CN109913399B - 一种含有多个耐药基因盒的中间气单胞菌整合子及其获取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有多个耐药基因盒的中间气单胞菌整合子及其获取方法和应用，该整合子序列如SEQ ID NO.1所示，所述整合子命名为InQST31。以深入研究水产动物源致病菌耐药机制特别是对有关整合子的研究，有利于抗菌药物的合理使用和新抗生素药物的开发，同时，加强抗菌药物在水产养殖过程中的合理应用。属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域。

Description

一种含有多个耐药基因盒的中间气单胞菌整合子及其获取方 法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域，具体涉及一种含有多个耐药基因盒的中间气单胞菌整合子及其获取方法和应用。

背景技术

中间气单胞菌(Aeromonas media)，是气单胞菌属的一个种，最早于1983年在河水中发现，随后在淤泥、废水、动物体以及人体中都检测到该细菌的存在。中间气单胞菌是一种新发现的条件致病菌，可引起人类和动物的感染，人类感染的主要症状是腹泻。中间气单胞菌引起水生动物疾病的报道相对较少，仅王高学等(2007)报道了中间气单胞菌引起刺参腐皮病；吕爱军等(2012)等报道了中间气单胞菌引起锦鲤肛门出血，皮肤溃疡等；黄文明等(2013)报道了中间气单胞菌引起胭脂鱼发病；杨移斌等(2016)通过病原分离纯化鉴定及人工感染等实验，证实中间气单胞菌可引起斑点叉尾蛔出血性死亡；以及张书环(2018)等人证明中间气单胞菌导致人工养殖中华鲟体表及内脏器官广泛出血。抗生素是水产养殖中防治该菌的主要手段。随着世界范围内抗生素的滥用，细菌耐药株不断出现，耐药谱不断扩大，呈多重耐药趋势，已引起全世界范围的高度关注。2014年4月30日，WHO发布报告称，抗生素耐药性细菌正蔓延至全球各地，成为21世纪最大的公共卫生安全问题之一。水产动物中的耐药菌可通过食物链或直接接触感染人类并传播耐药基因至正常菌群或人类致病菌，严重威胁人类生命健康。

整合子(integron)是细菌的DNA片段，与细菌耐药性密切相关，是一种存在于细菌质粒或染色体上的遗传元件系统，可通过自身编码的整合酶来获取外源基因并使之表达。1989年，Strokes首次提出整合子的概念，1991年，Hall正式提出基因盒-整合子系统概念。根据整合酶序列的不同整合子分为多种不同的类型。目前研究发现I类整合子在革兰氏阴性菌中分布广泛、检出率最高。I类整合子主要由5'-CS、3'-CS以及两者之间的可变区三部分组成。5'-CS区中包括整合酶intI1、特异性重组位点attI和启动子，Int I基因负责催化att I和att C上的基因盒的整合及切除。3'-CS区常见的有3个ORF：季铵盐化合物及嗅化乙啶的耐药基因(qacEΔ1)、磺胺耐药基因(Sull)和功能尚不明确的ORF5。可变区即各种耐药基因盒，每个基因盒由一个结构基因(多为耐药基因)及与3'末端毗邻的一个反向重复序列attC组成。

整合子捕获、整合和表达耐药基因盒，引起耐药基因在同种或不同种菌属间传播，从而使细菌的耐药性得以广泛扩散。目前，已有多种耐药基因盒被确认是通过整合子位点特异性重组捕获并表达，从而使宿主菌对各种常用药物产生耐药性。同时，整合子自身可位于接合性质粒、转座子等可移动性元件上，这些可移动元件可使整个整合子发生移动。因而整合子在新的耐药菌株的出现及耐药基因水平散播中扮演着非常重要的角色。目前对整合子的研究主要集中在人类和畜禽源致病菌上，水产动物源细菌耐药性研究甚少。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种含有多个耐药基因盒的中间气单胞菌整合子及其获取方法和应用，以深入研究水产动物源致病菌耐药机制特别是对有关整合子的研究，有利于抗菌药物的合理使用和新抗生素药物的开发，同时，加强抗菌药物在水产养殖过程中的合理应用。

为实现上述目的，本发明采用如下方案：

提供一种含有多个耐药基因盒的中间气单胞菌整合子，该整合子序列如SEQ IDNO.1所示，所述整合子命名为InQST31。该整合子含有aacA4基因盒、bla OXA-2基因盒、CatB3基因盒、aadA16基因盒。上述整合子表达多种耐药基因，从而导致含有该整合子的菌种对多种抗生素药物具有耐药性。这些抗生素包括：氨基糖苷类抗生素、β-内酰胺类、氯霉素类抗生素、磺胺类抗生素。

常见的氨基糖苷类抗生素包括：庆大霉素、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、阿米卡星。

常见的β-内酰胺类抗生素包括：青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β内酰胺类抗生素。

常见的氯霉素类抗生素包括：氯霉素、氟苯尼考。

常见的磺胺类抗生素包括：磺胺异恶唑(SIZ)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、柳氮磺吡啶(SASP)、磺胺米隆(SML)、磺胺嘧啶银、磺胺醋酰(SA)、以及复方新诺明(甲氧苄啶+磺胺甲恶唑)。

上述整合子的获取方法如下：

(1)从江口县某养殖场患病棘胸蛙蝌蚪腹水中分离培养出1株对庆大霉素、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、大观霉素、克拉霉素、红霉素、麦迪霉素、多西环素、四环素、复方新诺明、磺胺异噁唑、甲氧苄氨嘧啶、环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、氯霉素、头孢噻吩、头孢唑啉、氨苄西林、阿莫西林、头孢哌酮、头孢氨苄、头孢克肟、万古霉素、杆菌肽、替考拉宁、新生霉素、哌拉西林、呋喃唑酮、利福平、甲硝唑、克林霉素、林可霉素、制霉素共35种抗生素耐药的细菌；

(2)将步骤(1)分离的单克隆菌株采用生理生化试验和16s rDNA及gyrB基因序列建树分析进行细菌鉴定，经鉴定此菌株为中间气单胞菌，命名为QST31；

(3)将QST31培养扩增，取5mL菌液，按照

Genomic DNA Purification试剂盒说明书的要求抽提所述QST31菌株的总DNA；

(4)根据I类整合子的基因特点，以步骤(3)提取纯化后的基因组为模板，采用PCR方法获得int1基因片段，片段引物：SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，根据已知的经过测序验证的int1序列，采用染色体步移技术并经过SeqMan软件进行序列拼接，得到权利要求1所述的整合子结构。

本发明还提供了一种含有整合子InQST31序列的重组质粒。所述质粒包含整合子InQST31序列。在本发明的具体的实施方案中，所述重组质粒由整合子InQST31序列和pET32a(+)载体重组而成，整合子插入位点在pET32a(+)载体上KpnI和NotI酶切位点处。所述重组质粒使用的空载体可以使用任何常见的蛋白表达质粒载体代替。

该重组质粒的制备方法如下：

(1)InQST31的PCR扩增

根据所述整合子的特性，将该基因分为5个部分，分别命名为F1、F2、F3、F4和F5，以基因组为模版，采用PCR方法分别获得DNA片段F1、F2、F3、F4和F5，片段的序列依次为SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，DNA片段F1的引物：SEQID NO.9和SEQ ID NO.10；DNA片段F2的引物：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；DNA片段F3的引物：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；DNA片段F4的引物：SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；DNA片段F5的引物：SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；

PCR的反应体系均为：PrimeSTAR HS DNA Polymerase：2μl，5×PrimeSTARBuffer：10μl，dNTP Mixture：4μl，引物：1μl，引物：1μl，模板DNA：2μl，无RNase水：30μl；扩增条件为：94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，30个循环。

(2)InQST31亚克隆的构建：

将步骤(1)中获得的片段F1、F2、F3、F4和F5和经过改造的平末端载体pSIMPLE-19EcoR V/BAP Vector连接(引入NotI限制性酶切位点)，并将连接产物转化入感受态E.coliHB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F1、pSIMPLE19-F2、pSIMPLE19-F3、pSIMPLE19-F4和pSIMPLE19-F5；

(3)含有InQST31全长基因的重组克隆的构建：

用MluI和NotI酶切步骤(2)中获得的pSIMPLE19-F1和pSIMPLE19-F2，回收pSIMPLE19-F1的大片段和pSIMPLE19-F2的小片段，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4 DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态E.coli HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F1-F2；

用Sal1和NotI酶切步骤(2)中获得的pSIMPLE19-F3和pSIMPLE19-F4，回收pSIMPLE19-F3的大片段和pSIMPLE19-F4的小片段，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4 DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态E.coli HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F3-F4；

用EcoRI和NotI酶切pSIMPLE19-F1-F2和pSIMPLE19-F3-F4，回收pSIMPLE19-F1-F2的大片段和pSIMPLE19-F3-F4的小片段，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4 DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态E.coli HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4；

用NcoI和NotI酶切pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4和pSIMPLE19-F5，回收pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4的大片段和pSIMPLE19-F5的小片段，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4 DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态E.coliHB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4-F5；

用KpnI和NotI酶切pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4-F5和pET32a(+)，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收经过酶切的pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4-F5和经过酶切的pET32a(+)，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4 DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态E.Coli JMI09，通过含有卡那霉素的平板选阳性克隆。

本发明还提供了一种含有整合子InQST31的重组菌株。该重组细菌是将包含序列如SEQ ID NO.1所示的整合子的重组质粒转入E.Coli JM109菌株中制备而成。为了研究整合子的耐药性，将该整合子InQST31克隆入pET32a(+)载体中，整合子插入位点在pET32a(+)载体上KpnI和NotI酶切位点处。并将其转化入野生型E.Coli JM109中，通过含有卡那霉素的平板选阳性克隆(含有pET32a(+)-整合子的细菌)。将阳性克隆做药敏试验，结果显示QST31菌株中的整合子InQST31可以使重组E.Coli JM109菌株对以下药物耐药：庆大霉素、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、大观霉素、头孢噻吩、头孢唑啉、氨苄青霉素、阿莫西林、头孢哌酮、头孢氨苄、头孢克肟、氯霉素、复方新诺明、磺胺异噁唑、甲氧苄氨嘧啶。

本发明具有如下优点：

本发明构建的带有InQST31全长序列的克隆是通过将InQST31全长基因组分成5个片段扩增并拼接后克隆到质粒pET32a(+)载体上，所扩增的片段相对较短，更好地保证所扩增片段序列的保真性，避免了细菌基因组酶切的操作难度，保证了所构建的表达载体含有整合子的全部序列。

首次从人工养殖的棘胸蛙蝌蚪分离到病原菌中间气单胞菌，并从其基因组上检测到一个含有多个耐药基因盒的整合子；深入研究水产动物源致病菌耐药机制特别是对有关整合子的研究，有利于抗菌药物的合理使用和新抗生素药物的开发，同时，加强抗菌药物在水产养殖过程中的合理应用，可减少整合子发生、减少分子进化的外部诱导环境，延缓多药耐药菌株的发生，为水产养殖中的合理用药提供了一定的指导作用，有利于生产实践中减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。

附图说明

图1为本发明的整合子InQST31的结构示意图。

图2为一种含有整合子InQST31全序列的表达载体构建示意图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，以下列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以下实施例，还可以有许多变形。因此本领域的技术人员在本发明公开内容的基础上做的修改或改进，均应属于本发明要求保护的范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：整合子InQST31的鉴定，其步骤是：

1、QST31菌株的分离、鉴定及药物敏感性

1.1材料

LB琼脂、LB肉汤、M-H琼脂：杭州微生物试剂有限公司。

PCR高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase：宝生物工程(大连)有限公司。

PCR相关试剂：宝生物工程(大连)有限公司。

特异性引物：生工生物工程(上海)股份有限公司。

生理生化鉴定试剂：杭州微生物试剂有限公司。主要包括：革兰氏染色液，动力-吲哚-尿素培养基基础(MIU)，氰化钾培养基基础，苯丙氨酸培养基，赖氨酸脱羧酶培养基，克氏柠檬酸盐培养基，细菌微量生化鉴定管：葡萄糖磷酸盐蛋白胨水(MR-VP)、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、硫化氢、麦芽糖、甘露醇、硫化氢、丙二酸盐、半乳糖、甘油、阿拉伯糖、阿拉伯醇、纤维二糖、明胶、葡萄糖、甘露糖、蜜二糖、鼠李糖、侧金盏花醇。

药敏纸片：杭州微生物试剂有限公司。药物种类及含量：庆大霉素10μg，链霉素10μg，妥布霉素10μg，卡那霉素30μg，新霉素30μg，大观霉素100μg，丁胺卡那30μg，克拉霉素15μg，红霉素15μg，麦迪霉素30μg，阿奇霉素30μg，多西环素30μg，四环素30μg，复方新诺明23.75/1.25μg，磺胺异噁唑300μg，甲氧苄氨嘧啶5μg，氧氟沙星5μg，环丙沙星5μg，恩诺沙星5μg，诺氟沙星10μg，氟苯尼考30μg，氯霉素30μg，头孢噻吩30μg，头孢唑啉30μg，头孢他啶30μg，头孢噻肟30μg，氨苄西林10μg，阿莫西林10μg，头孢哌酮30μg，头孢氨苄30μg，头孢克肟5μg，万古霉素30μg，杆菌肽0.04u，替考拉宁30μg，多粘菌素B300 IU，新生霉素30μg，哌拉西林100μg，呋喃妥因300μg，呋喃唑酮100μg，利福平5μg，甲硝唑5μg，克林霉素2μg，林可霉素2μg，制霉素100μg。

1.2方法

细菌分离实验：选择症状明显，濒临死亡的棘胸蛙蝌蚪10尾，于无菌环境下取其腹水用于细菌分离，用接种环蘸取腹水样品于LB琼脂平板上划线，恒温28℃培养24h后，挑取颜色相近、大小相同及数量较多的菌落再纯化，将分离得到的菌株与25％甘油混匀后置于-80℃冰箱。

生理生化实验：将分离纯化的菌株划线于LB琼脂平板上，恒温28℃培养24h后，观察菌落大小、形态特征及其颜色，并进行革兰氏染色，采用细菌生化微量鉴定管测定生理生化指标。

细菌16S rDNA与gyrB基因测序：分离纯化的菌株划线于LB琼脂平板上，恒温28℃培养24h后，挑取单克隆菌体作为PCR模板。细菌16s rDNA通用引物为27F:5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。gyrB基因引物为3F:5’-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3’，14R:5’-TTG TCCGGGTTGTACTCGTC-3’。采用PCR方法分别获得16s rDNA和gyrB基因片段。PCR仪为Biorad公司的MyCycler Thermal cycler。PCR的反应体系为：PrimeSTAR HS DNA Polymerase：2μl，5×PrimeSTAR Buffer：10μl，dNTP Mixture：4μl，引物：1μl，引物：1μl，模板DNA为：2μl，无RNase水：30μl；扩增条件为：94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，30个循环。使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，扩增片段送上海生工纯化测序。

细菌16S rDNA与gyrB基因系统发育树：将分离菌株的16S rDNA及gryB基因与GenBank中已有序列进行比对，根据比对结果检索出同源性较高的序列采用Clustal X软件进行多序列匹配分析，通过MEGA5.1软件Neighbor-Joining法构建系统进化树，1000次Bootstrap检验置信度。

药敏试验：参照K-B纸片扩散法，将分离纯化菌株接种于LB液体培养基中，28℃震荡(200r/min)18h调整菌液浓度为1.0×10⁷CFU/mL，取稀释菌液200μL均匀涂布于M-H琼脂培养基上，贴上不同的药敏纸片，恒温28℃培养24h后测量抑菌圈直径(mm)，根据杭州微生物试剂有限公司药敏纸片抑菌圈标准确定致病菌株对药物的敏感程度。

1.3结果

1.3.1细菌鉴定

分离菌株理化特性与中间气单胞菌一致。为革兰氏阴性杆菌，无运动性，产苯丙氨酸脱氨酶、精氨酸双水解酶，不产H2S、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶，M-R反应、柠檬酸盐、丙二酸盐、明胶液化、O/129(R)阳性，V-P反应、尿素、吲哚、D-葡萄糖产气、阴性，呈发酵代谢类型，可利用D-葡萄糖、D-甘露醇、D-甘露糖、半乳糖、甘油、阿拉伯糖、纤维二糖、麦芽糖。

通过将16S rDNA及gyrB基因测序结果与NCBI基因库中已有序列比对，结果显示分离菌株与气单胞菌属种类同源性最高，通过构建系统发育树分析，其结果显示菌株QST31与中间气单胞菌聚为一支，同源性达到99％。综合生理生化特征测定结果，分离菌株判定为中间气单胞菌，其命名为QST31。

1.3.3药敏实验结果

药敏实验结果表明，QST31菌株对于以下药物产生抗性：庆大霉素、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、大观霉素、克拉霉素、红霉素、麦迪霉素、多西环素、四环素、复方新诺明、磺胺异噁唑、甲氧苄氨嘧啶、环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、氯霉素、头孢噻吩、头孢唑啉、氨苄西林、阿莫西林、头孢哌酮、头孢氨苄、头孢克肟、万古霉素、杆菌肽、替考拉宁、新生霉素、哌拉西林、呋喃唑酮、利福平、甲硝唑、克林霉素、林可霉素、制霉素。

2、整合子InQST31的分离和鉴定

2.1方法

2.1.1QST31菌株的基因组提取

取5ml的QST31菌液(前面已述)，按照细菌基因组提取试剂盒

GenomicDNA Purification Kit(购自美国Promega公司)说明书操作步骤提取QST31细菌基因组DNA，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(购自Thermo公司)测定DNA的浓度，并使用浓度为1％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，于-80℃保存备用。

2.1.2整合子的获取

以QST31基因组为模板，int1引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，使用PCR高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase(前面已述)采用PCR方法获得int1基因片段。使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，扩增片段送上海生工纯化测序。PCR仪为Biorad公司的MyCycler Thermal cycler。PCR的反应体系为：PrimeSTAR HS DNA Polymerase：2μl，5×PrimeSTAR Buffer：10μl，dNTP Mixture：4μl，引物：1μl，引物：1μl，模板DNA为：2μl，无RNase水：30μl；扩增条件为：94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，30个循环。

根据已知的经过测序验证的int1序列，采用染色体步移技术，参照Takara GenomeWalking Kit说明书(购自宝生物工程(大连)有限公司)，根据已知DNA序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物(SP Primer)，与试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物，进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应即可获取已知序列的侧翼序列，根据第一次步移获取的序列信息，继续进行侧翼序列获取。经过测序验证的序列通过SeqMan软件进行序列拼接，得到权利要求1所述的整合子结构。

2.2结果

测序结果拼接后分析显示，长度为8466bp的DNA片段属于I类整合子，该整合子包括I型整合子的基本结构和多个基因盒，序列如SEQIDNO.1所示，结构示意图如图1所示。

实施例2基因重组实验研究整合子InQST31的功能

1、方法

1.1 InQST31的PCR扩增

将InQST31的全长基因分成5个部分设计引物，这五个片段分别命名为F1、F2、F3、F4和F5。以上述步骤2.1.1中的基因组DNA为模版，采用PCR高保真酶PrimeSTAR HS DNAPolymerase PCR(前面已述)分别获得DNA片段F1、F2、F3、F4和F5。片段F1～F5序列如SEQ IDNO.1～5所示。使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)分别回收DNA片断，使用Thermo Scientific NanoDrop2000(前面已述)测定DNA的浓度，使用浓度为1％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20℃保存备用。

PCR仪为Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海生工生物技术有限公司合成。DNA片段F1的引物：SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，DNA片段F2的引物：SEQID NO.11和SEQ ID NO.12，DNA片段F3的引物：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，DNA片段F4的引物：SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，DNA片段F5的引物：SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18。

SEQ ID NO.9

5’-GGTACCTGTCGTTTTCAGAAGACGGCTG-3’

SEQ ID NO.10

5’-ACGCGTTCAAGCGCGGCAACAG-3’

SEQ ID NO.11

5’-ACGCGTGGCCTAACCCTTCCATC-3’

SEQ ID NO.12

5’-GAATTCCGCATTGCTGATCGCAAG-3’

SEQ ID NO.13

5’-GAATTCTACTGTCTGGATTTATG-3’

SEQ ID NO.14

5’-GTCGACCCCAGATGATGCTCGATG-3’

SEQ ID NO.15

5’-GTCGACGTTGCTGGCCGTGCA-3’

SEQ ID NO.16

5’-CCATGGCGTCGGCCTCCGCAGC-3’

SEQ ID NO.17

5’-CCATGGTGACGGTGTTCGGCATTC-3’

SEQ ID NO.18

5’-GCGGCCGCTTAGATTTCGAGTTCTAGGCG-3’

PCR的反应体系为：PrimeSTAR HS DNA Polymerase：2μl，5×PrimeSTAR Buffer：10μl，dNTP Mixture：4μl，引物：1μl，引物：1μl，模板DNA为：2μl，无RNase水：30μl；扩增条件为：94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，30个循环。

1.2 InQST31亚克隆的构建

将上述步骤1.1中获得的DNA片段F1、F2、F3、F4、F5分别与经过改造的平末端连接载体pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector(连接位点处引入NotI限制性酶切位点)使用T4 DNA连接酶(美国NEB公司)连接，将连接产物转化感受态E.coli HB101(美国Promega公司)，挑取克隆并进行PCR鉴定。PCR的反应体系均为：10×buffer：2μl，dNTP：0.4μl，引物：0.2μl，引物：0.2μl，模板：0.2μl，Taq酶：0.2μl，水：16.8μl。扩增条件为：94℃2min，94℃30s，55℃40s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，28个循环。将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F1、pSIMPLE19-F2、pSIMPLE19-F3、pSIMPLE19-F4和pSIMPLE19-F5。鉴定pSIMPLE19-F1所用的引物为片段F1的引物为SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10；鉴定pSIMPLE19-F2所用的引物为片段F2的引物为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；鉴定pSIMPLE19-F3所用的引物为片段F3的引物为SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14；鉴定pSIMPLE19-F4所用的引物为片段F4的引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；鉴定pSIMPLE19-F5所用的引物为片段F4的引物为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18。

1.3含有InQST31全长基因的克隆构建：

InQST31部分基因(F1-F2)的拼接：用MluI(美国NEB公司)和NotI酶切(美国NEB公司)上述步骤1.2中得到的pSIMPLE19-F1和pSIMPLE19-F2，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)回收pSIMPLE19-F1的大片段和pSIMPLE19-F2的小片段，使用ThermoScientific NanoDrop 2000(前面已述)测定DNA的浓度，使用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。然后使用T4 DNA连接酶(美国NEB公司)连接pSIMPLE19-F1的大片段和pSIMPLE19-F2的小片段，并将连接产物转化感受态E.coil HB101(前面已述)，挑取克隆并进行PCR鉴定，PCR的反应体系均为：10×buffer：2μl，dNTP：0.4μl，引物(5’-GCCTGCGCAGAAAGTTGTAG-3’)(SEQ ID NO.19)：0.2μl，引物(5’-CACCAGCCATCACCGCTTCCG-3’)(SEQ ID NO.20)：0.2μl，模板：0.2μl，Taq酶：0.2μl，水：16.8μl。扩增条件为：94℃2min，94℃30s，55℃40s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，28个循环。将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F1-F2。

InQST31部分基因(F3-F4)的拼接：用SalI(美国NEB公司)和NotI(前面已述)酶切上述步骤1.2中得到的pSIMPLE19-F3和pUC19-F4，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)回收pSIMPLE19-F3的大片段和pSIMPLE19-F4的小片段，使用Thermo ScientificNanoDrop 2000(前面已述)测定DNA的浓度，使用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。然后使用T4 DNA连接酶(前面已述)连接pSIMPLE19-F3的大片段和pSIMPLE19-F4的小片段，并将连接产物转化感受态HB101(前面已述)，挑取克隆并进行PCR鉴定。PCR的反应体系均为10×buffer：2μl，dNTP：0.4μl，引物(5’-GGAGAAGATCAAAGCGGCAATGC-3’)(SEQ ID NO.21)：0.2μl，引物(5’-CCAGATCAACATCGGTTGTC-3’)(SEQ ID NO.22)：0.2μl，模板：0.2μl，Taq酶：0.2μl，水：16.8μl。扩增条件为：94℃2min，94℃30s，55℃40s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，28个循环。将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F3-F4。

InQST31部分基因(F1-F2-F3-F4)的拼接：用EcoRI(美国NEB公司)和NotI酶切(前面已述)上述步骤中得到的pSIMPLE19-F1-F2和pSIMPLE19-F3-F4，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)回收pSIMPLE19-F1-F2的大片段和pSIMPLE19-F3-F4的小片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)测定DNA的浓度，使用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。然后使用T4 DNA连接酶(前面已述)连接pSIMPLE19-F1-F2的大片段和pSIMPLE19-F3-F4的小片段，并将连接产物转化感受态E.coli HB101，挑取克隆并进行PCR鉴定。PCR的反应体系均为10×buffer：2μl，dNTP：0.4μl，引物(5’-GGCATGCGCGAACGTTCTGA-3’)(SEQ ID NO.23)：0.2μl，引物(5’-AACCCATCCTACCCACCAAC-3’)(SEQ ID NO.24)：0.2μl，模板：0.2μl，Taq酶：0.2μl，水：16.8μl。扩增条件为：94℃2min，94℃30s，55℃40s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，28个循环。将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4。

InQST31全长基因(F1-F2-F3-F4-F5)的拼接：用NcoI(美国NEB公司)和Not I酶切pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4和pSIMPLE19-F5，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4的大片段和pSIMPLE19-F5的小片段，使用Thermo ScientificNanoDrop 2000测定DNA的浓度，使用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。然后使用T4DNA连接酶连接pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4的大片段和pSIMPLE19-F5的小片段，并将连接产物转化感受态E.coli HB101，挑取克隆并进行PCR鉴定。PCR的反应体系均为：10×buffer：2μl，dNTP：0.4μl，引物(5’GTTATCGCAATAGTTGGCGAAG-3’)(SEQ ID NO.25)：0.2μl，引物(5’-TCAGCAATATCGGGATAGAG-3’)(SEQ ID NO.26)：0.2μl，模板：0.2μl，Taq酶：0.2μl，水：16.8μl。扩增条件为：94℃2min，94℃30s，55℃40s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，28个循环。将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4-F5。

拼接的全基因插入pET32a(+)：用KpnI(美国NEB公司)和NotI酶切pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4-F5和pET32a(+)(北京索莱宝科技有限公司)，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收经过酶切的pUC19-F1-F2-F3-F4-F5和经过酶切的pET32a(+)，使用Thermo ScientificNanoDrop 2000测定DNA的浓度，使用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。然后使用T4DNA连接酶连接经过酶切的产物，并将连接产物转化感受态E.coli JM109(美国Promega公司)，挑取克隆并进行PCR鉴定。PCR的反应体系均为：10×buffer：2μl，dNTP：0.4μl，，引物(5’-GGCATGCGCGAACGTTCTGA-3’)(SEQ ID NO.27)：0.2μl，引物(5’-AACCCATCCTACCCACCAAC-3’)(SEQ ID NO.28)：0.2μl，Taq酶：0.2μl，模板：0.2μl，水：16.8μl。扩增条件为：94℃2min，94℃30s，55℃40s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，28个循环。将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pET32a(+)-QST31-FL。

1.4对构建成功的克隆菌进行耐药性检测

参照K-B纸片扩散法，将重组菌E.Coli JM109(pET32a(+)-整合子InQST31)接种于LB液体培养基中，28℃震荡(200r/min)18h调整菌液浓度为1.0×10⁷CFU/mL，取稀释菌液200μL均匀涂布于M-H琼脂培养基上，贴上不同的药敏纸片，恒温28℃培养24h后测量抑菌圈直径(mm)，根据杭州微生物试剂有限公司药敏纸片抑菌圈标准确定重组菌株对药物的敏感程度。

2、结果

药敏实验结果显示，重组菌E.Coli JM109(pET32a(+)-整合子InQST31)对庆大霉素、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、大观霉素、头孢噻吩、头孢唑啉、氨苄青霉素、阿莫西林、头孢哌酮、头孢氨苄、头孢克肟、氯霉素、复方新诺明、磺胺异噁唑、甲氧苄氨嘧啶耐药。表明该整合子导致重组菌E.Coli JM109产生了对氨基糖苷类、酰胺醇类和β-内酰胺类药物的耐药性。

序列表

<110> 贵州省水产研究所

<120> 一种含有多个耐药基因盒的中间气单胞菌整合子及其获取方法和应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8466

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 1

tgtcgttttc agaagacggc tgcactgaac gtcagaagcc gactgcacta tagcagcgga 60

ggggttggat ccatcaggca acgacgggct gctgccggcc atcagcggac gcagggagga 120

ctttccgcaa ccggccgttc gatgcggcac cgatggcctt cgcgcagggg tagtgaatcc 180

gccaggattg acttgcgctg ccctacctct cactagtgag gggcggcagc gcatcaagcg 240

gtgagcgcac tccggcaccg ccaactttca gcacatgcgt gtaaatcatc gtcgtagaga 300

cgtcggaatg gccgagcaga tcctgcacgg ttcgaatgtc gtaaccgctg cggagcaagg 360

ccgtcgcgaa cgagtggcgg agggtgtgcg gtgtggcggg cttcgtgatg cctgcttgtt 420

ctacggcacg tttgaaggcg cgctgaaagg tctggtcata catgtgatgg cgacgcacga 480

caccgctccg tggatcggtc gaatgcgtgt gctgcgcaaa aacccagaac cacggccagg 540

aatgcccggc gcgcggatac ttccgctcaa gggcgtcggg aagcgcaacg ccgctgcggc 600

cctcggcctg gtccttcagc caccatgccc gtgcacgcga cagctgctcg cgcaggctgg 660

gtgccaagct ctcgggtaac atcaaggccc gatccttgga gcccttgccc tcccgcacga 720

tgatcgtgcc gtgatcgaaa tccagatcct tgacccgcag ttgcaaaccc tcactgatcc 780

gcatgcccgt tccatacaga agctgggcga acaaacgatg ctcgccttcc agaaaaccga 840

ggatgcgaac cacttcatcc ggggtcagca ccaccggcaa gcgccgcgac ggccgaggtc 900

ttccgatctc ctgaagccag ggcagatccg tgcacagcac cttgccgtag aagaacagca 960

aggccgccaa tgcctgacga tgcgtggaga ccgaaacctt gcgctcgttc gccagccagg 1020

acagaaatgc ctcgacttcg ctgctgccca aggttgccgg gtgacgcaca ccgtggaaac 1080

ggatgaaggc acgaacccag ttgacataag cctgttcggt tcgtaaactg taatgcaagt 1140

agcgtatgcg ctcacgcaac tggtccagaa ccttgaccga acgcagcggt ggtaacggcg 1200

cagtggcggt tttcatggct tgttatgact gtttttttgt acagtctatg cctcgggcat 1260

ccaagcagca agcgcgttac gccgtgggtc gatgtttgat gttatggagc agcaacgatg 1320

ttacgcagca gggcagtcgc cctaaaacaa agttaggccc cgcaggggag agtcggcgct 1380

ttgaacttct tagcctgcgc agaaagttgt agttcccacg cctagcgccg cagttcctgg 1440

cagctcaccg cggatgcaac caacgctcac ccagtcaaat ggtagatatg gatcaccaga 1500

tcccctcaag gcatccacaa gaaaggttag gtatggatca aagtagtaag gaagtcagtt 1560

ctccagctac tgaccagttt gcgctcccat tccgcgccac gtttggcctg ggagatcgcg 1620

tacgcaagaa atctggcgcc gcttggcagg gtcaagttgt cggctggtac agcacaaaac 1680

taaccccaga aggctatgcc gtcgagtccg agtctcatcc gggctctgta caaatctatc 1740

ctgttgccgc gcttgaacgc gtggcctaac ccttccatcg agaggacgtc acaagggcta 1800

cgcccttgcg ccgcctctca tgtcaaacgt taggcagcac agagcgacca tttcatgtcc 1860

gcgagcaccc cccccataac tcttcgcctc atgaccgagc gcgacctgcc gatgctccat 1920

gattggctca accggccgca catcgttgag tggtggggtg gtgacgaaga gcgaccgact 1980

cttgatgaag tgctggaaca ctacctgccc agagcgatgg cggaagagtc cgtaacaccg 2040

tacatcgcaa tgctgggcga ggaaccgatc ggctatgctc agtcgtacgt cgcgctcgga 2100

agcggtgatg gctggtggga agatgaaact gatccaggag tgcgaggaat agaccagtct 2160

ctggctgacc cgacacagtt gaacaaaggc ctaggaacaa ggcttgtccg cgctctcgtt 2220

gaactactgt tctcggaccc caccgtgacg aagattcaga ccgacccgac tccgaacaac 2280

catcgagcca tacgctgcta tgagaaggca ggattcgtgc gggagaagat catcaccacg 2340

cctgacgggc cggcggttta catggttcaa acacgacaag ccttcgagag aaagcgcggt 2400

gttgcctaac aactcattca agccgacgcc gcttcgcggc gcggcttaat tcaggtgttg 2460

ggcgtcaagg aaaacttaat ggcaatccga atcttcgcaa tacttttctc cacttttgtt 2520

tttggcacgt tcgcgcatgc acaagaaggc atgcgcgaac gttctgactg gcggaagttt 2580

ttcagcgaat ttcaagccaa aggcacgata gttgtggcag acgaacgcca aacagatcgt 2640

gtcatattgg tttttgatca ggtgcggtca gagaaacgct actcgccggc ctcgacattc 2700

aagattccac atacactttt tgcacttgac gcaggcgctg cacgtgatga gtttcaagtt 2760

ttccgatggg acggcatcaa aagaagcttt gcagctcaca accaagacca agacttgcga 2820

tcagcaatgc ggaattctac tgtctggatt tatgagctat ttgcaaaaga gatcggtgaa 2880

gacaaggctc gacgctattt gaagcaaatc gactatggca acgccgatcc ttcgacaagt 2940

aatggcgatt actggataga tggcaatctt gctatcgcgg cacaagaaca gattgcattt 3000

ctcaggaagc tctatcataa cgagttgccc tttcgggtag aacatcagcg cttggtcaag 3060

gacctcatga ttgtggaagc cggtcgcaac tggatactgc gcgcaaagac gggctgggaa 3120

ggccgcatgg gttggtgggt aggatgggtt gagtggccga ctggccccgt attcttcgca 3180

ctgaatattg atacgccaaa caggatggat gaccttttca aaagggaggc aatagtgcgg 3240

gcaatccttc gctctatcga agcgttgccg cccaacccgg cagtcaactc ggacgcagcg 3300

cgataaagcc gcgcagcgcc ggttacttct acgttagacg gcaaagtcac agaccgcggg 3360

atctcttatg accaactact ttgatagccc cttcaaaggc aagctgcttt ctgagcaagt 3420

gaagaacccc aatatcaaag ttgggcggta cagctattac tctggctact atcatgggca 3480

ctcattcgat gactgcgcac ggtatctgtt tccggaccgt gatgacgttg ataagttgat 3540

catcggtagt ttctgctcta tcgggagtgg ggcttccttt atcatggctg gcaatcaggg 3600

gcatcggtac gactgggcat catctttccc gttcttttat atgcaggaag aacctgcatt 3660

ctcaagcgca ctcgatgcct tccaaaaagc aggtaatact gtcattggca atgacgtttg 3720

gatcggctct gaggcaatgg tcatgcccgg aatcaagatc gggcacggtg cggtgatagg 3780

cagccgctcg ttggtgacaa aagatgtgga gccttacgct atcgttggcg gcaatcccgc 3840

taagaagatt aagaaacgct tcaccgatga ggaaatttca ttgcttctgg agatggagtg 3900

gtggaattgg tcactggaga agatcaaagc ggcaatgccc atgctgtgct cgtctaatat 3960

tgttggcctg cacaagtatt ggctcgagtt tgccgtctaa caattcaatc aagccgatgc 4020

cgcttcgcgg cacggcttat ttcaggcgtt agatgcacta agcacataat tgctcacagc 4080

caaactatca ggtcaagtct gcttttatta tttttaagcg tgcataataa gccctacaca 4140

aattgggagt tagacatcat gagcaacgca gtgcccgccg agatttcggt acagctatca 4200

caggcactca acgtcatcga gcatcatctg gggtcgacgt tgctggccgt gcatttgtac 4260

ggctctgcac tcgacggtgg cctgaagcca tgcagtgata ttgatttgct ggttactgtg 4320

actgcacagc tcgatgagac tgtgcggcag gctctgttcg tagatttcct ggaagtttcc 4380

gcttctcccg gccaaagtga agctctccgt gccttggaag ttaccatcgt cgtgtacggc 4440

gatgttgttc cttggcgtta tccagccaga cgggaactgc aattcgggga gtggcagcgc 4500

aaggacattc ttgcgggcat cttcgagccc gcgacaaccg atgttgatct ggctattctg 4560

ctaactaaag caaggcaaca cagccttgcc ttggcaggtt cggccgcgga agatttcttc 4620

aacccagtcc cggaaagcga tctattcaaa gcactggccg acaccttgaa actatggaac 4680

tcacaaccgg attgggcagg cgacgagcgg aatgtagtgc ttaccttgtc tcgcatttgg 4740

tacagcgcag caaccggcaa gatcgcgccg aaggatgtag ctgccaactg ggtaatggaa 4800

cgcctgcccg tccaacatca gcccgtgctg cttgaagccc agcaggctta ccttggacaa 4860

gggatggatt gcttggcctc acgcgctgat cagttgactg cgttcattta ctttgtgaag 4920

cacgaagccg ccagtctgct cggctccacg ccaatgatgt ctaacagttc attagacggc 4980

aaagtcacag accgcgggat ctcttatgac caactacttt gatagcccct tcaaaggcaa 5040

gctgctttct gagcaagtga agaaccccaa tatcaaagtt gggcggtaca gctattactc 5100

tggctactat catgggcact cattcgatga ctgcgcacgg tatctgtttc cggaccgtga 5160

tgacgttgat aagttgatca tcggtagttt ctgctctatc gggagtgggg cttcctttat 5220

catggctggc aatcaggggc atcggtacga ctgggcatca tctttcccgt tcttttatat 5280

gcaggaagaa cctgcattct caagcgcact cgatgccttc caaaaagcag gtaatactgt 5340

cattggcaat gacgtttgga tcggctctga ggcaatggtc atgcccggaa tcaagatcgg 5400

gcacggtgcg gtgataggca gccgctcgtt ggtgacaaaa gatgtggagc cttacgctat 5460

cgttggcggc aatcccgcta agaagattaa gaaacgcttc accgatgagg aaatttcatt 5520

gcttctggag atggagtggt ggaattggtc actggagaag atcaaagcgg caatgcccat 5580

gctgtgctcg tctaatattg ttggcctgca caagtattgg ctcgagtttg ccgtctaaca 5640

attcaatcaa gccgatgccg cttcgcggca cggcttattt caggcgttag atgcactaag 5700

cacataattg ctcacagcca aactatcagg tcaagtctgc ttttattatt tttaagcgtg 5760

cataataagc cctacacaaa ttgggagtta gacatcatga gcaacgcagt gcccgccgag 5820

atttcggtac agctatcaca ggcactcaac gtcatcgagc atcatctggg atcgacgttg 5880

ctggccgtgc atttgtacgg ctctgcactc gacggtggcc tgaagccatg cagtgatatt 5940

gatttgctgg ttactgtgac tgcacagctc gatgagactg tgcggcaggc tctgttcgta 6000

gatttcctgg aagtttccgc ttctcccggc caaagtgaag ctctccgtgc cttggaagtt 6060

accatcgtcg tgtacggcga tgttgttcct tggcgttatc cagccagacg ggaactgcaa 6120

ttcggggagt ggcagcgcaa ggacattctt gcgggcatct tcgagcccgc gacaaccgat 6180

gttgatctgg ctattctgct aactaaagca aggcaacaca gccttgcctt ggcaggttcg 6240

gccgcggaag atttcttcaa cccagtcccg gaaagcgatc tattcaaagc actggccgac 6300

accttgaaac tatggaactc acaaccggat tgggcaggcg acgagcggaa tgtagtgctt 6360

accttgtctc gcatttggta cagcgcagca accggcaaga tcgcgccgaa ggatgtagct 6420

gccaactggg taatggaacg cctgcccgtc caacatcagc ccgtgctgct tgaagcccag 6480

caggcttacc ttggacaagg gatggattgc ttggcctcac gcgctgatga gttgactgcg 6540

ttcatttact ttgtgaagca cgaagccgcc agtctgctcg gctccacgcc aatgatgtct 6600

aacagttcat tcaagccgac gccgcttcgc ggcgcggctt aattcaggcg atatatcatg 6660

aaaggctggc tttttcttgt tatcgcaata gttggcgaag taatcgcaac atccgcatta 6720

aaatctagcg agggctttac taagcttgcc ccttccgccg ttgtcataat cggttatggc 6780

atcgcatttt attttctttc tctggttctg aaatccatcc ctgtcggtgt tgcttatgca 6840

gtctggtcgg gactcggcgt cgtcataatt acagccattg cctggttgct tcatgggcaa 6900

aagcttgatg cgtggggctt tgtaggtatg gggctcataa ttgctgcctt tttgctcgcc 6960

cgatccccat cgtggaagtc gctgcggagg ccgacgccat ggtgacggtg ttcggcattc 7020

tgaatctcac cgaggactcc ttcttcgatg agagccggcg gctagacccc gccggcgctg 7080

tcaccgcggc gatcgaaatg ctgcgagtcg gatcagacgt cgtggatgtc ggaccggccg 7140

ccagccatcc ggacgcgagg cctgtatcgc cggccgatga gatcagacgt attgcgccgc 7200

tcttagacgc cctgtccgat cagatgcacc gtgtttcaat cgacagcttc caaccggaaa 7260

cccagcgcta tgcgctcaag cgcggcgtgg gctacctgaa cgatatccaa ggatttcctg 7320

accctgcgct ctatcccgat attgctgagg cggactgcag gctggtggtt atgcactcag 7380

cgcagcggga tggcatcgcc acccgcaccg gtcaccttcg acccgaagac gcgctcgacg 7440

agattgtgcg gttcttcgag gcgcgggttt ccgccttgcg acggagcggg gtcgctgccg 7500

accggctcat cctcgatccg gggatgggat ttttcttgag ccccgcaccg gaaacatcgc 7560

tgcacgtgct gtcgaacctt caaaagctga agtcggcgtt ggggcttccg ctattggtct 7620

cggtgtcgcg gaaatccttc ttgggcgcca ccgttggcct tcctgtaaag gatctgggtc 7680

cagcgagcct tgcggcggaa cttcacgcga tcggcaatgg cgctgactac gtccgcaccc 7740

acgcgcctgg agatctgcga agcgcaatca ccttctcgga aaccctcgcg aaatttcgca 7800

gtcgcgacgc cagagaccga gggttagatc atgcctagca ttcaccttcc ggccgcccgc 7860

tagcggaccc tggtcaggtt ccgcgaaggt gggcgcagac atgctgggct cgtcaggatc 7920

aaactgcact atgaggcggc ggttcatacc gcgccagggg agcgaatgga cagcgaggag 7980

cctccgaacg ttcgggtcgc ctgctcgggt gatatcgacg aggttgtgcg gctgatgcac 8040

gacgctgcgg cgtggatgtc cgccaaggga acgcccgcct gggacgtcgc gcggatcgac 8100

cggacattcg cggagacctt cgtcctgaga tccgagctcc tagtcgcgag ttgcagcgac 8160

ggcatcgtcg gctgttgcac catgtcggcc gaggatcccg agttctggcc cgacgccctc 8220

aagggggagg ccgcatatct gcacaagctc gcggtgcgac ggacacatgc gggccggggt 8280

gtcagctccg cgctgatcga ggcttgccgc catgccgcgc gaacgcaggg gtgcgccaag 8340

ctgcggctcg actgccaccc gaacctgcgt ggcctatacg agcggctcgg attcacccac 8400

gtcgacactt tcaatcccgg ctgggatcca accttcatcg cagaacgcct agaactcgaa 8460

atctaa 8466

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 2

gccactgcgc cgttaccacc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 3

ggccgagcag atcctgcacg 20

<210> 4

<211> 1762

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 4

tgtcgttttc agaagacggc tgcactgaac gtcagaagcc gactgcacta tagcagcgga 60

ggggttggat ccatcaggca acgacgggct gctgccggcc atcagcggac gcagggagga 120

ctttccgcaa ccggccgttc gatgcggcac cgatggcctt cgcgcagggg tagtgaatcc 180

gccaggattg acttgcgctg ccctacctct cactagtgag gggcggcagc gcatcaagcg 240

gtgagcgcac tccggcaccg ccaactttca gcacatgcgt gtaaatcatc gtcgtagaga 300

cgtcggaatg gccgagcaga tcctgcacgg ttcgaatgtc gtaaccgctg cggagcaagg 360

ccgtcgcgaa cgagtggcgg agggtgtgcg gtgtggcggg cttcgtgatg cctgcttgtt 420

ctacggcacg tttgaaggcg cgctgaaagg tctggtcata catgtgatgg cgacgcacga 480

caccgctccg tggatcggtc gaatgcgtgt gctgcgcaaa aacccagaac cacggccagg 540

aatgcccggc gcgcggatac ttccgctcaa gggcgtcggg aagcgcaacg ccgctgcggc 600

cctcggcctg gtccttcagc caccatgccc gtgcacgcga cagctgctcg cgcaggctgg 660

gtgccaagct ctcgggtaac atcaaggccc gatccttgga gcccttgccc tcccgcacga 720

tgatcgtgcc gtgatcgaaa tccagatcct tgacccgcag ttgcaaaccc tcactgatcc 780

gcatgcccgt tccatacaga agctgggcga acaaacgatg ctcgccttcc agaaaaccga 840

ggatgcgaac cacttcatcc ggggtcagca ccaccggcaa gcgccgcgac ggccgaggtc 900

ttccgatctc ctgaagccag ggcagatccg tgcacagcac cttgccgtag aagaacagca 960

aggccgccaa tgcctgacga tgcgtggaga ccgaaacctt gcgctcgttc gccagccagg 1020

acagaaatgc ctcgacttcg ctgctgccca aggttgccgg gtgacgcaca ccgtggaaac 1080

ggatgaaggc acgaacccag ttgacataag cctgttcggt tcgtaaactg taatgcaagt 1140

agcgtatgcg ctcacgcaac tggtccagaa ccttgaccga acgcagcggt ggtaacggcg 1200

cagtggcggt tttcatggct tgttatgact gtttttttgt acagtctatg cctcgggcat 1260

ccaagcagca agcgcgttac gccgtgggtc gatgtttgat gttatggagc agcaacgatg 1320

ttacgcagca gggcagtcgc cctaaaacaa agttaggccc cgcaggggag agtcggcgct 1380

ttgaacttct tagcctgcgc agaaagttgt agttcccacg cctagcgccg cagttcctgg 1440

cagctcaccg cggatgcaac caacgctcac ccagtcaaat ggtagatatg gatcaccaga 1500

tcccctcaag gcatccacaa gaaaggttag gtatggatca aagtagtaag gaagtcagtt 1560

ctccagctac tgaccagttt gcgctcccat tccgcgccac gtttggcctg ggagatcgcg 1620

tacgcaagaa atctggcgcc gcttggcagg gtcaagttgt cggctggtac agcacaaaac 1680

taaccccaga aggctatgcc gtcgagtccg agtctcatcc gggctctgta caaatctatc 1740

ctgttgccgc gcttgaacgc gt 1762

<210> 5

<211> 1075

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 5

ggcctaaccc ttccatcgag aggacgtcac aagggctacg cccttgcgcc gcctctcatg 60

tcaaacgtta ggcagcacag agcgaccatt tcatgtccgc gagcaccccc cccataactc 120

ttcgcctcat gaccgagcgc gacctgccga tgctccatga ttggctcaac cggccgcaca 180

tcgttgagtg gtggggtggt gacgaagagc gaccgactct tgatgaagtg ctggaacact 240

acctgcccag agcgatggcg gaagagtccg taacaccgta catcgcaatg ctgggcgagg 300

aaccgatcgg ctatgctcag tcgtacgtcg cgctcggaag cggtgatggc tggtgggaag 360

atgaaactga tccaggagtg cgaggaatag accagtctct ggctgacccg acacagttga 420

acaaaggcct aggaacaagg cttgtccgcg ctctcgttga actactgttc tcggacccca 480

ccgtgacgaa gattcagacc gacccgactc cgaacaacca tcgagccata cgctgctatg 540

agaaggcagg attcgtgcgg gagaagatca tcaccacgcc tgacgggccg gcggtttaca 600

tggttcaaac acgacaagcc ttcgagagaa agcgcggtgt tgcctaacaa ctcattcaag 660

ccgacgccgc ttcgcggcgc ggcttaattc aggtgttggg cgtcaaggaa aacttaatgg 720

caatccgaat cttcgcaata cttttctcca cttttgtttt tggcacgttc gcgcatgcac 780

aagaaggcat gcgcgaacgt tctgactggc ggaagttttt cagcgaattt caagccaaag 840

gcacgatagt tgtggcagac gaacgccaaa cagatcgtgt catattggtt tttgatcagg 900

tgcggtcaga gaaacgctac tcgccggcct cgacattcaa gattccacat acactttttg 960

cacttgacgc aggcgctgca cgtgatgagt ttcaagtttt ccgatgggac ggcatcaaaa 1020

gaagctttgc agctcacaac caagaccaag acttgcgatc agcaatgcgg aattc 1075

<210> 6

<211> 1401

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 6

tactgtctgg atttatgagc tatttgcaaa agagatcggt gaagacaagg ctcgacgcta 60

tttgaagcaa atcgactatg gcaacgccga tccttcgaca agtaatggcg attactggat 120

agatggcaat cttgctatcg cggcacaaga acagattgca tttctcagga agctctatca 180

taacgagttg ccctttcggg tagaacatca gcgcttggtc aaggacctca tgattgtgga 240

agccggtcgc aactggatac tgcgcgcaaa gacgggctgg gaaggccgca tgggttggtg 300

ggtaggatgg gttgagtggc cgactggccc cgtattcttc gcactgaata ttgatacgcc 360

aaacaggatg gatgaccttt tcaaaaggga ggcaatagtg cgggcaatcc ttcgctctat 420

cgaagcgttg ccgcccaacc cggcagtcaa ctcggacgca gcgcgataaa gccgcgcagc 480

gccggttact tctacgttag acggcaaagt cacagaccgc gggatctctt atgaccaact 540

actttgatag ccccttcaaa ggcaagctgc tttctgagca agtgaagaac cccaatatca 600

aagttgggcg gtacagctat tactctggct actatcatgg gcactcattc gatgactgcg 660

cacggtatct gtttccggac cgtgatgacg ttgataagtt gatcatcggt agtttctgct 720

ctatcgggag tggggcttcc tttatcatgg ctggcaatca ggggcatcgg tacgactggg 780

catcatcttt cccgttcttt tatatgcagg aagaacctgc attctcaagc gcactcgatg 840

ccttccaaaa agcaggtaat actgtcattg gcaatgacgt ttggatcggc tctgaggcaa 900

tggtcatgcc cggaatcaag atcgggcacg gtgcggtgat aggcagccgc tcgttggtga 960

caaaagatgt ggagccttac gctatcgttg gcggcaatcc cgctaagaag attaagaaac 1020

gcttcaccga tgaggaaatt tcattgcttc tggagatgga gtggtggaat tggtcactgg 1080

agaagatcaa agcggcaatg cccatgctgt gctcgtctaa tattgttggc ctgcacaagt 1140

attggctcga gtttgccgtc taacaattca atcaagccga tgccgcttcg cggcacggct 1200

tatttcaggc gttagatgca ctaagcacat aattgctcac agccaaacta tcaggtcaag 1260

tctgctttta ttatttttaa gcgtgcataa taagccctac acaaattggg agttagacat 1320

catgagcaac gcagtgcccg ccgagatttc ggtacagcta tcacaggcac tcaacgtcat 1380

cgagcatcat ctggggtcga c 1401

<210> 7

<211> 2764

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 7

gttgctggcc gtgcatttgt acggctctgc actcgacggt ggcctgaagc catgcagtga 60

tattgatttg ctggttactg tgactgcaca gctcgatgag actgtgcggc aggctctgtt 120

cgtagatttc ctggaagttt ccgcttctcc cggccaaagt gaagctctcc gtgccttgga 180

agttaccatc gtcgtgtacg gcgatgttgt tccttggcgt tatccagcca gacgggaact 240

gcaattcggg gagtggcagc gcaaggacat tcttgcgggc atcttcgagc ccgcgacaac 300

cgatgttgat ctggctattc tgctaactaa agcaaggcaa cacagccttg ccttggcagg 360

ttcggccgcg gaagatttct tcaacccagt cccggaaagc gatctattca aagcactggc 420

cgacaccttg aaactatgga actcacaacc ggattgggca ggcgacgagc ggaatgtagt 480

gcttaccttg tctcgcattt ggtacagcgc agcaaccggc aagatcgcgc cgaaggatgt 540

agctgccaac tgggtaatgg aacgcctgcc cgtccaacat cagcccgtgc tgcttgaagc 600

ccagcaggct taccttggac aagggatgga ttgcttggcc tcacgcgctg atcagttgac 660

tgcgttcatt tactttgtga agcacgaagc cgccagtctg ctcggctcca cgccaatgat 720

gtctaacagt tcattagacg gcaaagtcac agaccgcggg atctcttatg accaactact 780

ttgatagccc cttcaaaggc aagctgcttt ctgagcaagt gaagaacccc aatatcaaag 840

ttgggcggta cagctattac tctggctact atcatgggca ctcattcgat gactgcgcac 900

ggtatctgtt tccggaccgt gatgacgttg ataagttgat catcggtagt ttctgctcta 960

tcgggagtgg ggcttccttt atcatggctg gcaatcaggg gcatcggtac gactgggcat 1020

catctttccc gttcttttat atgcaggaag aacctgcatt ctcaagcgca ctcgatgcct 1080

tccaaaaagc aggtaatact gtcattggca atgacgtttg gatcggctct gaggcaatgg 1140

tcatgcccgg aatcaagatc gggcacggtg cggtgatagg cagccgctcg ttggtgacaa 1200

aagatgtgga gccttacgct atcgttggcg gcaatcccgc taagaagatt aagaaacgct 1260

tcaccgatga ggaaatttca ttgcttctgg agatggagtg gtggaattgg tcactggaga 1320

agatcaaagc ggcaatgccc atgctgtgct cgtctaatat tgttggcctg cacaagtatt 1380

ggctcgagtt tgccgtctaa caattcaatc aagccgatgc cgcttcgcgg cacggcttat 1440

ttcaggcgtt agatgcacta agcacataat tgctcacagc caaactatca ggtcaagtct 1500

gcttttatta tttttaagcg tgcataataa gccctacaca aattgggagt tagacatcat 1560

gagcaacgca gtgcccgccg agatttcggt acagctatca caggcactca acgtcatcga 1620

gcatcatctg ggatcgacgt tgctggccgt gcatttgtac ggctctgcac tcgacggtgg 1680

cctgaagcca tgcagtgata ttgatttgct ggttactgtg actgcacagc tcgatgagac 1740

tgtgcggcag gctctgttcg tagatttcct ggaagtttcc gcttctcccg gccaaagtga 1800

agctctccgt gccttggaag ttaccatcgt cgtgtacggc gatgttgttc cttggcgtta 1860

tccagccaga cgggaactgc aattcgggga gtggcagcgc aaggacattc ttgcgggcat 1920

cttcgagccc gcgacaaccg atgttgatct ggctattctg ctaactaaag caaggcaaca 1980

cagccttgcc ttggcaggtt cggccgcgga agatttcttc aacccagtcc cggaaagcga 2040

tctattcaaa gcactggccg acaccttgaa actatggaac tcacaaccgg attgggcagg 2100

cgacgagcgg aatgtagtgc ttaccttgtc tcgcatttgg tacagcgcag caaccggcaa 2160

gatcgcgccg aaggatgtag ctgccaactg ggtaatggaa cgcctgcccg tccaacatca 2220

gcccgtgctg cttgaagccc agcaggctta ccttggacaa gggatggatt gcttggcctc 2280

acgcgctgat gagttgactg cgttcattta ctttgtgaag cacgaagccg ccagtctgct 2340

cggctccacg ccaatgatgt ctaacagttc attcaagccg acgccgcttc gcggcgcggc 2400

ttaattcagg cgatatatca tgaaaggctg gctttttctt gttatcgcaa tagttggcga 2460

agtaatcgca acatccgcat taaaatctag cgagggcttt actaagcttg ccccttccgc 2520

cgttgtcata atcggttatg gcatcgcatt ttattttctt tctctggttc tgaaatccat 2580

ccctgtcggt gttgcttatg cagtctggtc gggactcggc gtcgtcataa ttacagccat 2640

tgcctggttg cttcatgggc aaaagcttga tgcgtggggc tttgtaggta tggggctcat 2700

aattgctgcc tttttgctcg cccgatcccc atcgtggaag tcgctgcgga ggccgacgcc 2760

atgg 2764

<210> 8

<211> 1464

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 8

tgacggtgtt cggcattctg aatctcaccg aggactcctt cttcgatgag agccggcggc 60

tagaccccgc cggcgctgtc accgcggcga tcgaaatgct gcgagtcgga tcagacgtcg 120

tggatgtcgg accggccgcc agccatccgg acgcgaggcc tgtatcgccg gccgatgaga 180

tcagacgtat tgcgccgctc ttagacgccc tgtccgatca gatgcaccgt gtttcaatcg 240

acagcttcca accggaaacc cagcgctatg cgctcaagcg cggcgtgggc tacctgaacg 300

atatccaagg atttcctgac cctgcgctct atcccgatat tgctgaggcg gactgcaggc 360

tggtggttat gcactcagcg cagcgggatg gcatcgccac ccgcaccggt caccttcgac 420

ccgaagacgc gctcgacgag attgtgcggt tcttcgaggc gcgggtttcc gccttgcgac 480

ggagcggggt cgctgccgac cggctcatcc tcgatccggg gatgggattt ttcttgagcc 540

ccgcaccgga aacatcgctg cacgtgctgt cgaaccttca aaagctgaag tcggcgttgg 600

ggcttccgct attggtctcg gtgtcgcgga aatccttctt gggcgccacc gttggccttc 660

ctgtaaagga tctgggtcca gcgagccttg cggcggaact tcacgcgatc ggcaatggcg 720

ctgactacgt ccgcacccac gcgcctggag atctgcgaag cgcaatcacc ttctcggaaa 780

ccctcgcgaa atttcgcagt cgcgacgcca gagaccgagg gttagatcat gcctagcatt 840

caccttccgg ccgcccgcta gcggaccctg gtcaggttcc gcgaaggtgg gcgcagacat 900

gctgggctcg tcaggatcaa actgcactat gaggcggcgg ttcataccgc gccaggggag 960

cgaatggaca gcgaggagcc tccgaacgtt cgggtcgcct gctcgggtga tatcgacgag 1020

gttgtgcggc tgatgcacga cgctgcggcg tggatgtccg ccaagggaac gcccgcctgg 1080

gacgtcgcgc ggatcgaccg gacattcgcg gagaccttcg tcctgagatc cgagctccta 1140

gtcgcgagtt gcagcgacgg catcgtcggc tgttgcacca tgtcggccga ggatcccgag 1200

ttctggcccg acgccctcaa gggggaggcc gcatatctgc acaagctcgc ggtgcgacgg 1260

acacatgcgg gccggggtgt cagctccgcg ctgatcgagg cttgccgcca tgccgcgcga 1320

acgcaggggt gcgccaagct gcggctcgac tgccacccga acctgcgtgg cctatacgag 1380

cggctcggat tcacccacgt cgacactttc aatcccggct gggatccaac cttcatcgca 1440

gaacgcctag aactcgaaat ctaa 1464

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 9

ggtacctgtc gttttcagaa gacggctg 28

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 10

acgcgttcaa gcgcggcaac ag 22

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 11

acgcgtggcc taacccttcc atc 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 12

gaattccgca ttgctgatcg caag 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 13

gaattctact gtctggattt atg 23

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 14

gtcgacccca gatgatgctc gatg 24

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 15

gtcgacgttg ctggccgtgc a 21

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 16

ccatggcgtc ggcctccgca gc 22

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 17

ccatggtgac ggtgttcggc attc 24

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 18

gcggccgctt agatttcgag ttctaggcg 29

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 19

gcctgcgcag aaagttgtag 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 20

caccagccat caccgcttcc g 21

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 21

ggagaagatc aaagcggcaa tgc 23

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 22

ccagatcaac atcggttgtc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 23

ggcatgcgcg aacgttctga 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 24

aacccatcct acccaccaac 20

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 25

gttatcgcaa tagttggcga ag 22

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 26

tcagcaatat cgggatagag 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 27

ggcatgcgcg aacgttctga 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 中间气单胞菌(Aeromonas media)

<400> 28

aacccatcct acccaccaac 20

说明书核苷酸和氨基酸序列表

1

Claims (6)

1. 一种含有多个耐药基因盒的中间气单胞菌整合子，其特征在于：所述整合子序列如SEQ ID NO.1所示，所述整合子命名为InQST31。

2.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒中包含序列如SEQ ID NO.1所示的整合子。

3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒的制备过程中使用的载体质粒为pET32a（+）载体。

4.如权利要求2或3所述重组质粒的制备方法，其特征在于，具体操作步骤如下：

（1）InQST31的PCR扩增

根据如序列1所述整合子的特性，将该基因分为5个部分，分别命名为F1、F2、F3、F4和F5，以基因组为模版，采用PCR方法分别获得DNA片段F1、F2、F3、F4和F5，片段的序列依次为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，DNA片段F1的引物：SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；DNA片段F2的引物：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；DNA片段F3的引物：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；DNA片段F4的引物：SEQ ID NO.15和SEQID NO.16；DNA片段F5的引物：SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；

PCR的反应体系均为：PrimeSTAR HS DNA Polymerase：2 μl，5×PrimeSTAR Buffer：10μl，dNTP Mixture：4 μl，引物：1 μl，引物：1 μl，模板DNA：2 μl，无RNase水：30 μl；扩增条件为：94℃ 2 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 3 min，72℃ 10 min，16℃ 10 min ，30个循环；

（2）InQST31亚克隆的构建：

将步骤（1）中获得的片段F1、F2、F3、F4和F5和经过改造的平末端载体pSIMPLE-19 EcoRV/BAP Vector连接，并将连接产物转化入感受态E.coli HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F1、pSIMPLE19-F2、pSIMPLE19-F3、pSIMPLE19-F4和pSIMPLE19-F5；

（3）含有InQST31全长基因的重组克隆的构建：

用MluI和NotI酶切步骤（2）中获得的pSIMPLE19-F1和pSIMPLE19-F2，回收pSIMPLE19-F1的大片段和pSIMPLE19-F2的小片段，使用浓度为1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4 DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态E.coli HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F1-F2；

用Sal1和NotI酶切步骤（2）中获得的pSIMPLE19-F3和pSIMPLE19-F4，回收pSIMPLE19-F3的大片段和pSIMPLE19-F4的小片段，使用浓度为1% （w/v）琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4 DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态E.coli HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F3-F4；

用EcoRI和NotI酶切pSIMPLE19-F1-F2和pSIMPLE19-F3-F4，回收pSIMPLE19-F1-F2的大片段和pSIMPLE19-F3-F4的小片段，使用浓度为1% （w/v）琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4 DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态E.coli HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4；

用NcoI和NotI酶切pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4和pSIMPLE19-F5，回收pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4的大片段和pSIMPLE19-F5的小片段，使用浓度为1% （w/v）琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4 DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态E.coliHB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4-F5；

用KpnI和NotI酶切pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4-F5和pET32a（+），分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收经过酶切的pSIMPLE19-F1-F2-F3-F4-F5和经过酶切的pET32a（+），使用浓度为1% （w/v）琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4 DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态E.Coli JMI09，通过含有卡那霉素的平板选阳性克隆，获得包含如序列1所示整合子的权利要求２或３的重组质粒。

5.一种重组细菌，其特征在于：所述重组细菌中含有序列如SEQ ID NO.1所示的整合子。

6.权利要求5所述重组细菌的制备方法，其特征在于：该重组细菌是将序列如SEQ IDNO.1所示的整合子的重组质粒转入E.Coli JM109菌株中制备而成。

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