CN104878037A

CN104878037A - 整合子In1085

Info

Publication number: CN104878037A
Application number: CN201510260575.1A
Authority: CN
Inventors: 王冬国; 陈佳玉; 陶宝鸿; 牟永华; 李海军
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-05-18
Filing date: 2015-05-18
Publication date: 2015-09-02

Abstract

本发明公开了一种新的整合子In1085，其序列如SEQ ID NO.1所示。该整合子是在一种耐药大肠杆菌Eco336的基因组中发现的。因此本发明的上述整合子的发现一方面对从基因水平上探讨细菌耐药性转移的分子机制具有重要的理论和实践意义；另一方面为临床用药提供了一定的指导作用，有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。

Description

整合子In1085

技术领域

本发明属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域，涉及一种新发现的与大肠埃希菌耐药性密切相关的整合子。

背景技术

大肠杆菌是医学和兽医临床上最常见的病原菌之一，给人类的健康和畜牧业的发展造成了严重的损害。抗菌药在控制大肠杆菌感染方面发挥了重要作用，但随着抗菌药物的广泛应用，导致大肠杆菌耐药株尤其是多重耐药菌株不断出现，大肠杆菌的耐药问题已成为影响人类健康和养殖业发展的重要因素。

整合子(integron)是一个能通过自身编码的整合酶识别、捕获、整合或剪切细胞外游离基因或基因片段，并使之转化为功能性基因的重组表达系统。整合子依据整合酶序列的不同可分成多种不同的类型。I类整合子至今发现在革兰阴性菌中广泛分布、检出率最多。I类整合子的基本结构由3部分组成，两端是高度保守序列，分别称作5’保守端(5’-CS)和3’保守端(3’-CS)，5’-CS长约1.4kb，3’-CS长约2kb，5’-CS和3’-CS之间的区域称作可变区，可变区由一个或多个基因盒组成，基因盒一般含抗菌药物耐药基因。整合子是一种可移动的基因元件，位于细菌的质粒或染色体上，可携带多个抗菌药物耐药基因，并能引起耐药基因的高效、快速转移，造成同种或不同菌种之间的扩散，从而表达对不同抗生素的多重耐药性。

临床抗菌药物大量应用是细菌整合子分子进化和捕获更多耐药基因的重要原因，故应加强抗菌药物的合理应用，以减少整合子发生、减少分子进化的外部诱导环境，延缓多药耐药菌株的发生。

发明内容

本发明提供了一种含有耐药基因盒的整合子，将其命名为In1085，其序列如SEQ ID NO.1所示。该整合子含有aacA4基因盒、bla_OXA-1基因盒、catB3基因盒、arr-3基因盒和dfrA27基因盒。上述整合子表达多种耐药基因，从而导致含有该整合子的菌种对多种抗生素药物具有耐药性。这些抗生素包括：氨基糖苷类抗生素、β内酰胺类抗生素、磺胺类抗生素、氯霉素类抗生素以及利福平类抗生素。

常见的氨基糖苷类抗生素包括：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星。

常见的β内酰胺类抗生素包括：青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素。

常见的磺胺类抗生素包括：磺胺异恶唑(SIZ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、柳氮磺吡啶(SASP)、磺胺米隆(SML)、磺胺嘧啶银、磺胺醋酰(SA)、以及复方新诺明(甲氧苄啶+磺胺甲恶唑)。

常见的氯霉素类抗生素包括：氯霉素、琥珀酸氯霉素。

常见的利福平类抗生素包括：利福平、利福喷汀。

本发明的整合子是通过以下方法获得的：

(1)在台州市立医院泌尿外科病人尿液培养阳性的标本中分离出1株对头孢曲松、阿米卡星、复方新诺明耐药的细菌。

(2)然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法(补充药敏纸片)进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为大肠埃希氏菌菌，将其命名为Eco336。同时，试验证实此菌株对多种抗生素有显著耐药性。

(3)将Eco336菌株培养扩增，提取所述耐药菌株的质粒。

(4)将步骤(3)提取纯化后的质粒使用BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离得到一段长度为5,668bp的DNA片段，将该DNA片段以常规方法与pMD19-T载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞E.coli TOP10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序。

本发明还提供了一种含有整合子In1085序列的重组质粒。所述质粒包含整合子In1085序列。在本发明的具体的实施方案中，所述重组质粒由整合子In1085序列和pET32a载体重组而成，整合子插入位点在pET32a载体上BamHI酶切位点处。所述重组质粒使用的空载体可以使用任何常见的质粒载体代替。所述重组质粒的方法也为本领域技术人员熟知的常规方法。

本发明还提供了一种含有整合子In1085的接合菌株。为了研究整合子的耐药性，本发明利用细菌质粒转导实验来检测鉴定整合子In1085的功能，将Eco336菌株与E.coli J53 Az^R(对叠氮化钠耐药)菌株共培养，通过含叠氮化钠(300mg/L)和阿米卡星(0.06mg/L)平板筛选接合子，将接合子做药敏试验，受体菌拥有供体菌的耐药性。其中，所用阿米卡星可用下列药物代替：氨曲南、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素、头孢替坦、头孢唑林、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦(舒普深)、复方新诺明。

本发明还提供了一种含有整合子In1085的重组菌株。为进一步证实上述接合菌株的抗性来源于Eco336菌株中的整合子，本发明将该整合子In1085克隆入pET32a载体中，整合子插入位点在pET32a载体上BamHI酶切位点处。并将其转化入野生型E.coli JM109中，通过含有Amp的平板选阳性克隆(含有pET32a-整合子的细菌)。将阳性克隆做药敏试验，结果显示Eco336菌株中的整合子In1085可以使重组E.coli JM109菌株对以下药物耐药：氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素、头孢替坦、头孢唑林、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦(舒普深)、复方新诺明、氯霉素。

本发明的优点和有益效果：

(1)本发明首次发现了序列为SEQ ID NO.1的包括多种耐药基因盒的整合子In1085，该整合子的核苷酸序列在现有技术中未见报道。

(2)本发明整合子序列的发现，为临床用药提供了一定的指导作用。有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。

附图说明

图1为本发明的整合子In1085的结构示意图。

具体的实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所描述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 整合子In1085的鉴定

1、Eco336菌株的分离和鉴定

1.1 材料

细菌药敏卡：法国bioMerieux的AST-GN13。AST-GN13药敏种类有：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、环丙沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、SMZ。

补充药敏纸片(药敏平板琼脂扩散实验)：纸片来源于英国Oxoid公司，有头孢哌酮/舒巴坦(75μg/30μg)、复方新诺明(30μg)、氯霉素(30μg)。

1.2 方法

仪器鉴定：将台州市立医院泌尿外科病人尿液培养阳性的菌株转种到血平板上分离培养(在35℃含5％CO₂孵育箱中培养16-18h)，然后将分离的纯细菌按操作程序在VITEK 2上机作细菌鉴定与药敏试验。

补充药敏试验：将0.5麦氏单位的菌液涂抹在MH平板上，按操作程序贴上头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明和氯霉素纸片，在35℃含5％CO₂孵育箱中培养16-18h后，按CLSI 2012标准鉴定药敏结果。

1.3 结果

1.3.1 仪器鉴定结果

经VITEK 2微生物分析仪鉴定为大肠杆菌，鉴定概率为99％，将其命名为Eco336。

1.3.2 药敏实验结果

药敏实验结果表明，Eco336菌株对于以下药物产生抗性：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、SMZ、头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明、氯霉素。

2、整合子In1085的分离和鉴定

2.1 方法

2.1.1 Eco336菌株的质粒提取

采用TaKaRa的质粒少量提取试剂盒，按照说明书操作步骤提取细菌质粒DNA，作为PCR模板，-20℃冰箱保存备用。

2.1.2 整合子的获取

(1)将清洁干燥并经灭菌的0.5ml eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入Eco336质粒DNA 1μg和10×限制性内切酶反应缓冲液2μl(Fermentas)，再加入重蒸水使总体积19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液(Fermentas)，用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。

(2)混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上(插在泡沫塑料板上)，37℃水浴保温2-3h，使酶切反应完全。

(3)每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应。

(4)将酶切后的产物经过琼脂糖凝胶电泳进行分离。

2.1.3 整合子的鉴定

(1)将经琼脂糖凝胶电泳分离得到的长度为5,668bp的DNA片段回收。

(2)使用常规方法，将步骤(1)回收的DNA片段与pMD19-T载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞E.coli TOP10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序。

2.2 结果

测序结果显示，长度为5,668bp的DNA片段属于I类整合子，该整合子包括I型整合子的基本结构和多个基因盒，序列如SEQ ID NO.1所示，结构示意图如图1所示。

实施例2 质粒转导实验研究整合子In1085的功能

1、方法

(1)供体菌为Eco336菌株，受体菌为E.coli J53 Az^R(对叠氮化钠耐药)。将供体菌、受体菌分别接种于LB平板上，35℃过夜培养。挑取单个菌落分别接种于4mL的LB肉汤中，37℃220r/min摇菌培养至对数生长期。各取0.5mL供、受体菌于4mL的LB肉汤中，37℃静止过夜培养。接合子以胰大豆琼脂(TSA)平皿筛选，平板中含叠氮化钠(300mg/L)和阿米沙星(0.03mg/L)。置35℃孵育18-24h。提取耐药菌株的质粒(步骤同实施例1)，以PCR法进行整合子In1085序列的检测。

扩增整合子In1085序列的引物如表1所示：

表1引物序列

PCR的反应体系(50μl)：Mg²⁺ 2.5mmol/L，引物30pmol/L，dNTP0.2mmol/L，2.5U Tap酶及2μl DNA模板。

扩增条件：

94℃预变性3min，然后94℃变性1min，50-59℃合适温度下退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延长至10min。

将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收所有扩增出的5,668bp片段，以常规方法将扩增片段分别与pMD19-T载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞E.coli TOP10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序。

(2)将阳性菌株进行药敏实验，步骤同实施例1。

1.2 结果

药敏实验结果显示，整合子In1085序列表达阳性菌株的药敏反应同Eco336菌株相同，代表整合子In1085序列接合转移成功，且该整合子导致了接合细菌产生了下列药物的耐药性：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、SMZ、头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明、氯霉素。

实施例3 基因重组实验研究整合子In1085的功能

1、方法

(1)将实施例2中的PCR产物(核苷酸序列为SEQ ID NO.1)与pMD18T载体连接，连接产物加入100μl E.coli JM109的感受态中转化，在含有IPTG、x-gal、Amp的平板上培养，将IPTG、x-gal、Amp耐药菌株提取质粒测序(步骤同实施例1)，检测整合子In1085是否插入基因组中。然后将整合子In1085序列克隆到pET32a载体中，整合子的插入位点在pET32a载体上BamHI酶切位点处，按照常规方法制备，得到含整合子In1085序列的pET32a重组质粒。将重组质粒转化到感受态E.coli JM109细胞中。

(2)对构建成功的克隆菌进行耐药性检测

采用法国bioMerieux的VITEK 2细菌鉴定及药敏分析系统和药敏平板琼脂扩散方法(补充药敏纸片)对重组菌E.coli JM109(pET32a-整合子In1085)进行耐药性检测。

2、结果

药敏实验结果显示，重组菌E.coli JM109(pET32a-整合子In1085)的药敏反应同Eco336菌株相同，代表整合子In1085序列已经成功整合到E.coli JM109的基因组中，且该整合子导致了重组菌E.coli JM109产生了下列药物的耐药性：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、SMZ、头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明、氯霉素。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种整合子，其特征在于，所述整合子序列如SEQ ID NO.1所示，所述整合子命名为In1085。

2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒中包含权利要求1所述的整合子。

3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的制备过程中使用的载体质粒为pET32a载体。

4.一种接合细菌，其特征在于，所述接合细菌中含有权利要求1所述的整合子；所述接合细菌是由Eco336菌株与E.coli J53 Az^R菌株制备。

5.一种重组细菌，其特征在于，所述重组细菌中含有权利要求1所述的整合子；所述重组细菌是将权利要求2或3所述的重组质粒转入E.coli JM109菌株中制备而成。

6.权利要求1所述的整合子的获取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)在台州市立医院泌尿外科病人尿液培养阳性的标本中分离出1株对阿米卡星、头孢吡啶、亚胺培南耐药的细菌；

(2)将步骤(1)分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法，同时补充药敏纸片进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为大肠埃希菌，命名为Eco336；

(3)将Eco336菌株培养扩增，提取所述Eco336菌株的质粒；

7.一种权利要求4所述的接合细菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操作步骤如下：将Eco336菌株与E.coli J53 Az^R菌株共培养，通过含有叠氮化钠和Eco336菌株耐受药物的平板筛选接合子。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述Eco336菌株耐受药物是阿米卡星。

9.一种权利要求5所述的重组细菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操作步骤如下：将整合子In1085克隆入pET32a载体中，然后将重组质粒转化入野生型E.coli JM109中，通过含有Amp的平板选阳性克隆。