CN111705056B - 一种高效敲低apobec1基因的慢病毒载体的构建及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高效敲低APOBEC1基因的慢病毒载体的构建及应用。该shRNA的正义链为SEQ ID NO：1所示的碱基序列，shRNA的反义链为SEQ ID NO：2所示的碱基序列。本发明具有的技术效果为：1.基因敲低效率高，可以实现85‑90％的敲低率；2.带有绿色荧光蛋白，可以观察阳性感染细胞；3.带有puromycin抗性标记，可以筛选稳定转染细胞株。

Description

一种高效敲低APOBEC1基因的慢病毒载体的构建及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高效敲低APOBEC1基因的慢病毒载体的构建及应用。
背景技术
人类结直肠癌是我国第最常见的消化道肿瘤之一。2011年我国结直肠癌的发病率和病死率为23.03/10万和11.11/10万。2015年中国癌症统计数据显示：我国结直肠癌发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中均位居第5位，其中新发病例37.6万，死亡病例19.1万。其中，城市地区远高于农村，且结肠癌的发病率上升显著。我国结直肠癌的发病率和死亡率均呈上升趋势。有效治疗结直肠癌离不开对发病机制的深入理解。
研究者在研究临床大数据时发现，肠癌患者中有Apobec1显著的高表达，并且该蛋白只在消化道肿瘤的患者中呈几十倍的高表达，在结直肠癌中的高表达尤为显著，但是关于Apobec1在结肠癌发生过程中起什么作用至今仍是未知。因此，构建Apobec1的敲低结肠癌细胞模型对于研究结直肠癌十分重要。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种高效敲低APOBEC1基因的慢病毒载体的构建及应用。该shRNA的基因敲低效率高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于敲低APOBEC1基因表达的shRNA，shRNA的正义链为SEQ IDNO：1所示的碱基序列，shRNA的反义链为SEQ ID NO：2所示的碱基序列。
本发明发明构建了pLenti-shRNA，特异性敲低了结肠癌细胞系中的Apobec1。结果发现，随着Apobec1的敲低结肠癌细胞的增殖速度明显降低。这就意味着Apobec1很可能是促进结肠癌的一种基因，起着类似oncogene的作用，此细胞模型对于研究结结直肠癌十分重要。
首先设计针对Human APOBEC1的shRNA干扰片段，并且通过发明合适的颈环区来匹配前一步设计的shRNA干扰片段，通过分子生物学手段将该干扰片段构建入慢病毒载体(pLKD-CMV-EGFP-2A-Puro-U6-shRNA)的U6启动子下游，该载体可以实现在干扰目的基因的同时表达绿色荧光蛋白EGFP和puromycin抗性基因，前者便于观察载体工作状态，后者方便筛选目的基因干扰的稳定细胞株。
本发明还提供了该shRNA的合成方法，该shRNA的合成体系为：
Figure BDA0002444138580000021
该shRNA的合成程序为：
高温变性：94～96℃，5～10min；
梯度退火：80℃，10s；70℃，15s；60℃，20s；50℃，20s；40℃，15s；30℃，10s；4℃，10s。
本发明还提供了含有上述shRNA的慢病毒载体。
在本发明中，慢病毒载体的RNA干扰靶序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明还提供了该慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：
将线性化载体与shRNA进行连接；
将所得连接产物转化感受态细胞；
质粒抽提；
慢病毒包装。
作为优选，线性化载体为采用Age I和EcoR I对慢病毒载体进行双酶切获得。
作为优选，在将线性化载体与shRNA进行连接步骤中，连接体系为：
Figure BDA0002444138580000022
Figure BDA0002444138580000031
作为优选，慢病毒包装所用细胞为293T细胞。
本发明还提供了一种结肠癌细胞，该结肠癌细胞为感染上述慢病毒载体的结肠癌细胞。
作为优选，筛选结肠癌细胞的抗生素为puromycin。
作为优选，结肠癌细胞为SW480，puromycin的筛选浓度为1.5～2.0mg/mL。优选地，puromycin的筛选浓度为1.6mg/mL。
作为优选，结肠癌细胞为SW1116，puromycin的筛选浓度为1.8～2.5mg/mL。优选地，puromycin的筛选浓度为2.0mg/mL。
本发明提供了一种高效敲低APOBEC1基因的慢病毒载体的构建及应用。该shRNA的正义链为SEQ ID NO：1所示的碱基序列，shRNA的反义链为SEQ ID NO：2所示的碱基序列。本发明具有的技术效果为：
1.基因敲低效率高，可以实现85-90％的敲低率；
2.带有绿色荧光蛋白，可以观察阳性感染细胞；
3.带有puromycin抗性标记，可以筛选稳定转染细胞株。
附图说明
图1为用Age I和EcoR I对表达载体进行双酶切得到312bp的ccdB基因和8.2kb的载体片段；其中，1示未酶切的载体；2示经Age I和EcoR I双酶切的载体；3示1kb DNAladder Marker：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；
图2为菌落PCR鉴定阳性转化子结果；其中，1为DL2,000DNA Marker：2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；2-9分别为挑取的8个转化子；
图3为成功构建的APOBEC1敲低型结肠癌细胞系SW480；
图4为SW480细胞系中Apobec1基因敲低结果；
图5为SW480细胞系中对照与Apobec1的基因敲低对比图，以及Apobec1敲低后肠癌模式细胞-SW480生长速率检测结果；
图6成功构建的APOBEC1敲低型结肠癌细胞系SW1116；
图7为SW1116细胞系中Apobec1基因敲低结果；
图8为对照与Apobec1的基因敲低对比图，以及Apobec1敲低后肠癌模式细胞-SW1116生长速率检测结果；
图9示对照1的引物序列的颈环结构；
图10示实施例1的引物序列的颈环结构；
图11示对照序列的基因敲低效果验证。
具体实施方式
本发明公开了一种高效敲低APOBEC1基因的慢病毒载体的构建及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种高效敲低APOBEC1基因的慢病毒载体的构建及应用中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、干扰靶点设计和引物合成：
本发明创新点之一在于设计用于Apobec1基因敲低的靶序列，该靶序列为经过分析和设计的，19个碱基的序列，具体序列如下：
表1靶序列
Gene Gene ID TargetSeq
APOBEC1 NM_001644.5 CCTGGGAGTTTGACGTCTT
创新点之二在于引物序列中的颈环设计：CTCAAGAGA；
创新点之三在于设计开发病毒载体构建框架。
表2病毒载体构建框架
Figure BDA0002444138580000051
创新点之四在于设计引物序列如下所示：
表3引物序列
Figure BDA0002444138580000052
2、引物退火形成带粘性末端的双链片段：
1)退火体系(50μL)
Figure BDA0002444138580000053
2)将上述成分加入到250μL的PCR管中。
3)在PCR仪中，对引物进行高温变性95℃，5min，
4)在PCR仪上设计梯度退火。其梯度退火条件为：“80℃10sec-70℃15sec-60℃20sec-50℃20sec-40℃15sec-30℃10sec-4℃，10sec”。
3、线性化表达载体的制备：
用限制性内切酶对表达载体pLVshRNA-eGFP进行酶切，Age I和EcoR I对表达载体进行双酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10×反应Buffer 5μL，限制性内切酶各1μL，去离子水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用Agarose Gel DNA Extraction Kit做胶回收。
用Age I和EcoR I对表达载体进行双酶切得到312bp的ccdB基因和8.2kb的载体片段，酶切图谱如图1所示。
4、干扰片段连接入表达载体：
连接反应体系如下：
表4连接反应体系
Figure BDA0002444138580000061
于16℃连接过夜。
5、感受态细胞的转化：
DH5α感受态细胞的转化。
6、菌落PCR鉴定阳性转化子：
挑取平板上长出的转化子重悬于10μL LB培养液中，取1μL做模板进行菌落PCR鉴定。
正向引物hU6-F2：TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG，位于人U6启动子序列中，
反向引物pY-SEQR：CTATTAATAACTAATGCATGGC，位于CMV启动子的5’序列，阳性克隆得到332bp的片段。
反应体系和PCR循环条件如下：
PCR反应液组成
Figure BDA0002444138580000062
PCR反应条件
Figure BDA0002444138580000071
Figure BDA0002444138580000072
菌落PCR鉴定图如图2所示。
7、阳性克隆送测序：
测序结果：下划线标注的部分为正确的插入序列
GAAATATTTGACTGTAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTT GGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCCTGGGAGTTTGACGTCTTCTCAAGAGAAAGACGTCAAACTCCCAGGTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGT
8、质粒小提：使用脱内毒素质粒提取试剂盒。
9、包装慢病毒：293T
10、慢病毒感染细胞：常规操作。
11、筛选获得稳定转染的Apobec1敲低的结肠癌SW480细胞系
选出合适筛选SW480细胞株的抗生素浓度，然后获得稳定转染细胞株。具体为：
通过梯度摸索出筛选稳定转染SW480细胞系的合适puromycin浓度：梯度实验所设计浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0(μg/mL)筛选时间长度为4天，结果发现，浓度为低于1.4的浓度筛选不彻底，高于2.0浓度会导致阳性转染细胞死亡。最适浓度范围是1.5-2.0μg/mL，最佳浓度为1.6μg/ml。
成功构建的APOBEC1敲低型结肠癌细胞系SW480见图3。
12、筛选获得稳定转染的Apobec1敲低的结肠癌SW1116细胞系
选出合适筛选SW1116细胞株的抗生素浓度，然后获得稳定转染细胞株。
具体为：
通过梯度摸索出筛选稳定转染SW480细胞系的合适puromycin浓度：梯度实验所设计浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0(μg/mL)筛选时间长度为4天，结果发现，浓度为低于1.8的浓度筛选不彻底，高于2.5浓度会导致阳性转染细胞死亡。最适浓度范围是1.8-2.5μg/mL,最佳浓度为2.0μg/mL。
成功构建的APOBEC1敲低型结肠癌细胞系SW1116见图6。
试验例1 Apobec1基因敲低结果在肠癌模式细胞SW480中验证
试验方法：Realtime PCR验证。第一步，利用Trizol(购自Invitrogen公司)法分别提取对照组和基因敲低组的RNA，然后用反转录试剂盒(购自天根生物)将RNA反转录为cDNA，再利用Realtime-PCR试剂盒(天根生物)测定cDNA的丰度。用于Realtime-PCR的引物为自己设计的特异性引物：
Apobec1 Forward:5’-AAA TCG GCA AGG TCT CAG-3’，
Apobec1 Reverse:CCA GGT GGG TAG TTG ACA A-3’。
采用β-Actin作为Realtime PCR的内参，引物序列为：
β-Actin Forward:5’-ATG GAA TCC TGT GGC ATC-3’，
β-Actin Reverse:5’-AGC ACT GTG TTG GCA TACA-3’。
试验结果见图4。由试验结果可知，本发明将Apobec1的RNA敲低约82％。
试验例2敲低肠癌模式细胞SW480生长速率检测
细胞生长速率下降(CCK8法)：按照碧云天公司生产的CCK8细胞增殖检测试剂盒“Cell Counting Kit-8”。
试验结果见图5。由试验结果可知，当把SW480细胞中的Apobec1敲低之后，细胞的增殖速度明显减弱，这预示Apobec1与结肠癌细胞的增殖是呈正相关的，意味着可以将其作为结肠癌治疗的靶点而进一步研究，开发新药。
试验例3 Apobec1基因敲低结果在肠癌模式细胞SW1116验证
试验方法：Realtime PCR验证。第一步，利用Trizol(购自Invitrogen公司)法分别提取对照组和基因敲低组的RNA，然后用反转录试剂盒(购自天根生物)将RNA反转录为cDNA，再利用Realtime-PCR试剂盒(天根生物)测定cDNA的丰度。用于Realtime-PCR的引物为自己设计的特异性引物：
Apobec1 Forward:5’-AAA TCG GCA AGG TCT CAG-3’，
Apobec1 Reverse:CCA GGT GGG TAG TTG ACA A-3’。
采用β-Actin作为Realtime PCR的内参，引物序列为：
β-Actin Forward:5’-ATG GAA TCC TGT GGC ATC-3’，
β-Actin Reverse:5’-AGC ACT GTG TTG GCA TACA-3’。
图6为基因敲低病毒转染图。图7为对照与Apobec1的基因敲低对比图。由图8试验结果可知，本发明将Apobec1的RNA敲低约79％。
试验例3其他引物序列对比效果
在本发明研发过程中设计过多种引物序列，如表5所示，但这些引物序列难以形成有效的颈环结构，如对照1的引物序列的颈环结果如图9所示；而实施例1的引物序列可以形成良好的颈环结构，其颈环结果如图10所示。
表5对照引物序列
Figure BDA0002444138580000091
Figure BDA0002444138580000101
备注：Control 1序列与发明相同，但是loop不同。Control 2:目标序列与发明不同，但是loop相同。Control 3：Apobec1的非特异性序列。
采用上述对照序列进行基因敲低效果验证，结果见图11。
提取RNA，进行反转录之后，利用发明人设计的Real time-PCR的引物：
Apobec1 Forward:5’-AAA TCG GCA AGG TCT CAG-3’，
Apobec1 Reverse:CCA GGT GGG TAG TTG ACA A-3’。
采用β-Actin作为Realtime PCR的内参，引物序列为：
β-Actin Forward:5’-ATG GAA TCC TGT GGC ATC-3’，
β-Actin Reverse:5’-AGC ACT GTG TTG GCA TACA-3’，
对不同的基因敲低序列设计进行对比，结果本发明对于Apobec1的敲低效果要明显优于其他对照。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 济宁医学院
<120> 一种高效敲低APOBEC1基因的慢病毒载体的构建及应用
<130> MP1933002
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggcctggg agtttgacgt cttctcaaga gaaagacgtc aaactcccag gttttttg 58
<210> 2
<211> 58
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattcaaaaa acctgggagt ttgacgtctt tctcttgaga agacgtcaaa ctcccagg 58
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctgggagtt tgacgtctt 19

Claims (8)

1.一种结肠癌细胞，其特征在于，所述结肠癌细胞为感染含有shRNA的慢病毒载体的结肠癌细胞；所述shRNA的正义链为SEQ ID NO：1所示的碱基序列，所述shRNA的反义链为SEQID NO：2所示的碱基序列。
2.权利要求1所述的结肠癌细胞，其特征在于，
所述shRNA的合成体系为：
正义链 3~10μg
反义链 3~10μg
退火缓冲液 25μL
H2O 补足至50μL；
所述shRNA的合成程序为：
高温变性：94~96℃，5~10min；
梯度退火：80℃，10s；70℃，15s；60℃，20s；50℃，20s；40℃，15s；30℃，10s；4℃，10s。
3.根据权利要求1所述的结肠癌细胞，其特征在于，所述慢病毒载体的RNA干扰靶序列如SEQ ID NO：3所示。
4.权利要求1所述的结肠癌细胞，其特征在于，所述含有shRNA的慢病毒载体的构建包括如下步骤：
将线性化载体与所述shRNA进行连接；
将所得连接产物转化感受态细胞；
质粒抽提；
慢病毒包装。
5.根据权利要求4所述的结肠癌细胞，其特征在于，所述线性化载体为采用Age I和EcoRI对慢病毒载体进行双酶切获得。
6.根据权利要求4所述的结肠癌细胞，其特征在于，在将线性化载体与所述shRNA进行连接步骤中，所述连接体系为：
退火的shRNA 10-4 ~ 10-6 μmol
线性化载体 100~200 ng
T4 DNA连接酶缓冲液 2μL
T4 DNA连接酶 1μL
H2O 补足至20μL。
7.根据权利要求4所述的结肠癌细胞，其特征在于，所述慢病毒包装所用细胞为293T细胞。
8.根据权利要求1所述的结肠癌细胞，其特征在于，筛选所述结肠癌细胞的抗生素为puromycin；
所述结肠癌细胞为SW480，所述puromycin的筛选浓度为1.5~2.0mg/mL；
所述结肠癌细胞为SW1116，所述puromycin的筛选浓度为1.8~2.5mg/mL。
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APOBEC1-Mediated Editing and Attenuation of Herpes Simplex Virus 1 DNA Indicate That Neurons Have an Antiviral Role during Herpes Simplex Encephalitis;Peter Gee等;《JOURNAL OF VIROLOGY》;20111031;第85卷(第19期);摘要及材料与方法 *
Peter Gee等.APOBEC1-Mediated Editing and Attenuation of Herpes Simplex Virus 1 DNA Indicate That Neurons Have an Antiviral Role during Herpes Simplex Encephalitis.《JOURNAL OF VIROLOGY》.2011,第85卷(第19期), *

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