CN108486105A - 一种马克斯克鲁维酵母启动子及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马克斯克鲁维酵母启动子，其包含菊粉酶基因起始密码子上游1136bp的序列，去除了N端的poly‑A序列，并且包含潜在的Zn(II)₂Cys₆转录因子的结合位点。该启动子至少包括以下核苷酸序列：1)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或2)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，具有菊粉酶基因启动子活性的衍生核苷酸序列。本发明还公开了含有该启动子的重组表达载体、含有该启动子或重组表达载体的基因工程菌及其应用与制备方法。利用本发明构建的重组载体可以获得阿魏酸酯酶外源蛋白的表达，其表达的活性超过了目前已报道的其他长度的菊粉酶基因启动子。

Description

一种马克斯克鲁维酵母启动子及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种马克斯克鲁维酵母启动子、含有该马克斯克鲁维酵母启动子的重组表达载体、含有该马克斯克鲁维酵母启动子或重组表达载体的基因工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus，下文简称KM)是同宗配合的半子囊菌酵母，位于酵母科克鲁维属。KM通常在酸奶，马乳酒，奶酪，牛奶，以及甘蔗叶子中出现。KM是一种被普遍认可的食品级的酵母。它已经通过了FDA的GRAS认证，欧盟的QPS认证，还被中国卫计委批准为新食品原料。由于其安全性高，KM在生产食用、饲用和药用蛋白领域具有得天独厚的优势。但是KM目前缺乏高效的表达元件和配套的表达载体，限制了KM表达系统的发展。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种马克斯克鲁维酵母启动子、含有该马克斯克鲁维酵母启动子的重组表达载体、含有该马克斯克鲁维酵母启动子或重组表达载体的基因工程菌及其制备方法与应用。其具体技术方案如下：

本发明在第一方面提供了一种马克斯克鲁维酵母启动子，为菊粉酶基因启动子，其包含菊粉酶基因起始密码子上游1136bp的序列，去除了N端的poly-A序列，并且包含潜在的转录因子的结合位点。

优选地，上述转录因子为Zn(II)₂Cys₆转录因子。菊粉酶基因的表达可能受到Zn(II)₂Cys₆转录因子的调控，该因子的识别位点为(CGGN₈CGG)。通过对启动子的分析，发现在起始密码子上游-1087到1073bp之间存在一个很相似的转录因子的结合位点(CGGCGGGGCTGC CGG)，提示该区域参与调控菊粉酶基因启动子的活性。因此，保留这一区域可能有助于提升菊粉酶基因启动子的活性。

在较优实施例中，马克斯克鲁维酵母启动子至少包括以下核苷酸序列：

1)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或

2)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，具有菊粉酶基因启动子活性的衍生核苷酸序列。

本发明在第二方面提供了一种重组表达载体，其包含本发明在第一方面提供的马克斯克鲁维酵母启动子。

优选地，上述重组表达载体还包含菊粉酶信号肽、菊粉酶基因终止子、URA3基因和酵母自主复制序列。

在较优实施例中，重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

优选地，重组表达载体还包含与上述马克斯克鲁维酵母启动子可操作地连接的目的基因。

更优选地，目的基因为阿魏酸酯酶基因。

本发明在第三方面提供了一种基因工程菌，其含有本发明在第一方面提供的马克斯克鲁维酵母启动子。

本发明还提供了一种基因工程菌，其含有本发明在第二方面提供的重组表达载体。

优选地，上述基因工程菌的宿主菌为马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株。

更优选地，上述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株来源于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCC No.10621的马克斯克鲁维酵母菌，通过同源重组敲除URA3基因获得。

本发明在第四方面提供了本发明在第一方面提供的马克斯克鲁维酵母启动子的应用，马克斯克鲁维酵母启动子用于提高外源蛋白的表达。

优选地，外源蛋白为阿魏酸酯酶。

本发明在第五方面提供了本发明在第一方面提供的马克斯克鲁维酵母启动子的制备方法，制备方法包括以下步骤：

步骤1、以马克斯克鲁维酵母菌FIM-1的基因组为模板，利用核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示的引物INU-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的引物INU-R1PCR扩增菊粉酶基因；

步骤2、在反应体系中添加Taq酶，对步骤1中的PCR扩增产物进行加A，获得目的片段；

步骤3、回收步骤2中的目的片段，与pMD18-T载体进行连接，得到含有菊粉酶基因启动子的质粒pMD18-T-INU。

优选地，上述马克斯克鲁维酵母菌FIM-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10621。

本发明在第六方面提供了本发明在第二方面提供的重组表达载体的制备方法，制备方法包括以下步骤：

步骤1、以质粒pMD18-T-INU为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的引物INUΔ-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的引物INUΔ-R1将菊粉酶基因的79-1668bp的序列去除，同时在菊粉酶基因的78bp之后和终止密码子之间引入多克隆位点，得到质粒pMD18-T-P2-SP-MCS-T_INU；

步骤2、以质粒pMD18-T-P2-SP-MCS-T_INU为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的引物INU-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的引物INU-R2扩增P2-SP-MCS-T_INU片段；

步骤3、以pUKD载体为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的引物pUKD-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的引物pUKD-R1将pKS和KD序列之间的EcoRI位点去除，得到质粒pUKDΔE；

步骤4、利用EcoRI对质粒PUKDΔE进行酶切，回收酶切产物；

步骤5、将步骤2中的P2-SP-MCS-T_INU片段与步骤4中的酶切产物连接，得到载体pUKDN132-P2。

优选地，步骤1中，质粒pMD18-T-INU根据上述马克斯克鲁维酵母启动子的制备方法进行制备。

优选地，步骤1中，多克隆位点至少包括SmaI、SpeI和NotI的位点。

优选地，P2-SP-MCS-T_INU片段包含菊粉酶基因启动子从起始密码子上游1136bp开始到起始密码子上游1bp的序列、菊粉酶基因的1-78bp含有编码信号肽的序列、多克隆位点和菊粉酶基因终止子842bp。

本发明在第七方面提供了阿魏酸酯酶基因重组表达载体的制备方法，制备方法包括以下步骤：

步骤1、利用SpeI和NotI对质粒pUKDN112-EstE进行酶切，回收含有阿魏酸酯酶基因的酶切产物；

步骤2、利用SpeI和NotI对质粒pUKDN132-P2进行酶切，回收酶切产物；

步骤3、将步骤1中的酶切产物与步骤2中的酶切产物进行连接，得到质粒pUKDN132-P2-EstE。

优选地，步骤1中的质粒pUKDN112-EstE根据专利申请号为201711086961.9的文献制备得到。

优选地，步骤2中的质粒pUKDN132-P2根据上述重组表达载体的制备方法进行制备。

本发明在第八方面提供了含有上述重组表达载体的基因工程菌的制备方法，制备方法包括以下步骤：

步骤1、将来源于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCC No.10621的马克斯克鲁维酵母菌，通过同源重组敲除URA3基因，并利用含有5-氟乳清酸的YPD筛选获得尿嘧啶缺陷的宿主菌Fim-1ura3Δ；

步骤2、采用醋酸锂转化法将重组表达载体转入宿主菌Fim-1ura3Δ；

步骤3、将转化后的产物涂布于SD平板，恒温培养直至克隆形成。

优选地，上述步骤2中，重组表达载体为pUKDN132-P2-EstE。

本发明提供的马克斯克鲁维酵母启动子以及利用该启动子构建的重组载体，实现了对外源蛋白的高效表达，很大程度上促进了KM表达系统的发展，在食用、饲用和药用蛋白领域将具有广泛的应用。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1示出了本发明较优实施例中含有菊粉酶基因启动子的重组表达载体pUKDN132-P2的示意图；

图2示出了本发明较优实施例中描述的P2启动子与其他长度的菊粉酶基因启动子的比较；P1中带有“A”字样的区域表示位于起始密码子上游1170bp到上游1137bp的富含A的区域，P2中的条状区域表示潜在的Zn(II)₂Cys₆转录因子的结合位点；

图3示出了本发明较优实施例中描述的P2启动子与其他长度的菊粉酶基因启动子驱动的阿魏酸酯酶的表达活性的比较；柱状表示平均值±S.D(n＝4)。

具体实施方式

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

实施例1、马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子的扩增

按照酵母基因组DNA提取试剂盒(Solarbio，D1900)说明书的方法，抽提马克斯克鲁维酵母菌FIM-1的基因组。FIM1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10621(保藏单位代码：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年3月13日，检测结果：存活，分类命名：马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus)。

以FIM-1的基因组为模板，利用引物INU-F1(序列如SEQ ID No.1所示)和INU-R1(序列如SEQ ID No.2所示)扩增菊粉酶基因，包括菊粉酶基因启动子(起始于起始密码子上游1136bp)菊粉酶基因(1671bp)和菊粉酶基因终止子(842bp)。PCR的过程参照PhantaSuper Fidelity DNA Polymerase的产品说明进行(Vazyme,货号P505-d1/d2/d3)。PCR完成后，在反应体系添加1μL Taq酶(Takara,R001Q)，72℃反应20min，对PCR产物进行加A。通过琼脂糖电泳分析PCR扩增产物，获得了3649bp的目的片段。按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工，货号B518131-0050)的说明书操作，对PCR产物进行回收。将PCR产物与pMD18-T载体(Takara,6011)进行连接，连接方法参见产品说明书。获得的质粒被命名为pMD18-T-INU。该质粒上含有菊粉酶基因启动子，从菊粉酶基因起始密码子上游1136bp开始，到起始密码子上游1bp结束，该启动子被简称为P2(序列如SEQ ID No.3所示)。

实施例2、含有马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子的重组表达载体的构建

按照QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent,200523)说明书的方法，以pMD18-T-INU为模板，利用引物INUΔ-F1(序列如SEQ ID No.4所示)和INUΔ-R1(序列如SEQ ID No.5所示)将菊粉酶基因的79-1668bp的序列去除，同时在菊粉酶基因的78bp之后和终止密码子(TGA)之间引入多克隆位点。该多克隆位点包括了SmaI,SpeI和NotI的位点。获得的质粒被命名为pMD18-T-P2-SP-MCS-T_INU。

以pMD18-T-P2-SP-MCS-T_INU为模板，利用引物INU-F2(序列如SEQ ID No.6所示)和INU-R2(序列如SEQ ID No.7所示)扩增P2-SP-MCS-T_INU片段。该片段含有菊粉酶基因的启动子(从起始密码子上游1136bp开始，到起始密码子上游1bp)，菊粉酶基因的1-78bp(含有编码信号肽的序列)，多克隆位点和菊粉酶终止子(842bp)。PCR反应采用Phanta SuperFidelity DNA Polymerase。通过琼脂糖电泳分析PCR扩增产物，获得了2150bp的P2-SP-MCS-T_INU片段。利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对P2-SP-MCS-T_INU片段进行回收。

按照QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit的使用说明，以pUKD载体(Appl Microbiol Biotechnol(2003)62:387-391)为模板，利用引物pUKD-F1(序列SEQ IDNo.8所示)和pUKD-R1(序列SEQ ID No.9所示)将pKS序列(大肠杆菌复制序列和氨苄抗性基因)和KD序列(酵母自主复制序列)之间的EcoRI位点去除。获得质粒为pUKDΔE。利用EcoRI对PUKDΔE进行酶切，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对酶切产物进行回收。

利用Gibson Assembly无痕连接系统(NEB公司，货号E2611S/L)，将P2-SP-MCS-TINU片段与pUKDΔE的EcoRI酶切产物连接。获得的载体为pUKDN132-P2，如图1所示，pUKDN132-P2的序列如SEQ ID No.10所示。

实施例3、利用马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子实现阿魏酸酯酶的分泌表达

利用SpeI和NotI对实验室保存的pUKDN112-EstE(专利申请号201711086961.9)进行酶切。利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对754bp的酶切产物回收。该片段含有阿魏酸酯酶基因EstE的编码序列。

利用SpeI和NotI对pUKDN132-P2进行酶切，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对酶切产物回收。按照DNA ligation Kit Ver.2.1(Takara,6022)说明书操作，将pUKDN132-P2和EstE的酶切产物进行连接。获得的质粒命名为pUKDN132-P2-EstE。

本发明采用的酵母表达宿主菌株来源于马克斯克鲁维酵母菌Fim-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10621(保藏单位代码：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年3月13日，检测结果：存活，分类命名：马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus)。通过同源重组的方法敲除URA3基因，并利用含有5-氟乳清酸(1.5g/L)的YPD筛选获得尿嘧啶缺陷的表达宿主菌，被命名为马克斯克鲁维酵母Fim-1ura3Δ。采用醋酸锂转化法(World Journal of Microbiology&Biotechnology 16:653-654,2000)，将pUKDN132-P2-EstE转入Fim-1ura3Δ中。将转化后的产物涂布于SD平板(0.67％无氨基酸酵母氮源、2％葡萄糖、2％琼脂)，将平板放置30℃恒温培养箱培养，培养2-4天直至克隆形成。克隆被命名为FIM-1-EstE。

挑选4个不同的FIM1-EstE的克隆，接种于装有50ml的YD培养基(2％酵母抽提物，4％葡萄糖)中，30℃、220rpm培养72h后收集上清，进行阿魏酸酯酶的酶活测定。测定方法和酶活定义参照专利进行(专利申请号201711086961.9)。4个克隆的平均酶活为4.4U/mL，说明利用马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子可以实现阿魏酸酯酶的分泌表达。

实施例4、本发明的马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子与其他长度的马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子的表达能力的比较

此前用于外源蛋白表达的菊粉酶基因启动子主要包括：从起始密码子上游1216bp起始的启动子(专利申请号201711086961.9，简称为P1启动子)，从起始密码子上游1053bp起始的启动子(FEMS Yeast Res.2017Sep 1；17(6).doi:10.1093/femsyr/fox062，简称为P3启动子)，从起始密码子上游737bp起始的启动子(Appl MicrobiolBiotechnol.1993Nov；40(2-3):309-17.简称为P4启动子)，从起始密码子上游353bp起始的启动子(FEMS Yeast Res.2017Sep 1；17(6).doi:10.1093/femsyr/fox062，简称为P5启动子)。

本发明的P2启动子从起始密码子上游1136bp起始。P2启动子与上述所有启动子的长度不同。与P1启动子相比，P2启动子去除了polyA序列。与P3启动子相比，增加了一个潜在的Zn(II)₂Cys₆转录因子的结合位点。P1～P5启动子的比较参见图2。

为了比较P1～P5启动子的表达能力，本实施例采用与实施例1和实施例2类似的方法，将P1、P3、P4、P5启动子构建成重组载体。这些重组载体除了菊粉酶基因启动子的长度不同以外，其他序列与pUKDN132-P2完全一致，被分别命名为pUKDN132-P1、pUKDN132-P3、pUKDN132-P4和pUKDN132-P5。

本实施例采用与和实施例3类似的方法，将阿魏酸酯酶基因转入上述载体中，获得pUKDN132-P1-EstE,pUKDN132-P3-EstE,pUKDN132-P4-EstE和pUKDN132-P5-EstE。将这些载体转入Fim-1ura3Δ中，对转化子进行培养，吸取上清进行阿魏酸酯酶的酶活测定，并与pUKDN132-EstE(含有本发明描述的P2启动子)的转化子培养液上清中的酶活进行比较。结果如图3所示，本发明描述的P2启动子驱动表达的阿魏酸酯酶的活性显著高于其他启动子的活性，表明本发明描述的菊粉酶基因启动子在表达外源蛋白上具有先进性。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种马克斯克鲁维酵母启动子及其制备方法与应用

<130> 2018

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

cacaaacaca aacacaaaca caaaaacg 28

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

tagaatgttg gtcagatgtg atgtacacc 29

<210> 3

<211> 1136

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cacaaacaca aacacaaaca caaaaacgct aaattatgca cacaagggcc ggcggggctg 60

ccggaaaaaa aaagggaaaa atacacagac gagcgcgcac agatggggtt accactgcaa 120

gttacaagtt gcaagttgca cgctggaatc agaattggaa tcagaattgg aattggaatt 180

agaattagaa ttaaacttgg ggtagccacg ggaacgggat aactcaggaa tcgctcgcag 240

gcgtctccgt ctaggcaatc ccaaggtaag cctaggcact cccacagggg aaagaacggt 300

tgaaggcaaa gtagtgctaa caattggtaa cgaatggtaa caagtgtgtc cgtctccacc 360

tgacatttgc tagagctggg gattccacat tcttgtgctc tgaattctca aaccgaaatg 420

gggcgttgtt accccaggta tccggttgta gttggcactg gggatggaaa aaaatgatgt 480

tgatgttgag ttagttgggt tgagtcaatt agtgcgtgaa agtatcacca cttttgtcat 540

ccggcgtttc tgtgcgaatc acacacacac acacagttta ttggagcact tgtttctggc 600

gtattcgtaa ttgttctgcg gtgcggttct gtgtgcattt ttcctggggt gtctgccgca 660

cctactcatc acccacgccg tgggtttgag ccatggcgga ggtacgactg actggctgcc 720

tgcctgcctg actgactgcc tgactgcagg aaaagagggt ttcgaaggaa aaacttttcc 780

tgtgttaatc cggccgtgcg ccgctgctcc aaaatccacc ttcatgagaa ggagtttgaa 840

aaaacaaaaa aattcacata taaaaagcgt atctcgagat ctcaaagtct cccttgaatc 900

gtgtttgcca gttgtaactc atcctttatt cttctattct atctctctct ttccttcccc 960

taatcagcaa ttaaatccgg ggtaaggaag aattactact gtgtgtaacg gttatatttc 1020

gttttttatt ttttttttcc attgccatag agaaagaaaa aaaaaaaaaa gagagtttgt 1080

gaagatcttc cattcgaatc ccataagtga cacatttaat tttttttttg ttagat 1136

<210> 4

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ggagtcagtg cttcagtgat caattacaag agagacggtg accccgggac tagtgcggcc 60

gcttaaggcc gcaagctttg atctgatctg cttactttac taacgac 107

<210> 5

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gtcgttagta aagtaagcag atcagatcaa agcttgcggc cttaagcggc cgcactagtc 60

ccggggtcac cgtctctctt gtaattgatc actgaagcac tgactcc 107

<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tgccgattcg cacgctgcaa ccgcggcaca aacacaaaca caaacacaaa aacgc 55

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

atggtctttc caatcagaat tcgaccgatc ctagaatgtt ggtcagatgt gatg 54

<210> 8

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc caagcttgca tgcatcacta atgaaaagca 60

tacgacgcc 69

<210> 9

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ggcgtcgtat gcttttcatt agtgatgcat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa 60

cgtcgtgac 69

<210> 10

<211> 11388

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

cgtaatcatg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 60

catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac 120

attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 180

ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 240

ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 300

aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 360

aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 420

gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 480

gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 540

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 600

ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 660

ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 720

tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 780

tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 840

ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 900

aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 960

ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 1020

tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 1080

atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 1140

aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 1200

ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 1260

tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 1320

ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 1380

tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 1440

aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt 1500

gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 1560

tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 1620

cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 1680

tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 1740

ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 1800

cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 1860

actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 1920

ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 1980

aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 2040

ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 2100

atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 2160

tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag 2220

gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc 2280

ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc 2340

gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt 2400

actgagagtg caccataaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt 2460

ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc 2520

aaaagaatag cccgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt 2580

aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact 2640

acgtgaacca tcacccaaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg 2700

gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag 2760

aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac 2820

gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtactatgg 2880

ttgctttgac gtatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 2940

aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 3000

tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 3060

ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct tgcatgcatc 3120

actaatgaaa agcatacgac gcctgcgtct gacatgcact cattctgaag aagattctgg 3180

gcgcgtttcg ttctcgtttt cctctgtata ttgtactctg gtggacaatt tgaacataac 3240

gtctttcacc tcgccattct caataatggg ttccaattct atccaggtag cggttaattg 3300

acggtgctta agccgtatgc tcactctaac gctaccgttg tccaaacaac ggaccccttt 3360

gtgacgggtg taagacccat catgaagtaa aacatctcta acggtatgga aaagagtggt 3420

acggtcaagt ttcctggcac gagtcaattt tccctcttcg tgtagatcag aggctatata 3480

catgccgagg tattcgatca ctctacgatg acggtctgtt agctcaacaa cttcttctaa 3540

atgctccata accgtaacgt aagaagcata actgtcaata ctgaagtcat cccagtttat 3600

tggtgctcct gttgaacagt catccactat atgttcgaat agcccaggat cacgaggagg 3660

tcctacaaac ggatacggta cagtcttctt tttatagtct gcaaattcta gaatagcatt 3720

ttttatccaa tagtgtcgaa tcgtcctggc cgttctaccg ataaaggatc caatgtgatt 3780

attagctcca ctacacgata tgttaagttt gatcgatgtc ttgttaacaa acgctaaact 3840

caagttcggc atttccaaca gcgagaagaa atcatcaatt ccatcggcta tctcttgata 3900

agtcattaga tcatatacct tctcgggatg tcgttgagtt actttatgac tagaaatctt 3960

caggttatca tcaacgtaat tgttctccaa tagctctgga gagggacata acaatacttt 4020

gattttttcc atggcctgga cttgtttccg taggaaatac ttgttctttt gtagacgttc 4080

catgatgagt ttgtatacct ctgctggaga tatccattct agatctttga tataagtttg 4140

gtatggtaaa gagttgattt tgtaggacac gtaaatctgc gctagataag tacattgtgc 4200

aaatgcctct ggtacttcgt aagacccatg ctgcgtaatt atagtattat tgagtggatc 4260

ataagcgttg tactcgtttt tgaatttaaa actgtctaat aaggccctgt aaatctctct 4320

gacttgttgt acacctttct gctcttcggg actgagatcg gatagcaatg gagcagcagt 4380

ttctgagctt tctgatgggg ctgacatggc agatgcctat tcaatgctgc cttttgtttg 4440

ggaggttatg aaatgcatct gtttacattg tatgtaatac ccttactagg caatgttata 4500

agcaaaaatc ctttgatcac atggaatatc actttatacg tgttgaaata tgcaaaaaaa 4560

cagtccccct gagctcaggg ggtggtttac gcttttgagg ctcagcagcg cgaattctct 4620

cttggggctg aagtgaaatt taaaaaagtc gcttgaggct cagccggaat tataaaacat 4680

cacctgagtc ttgagagcgc tttcactcac ctgaggctca gctgaaattt caaaaagtca 4740

cttgagccca gaaggagtgt ttcaccccct gaggctataa cgttcgttat tttaatacct 4800

aaataaacaa aaatatatgg tacaggaacg cgaggcaacg cgccgataca gggtcaatgg 4860

gtacacgaga gggtgacact aggcgtagaa agtcattagt ataaaataca gtggtatata 4920

gtagatattt agtttgtttt ccttttcttt ttctccaaaa cgatatcaga catttgtctg 4980

ataatgaagc attatcagac aaatgtctga tatcgttttt caataataat atacatcatc 5040

acaaaacaaa caaacatagc atcgcaagcc ccatcatgcc accaccgtcc gctgtgatcg 5100

caactcatgt ttccggcggt attctgcaat gaattggaga acctcgtctg agataattcc 5160

atgccattgt tcgaacaact ggaggctagg atgagctgag aaggattgag cgaccaagcg 5220

cggacttgac ggtgggctga gtggtgggct accagggctg ttaccctcct cttcaagtag 5280

ctcctcgcga gataaaggtt tattagaagg atccttcaaa acatatattt cactgcccaa 5340

tggggcttcc ttgtaaaaac ctgatataaa ggcaaataca cggtcatcta cagtcacact 5400

accatgactg tagtgtgatc tagccactgc actttgaatt tcacggtccc cagcccaatt 5460

gcccagtgag gagacatatt ttcccttctc agatctcgat aaaaaggtcg ccattaaatg 5520

tcttccaaaa tgagacttcg ggccgttcca gatcttgaag actggttcat cgacatgctg 5580

ggtaagaaac ctagagaacg ttctggccaa tgactctggt aaaaactgat gagtttgatt 5640

agttggtcta ttactggata ctgttttttc aataggcgag caaacacgca aatagtcgta 5700

taatgatatc agaagatcgc aatcaccatt cacaggatag aagttaacgt accgttcagt 5760

tctgcttttc gtttctgtca cagtagcacg cacaattggg cccagaaatg aattgttgta 5820

gatctcaaaa gtccttggat ctagattctt cagatcgctg tatctgcagc aatttccaac 5880

agctcccaga agtagcaatc ggtattccgc tcgttttgta gtggttacgc aggactgatc 5940

gaagaagcag gcaatcctgg agacaatctt ccaaatatct ttttcttttg acagaatatt 6000

agtgaattgt aatccaacca tagaagcatc gtatttatgt gtttcctcgt agcgatcaaa 6060

caaggaaact tcttgatttt taaatgggct aacaacaacc ttgtaagaag gcaatgctga 6120

ttcgatatcc ttttgcagag actctgtctt tcttagtcta acagtgaatt tgataatttt 6180

gtcatcctta tcaaaagaca gagatttgcc aattgcgctc ttgtaagagc ggtaggtatt 6240

gattttcatc tcgcgtcgga tagatagcga ctgcattgtc aagatagaga atagggacgc 6300

cagcttattt ctaatttctt tcgcatttat attaaaggtg tcagattcca gaatttcatt 6360

aatttcatta gcacactgat gaggtgtgag gtgagcagcc tccgcaaagg tagacatagg 6420

ggcattggtt ggaggccttt gaggtaccac tagagtgctg caaacatagc accgttcgag 6480

actttaaaat cttcagtttt aaaattatga aaaaaaacat cgtcctgagt tgaaacggtc 6540

gtttcaacct ccgtgtacag aaagatacat agcatatggc aagctgcacg cagcgtaaac 6600

atgccggaca actgtcattt cgtcagatca gttgatctac tctctgtgat actgcttcgt 6660

ttgtccacgg aggtcggact aactctcacc acgcttccac ggcattcgaa agaactaata 6720

ttgtatcatt gtacatatga ggaacacgca gttgaactga gcaaaccagg actcaggaaa 6780

gcaggaggta agtgctcgct tttcgtggat ccagaggaac gtgaaaattc gccttctcct 6840

cctataccgc cgtatcagat atcagagatg ccccttcatg aacttctcga gtcaggcaat 6900

gctaaattgg ttccaaatcc cgagtttgat ctaactgatc cagacgactt tcataagtgt 6960

ttctcggtca cctattcagc attatcttta atggtaccat atctgcccag agctgctcta 7020

aaggctgctc gagtgttttg taaagatcat tcaatattaa caacggatat gcttgatttg 7080

aattatcttg aagagctaat tgagttctca aaggaaactg tgaacaaaat cccagctaga 7140

atccctatag aggacatgct tctcgagcgg ggatatgtgc taccatgggt tcatggtggt 7200

acagtgaagg gaggaaagct actgaccccc aacgattgat tctttaccga atcattgcat 7260

aattcattgc ataattcatt gcagaatacc gccggaaaca tgagttgcga tcacagcgga 7320

cggtggtggc atgatggggc ttgcgatgct atgtttgttt gttttgtgat gatgtatatt 7380

attattgaaa aacgatatca gacatttgtc tgataatgct tcattatcag acaaatgtct 7440

gatatcgttt tggagaaaaa gaaaaggaaa acaaactaaa tatctactat ataccactgt 7500

attttatact aatgactttc tacgcctagt gtcaccctct cgtgtaccca ttgaccctgt 7560

atcggcgcgt tgcctcgcgt tcctgtacca tatatttttg tttatttagg tattaaaatt 7620

tactttcctc atacaaatat taaattcacc aaacttctca aaaactaatt attcgtagtt 7680

acaaactcta ttttacaatc acgtttattc aaccattcta catccaataa ccaaaatgcc 7740

catgtacctc tcagcgaagt ccaacggtac tgtccaatat tctcattaaa tagtctttca 7800

tctatatatc agaaggtaat tataattaga gatttcgaat cattaccgtg ccgattcgca 7860

cgctgcaacc gcggcacaaa cacaaacaca aacacaaaaa cgctaaatta tgcacacaag 7920

ggccggcggg gctgccggaa aaaaaaaggg aaaaatacac agacgagcgc gcacagatgg 7980

ggttaccact gcaagttaca agttgcaagt tgcacgctgg aatcagaatt ggaatcagaa 8040

ttggaattgg aattagaatt agaattaaac ttggggtagc cacgggaacg ggataactca 8100

ggaatcgctc gcaggcgtct ccgtctaggc aatcccaagg taagcctagg cactcccaca 8160

ggggaaagaa cggttgaagg caaagtagtg ctaacaattg gtaacgaatg gtaacaagtg 8220

tgtccgtctc cacctgacat ttgctagagc tggggattcc acattcttgt gctctgaatt 8280

ctcaaaccga aatggggcgt tgttacccca ggtatccggt tgtagttggc actggggatg 8340

gaaaaaaatg atgttgatgt tgagttagtt gggttgagtc aattagtgcg tgaaagtatc 8400

accacttttg tcatccggcg tttctgtgcg aatcacacac acacacacag tttattggag 8460

cacttgtttc tggcgtattc gtaattgttc tgcggtgcgg ttctgtgtgc atttttcctg 8520

gggtgtctgc cgcacctact catcacccac gccgtgggtt tgagccatgg cggaggtacg 8580

actgactggc tgcctgcctg cctgactgac tgcctgactg caggaaaaga gggtttcgaa 8640

ggaaaaactt ttcctgtgtt aatccggccg tgcgccgctg ctccaaaatc caccttcatg 8700

agaaggagtt tgaaaaaaca aaaaaattca catataaaaa gcgtatctcg agatctcaaa 8760

gtctcccttg aatcgtgttt gccagttgta actcatcctt tattcttcta ttctatctct 8820

ctctttcctt cccctaatca gcaattaaat ccggggtaag gaagaattac tactgtgtgt 8880

aacggttata tttcgttttt tatttttttt ttccattgcc atagagaaag aaaaaaaaaa 8940

aaaagagagt ttgtgaagat cttccattcg aatcccataa gtgacacatt taattttttt 9000

tttgttagat atgaagttag catactccct cttgcttcca ttggcaggag tcagtgcttc 9060

agtgatcaat tacaagagag acggtgaccc cgggactagt gcggccgctt aaggccgcaa 9120

gctttgatct gatctgctta ctttactaac gacaaaaaaa aatcaaaaaa aaaaaaacaa 9180

tcagtccttc tcttcttacg atatgatatg attaaatgat gctatgaaat catcttcttc 9240

ttaactttct taaatcttac gcgtcactta ctctatatac ccgtttagct ttgcctggtc 9300

acagcgacat tttatataag tgtacgtatt ttcttttttt ttttaaaaat ttctattcta 9360

accttagaaa agtgcccttt aaaccagctg tcctggcact atatctttat catgtgccgg 9420

tcgctttccc tttccgtttc ccttttcctt tcaattggtg gcctggaatt ccgaactcat 9480

tttcgcatct gaaactaatt ctcgaaacct ttaacatcaa acaattgaaa agatcatcat 9540

caccagaaat aagaaaaaga tcaacacaac agctaataac agtacgaaag aaagatcgct 9600

cgagtgaaaa ggcagccaag aaaggtcatt cgatttgggt ctagactgat tatagacata 9660

ccaattgcac tcagtaagaa aatgagtttc aaatttgacg atgacggtgt ggtaaaagaa 9720

tttcacggca acaccatcat atgccatatt cctcaacaaa ccgaattctt caacaaattg 9780

ttggacttct accgttttgc gaaacgactt tccttctacg acaagatcac cctacttcct 9840

ccttcaagct accacgttac gatcatgaat tgctgccacg aacacgatcg ttctgagggc 9900

cactggccca aaggaatcga tccggacaca agcatgctgc ggtgtacatc acatctgacc 9960

aacattctag gatcggtcga attctgattg gaaagaccat tctgctttac ttttagagca 10020

tcttggtctt ctgagctcat tatacctcaa tcaaaactga aattaggtgc ctgtcacggc 10080

tcttttttta ctgtaccttt gacttccttt cttatttcca aggatgctca tcacaatacg 10140

cttctagatc tattatgcat tataattaat agttgtagct acaaaaggta aaagaaagtc 10200

cggggcaggc aacaatagaa atcggcaaaa aaaactacag aaatactaag agcttcttcc 10260

ccattcagtc atcgcatttc gaaacaagag gggaatggct ctggctaggg aactaaccac 10320

catcgactga ctctatgcac taaccacgtg actacatata tgtgatcgtt tttaacattt 10380

ttcaaaggct gtgtgtctgg ctgtttccat taattttcac tgattaagca gtcatattga 10440

atctgagctc atcaccaaca agaaattcta ccgtaaaagt gtaaaagttc gtttaaatca 10500

tttgtaaact ggaacagcaa gaggaagtat catcagctag ccccataaac taatcaaagg 10560

aggatgtcga ctaagagtta ctcggaaaga gcagctgctc atagaagtcc agttgctgcc 10620

aagcttttaa acttgatgga agagaagaag tcaaacttat gtgcttctct tgatgttcgt 10680

aaaacagcag agttgttaag attagttgag gttttgggtc catatatctg tctattgaag 10740

acacatgtag atatcttgga ggatttcagc tttgagaata ccattgtgcc gttgaagcaa 10800

ttagcagaga aacacaagtt tttgatattt gaagacagga agtttgccga cattgggaac 10860

actgttaaat tacaatacac gtctggtgta taccgtatcg ccgaatggtc tgatatcacc 10920

aatgcacacg gtgtgactgg tgcgggcatt gttgctggtt tgaagcaagg tgccgaggaa 10980

gttacaaaag aacctagagg gttgttaatg cttgccgagt tatcgtccaa ggggtctcta 11040

gcgcacggtg aatacactcg tgggaccgtg gaaattgcca agagtgataa ggactttgtt 11100

attggattta ttgctcaaaa cgatatgggt ggaagagaag agggctacga ttggttgatc 11160

atgacgccag gtgttggtct tgatgacaaa ggtgatgctt tgggacaaca atacagaact 11220

gtggatgaag ttgttgccgg tggatcagac atcattattg ttggtagagg tcttttcgca 11280

aagggaagag atcctgtagt ggaaggtgag agatacagaa aggcgggatg ggacgcttac 11340

ttgaagagag taggcagatc cgcttaagag gggtaccgag ctcgaatt 11388

Claims (25)

1.一种马克斯克鲁维酵母启动子，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母启动子为菊粉酶基因启动子，包含菊粉酶基因起始密码子上游1136bp的序列，去除了N端的poly-A序列，并且包含潜在的转录因子的结合位点。

2.根据权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母启动子，其特征在于，所述转录因子为Zn(II)₂Cys₆转录因子。

3.根据权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母启动子，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母启动子至少包括以下核苷酸序列：

1)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或

2)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，具有菊粉酶基因启动子活性的衍生核苷酸序列。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含根据权利要求1-3中任一项所述的马克斯克鲁维酵母启动子。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包含菊粉酶信号肽、菊粉酶基因终止子、URA3基因和酵母自主复制序列。

6.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

7.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包含与所述马克斯克鲁维酵母启动子可操作地连接的目的基因。

8.根据权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于，所述目的基因为阿魏酸酯酶基因。

9.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有根据权利要求1-3中任一项所述的马克斯克鲁维酵母启动子。

10.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有根据权利要求4-8中任一项所述的重组表达载体。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌为马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株。

12.根据权利要求11所述的基因工程菌，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株来源于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCCNo.10621的马克斯克鲁维酵母菌，通过同源重组敲除URA3基因获得。

13.根据权利要求1-3中任一项所述的马克斯克鲁维酵母启动子的应用，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母启动子用于提高外源蛋白的表达。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述外源蛋白为阿魏酸酯酶。

15.根据权利要求1-3中任一项所述的马克斯克鲁维酵母启动子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1、以马克斯克鲁维酵母菌FIM-1的基因组为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的引物INU-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的引物INU-R1 PCR扩增菊粉酶基因；

步骤2、在反应体系中添加Taq酶，对步骤1中的PCR扩增产物进行加A，获得目的片段；

步骤3、回收步骤2中的所述目的片段，与pMD18-T载体进行连接，得到含有所述菊粉酶基因启动子的质粒pMD18-T-INU。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母菌FIM-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10621。

17.根据权利要求5或6所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1、以质粒pMD18-T-INU为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的引物INUΔ-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的引物INUΔ-R1将菊粉酶基因的79-1668bp的序列去除，同时在菊粉酶基因的78bp之后和终止密码子之间引入多克隆位点，得到质粒pMD18-T-P2-SP-MCS-T_INU；

步骤2、以所述质粒pMD18-T-P2-SP-MCS-T_INU为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的引物INU-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的引物INU-R2扩增P2-SP-MCS-T_INU片段；

步骤3、以pUKD载体为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的引物pUKD-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的引物pUKD-R1将pKS和KD序列之间的EcoRI位点去除，得到质粒pUKDΔE；

步骤4、利用EcoRI对所述质粒PUKDΔE进行酶切，回收酶切产物；

步骤5、将步骤2中的所述P2-SP-MCS-T_INU片段与步骤4中的所述酶切产物连接，得到载体pUKDN132-P2。

18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述质粒pMD18-T-INU根据权利要求15所述的马克斯克鲁维酵母启动子的制备方法进行制备。

19.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述多克隆位点至少包括SmaI、SpeI和NotI的位点。

20.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述P2-SP-MCS-T_INU片段包含菊粉酶基因启动子从起始密码子上游1136bp开始到起始密码子上游1bp的序列、菊粉酶基因的1-78bp含有编码信号肽的序列、多克隆位点和菊粉酶基因终止子842bp。

21.根据权利要求8所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1、利用SpeI和NotI对质粒pUKDN112-EstE进行酶切，回收含有阿魏酸酯酶基因的酶切产物；

步骤2、利用SpeI和NotI对质粒pUKDN132-P2进行酶切，回收酶切产物；

步骤3、将步骤1中的所述酶切产物与步骤2中的所述酶切产物进行连接，得到质粒pUKDN132-P2-EstE。

22.根据权利要求21所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，步骤1中的所述质粒pUKDN112-EstE根据专利申请号为201711086961.9的文献制备得到。

23.根据权利要求21所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，步骤2中的所述质粒pUKDN132-P2根据权利要求17所述的重组表达载体的制备方法进行制备。

24.根据权利要求10所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1、将来源于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCC No.10621的马克斯克鲁维酵母菌，通过同源重组敲除URA3基因，并利用含有5-氟乳清酸的YPD筛选获得尿嘧啶缺陷的宿主菌Fim-1ura3Δ；

步骤2、采用醋酸锂转化法将所述重组表达载体转入所述宿主菌Fim-1ura3Δ；

步骤3、将转化后的产物涂布于SD平板，恒温培养直至克隆形成。

25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述重组表达载体为pUKDN132-P2-EstE。