CN104531744A

CN104531744A - 整合子In0

Info

Publication number: CN104531744A
Application number: CN201510031022.9A
Authority: CN
Inventors: 王冬国; 梁海燕; 牟永华; 陈佳玉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2015-04-22

Abstract

本发明公开了一种新的整合子In0，其序列如SEQ ID NO.1所示。该整合子是在一种耐药大肠杆菌EC6335的基因组中发现的。因此本发明的上述整合子的发现一方面对从基因水平上探讨细菌耐药性转移的分子机制具有重要的理论和实践意义；另一方面为临床用药提供了一定的指导作用，有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。

Description

整合子In0

技术领域

本发明属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域，涉及一种新发现的与大肠杆菌耐药性密切相关的整合子In0。

背景技术

大肠杆菌是医学和兽医临床上最常见的病原菌之一，给人类的健康和畜牧业的发展造成了严重的损害。抗菌药在控制大肠杆菌感染方面发挥了重要作用，但随着抗菌药物的广泛应用，导致大肠杆菌耐药株尤其是多重耐药菌株不断出现，大肠杆菌的耐药问题已成为影响人类健康和养殖业发展的重要因素。

细菌耐药机制一整合子(integron)系统得到研究者们的广泛注意，并取得了很大的进展。细菌通过整合子系统，通过整合酶的作用，捕获外来的耐药基因，并在位于整合子上游启动子的作用下得到表达，使细菌具有耐药及多重耐药性，造成细菌多重耐药性的传播。在整合子介导细菌的耐药机制中，第一类整合子起着非常重要的作用。大部分的耐药基因水平传播都是由I类整合子介导的。因此调查研究大肠杆菌耐药性、扩增I型整合子基因检测I型整合子分子流行病学情况对从基因水平上探讨细菌耐药性转移的分子机制具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明提供了一种含有耐药基因盒的整合子，将其命名为In0，其序列如SEQID NO.1所示。该整合子含有bla_kpc-5基因盒。含有该整合子的菌株EC6335对多种抗生素药物具有抗性。这些抗生素包括：氨基糖苷类抗生素、β-内酰胺类抗生素。

常见的氨基糖苷类抗生素包括：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星。

常见的β内酰胺类抗生素包括：青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素。

本发明的整合子是通过以下方法获得的：

(1)在台州市立医院重症监护室病人脓液培养阳性的标本中分离出1株对头孢吡啶、亚胺培南耐药的细菌；

(2)然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法(补充药敏纸片)进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为大肠杆菌，将其命名为EC6335；同时，试验证实此菌株对多种抗生素有显著抗性；所述抗生素为氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素、头孢替坦、头孢唑林、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦(舒普深)；

(3)将EC6335菌株培养扩增，提取所述耐药菌株的质粒；

(4)扩增经步骤(3)获得的质粒上的DNA片段，测序；

(5)利用ContigExpress Program软件进行序列拼接，分析其结构，鉴定出序列如SEQ ID NO.1所示的序列。

进一步，步骤(4)的具体操作步骤如下：以步骤(3)获得的质粒为模板，利用表1中的引物进行DNA片段扩增：

表1 引物序列

将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收所有扩增出的片段，以常规方法将扩增片段分别与pMD19-T载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞E.coliTOP10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序。

分析SEQ ID NO.1所示的序列，发现该序列与传统的整合子的结构不同，SEQ ID NO.1中含有的基因盒位于整合子3’-CS序列的下游，而传统的基因盒位于整合子5’-CS和3’-CS序列中间。为了证明SEQ ID NO.1中的基因盒确实作为整合子的一部分随着整合子的转移而转移，本发明利用细菌质粒转导实验来证明SEQ ID NO.1是一个完整的整合子。具体操作如下：将EC6335菌株与E.coli J53AzR(对叠氮化钠耐药)菌株共培养，通过含叠氮化钠(300mg/L)和亚胺培南(2mg/L)平板筛选接合子，一方面提取接合子DNA，测序，验证SEQ ID NO.1作为一个整体存在；另一方面将接合子做药敏试验，证明受体菌拥有供体菌的抗性。其中，所用亚胺培南可用下列药物代替：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、厄他培南、庆大霉素、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、头孢哌酮/舒巴坦。

本发明的整合子序列可以商业合成。

本发明的优点和有益效果：

(1)本发明首次发现了序列为SEQ ID NO.1的整合子In0，该整合子的核苷酸序列在现有技术中未见报道。

(2)本发明整合子序列的发现，一方面对从基因水平上探讨细菌耐药性转移的分子机制具有重要的理论和实践意义；另一方面为临床用药提供了一定的指导作用，有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。

附图说明

图1为本发明的整合子In0的结构示意图。

具体的实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所描述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1整合子In0的鉴定

1、EC6335菌株的分离和鉴定

1.1材料

细菌药敏卡：法国bio Merieux的AST-GN13。AST-GN13药敏种类有：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、环丙沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、SMZ。

补充药敏纸片(药敏平板琼脂扩散实验)：纸片来源于英国Oxoid公司，有头孢哌酮/舒巴坦(75μg/30μg)。

1.2方法

仪器鉴定：将台州市立医院重症监护室病人脓液培养阳性的菌株转种到血平板上分离培养(在35℃含5％CO₂孵育箱中培养16-18h)，然后将分离的纯细菌按操作程序在VITEK 2上机作细菌鉴定与药敏试验。

补充药敏试验：将0.5麦氏单位的菌液涂抹在MH平板上，按操作程序贴上头孢哌酮/舒巴坦纸片，在35℃含5％CO₂孵育箱中培养16-18h后，按CLSI 2012标准鉴定药敏结果。

1.3结果

1.3.1仪器鉴定结果

经VITEK 2微生物分析仪鉴定为大肠杆菌，鉴定概率为99％，将其命名为EC6335。

1.3.2药敏实验结果

药敏实验结果表明，EC6335菌株对于以下药物产生抗性：氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素、头孢替坦、头孢唑林、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦(舒普深)。

2、整合子In0的获取和鉴定

2.1方法

2.1.1EC6335菌株的质粒提取

采用TaKaRa的质粒少量提取试剂盒，按照说明书操作步骤提取细菌质粒DNA，作为PCR模板，-20℃冰箱保存备用。

2.1.2整合子序列扩增

以上述提取的质粒为模板，利用表1中的引物进行DNA片段扩增。

2.1.3序列拼接

将上述扩增出的DNA片段利用ContigExpress Program软件进行序列拼接，分析结构，鉴定出序列如SEQ ID NO.1所示的整合子，其结构示意图如图1所示。

实施例2质粒转导实验研究整合子In0的功能

1、方法

(1)供体菌为EC6335菌株，受体菌为E.coli J53AzR(对叠氮化钠耐药)。将供体菌、受体菌分别接种于LB平板上，35℃过夜培养。挑取单个菌落分别接种于4mL的LB肉汤中，37℃220r/min摇菌培养至对数生长期。各取0.5ml供、受体菌于4ml的LB肉汤中，37℃静止过夜培养。接合子以胰大豆琼脂(TSA)平皿筛选，平板中含叠氮化钠(300mg/L)和亚胺培南(2mg/L)。置35℃孵育18-24h。提取耐药菌株的质粒(步骤同实施例1)为PCR扩增模板，使用表1中的引物检测整合子基因序列是否存在。

(2)选取包含上述基因片段的阳性菌株进行药敏实验，步骤同实施例1。

2、结果

测序结果显示，接合子中含有完整的整合子In0序列，序列信息如SEQ IDNO.1；药敏实验结果显示，整合子In0序列表达阳性菌株的药敏反应同EC6335菌株相同。上述实验结果表明整合子In0序列接合转移成功，且该整合子导致了接合细菌产生了对下列药物的抗性：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、头孢哌酮/舒巴坦。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种整合子，其特征在于，所述整合子序列如SEQ ID NO.1所示，所述整合子命名为In0。

2.一种接合细菌，其特征在于，所述接合细菌中含有权利要求1所述的整合子；所述接合细菌是由EC6335菌株与E.coli J53AzR菌株制备而成。

3.权利要求1所述的整合子的获取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)在台州市立医院重症监护室病人脓液培养阳性的标本中分离出1株对头孢吡啶、亚胺培南的细菌；

(2)将步骤(1)分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法，同时补充药敏纸片进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为大肠杆菌，命名为EC6335；

(3)将EC6335菌株培养扩增，提取所述EC6335菌株的质粒；

(4)扩增经步骤(3)获取的质粒上的DNA片段，测序；

(5)利用ContigExpress Program软件进行序列拼接，得到权利要求1所述的整合子的结构。

4.一种权利要求2所述的接合细菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操作步骤如下：将EC6335菌株与E.coli J53AzR菌株共培养，通过含有叠氮化钠和EC6335菌株耐受药物的平板筛选接合子。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述EC6335菌株耐受药物是亚胺培南。