 효율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

<110> SAM SUNG ELECTRONICS, University-Industry Foundation <120> Method for inserting DNA fragments to genome by using marker gene expression <130> PN107258 <160> 43 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> flanking sequence of pylT,S <400> 1 catcgttttt gccaaatgta acgggcaggt tgtctggctt aagcattgtt 50 <210> 2 <211> 1638 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pylT,S <400> 2 aaaaaaatat tctcaacata aaaaactttg tgtaatactt gtaacgctga attcggaaac 60 ctgatcatgt agatcgaatg gactctaaat ccgttcagcc gggttagatt cccggggttt 120 ccgccaatgc atatccttaa tccttagcga aagctaagga ttttttttgg atcggaatta 180 attcccggtt taaaccgggg atctcgatcc cgcgaaatta atacgactca ctatagggga 240 attgtgagcg gataacaatt cccctctaga aataattttg tttaacttta agaaggagag 300 atctatatgg ataaaaagcc gctcgacacg cttatttcgg cgacgggcct gtggatgtcc 360 cgcacgggta tgattcacaa aattaaacac cacgaagtgt cgcgttcaaa aatctatatc 420 gaaatggcat gcggtgagcg tctggttgtg aacaacagcc gtagcagccg tactgcacgg 480 gcactccgtc 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cggcgtcgga 960 gcagaggatg tcatatgtaa ggaaaaaatg tgtccagtta tgtgcgcctt aagctacaag 1020 cacttcgagg aaggtgtaga aatcgcacgt acgaacttgg ccaacgaagg taacggccat 1080 acctgtgcga tccattccaa caatcaggcg catatcatac tggcaggttc agaactgacg 1140 gtttcgcgga tcgtggtcaa tgcgccgagt gccactacag caggcggtca catccaaaat 1200 ggtctggcag tgacaaatac gctcggatgc gggagttggg gtaataactc tatctccgag 1260 aactttactt ataaacacct gttaaacatt agccgcatag cgccgcttaa ttcaagcatt 1320 cacattcctg atgacaaaga gatctgggaa ctctaa 1356 <210> 37 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> flanking sequence of sucD <400> 37 catatcaaaa atggattgag ttaactgcaa ggacgcactg gtcgcgttag agttgatgcc 60 gttcgcgtcg cggtagccgt tgctataggt gtaatctgca cctaaaccta gctgtggcag 120 taatggactg cgcgcttcat taattttttc aaaggcagca tcacgatcgg cggcagactt 180 acgcaattcc gggttactaa ggcgtgcttg ctgataaact tgcatcaggt tctcggcctg 240 gctcaacgaa ctgaacccag aaaggctcag gccgataaga atggggagca atttcttcat 300 300 <210> 38 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> flanking sequence of sucD-1 <400> 38 agtggcaccg ggggtcaagt agattatgtc cgcggggcag cttggtctaa aaacggcaaa 60 agcatcatgg caattccctc aacagccaaa aacggtactg catctcggat agttcctata 120 attgcagagg gcgctgctgt aacaaccctc cgcaacgaag tcgactacgt tgttacggaa 180 tatgggatag cacagttaaa aggtaagagt ttgcgtcagc gcgcagaagc tcttattgcg 240 atagcccacc cggactttag agaggaactg acgaagcatc tgcgcaaacg ttttggttaa 300 300 <210> 39 <211> 665 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sucD-1 <400> 39 atggaaataa aagagatggt gtcgttggca aggaaagctc agaaggaata tcaagcgacc 60 cataatcaag aagcagttga taacatttgc cgagctgcag caaaagtgat ttatgaaaat 120 gcagctatac tggctcgcga agcagtagac gaaaccggca tgggcgtata tgaacataaa 180 gtggccaaga atcaggggaa atccaaaggc gtctggtaca atttgcacaa taaaaaatcg 240 atcggtatct taaatataga cgagagaacc gggatgatcg agatagcaaa acctatcggg 300 gttgttggag ccgtaacccc gacgacaaac ccgattgtga ctccaatgag caacatcatt 360 tttgccctta agacatgcaa tgccattatt atcgccccac atcccagatc caaaaaatgc 420 tcagcacatg cagttcgtct 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aactcaggaa ctaatgggcg ccgtggatgt 180 ggtagttgcg acgggtggta tgggtatggt gaaatctgca tattcttcag ggaagccttc 240 ttttggtgta ggagccggta acgttcaagt gatcgtggat agtaatatcg attttgaagc 300 300 <210> 42 <211> 691 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sucD-2 <400> 42 tgcggcagaa aaaattatca ccggccgtgc tttcgacaat gggatcatct gttcaggcga 60 acagagtatc atctacaacg aagctgacaa ggaagctgtc ttcacagcct tccgcaacca 120 tggtgcatat ttttgtgatg aagcggaggg agatcgggcc cgtgctgcga tttttgagaa 180 tggcgccatc gcgaaagatg tagtcggcca gagcgttgcc tttatcgcga agaaagcaaa 240 tatcaatata ccggagggta cccgtattct ggttgttgaa gctcgcggcg tcggagcaga 300 ggatgtcata tgtaaggaaa aaatgtgtcc agttatgtgc gccttaagct acaagcactt 360 cgaggaaggt gtagaaatcg cacgtacgaa cttggccaac gaaggtaacg gccatacctg 420 tgcgatccat tccaacaatc aggcgcatat catactggca ggttcagaac tgacggtttc 480 gcggatcgtg gtcaatgcgc cgagtgccac tacagcaggc ggtcacatcc aaaatggtct 540 ggcagtgaca aatacgctcg gatgcgggag ttggggtaat aactctatct ccgagaactt 600 tacttataaa cacctgttaa acattagccg 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Claims

5'에서 3' 방향으로 제1 인접(flanking) 서열, 제1 표적 서열을 포함하는 제1 영역, 및 제2 인접 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,
상기 세포의 유전체는 5'에서 3' 방향으로 표지자 암호화 영역의 전사 조절 부위를 포함하는 제2 영역 및 표지자 암호화 영역을 포함하는 제3 영역을 포함하는 것이고,
상기 제1 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제2 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 제2 영역의 5' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고.
상기 제2 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제2 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제3 영역의 5'말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 포함하는,
표적 서열을 세포의 유전체에 삽입하는 방법.
청구항 1에 있어서,
5'에서 3' 방향으로 제3 인접 서열, 제2 표적 서열을 포함하는 제4 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제5 영역, 및 제4 인접 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,
상기 제3 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제1 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것이고,
상기 제4 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 2에 있어서,
5'에서 3' 방향으로 제5 인접 서열, 제3 표적 서열을 포함하는 제6 영역, 및 제6 인접 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,
상기 제5 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제4 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제5 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고,
상기 제6 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제5 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 3에 있어서,
5'에서 3' 방향으로 제7 인접 서열, 제4 표적 서열의 3' 말단으로부터 5' 방향의 영역을 포함하는 제7 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제8 영역, 및 제8 인접 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,
상기 제7 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제6 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것이고,
상기 제8 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 4에 있어서,
5'에서 3' 방향으로 제9 인접 서열, 제4 표적 서열의 5' 말단으로부터 3' 방향의 영역을 포함하는 제9 영역, 및 제10 인접 서열을 포함하는 제5 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,
상기 제4 표적 서열은 상기 제4 표적 서열의 3' 말단 영역과 상기 제4 표적 서열의 5' 말단 영역을 포함하는 것이고,
상기 제9 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제7 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제8 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고,
상기 제10 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제8 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 전사 조절 부위는 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 인슐레이터(insulator), 사일렌서(silencer), 또는 전사 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 표지자는 막 단백질, 당분해 대사 관련 단백질, DNA 생합성 관련 단백질, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 막 단백질은 TolC(TolC outer membrane channel) 단백질인 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 당분해 대사 관련 단백질은 GalK(galactokinase) 단백질 또는 MalK(Component of malotse ABC transporter) 단백질인 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 DNA 생합성 관련 단백질은 ThyA(Thymidylate synthase) 단백질인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 표지자가 발현되지 않은 세포를 선택하여 제1 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 음성 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 표지자가 발현되는 세포를 선택하여 제2 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 양성 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 표지자가 발현되지 않은 세포를 선택하여 제3 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 음성 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
5'에서 3' 방향으로 제1 인접 서열, 제1 표적 서열을 포함하는 제1 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제2 영역, 표지자 암호화 영역을 포함하는 제3 영역제3 영역2 인접 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,
상기 제1 인접 서열 및 제2 인접 서열은 세포의 유전체의 삽입 부위의 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드 또는 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 포함하는, 표적 서열을 세포의 유전체에 삽입하는 방법.
청구항 14에 있어서,
5'에서 3' 방향으로 제3 인접 서열, 제2 표적 서열을 포함하는 제4 영역, 및 제4 인접 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,
상기 제3 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제1 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 제2 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고,
상기 제4 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제2 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 15에 있어서,
5'에서 3' 방향으로 제5 인접 서열, 제3 표적 서열을 포함하는 제6 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제5 영역, 및 제6 인접 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,
상기 제5 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제4 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것이고,
상기 제6 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 16에 있어서,
5'에서 3' 방향으로 제7 인접 서열, 제4 표적 서열의 3' 말단으로부터 5' 방향의 영역을 포함하는 제7 영역, 및 제8 인접 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,
상기 제7 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제6 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제5 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것이고,
상기 제8 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 상기 제5 영역의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 17에 있어서,
5'에서 3' 방향으로 제9 인접 서열, 제4 표적 서열의 5' 말단으로부터 3' 방향의 영역을 포함하는 제8 영역, 전사 조절 부위를 포함하는 제9 영역, 및 제10 인접 서열을 포함하는 제5 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계로서,
상기 제4 표적 서열은 상기 제4 표적 서열의 3' 말단 영역과 상기 제4 표적 서열의 5' 말단 영역을 포함하는 것이고,
상기 제9 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 제7 영역의 3' 말단으로부터 5' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것이고,
상기 제10 인접 서열은 상기 세포의 유전체 중 상기 제3 영역의 5' 말단으로부터 3' 방향의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상동성이 있는 것인 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 전사 조절 부위는 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 인슐레이터(insulator), 사일렌서(silencer), 전사 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 표지자는 막 단백질, 당분해 대사 관련 단백질, DNA 생합성 관련 단백질, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 20에 있어서, 상기 막 단백질은 TolC(TolC outer membrane channel) 단백질인 것인 방법.
청구항 20에 있어서, 상기 당분해 대사 관련 단백질은 GalK(galactokinase) 단백질 또는 MalK(Component of malotse ABC transporter) 단백질인 것인 방법.
청구항 20에 있어서, 상기 DNA 생합성 관련 단백질은 ThyA(Thymidylate synthase) 단백질인 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 표지자가 발현되는 세포를 선택하여 제1 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 양성 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 15에 있어서, 상기 표지자가 발현되지 않는 세포를 선택하여 제2 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 음성 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 표지자가 발현되는 세포를 선택하여 제3 표적 서열이 세포의 유전체에 삽입된 세포를 양성 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.