PT501921E - Processo para a manipulacao genetica de mixobacterias - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A MANIPULAÇÃO GENÉTICA DE MIXOBACTÉRIAS" A presente invenção refere-se a um novo processo para manipulação genética de mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium, o qual permite pela primeira vez uma utilização precisa de técnicas recombinantes de DNA deste grupo de organismos.

Em especial a presente invenção refere-se a um processo para introdução de sequências de DNA de origem homóloga ou heteróloga ou uma combinação de sequências de DNA de origem homóloga ou heteróloga no cromossoma das ditas mixobactérias via recombinaçâo homóloga assim como mixobactérias modificadas genéticamente produzidas através deste processo.

Igualmente abrangido são moléculas de DNA, plasmídeos e vectores recombinantes, que são especialmente adaptadas para uma utilização no processo de acordo com a invenção, assim como mixobactérias modificadas geneticamente do grupo Sorangium/Polyangium contendo DNA exógeno de origem homóloga ou heteróloga.

As mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium tratam-se de organismos altamente especializados, que se podem encontrar frequentementè em amostras de terra, material vegetal morto ou em estrume de animal. Característico deste grupo de microrganismos é a sua capacidade de utilizar celulose ou produtos de decomposição contendo celulose como única fonte de C. -2- -2-

i. t.

Uma outra caractcrística deste gmpo é a sua capacidade para produzir meta-bolitos secundários altamente activos.

Hoje em dia estãodescritos numerosas estirpes deste grupo, que por exemplo são capazes de sintetizarem compostos microbicidas vegetais. De especial importância são os chamados Soraphene, compostos macrociclícos, que apresentam um espectro biocida favorável perante microrganismos fitopato-génicos, em especial no entanto perante fungos fitopatogénicos. Estes compostos possuem propriedades curativas, sistémicas e especialmente preventivas, muito vantajosas e são utilizadas na protecção de numerosas culturas de plantas [EP 0 358 606]. É conhecido também de outros representantes do grupo das mixobactérias, que são capazes de sintetizarem compostos altamente activos com potência antibiótica [Reichenbach et al (1988)]. Devido a importância destes compostos existe um grande interesse em compreender os fundamentos genéticos da sua síntese, de forma a criar a possibilidade de a poder eventualmente influenciar de forma precisa.

Condição prévia é dispor de um processo, que possibilite uma manipulação genética directa e preferencialmente de forma dirigida destes organismos utilizando técnicas de DNA recombinante, por exemplo através da inserção precisa de novos genes ou fragmentos de genes ou quaisquer sequências de DNA, incluindo plasmídeos completos, no genoma da mixobactérias. Processos para a transferência conjugativa de vectores mobilizáveis de E. coli em bactérias Gram-positivas, em especial Corynebactérias, são descritos em EP 0372 230.

Também representantes individuais do grupo das mixobactérias -3-

Al· h*.rfr C.—-J foram já objcctivo anterior de investigação neste sentido. O especial interesse era em primeira linha para com Myxococcus xanthus, uma mixobactéria entretanto já bastante bem investigada, para a qual foram já descritos diversos processos de transferência de genes. Assim por exemplo o colifago PI foi intensamente utilizado, primeiro para a introdução do transposão Tn5 no cromossona da Myxococcus xanthus [Kaiser (1984); Kuner e Kaiser (1981)] e posteriormente então para a retransferência dos genes clonados na Myxococcus xanthus para o hospedeiro original E. coli [0'Conner e Zusman (1983); Shimkets et al (1983)]. Um outro exemplo diz respeito à manipulação genética de Myxococcus xanthus via transdução (Shimkets e Asher, 1988).

Um outro processo para tranferência de genes consiste na utilização do plasmídeo RP4, o qual apresenta tuna grande quantidade de hospedeiros. Breton et al (1985) poderam demonstrar, que se pode transferir este plasmídeo via conjugação de E. coli para Myxococcus xanthus, e que é aí integrado estavelmente no cromossoma. Baseando-se nestas características Breton et al (1986) assim como Breton e Guespin-Michel (1987) conseguiram integrar genes estranhos no cromossoma de Myxococcus xanthus. Como se conclui das investigações de Jaoua et al (1987; 1989), a integração observada baseia-se com grande probabilidade numa denominada "recombinação específica de sítio". Esta é limitada a zonas determinadas, espacialmente restritas no cromossoma de Myxococcus xanthus e é facilitado para o plasmídeo RP4 através de um ou vários denominados "hot spots". Além disso demonstrou-se ao longo das investigações realizadas no âmbito da presente invenção, que o sistema Myxococcus aqui discutido, já conhecido, não é aplicável em bactérias do grupo Sorangium/Polyangium. Provavelmente nestes organismos estão ausentes os elementos estruturais específicos necessários para uma "recombinação específica de sítio" no seu cromossoma. Além disso descobriu-se, que nestes organismos também não se efectua uma transposição estável, por exemplo com a utilização do transposão Tn5. -4- C—J t-i O objectivo que se destinava a resolver no âmbito desta invenção dizia respeito assim em primeira linha em por à disposição um processo utilizável universalmente para manipulação genética de mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium, que esteja livre das limitações mencionadas anteriormente dos processos conhecidos e que permita assim a introdução não precisa ou então preferencialmente precisa de material genético em mixobactérias, independentemente de elementos estruturais pré-existentes no cromossoma da mixobactéria ou de acontecimentos de tranposição específicos.

Isto pode de acordo com a invenção por exemplo ser conseguido, construindo-se estruturas genéticas, em especial vectores plasmídeos, que devido à sua constituição específica podem ser inseridos em qualquer zona do cromossoma, e que não, como é o caso nos processos já conhecidos, são ligados a determinadas zonas de integração pré-existentes no genoma devido à organização funcional do cromossoma da mixobactéria ou do plasmídeo utilizado (‘hot spots') ou então que são dependentes de transposições de transposões integrados. A presente invenção diz respeito assim em primeira linha a um processo de manipulação genética de mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium, que se caracteriza por se introduzir material genético de origem homóloga ou heteróloga ou uma combinacao de material genético de origem homóloga assim como heteróloga na célula da mixobactéria e via recombinação homologa de forma aleatória ou então com conhecimento respectivo da organização estrutural e funcional do genoma bacteriano, integrar de forma precisa no cromosoma da mixobactéria referida num local exactamente definido devido à homologia presente entre o DNA introduzido e o próprio DNA da bactéria, independentemente de elementos estruturais pré-existentes no cromossoma da mixobactéria ou de acontecimentos de transposição específicos. -5-

-5- I O processo de acordo com a invenção de manipulação genética de mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium, é especialmente caracterizado por a) material genético de origem homóloga ou heteróloga ou uma combinação de material genético de origem homóloga assim como heteróloga, que é homólogo ou então pelo menos essencialmente homólogo a uma zona correspondente no cromossoma da mixobactéria; ou então b) material genético, o qual não contém naturalmente segmentos homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos a uma zona correspondente no cromossoma da mixobactéria, e o qual é por isso associado artificialmente com a ajuda de técnicas rDNA em si conhecidas com tais segmentos homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos, em que o material genético introduzido é flanqueado pelos ditos segmentos de DNA homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos ser introduzido na célula da mixobactéria e aí via recombinação homóloga é integrado num local exactamente definido no cromossoma da dita mixobactéria devido à homologia existente entre o DNA introduzido e o próprio DNA da bactéria. A integração do material genético no cromossoma da bactéria via recombinação homóloga é facilitada através de um ou vários segmentos de DNA no interior do DNA introduzido, que são homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos a um local correspondente no cromossoma da mixobactéria. Ela não está assim limitada a determinadas estruturas no cromossoma mas sim pode ocorrer em princípio em qualquer local do cromossoma bacteriano. M -6- η

Os segmentos de DNA homólogo utilizáveis no âmbito do processo de acordo com a invenção não necessitam assim de apresentar necessariamente uma identidade de 100% com os segmentos correspondentes no cromossoma da mixobatéria para poder causar o acontecimento de recombinação necessário. Pelo contrário é suficiente quando estes segmentos de DNA são essencialmente homólogos aos locais correspondentes do genoma bacteriano, ou seja quando estes apresentam um grau de homologia entre 80 e 100% e especialmente preferido entre 90 e 100 %.

Sob segmentos de DNA "homólogos" devem ser assim também compreendidos os segmentos que nao apresentam uma identidade de 100% ao local correspodente do cromossoma bacteriano, mas sao pelo menos "essencialmente hmólogos".

Os segmentos de DNA homólogos podem aqui ser isolados ou do próprio organismo alvo ou então de organismos aparentados, por exemplo após fragmentação do genoma respectivo. Com o conhecimento da sequência de DNA dos respectivos segmentos de DNA previstos para a integração no cromossoma da mixobactéria, podem ser produzidos os fragmentos respectivos de DNA, que são homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos a estes segmentos cormossomais, evidentemente também sintéticamente.

Os segmentos de DNA de origem homóloga utilizáveis no âmbito da presente invenção podem ser ou um segmento de DNA de sequência conhecida ou então de fragmentos de DNA obtidos aleatoriamente, por exemplo após digestão de restricção de DNA homólogo.

Após conhecimento da organização estrutural e funcional das zonas respectivas do genoma bacteriano o processo de acordo com a invenção abre assim pela primeira vez a possibilidade de uma modificação precisa, predizível do gene presente no genoma da Mixobactéria (modificação in situ), através de troca de genes, fragmentos de genes ou outras sequências de DNA uteis, naturais ou artificiais, modificados, com segmentos de DNA homólogo no interior do genoma bacteriano. Além disso o processo de acordo com a invenção possibilita uma identificação precsa da função de genes individuais no interior do genoma inteiro de Mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium através da inibição precisa de genes [‘gene disruption'] ou através de complementação de genes, que anteriormente foram inactivados através da utilização de outros processos, em especial de processos de mutação.

Juntamente com a modificação in situ precisa e desta forma muito eficiente de genes específicos das bactérias (mutagenese precisa), o processo de acordo com a invenção abre uma série de outras possibilidades de utilização , como por exemplo a inserção de cópias de genes adicionais em regiões com uma conhecida alta taxa de expressão assim como a eliminação e desta forma a inibição de genes indesejáveis. Para além disso pode-se também a partir de agora ter em consideração as seguintes possibilidades de utilização. - Inserção de promotores fortes ou reguláveis de genes próprios de bactérias com funções interessantes. - Clonagem de genes de diferentes origens em mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium. - Clonagem e expressão de genes de diferentes origens. - Retransferência de DNA introduzido num outro organismo como por exemplo em E. coli para trabalhos posteriores. - Utilização do DNA heterólogo de um vector utilizado primeiro como sonda radioactiva para reconhecimento dos fragmentos da mixobactéria na vizinhança do local de inserção e segundo como modelo ['template'] para uma amplificação no âmbito de uma "Polymerase Chain Reaction" ['PCR'].

Um outro objectivo da presente invenção refere-se a um processo para produçaõ de bactérias geneticamente modificadas do grupo

Sorangium/Polyangium, que se caracteriza por, (ai) material genético de origem homóloga ou heteróloga ou uma combinação de material genético de origem homóloga assim como heteróloga, que é homólogo ou então pelo menos essencialmente homólogo a uma zona correspondente no cromossoma da mixobactéria ou então (a2) material genético, o qual naturalmente não contém segmentos homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos a uma zona correspondente no cromossoma da mixobactéria e por isso é associado artificialmente com a ajuda de técnicas rDNA em si conhecidas com tais segmentos homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos, em que o material genético introduzido é flanqueado pelos ditos segmentos de DNA homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos, ser introduzido na célula da mixobactéria e aí via recombinação homóloga é integrado num local exactamente definido no cromossoma da dita mixobactéria devido à homologia existente entre o DNA introduzido e o próprio DNA da bactéria e -9-

At h*.rb

! I -Λ (b) transformantcs positivos sclcccionados com a ajuda dc processos de selecção em si conhecidos e cultivados como cultura pura. A presente invenção permite assim pela primeira vez uma manipulação genética precisa do genoma de mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium, em que a integração do material genético pode ser facilitado em dependência com a direcção alvo respectiva do procedimento planeado facultativamente ou através de segmentos de DNA homólogos de sequência conhecida ou então através de segmentos homólogos de sequência desconhecida escolhidos aleatoriamente.

Igualmente englobado pela presente invenção são as moléculas de DNA recombinantes, que devido à sua construcção específica são capazes de integrar material genético, como por exemplo genes ou fragmentos de genes ou outras sequências de DNA úteis, que eventualmente codificam para propriedades novas e desejadas, com a ajuda de recombinação homóloga de forma aleatória, ou então, através do conhecimento da organização estrutural e funcional do genoma bacteriano também de forma precisa em zonas exactamente definidas no interior do genoma bacteriano com base nas homologias entre o DNA inserido e o DNA da própria bactéria, assim como processos para produção das ditas moléculas de DNA recombinadas.

Além disso englobado pela presente invenção são mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium, modificadas geneticamente eventualmente com propriedades novas e/ou melhoradas, que foram produzidas através da introdução das ditas moléculas de DNA recombinadas. A presente invenção refere-se além disso à descendência das ditas mixobactérias modificadas assim como mutantes e variantes delas, que ainda contêm a dita molécula de DNA recombinada.

Na seguinte descrição são utilizados uma série de teimos, que são usuais na tecnologia de DNA recombinante, assim como na genética bacteriana.

De forma a permitir uma compreensão clara e uniforme da descrição e reivindicações, assim como da extensão que os ditos termos compreendem, são listadas as seguintes definições:

Genetst ou DNA de origem heteróloga: Uma sequência de DNA, que codifica para uma produto específico ou produtos ou desempanha uma função biológica e que tem origem numa outra espécie, na qual o dito gene é introduzido; a dita sequência de DNA é também designado como gene estranho ou DNA estranho ou como DNA exógeno.

Genefs) ou DNA de origem homóloga: Uma sequência de DNA, que codifica para um produto específico ou produtos ou desempanha uma função biológica e que tem origem na mesma espécie, na qual o dito gene é introduzido. Este DNA também é designado como DNA exógeno.

Homologia de DNA: Grau de concordância entre duas ou várias sequências de DNA.

Gene(s) ou DNA sintéticos: Uma sequência de DNA, que codifica para um produto específico ou produtos ou desempanha uma função biológica e que é produzido por uma via sintética.

Promotor: Uma sequência de controlo da expressão do DNA, que garante a transcrição de qualquer sequência de gene de DNA homólogo ou heterólogo numa célula hospedeira, contanto que a dita sequência de gene esteja associada com um tal promotor dc forma opcrável e este seja activo na dita célula hospedeira.

Sequência de terminação: Sequência de DNA no final de uma unidade de transcrição, que assinala o fim do processo de transcrição.

Promotor de sobreproducão (OPPi: Promotor que é capaz de numa célula hospedeira provocar a expressão de uma sequência(s) de gene funcional associados de forma operável numa dimensão (medido sob a forma de RNA ou da quantidade de polipéptidos), que é visivelmente mais elevada do que a observada naturalmente na célula hospedeira, que não tenha sido transformada com o dito OPP.

Região 375' não traduzida: Segmentos de DNA colocados acima ou abaixo das regiões codificadas, que são transcritas em mRNA, não são no entanto traduzidos num polipeptídeo. Esta região contém sequências regulatórias, como por exemplo o local de ligação dos ribossomas (5').

Vector de expressão de DNA: Veículo de clonagem, como por exemplo um plasmídeo ou um bacteriófago, que contém todas as sequências de sinais, que são necessários para a expressão de um DNA inserido numa célula hospedeira apropriada.

Vector de transferência de DNA: Veículo de clonagem, como por exemplo um plasmídeo ou um vector bacteriófago, que possibilita a introdução de material genético numa célula hospedeira apropriada.

Recombinação homóloga: Troca reciproca de bocados de DNA entre moléculas de DNA homólogas. -12-

Mutantes, variantes: Descendentes resultantes de um microrganismo espontânemente ou então artificialmente, sob utilização de medidas de processos conhecidos, como por exemplo tratamento com UV, tratamento com agentes mutagénicos, etc, que ainda evidenciam as características e propriedades essenciais da invenção da estirpe original, a qual os obteve devido à transformação com DNA exógeno.

No âmbito da presente inveção foi agora possível pela primeira vez, de por à disposição um processo, que possibilite preferencialmente uma manipulação genética precisa do genoma de Mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium ao integrar a partir de agora de uma forma precisa material genético aleatoriamente ou então com o respectivo conhecimento da organização estrutural e funcional do genoma bacterino, em zonas exactamente definidas, em parte determinadas previamente no interior do genoma bacteriano e que pode aí também ser expresso, independentemente dos elementos estruturais pré-existentes do cromossoma da mixobactéria ou de acontecimentos de transposição específicos. O processo de acordo com a invenção baseia-se essencialmente no reconhecimento que é possível inserir material genético exógeno com a ajuda de recombinação homóloga no genoma da mixobactéria, em que genes ou fragmentos de genes ou outras sequências de DNA incluindo plasmídeos inteiros naturais podem ser utilizados além disso os modificados artificialmente e/ou sintéticos, desde que contenham segmentos de DNA ou sejam flanqueados por tais segmentos de DNA, que apresentam uma homologia suficiente aos segmentos correspondentes no genoma da mixobactéria para uma recombinação .

Os segmentos de DNA homólogos utilizáveis seguindo o processo de acordo com a invenção não têm de apresentar aqui obrigatoriamente 100 % de identidade com os segmentos correspondentes no cromossoma da mixobactéria de forma a poder causar o processo de recombinação necessário. É pelo contrário suficiente, quando estes segmentos de DNA são essencialmente homólogos com as zonas correspondentes no genoma da bactéria, isto é, quando estes apresentam um grau de homologia entre 80 e 100 % e especialmente preferencial entre 90 e 100 %. O tamanho das ditas zonas homólogas pode variar, devia ser pelo menos 100 pb. Preferencialmente no âmbito desta invenção são zonas de homologia, que abrangem entre 0,3 Kb e 4 Kb, preferencialmente no entanto entre 1 Kb e 3 Kb.

Uma parte essencial da presente invenção constituem moléculas de DNA recombinantes, que devido à sua constracção específica possibilitam a inserção precisa de genes ou fragmentos de genes ou outras sequências de DNA interessantes, incluindo plasmídeos inteiros, no genoma de uma célula alvo com a ajuda de recombinação homóloga na forma previamente mencionada.

Em especial a presente invenção refere-se a moléculas de DNA recombinantes, que possibilitam uma integração precisa de material genético como por exemplo genes, fragmentos de genes ou outros fragmentos de DNA numa zona definida no interior do genoma de mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium e que se caracterizam por, elas conterem o DNA a ser integrado e por o dito DNA apresentar numa certa medida homologias às regiões de DNA correspondente no interior do genoma da mixobactéria ou então por ser flanqueado por tais sequências de DNA homólogo, que na transformação da célula da mixobactéria contendo as regiões de DNA homólogas ocorre uma integração não precisa ou então preferencialmente precisa do dito DNA a integrar -14-

numa zona exaclamente definida no interior do genoma da mixobactéria devido à homologia presente entre o DNA introduzido e o DNA próprio da bactéria via recombinação homóloga.

As ditas moléculas de DNA recombinantes podem ser facilmente produzidas, (a) ao isolar de uma origem apropriada, o DNA a integrar, que apresenta as propriedades mencionadas anteriormente, ou (b) contanto que o referido DNA a integrar não contenha naturalmente nenhuma homologia ou então pelo menos essencialmente segmentos homologos a uma zona correspondente no cromossoma da mixobactéria, este artificialmente com a ajuda de técnicas rDNA em si conhecidas associado com segmentos de DNA homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos, em que o material genético introduzido é flanqueado pelos ditos segmentos de DNA homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos,

Contanto que o DNA a ser integrado se trata de uma sequência de DNA expressável, é vantajoso quando este está associado de forma operacional com os sinais de expressão funcionais na célula bacteriana assim como eventualmente flanqueado por segmentos de DNA que apresentam homologias a uma determinada região no interior do genoma bacteriano. Estes segmentos de DNA homólogos, que flanqueam, encontram-se preferencialmente fundidos numa unidade como componente da molécula de DNA fechada. -15- v f/y. c

Este último pode não ser efectuado, contanto que as ditas sequências de DNA expressáveis apresentem por si próprias já uma suficientemente elevada homologia com as regiões de DNA correspondentes no interior do genoma bacteriano, de forma a que pode ocorrer uma troca directa desta sequência de DNA contra o dito DNA genómico homologo facilitada pela recombinação homóloga.

Juntamente com DNA de cadeia dupla também pode ser utilizado no processo de acordo com a invenção DNA em cadeia simples, assim como DNA parcialmente em cadeia simples.

Para a utilização do processo de acordo com a invenção interessam tanto genes ou sequências de DNA homólogos como também heterólogos assim como genes ou sequências de DNA sintéticos de acordo com as definições feitas na presente invenção.

As sequências de DNA a serem integradas podem aqui ser exclusivamente construídas por DNA genómico, por cDNA ou seja DNA sintético. Uma outra possibilidade consiste na construcção de sequências de DNA híbridas, constituídas tanto por cDNA como também por DNA genómico e/ou DNA sintético.

Neste caso o cDNA pode provir do mesmo gene ou segmento de DNA que o DNA genómico ou então, tanto o cDNA como também o DNA genómico podem provir de diferentes genes ou segmentos de DNA. Em qualquer caso podem ser no entanto produzidos tanto o DNA genómico e/ou o cDNA, cada um por si, do mesmo ou de diferentes genes ou segmentos de DNA. -16- /<: ? h V. * C__

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Quando a sequência de DNA compreende componentes de mais de um gene ou segmento de DNA, estes podem provir ou de um mesmo organismo, de vários organismos, de diferentes estirpes, ou variedades da mesma espécie ou diferentes espécies da mesma família, ou então de organismos que pertencem a mais de uma faília da mesma ou de outras unidade taxonómicas.

De forma a garantir a expressão de um gene estrutural na célula bacteriana, as sequências de genes codificadoras podem ser associadas eventualmente primeiro de forma operacional com as sequências de expressão funcionais da célula da mixobactéria.

As construções de genes híbridas expressáveis da presente invenção contêm assim em regra regai juntamente com o(s) gene(s) estrutural(is) também sinais de expressão, que compreendem tanto sequências de promotores e terminadores como também preferencialmente outras sequências reguladoras das regiões 3' e 5' não traduzidas.

Cada promotor e cada terminador, que tem a capacidade de provocar uma indução da expressão de uma sequência de DNA expressável em mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium, pode ser utilizado como componente da construção de gene híbrida.

Promotores, que interessam para uma utilização no processo de acordo com a invenção, são por exemplo: - Promotores induzíveis por luz de Myxococcus xaníhus [EP 310 619]; - Outros promotores de Myxococcus xanthus; -17-

Af- C~~d - Promotores de Actinomicetes, em especial de Streptomicetes; - Promotores de E. coli, como por exemplo o promotor Tac(hí-brido), promotor PL ou promotor Τφ.

Sequências terminadoras apropriadas, que encontram utilização no âmbito desta invenção, são por exemplo descritos em Rosenberg e Court (1979) assim como em Gentz et al (1981).. A unidade funcional assim formada constituída por um gene e por sinais de expressão activos nas células mixobacterianas, pode depois ser flaqueada eventualmente com um ou vários segmentos de DNA, que apresentam numa certa medida homologias às regiões de DNA correspondentes no interior do genoma da mixobactéria, que na transformação das ditas regiões homólogas contidas na célula mixobactéria se realiza uma integração aleatória ou então preferencialmente uma integração precisa da sequência de gene flanqueada por sequências de DNA homólogas numa zona definida no interior do genoma bacteriano devido à homologia entre o DNA introduzido e o DNA próprio da bactéria através de recombinação homóloga. Os segmentos de DNA homólogos que flanqueam, encontram-se preferencialmente fundidos numa unidade como componentes da molécula de DNA fechada.

Numa forma de execução preferida o DNA introduzido é integrado num plasmídeo, que ou já contém segmento de DNA homólogo ou então obtém este por clonagem numa altura posterior.

Caso devam ser integrados não apenas unicamente genes ou fragmentos de genes mas sim o plasmídeo de DNA inteiro, que pode conter o dito gene ou fragmento de gene, no genoma da mixobactéria, assim é suficiente clonar as ditas sequências de DNA homólogas numa zona qualquer do plasmideo de DNA, em que no entanto quanto seja possível devem ser mantidos funcionais os genes previstos para uma expressão. Também neste caso pode-se assim considerar que o DNA a ser integrado (plasmideo de DNA) está flanqueado em princípio por sequências de DNA homólogos, pois pode-se considerar que estes segmentos de DNA homólogos estão fundidos numa unidade no interior da molécula de DNA fechada em círculo.

Juntamente com genes estruturais podem também ser utilizados quaisquer outros genes desejáveis ou fragmentos de genes ou outras sequências de DNA úteis, como por exemplo locais de ligação de moléculas reguladoras, promotores, sequências de terminação, etc.

Através da escolha de sequências de DNA apropriadas de origem homóloga ou heteróloga, que apresentam suficientemente grande homologia com os segmentos correspondentes no interior do genoma bacteriano e assim possibilitam uma troca de material genético via recombinação homóloga, é assim possível agora pela primeira vez integrar genes ou outras sequências de DNA de uma forma precisa em zonas pré-determinadas do genoma da mixobactéria e aí eventualmente expressá-los. A extensão da homologia necessária para uma troca via recombinação homóloga entre os segmentos de DNA homólogos e a região de DNA genómicas correspondentes é dependente de diversos parâmetros e tem por isso de ser adaptada às necessidades correspondentes em dependência com as sequências de DNA utilizadas.

Preferencial no âmbito desta invenção é uma região homóloga, que se estende por uma zona de 0,3 a 4 Kb, preferencialmente no entanto por uma zona de 1 a 3 Kb.

Para a utilização como segmentos de DNA homólogos são no âmbito desta invenção em primeira linha apropriadas sequências de DNA de origem homóloga, que foram obtidas através de isolamento do DNA total da mixobactéria e posterior digestão com enzimas de restrição apropriadas.

Com o conhecimaneto da sequência de DNA dos ditos fragmentos de DNA homólogos estes podem também ser evidentemente produzidos sintéticamente.

Além disso podem também ser utilizados segmentos de DNA homólogos de origem heteróloga, que não foram directamente isolados do genoma do organismo alvo, mas sim por exemplo de organismos aparentados e que assim não demonstram necessáriamente 100 % de identidade com as regiões de DNA correspondentes no genoma do organismo alvo, mas sim só são essencialmente homólogos a este, ou seja, apresentam um grau de homologia entre 80 % e 100 % e especialmente preferido entre 90 % e 100 %.

Uma componente essencial da presente invenção é assim um processo para manipulação genética precisa de mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium que se caracteriza por se introduzir material genético de origem homóloga ou uma combinação de material genético de origem homóloga assim como heteróloga na célula da mixobactéria e aí via recombinação homóloga integrar de forma precisa numa zona exactamente definida no cromossoma da dita mixobactéria devido às homologias existentes.

No âmbito desta invenção é assim agora pela primeira vez possível η -20-

ι 1 t. atravcs da produção dc construções de genes híbridos correspondentes efectuar modificações precisas de genes próprios de bactérias no interior do genoma das mixobactérias na forma descrita anteriormente ou então inserir genes ou outros fragmentos de DNA adicionais no genoma das mixobactérias. Ocorre a integração no interior de um gene ou operão funcional, isso leva então em regra regai à inactivação dos mesmos e na sequência a um defeito fenotípico observável.

Em pormenor pode-se então proceder, transformando as células das mixobactérias com uma das moléculas de DNA recombinantes anteriormente descritas, em que os genes, construções de genes híbridas ou outros fragmentos de DNA contidos nas ditas moléculas de DNA recombinantes, são integradas através de recombinação homóloga numa zona definida e assim pré-determinada no genoma bacteriano de forma aleatória ou então preferencialmente de forma precisa devido às homologias existentes.

Numa forma de execução específica da presente invenção ocorre a introdução de material genético em mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium não dirigida, através de um organismo doador com capacidade de troca de informação semelhante à conjugação com o organismo alvo mixobactéria, do dador para o recipiente mixobactéria.

Para a produção de plasmídeos apropriados, os quais apresentam uma homologia suficiente com o cromossoma da mixobactéria para a integração via recombinação homóloga, pode-se por exemplo proceder, isolando primeiro o DNA total da mixobactéria e fragmentando este posteriormente. Esta fragmentação pode ser realizada ou mecanicamente através da acção de forças de corte ou então preferencialmente através da utilização de enzimas de restrição apropriadas.

Da multiplicidade dos fragmentos obtidos podem ser então aqqueles com tamanho apropriado e posteriormente clonado num plasmídeo apropriado. A ligação dos fragmentos de DNA homólogos assim como de fragmentos de DNA de origem homóloga e heteróloga num vector de clonagem apropriado ocorre com a ajuda de métodos padrão como por exemplo são descritos em Maniatis et al, 1982.

Em regra regai o vector e a sequência de DNA a ser integrada são então primeiro cortados com enzimas de restrição apropriadas. Enzimas de restrição apropriadas são por exemplo aquelas com que se obtém fragmentos com extremidades lineares, como por exemplo Smal, Hpal e EcoRV, ou então enzimas que formam extremidades coesivas, como por exemplo EcoRI, Saci, BamHI, Sall, Pvul, etc.

Tanto os fragmentos com extremidades lineares como também aqueles com extremidades coesivas, que são entre si complementares, podem ser associados com a ajuda de ligases de DNA apropriadas outra vez numa molécula de DNA contínua uniforme.

Extremidades lineares podem também ser produzidas através do tratamento de fragmentos de DNA, que apresentam extremidades coesivas sobressaídas, com o fragmento de Klenow da DNA polimerase de E. coli através de preenchimento das lacunas com os correspondentes nucleotidos complementares.

Por outro lado as extremidades coesivas podem também ser produzidas sinteticamente, por exemplo através do acrescento de caudas homopolimeras complementares nas extremidades da sequência de DNA desejada assim como da molécula vector cortada através da utilização de uma transferase-deoxinucleotidilo terminal ou então através do acrescento de sequências de oligonucleotidos sintétios (Linker), que trazem um local de corte de restrição e posterior corte com a enzima correspondente.

Fundamentalmente pode-se utilizar para a produção e multiplicação das contrações anteriormente descritas, que contêm fragmentos de DNA homólogos ou então uma combinação de fragmentos de DNA de origem homóloga e heteróloga, todos os vectores de clonagem usuais, como por exemplo vectores plasmídeos ou vectores bacteriófagos, desde que apresentem as sequências de replicação e de controlo, que provêm de espécies que são compatíveis com a célula hospedeira. O vector de clonagem traz em geral uma origem de replicação, além disso genes específicos, que levam a características de seleção fenotípica na célula hospedeira transformada, em especial a resistências contra antibióticos. Os vectores transformados podem ser seleccionados com base nestes marcadores fenotípicos após uma transformação numa célula hospedeira.

Marcadores fenotípicos seleccionáveis, que encontram utilização no âmbito desta invenção, compreendem por exemplo, sem que isto imponha uma limitação do objecto da invenção, resistências contra ampicilina, tetra-ciclinas, cloroamfenicol, higromicina, G418, canamicina, neomicina e bleomi-cina. Uma prototrofia para determinados amino ácidos pode por exemplo desempenhar a função como outros marcadores seleccionáveis.

Preferido no âmbito da presente invenção são em primeira linha plasmídeos de E. coli, como por exemplo o plasmídeo pSUP2021 utilizado no âmbito da presente invenção.

Como células hospedeiras para a clonagem descrita anteriormente interessam no âmbito desta invenção em primeira linha procarióticas, incluindo hospedeiros bacterianos, como por exemplo A. tumefaciens, E. coli, S. typhimurium e Serratia marcescens, além disso pseudomonados, actinomicetes, salmonelas assim como a própria mixobactéria.

Especialmente preferido são os hospedeiros E. coli, como por exemplo a estirpe E. coli HB101. Células competentes da estirpe E. coli HB101 são produzidas então com a ajuda dos processos utilizados usualmente para a transformação de E. coli [ver: "Allgemeine recombinante DNA Techniken" (técnicas gerais de recombinação de DNA)].

Após transformação e posterior incubação num meio apropriado, as colónias resultantes são submetidas a um varrimento diferencial através de plaqueamento em meios selectivos. Posteriormente pode então ser isolado daquelas colónias que contêm plasmídeo com fragmentos de DNA clonados, o plasmídeo de DNA correspondente.

Desta forma obtém-se plasmídeos recombinantes de diferentes tamanhos. Após a análise de restrição podem então ser escolhidos os plasmídeo com tamanho apropriado para a subsequente introdução do plasmídeo de DNA na célula da mixobactéria. Esta transferência de DNA pode ocorrer ou directa-mente ou então preferencialmente através de um hospedeiro intermédio (célula doadora) com capacidade de troca de informação semelhante à conjugação com o organismo alvo mixobactéria no âmbito de uma transferência conjugal.

Uma componente essencial da presente invenção refere-se assim à construção de plasmídeos, que juntamente com segmentos homólogos também podem conter uma ou várias construções de genes, constituídos por um ou vários genes estruturais ou outros genes ou fragmentos de genes desejados, que eventualmente estão associados de forma operacional com os sinais de expressão funcionais na célula bacteriana, ou outras sequências de DNA úteis. Os fragmentos de DNA homólogos podem ou ser constituídos inteiramente por segmentos genómico da própria bactéria (mixobactéria do grupo Sorangium/Polyangium) e assim ser completamente de origem homóloga ou então eles podem também conter juntamente com segmentos homólogos porções mais ou menos pronunciadas de origem heteróloga. Também é concebível a utilização de segmentos de DNA homólogos de origem inteiramente heteróloga.

Num passo posterior do processo estes plasmídeos podem ser utilizados, para introduzir na célula da mixobactéria a construção genética descrita anteriormente, que eventualmente contém um gene estrutural, o qual codifica para um produto genético desejado e para aí integrar no genoma bacteriano. A transferência das construções genéticas de acordo com o pedido de patente na mixobactéria pode ocorrer de maneiras diferentes. Preferido no âmbito desta invenção é a transferência conjugal de uma célula doadora com capacidade de troca de informação semelhante à conjugação com o organismo alvo mixobactéria, no recipiente mixobactéria.

No âmbito desta transferência conjugal o DNA a ser transferido pode ser ou primeiro, como anteriormente descrito, clonado num vector de clonagem utilizado usualmente e subsequentemente transformado num hospedeiro intermédio apropriado, que desempanha a função de célula doadora. 0 desvio por um hospedeiro intermédio pode ser evitado, quando se utiliza uma estirpe de hospedeiro, que é apropriada tanto para a clonagem de DNA como também para a utilização como célula doadora no âmbito da conjugação.

Hospedeiros intermédios, que no âmbito desta invenção podem encontrar utilização como células doadoras, são essencialmente células procarióticas escolhidas do grupo constituído por E. coli, pseudomonados, actinomicetes, salmonelas assim como a própria mixobactéria.

Condição prévia para a transferência conjugal com plasmídeo de DNA de uma célula doadora para um recipiente é a existência de funções de transferência (tra) e de mobilização (mob). Aqui a função de mobilização tem de conter pelo menos a origem de transferência (oriT) e estar no plasmídeo a transferir. Pelo contrário a função de transferência (tra) pode estar localizada ou no plasmídeo ou num plasmídeo ajudante ou então encontrar-se integrado no cromossoma da célula doadora.

Plasmídeos, que cumprem as condições prévias anteriormente descritas e por isso são preferenciais no âmbito desta invenção, pertencem essencialmente ao grupo de incompatibilidade P, Q, T, N, W e Coli. O protótipo dos plasmídeos do grupo P é o plasmídeo RP4. Especialmente preferido no âmbito desta invenção é o plasmídeo pSUP2021, o qual contém um fragmento de 1,9 Kb do plasmídeo RP4, que apresenta como componente da função mob (RP4mob) a origem de transferência (oriT). Outros plasmídeos com a função mob (RP4mob), como por exemplo pSUPlOl, pSUP301, pSUP401, pSUP202, pSUP203 ou pSUP205 assim como os derivados daí resultantes [Simon et al (1988)], também podem ser utilizados no âmbito do processo de acordo com a invenção. i -26-

I —

No decurso das experiências realizadas no âmbito desta invenção mostrou-se que é vantajoso, quando no decurso da transferência conjugal o recipiente mixobactéria é submetida antes da incubação com a estirpe doadora a um curto tratamento de calor. Preferido é uma pré-incubação com uma duração de um a 120 minutos, em especial no entanto de 5 a 20 minutos das células recipientes a uma temperatura de 35° C a 60° C, preferencialmente a uma temperatura de 42° C a 55° C e especialmente preferido a uma temperatura de 48° C a 52° C.

Numa forma de execução preferencial da presente invenção é utilizada uma estirpe doadora de E. coli, que contém o gene transferência (tra) do plasmídeo RP4 incorporado no DNA cromossómico. Preferido no âmbito desta invenção é a estirpe doadora de E.coli W3101 (pME305) que contém o plasmídeo ajudante pME305, o qual tem a função de transferência (tra) de RP4.

Especialmente interessante do ponto de vista técnico do processo e assim especialmente preferido no âmbito desta invenção são estirpes de bactérias, que são apropriadas tanto como hospedeiros para a clonagem de vectores com sequências de DNA integradas como também para a utilização como células doadoras no âmbito da transferência conjugal. Também especialmente preferido são estirpes de bactérias, que são restrição negativas, e assim não decompõem o DNA estranho introduzido. Ambos os critérios anteriormente mencionados são cumpridos de forma ideal pela estirpe de E.coli ED8767 (pUZ8), a qual é mencionado nesta parte apenas só como representante para outras estirpes de bactérias apropriadas e a sua menção não deve ser de qualquer forma limitante.

Juntamente com a transferência de genes conjugal anteriormente descrita de uma célula doadora para um recipiente Mixobactéria, outros processos apropriados de transferência de genes podem evidentemente encontrar utilização para introdução de material genético em mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium. De mencionar aqui seria em primeira linha a transferência de genes via electroporação, no âmbito da qual as células das mixobactérias são expostas durante um curto período de tempo a elevados campos eléctricos [Kuspa e Kaiser (1989)]. As condições básicas gerais para a electroporação de células procarióticas são descritas em detalhe em US-P4,910,140.

Exemplos de execução não limitantes

Técnicas gerais de recombinacão de DNA

Dado muitas das técnicas de recombinação de DNA utilizadas nesta invenção serem rotina para o especialista, será dada uma pequena descrição destas técnicas usualmente utilizáveis. Todos estes processos estão descritos na referência de Maniatis et al (1982), a não ser que seja especificamente referido. A. Cortar com endonucleases de restrição

Tipicamente estão contidos aproximadamente 50 a 500 pg/ml DNA numa mistura de reacção, na solução tampão aconselhada pelo fabricante, em primeira linha New England Biolabs, Beverly, MA. e Bõhringer, Mannheim (BRD). 2 a 5 unidades de endonucleases de restrição são adicionadas a cada pg de DNA e a mistura reaccional é incubado à temperatura aconselhada pelo fabricante durante uma a três horas. A reacção é parada com o aquecimento durante 10 minutos a 65°C ou através de extração com fenol, seguido de precipitação do DNA com etanol. Esta técnica é descrita nas páginas 104 a 106 da referência Maniatis et al (1982).

-28- Β. Tratamento do DNA com polimerase, de forma a dar origem a extremidades lineares 50 a 500 pg/ml de fragmentos de DNA são adicionados a uma mistura reaccional no tampão aconselhado pelo fabricante, em primeira linha New England Biolabs, Beverly, MA. e Bõhringer, Mannheim (BRD). A mistura reaccional contém todos os quatro desoxinucleotideofosfatos numa concentração de 0,2 mM. A reação efectua-se durante 30 minutos a 15°C e é então parada com o aquecimento durante 10 minutos a 65°C. Para fragmentos que são obtidos através do corte com endonucleases de restrição, que dão origem a extremidades 5' sobressaídas, como EcoRI e BamHI, é utilizado o fragmento grande, ou fragmento de Klenow, da polimerase de DNA. Para fragmentos que são obtidos através de endonucleases, que dão origem a extremidades 3' sobressaídas, como PstI e Saci, é utilizada a polimerase de DNA T4. A utilização destas duas enzimas é descrita nas páginas 113 a 121 da referência Maniatis et al (1982). C. Electroforese em gel de agarose e purificação dos fragmentos de DNA do gel A electroforese em gel de agarose é realizada num sistema horizontal, como descrito nas páginas 150 a 163 da referência Maniatis et al. O tampão utilizado é o tampão tris-acetato aí descrito. Os fragmentos de DNA são corados com 0,5 gg/ml de brometo de etidium, que se encontra presente ou no tampão do gel ou do tabuleiro durante a electroforese ou é adicionado após a electroforese. O DNA é tomado visível através de iluminação com luz ultravioleta de onda comprida. -29-

Quando os fragmentos devem ser separados do gel, é utilizada uma agarose, que gelifíca a temperaturas mais baixas e pode ser comprada à Sigma Chemical, St. Louis, Missouri. Após a electroforese o fragmento desejado é recortado, colocado em tubos de plástico, aquecido durante aproximadamente 15 minutos a 65°C, extraído três vezes com fenol e precipitado duas vezes com etanol. Este processo está ligeiramente modificado em relação ao descrito por Maniatis et al (1982) na página 170.

Como alternativa o DNA pode ser isolado da agarose com a ajuda do Geneclean Kits (Bio 101 Inc., La Jolla, CA, USA). D. Adicionamento de fragmentos linker sintéticos nas extremidades

do DNA

Quando é desejável acrescentar um novo local de corte de endonucleases na extremidade de uma molécula de DNA, a molécula é eventualmente primeiro tratada com polímerase de DNA para dar origem a extremidades lineares, como é descrito no parágrafo anterior. Aproximadamente 0,1 a 1,0 pg deste fragmento é adicionado a aproximadamente 10 ng linker-DNA fosforilizado, que foi comprado à New England Biolabs, num volume de 20 a 30 μΐ com 2 μΐ de T4 DNA-ligase de New England Biolabs, e 1 mM ATP no tampão aconselhado pelo fabricante.

Após a incubação durante a noite a 15°C a reação é parada através de aquecimento durante 10 minutos. A mistura reaccional é diluída a aproximadamente 100 μΐ num tampão, que é apropriado para a endonuclease de restrição, que corta a sequência Linker sintética. São adicionados mais ou menos 50 a 200 unidades desta endonuclease. A mistura é incubada durante 2 a 6 horas a temperatura adaptada, depois o fragmento é sujeito a uma electroforese em gel de agarose e purificado como acima descrito. 0 fragmento resultante terá então extremidades com remates, as quais foram originadas através do corte com a endonuclease de restrição. Estas extremidades são normalmente coesivas, de forma que o fragmento resultante pode agora ser facilmente associada a outros fragmentos com as mesmas extremidades coesivas.

E. Remoção dos fosfatos 5' dos fragmentos de DNA

Durante os passos de clonagem do plasmídeo o tratamento do vector plasmídeo com fosfatases diminui a recirculação do vector (discutido na página 13 da referência Maniatis et al). Após corte do DNA com as endonucleases de restrição apropriadas é adicionado uma unidade de fosfatase alcalina do intestino de bezerro, que foi comprada à Bõhringer-Mannheim, Mannheim. O DNA é incubado durante 1 hora a 37°C e posteriormente extraído duas vezes com fenol e precipitado com etanol.

F. Associação dos fragmentos de DNA

Quando fragmentos com extremidades coesivas complementares devem ser associados uns com os outros, são incubados aproximadamente 100 ng de cada fragmento numa mistura reaccional de 20 a 40 μΐ com aproximadamente 0,2 unidades de T4 DNA-ligase de New England Biolabs no tampão aconselhado pelo fabricante. A incubação é realizada durante 1 a 20 horas a 15°C. Quando se quer associar fragmentos de DNA com extremidades lineares, eles são incubados como anteriormente, com excepção, que a quantidade de T4 DNA-ligase é elevada para 2 a 4 unidades. -3!- G. A transformação do DNA em E. coli

As estirpes de E. coli HB101, W3101 e ED8767 são utilizados na maioria das experiências. O DNA é introduzido com o processo de cloreto de cálcio como é descrito por Maniatis et al (1982), páginas 250 a 251, em E. coli. H. Varrimento de plasmídeos em E. coli

Após a transformação as colónias resultantes de E. coli são testadas sobre a presença dos plasmídeos desejados através de um rápido processo de isolação de plasmídeo. Dois processos usuais são descritos nas páginas 366 a 369 da referência Maniatis et al (1982). I. Isolamento do plasmídeo de DNA em grande escala

Processos para isolamento de plasmídeos de E. coli em grande escala são descritos nas páginas 88 a 94 da referência Maniatis et al (1982).

Exemplos:

Exemplo 1: Condições de cultivo para Soranmum

Sorangium cellulosum é cultivada num meio líquido G51b [ver secção "meios e tampão"] a uma temperatura de 30°C. As culturas são arejadas através de agitação a 180 rpm. Como meio alternativo pode ser utilizado o meio G52c.

Para o cultivo em meios sólidos pode ser utilizado o meio SolE descrito no secção "meios e tampão". A temperatura de incubação compreende também neste caso 30°C. -32-

Exemplo 2: Condições de cultivo para E. coli Células de E. coli são cultivadas num meio LB [Miller (1972)] a uma temperatura de 37°C.

Exemplo 3: Produção de um mutante espontâneo resistente à estreptomicina de Soraneium cellulosum

200 μΐ de uma cultura de três dias de Sorangium cellulosum [estirpe selvagem So ce 26], que foi criada num meio líquido, são plaqueados num meio sólido [meio SolE], à qual se adicionou 300 pg/ml estreptomicina. O tempo de incubação compreende 14 dias a uma temperatura de 30°C. As colónias que crescem neste meio tratam-se de mutantes espontâneos resistentes à estreptomicina, que são cultivadas outra vez no mesmo meio (com estreptomicina) para concentração adicional e purificação.

Uma destas colónias resistentes à estreptomicina é escolhida e

obtém a designação SJ3. Uma amostra deste mutante Sorangium cellulosum da estirpe So ce 26 foi depositada a 25.01.1991 em "Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" (colecção alemã de microrganismos e culturas celulares) [Braunschweig, BRD] reconhecida de acordo com as determinações da convenção de Budapeste como local de depósito internacional, sob o número de depósito DSM 6380.

Exemplo 4: Preparação do UNA total de Soransium

Para o isolamento do DNA total uma cultura de Sorangium que se encontra na fase estacionária é centrifugada durante 10 minutos a 10Ό00 rpm. As células separadas são então resuspendidas no tampão STE [ver secção "meios e tampao"] e ajustadas a uma densidade de células de aproximadamcntc 109 células/ml

Seguidamente 450 μΐ desta suspensão são misturados com 200 μΐ tampão RLM [ver secção "meios e tampão"] e 2 μΐ pirocarbonato de dietilo. De forma a garantir uma mistura ciudadosa e homogénea utilizam-se aparelhos apropriados como por exemplo um vortex ou semelhante. Após de 30 minutos de incubação a 70°C numa incubadora são adicionados 100 μΐ acetato de potássio [5 M]. Esta mistura é incubada durante 15 minutos em gelo e é bem misturada todos os 5 minutos [vortex]. Após a centrifugação [15 minutos a 10Ό00 rpm] o sobrenadante é misturado em seguida com 500 μΐ fenol/clorofórmio/álcool isoamilico [25/24/1] para a extração de proteínas. Após nova centrifugação [15 minutos a 10Ό00 rpm] a fase de cima, que contém a fracção DNA, é retirada e a porção de fenol que eventualmente ainda aí se encontre é removida com éter dietílico [1 ml]. Seguidamente o DNA é precipitado através da adição de 1 ml etanol. Após 30 minutos de incubação a -70°C todo a mistura é centrifugada 15 minutos a 10Ό00 rpm, o pellet é lavado com etanol a 70% e seco sob vácuo. Por último o DNA é dissolvido em tampão TER.

Exemplo 5: Transferência coniugativa de pSJB55 em Sorangium cellulosum SJ3 5.1 Processo de dois passos 5.1.1 Clonagem de DNA de Sorangium no plasmídeo pSUP2021 O cromossoma isolado do estirpe SJ3 de Sorangium é cortado com a enzima de restrição Pvul. Os fragmentos obtidos desta forma são clonados no plasmídeo pSUP2021 [Simon R et al (1983)]. Aqui 0,2 pg DNA plasmídico e 1 pg DNA cromossomal são em primeiro lugar digeridos com Pvul e -34-

.ο c t . ( posteriormente precipitados com elanol. O precipitado é separado, seco e o pcllct seco é ressuspendido em 14 μΐ de água bidestilada. Depois são adicionados 2,5 μΐ de um tampão de ligação concentrado dez vezes [ver secção "meios e tampão"], 2,5 μΐ albumina de soro de bezerro [0,1 %], 2,5 μΐ ATP [10 mM], 2,5 μΐ DTT [0,2 M], 8 μΐ H20 e 1 μΐ T4 DNA-ligase. A mistura de ligação completa é então incubada durante a noite a uma temperatura de aproximadamente 8°C. 5 μΐ desta mistura de ligação é transformado para a clonagem de plasmídeos recombinantes em estirpe HB101 de E. coli. Para isso são produzidas células competentes da estirpe HB101 de E. coli com a ajuda do processo usualmente utilizado para a transformação de E. coli [ver: Técnicas gerais de recombinação de DNA].

Após a transformação e subsequente incubação durante 24 horas em agar LB com canamicina [25 pg/ml] e cloramfenicol [25 pg/ml], as colónias resultantes são submetidas a um varrimento diferencial através de plaquetagem paralela em meio com ampicilina [60 pg/ml] e sem ampicilina. Seguidamente aquelas cólonias podem ser isoladas, que com base na integração do fragmento de DNA de Sorangium, perderam a sua resistência à ampicilina. Destas colónias sensíveis à ampicilina são então isolados os plasmídeos.

Desta forma obtém-se plasmídeos recombinantes de diferentes tamanhos. Após análise de restrição são escolhidos três destes plasmídeos para experiências adicionais. Estes plasmídeos com a designação pSJB50, pSJB55 e pSJB58 contêm insertos de DNA de Sorangium de 1 Kb, 3,5 Kb ou 4Kb. 5.1.2 Transferência conjugativa do plasmídeo pSJB55 em Sorangium cellulosum A tranferência do plasmídeo pSJB55 em Sorangium cellulosum ocorre com a intervenção da estirpe W3101 de E. coli (pME305) [Jaoua S et al (1987)], a qual é capaz de uma troca de informação semelhante à conjugação com Sorangium. O plasmídeo pME305 de E.coli [Relia (1984)] serve aqui como plasmídeo ajudante para a mobilização de pSJB55.

Primeiro são transformadas células competentes da estirpe W3101 E. coli (pME305) com a ajuda do processo utilizado usualmente para a transformação de E. coli com 5 μΐ do DNA plasmidico transformado pSJB55 previamente isolado. As células transformadas de E. coli tomam-se assim doadoras para o plasmídeo pSJB55.

Para a transferência em si são misturados 15 ml de uma cultura de Sorangium cellulosum SJ3 que se encontra na fase estacionária [4 x 108 células/ml a 1-4 x 109 células/ml] com 10 ml células doadoras de E. coli de uma cultura na fase tardia de log, que contém uma proporção comparável de células. Em conjunto estas são então centrifugadas durante 10 minutos a 4000 a 8000 rpm e ressuspendidas em 500 μΐ de um meio G51b ou G51t.

Mostrou-se vantajoso, quando as células recipientes de Sorangium são submetidas antes da conjugação com E. coli a um curto tratamento de calor num banho de água. Com a estirpe de SJ3 Sorangium cellulosum conseguem-se os melhores resultados de transferência com um tratamento de calor de 10 minutos a uma temperatura de 50°C. Sob estas condições é possível obter frequências de transferência de 1-5 x 10'5, o que em comparação com um processo sem tratamento de calor prévio corrresponde a um aumento de factor 10.

Após a transferência para placas com meio sólido SolE ocorre uma incubação de dois dias a 30°C. As células são então recolhidas e ressupendidas em 1 ml de um meio G51b ou G51t. 100 μΐ desta suspensão bacteriana são plaqueadas num meio So1F, selectivo, que contém juntamente com canamicina [25 mg/1] também fleomicina [20 a 35 mg/1] e estreptomicina [300 mg/1] como agentes selectivos. A contra seleção da estirpe doadora [E. coli W3101 (pME305)] ocorre com a ajuda de estreptomicina.

As colónias que cresceram neste meio SolE selectivo após um tempo de incubação de 10 a 14 dias tratam-se de transconjugantes de Sorangium cellulosum, que adquiriram através da tranferência conjugativa do plasmídeo pSJB55 uma resistência à fleomicina. Estas colónias resistentes à fleomicina podem ser utilizadas para outras investigações biomoleculares. A frequência de transformação para a tranferência do plasmídeo pSJB55 em Sorangium encontra-se em média 3 x 10'6 relativo à estirpe recipiente SJ3.

Os plasmídeos pSJB50 e pSJB58 podem ser transferidos de forma análoga para Sorangium. 5.2 Processo de um passo 5.2.1 Clonagem de DNA de Sorangium no plasmídeo pSUP2021 A clonagem de DNA de Sorangium no plasmídeo pSUP2021 pode ser realizada como descrita no exemplo 5.1.1.

Através da troca do plasmídeo ajudante pME305 utilizado em 5.1.1 pelo plasmídeo pUZ8 [Hcdges and Matthcw (1979)], que ao contrário do plasmídeo anteriormente mencionado não tem o gene de resistência à ampicilina, o passo de clonagem no hospedeiro intermediário E. coli HB101 pode ser suprimido, pois agora é possível uma clonagem directa na estirpe doadora E. coli ED8767 prevista para a transferência conjugativa. -37- A/t.

C—J O plasmídeo pUZ8 trata-se de um descendente do plasmídeo RP4 que abrange um largo espectro de hospedeiros, que é descrito em Datta et al (1971). As modificações em relação ao plasmídeo de origem RP4 referem-se essencialmente o gene de resistência à ampicilina assim como ao elemento de inserção IS21, que estão ambos deletados assim como a introdução de um gene adicional, que proporciona resistência a iões de mercúrio [ver Jaoua S et al (1987)].

As misturas de ligação feitas de acordo com o exemplo 5.1.1 podem assim agora ser transformadas directamente na estirpe de E.coli ED8767. Para isso são produzidas células competentes da estirpe de E.coli ED8767 com a ajuda do processo usualmente utilizado para a transformação de E.coli [ver: Técnicas gerais de recombinação de DNA].

Após a transformação e subsequente incubação durante 24 horas em agar LB com tetraciclina [10 pg/ml] e cloramfenicol [25 pg/ml], as colónias resultantes são submetidas a um varrimento diferencial através de plaquetagem paralela em meio com ampicilina [60 pg/ml] e sem ampicilina. Seguidamente aquelas cólonias podem ser isoladas, que com base na integração do fragmento de DNA de Sorangium perderam a resistência à ampicilina. As culturas assim obtidas podem então ser empregues directamente para a transferência conjugativa dos plasmídeos recombinantes em células Sorangium cellulosum.

Em vez da mistura de ligação mencionada anteriormente os plasmídeos recombinados pSJB50, pSJB55 ou pSJB58 produzidos de acordo com o exemplo 5.1.1 também podem aqui evidentemente ser clonados na estirpe de E.coli ED8767. -38- 5.2.2 Transferência conjugativa dos plasmídeos recombinantes em Sorangium céllulosum

Para a transferência em si são misturados 15 ml de uma cultura de Sorangium céllulosum SJ3 que se encontra na fase estacionária [1-4 x 109 células/ml] com 10 ml células doadoras de E. coli ED8767 de uma cultura na fase tardia de log, que contém uma proporção comparável de células. Em conjunto estas são então centrifugadas durante 10 minutos a 4000 rpm e ressuspendidas em 500 μΐ de um meio G51b ou G51t.

Também neste caso se mostrou vantajoso, quando as células recipientes de Sorangium são submetidas antes da conjugação com E. coli a um curto tratamento de calor num banho de água. Com a estirpe SJ3 Sorangium céllulosum conseguem-se os melhores resultados de transferência com um tratamento de calor de 10 minutos a uma temperatura de 50°C. Sob estas condições é possível obter frequências de transferência de 1-5 x 10'5, o que em comparação com um processo sem tratamento de calor prévio corrresponde a um aumento de factor 10. O cultivo subsequente das células transformadas de Sorangium ocorre de forma análoga à forma de procedimento descrito no exemplo 5.1.2.

Através da utilização de uma estirpe E. coli negativo para a restrição como estirpe doadora, como por exemplo E. coli ED8767 [Murray et al (1977)] a frequência de transformação pode ser drasticamente aumentada em comparação com o processo anteriormente descrito (até um factor 103).

Análise genética molecular (A) Prova da integração do plasmídeo pSJB55 no cromossoma de Soramium cellulosum SJ3 O DNA total isolado de acordo com a descrição acima [comparar exemplo 4] das células transformadas de Sorangium é digerido com Smal e Sall e colocado num gel de agarose [0,9 %] horizontal tris-acetato [40 mM tris-HCl, 20mM acetato de sódio, 2mM EDTANa2, pH 7,8]. Após efectuada a electroforese o gel é primeiro colocado durante 30 minutos numa solução desnaturante [1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH] e em seguida numa solução neutralizante [1,5 M NaCl, 0,5 M tris-HCl, 1 mM EDTANa2, pH 7,2]. Através de uma "Southern Capillary Blottings" o DNA é transferido com a utilização de um tampão SSC concentrado 20 vezes [ver secção "meios e tampão"] para uma membrana de nylon [por exemplo uma "Amersham Hybond nylon membrane"; Amersham International plc, Amersham place, Amersham, England HP7 9NA] e aí fixado através de um tratamento de UV durante 6 minutos. Outros pormenores deste processo estão descritos no Manual de Amersham International, "Membran Transfer and Detection Methods", (1985). O DNA previsto como sonda de hibridização é marcado de acordo com uma translação de corte [Rigby DWJ et al (1977)]. Trata-se aqui de um inserto que abrange 3,5 Kb, marcado com 32P, do plasmídeo pSJB55. A hibridização em si é realizada com a utilização de um processo ligeiramente modificado de acordo com Denhardt [Denhardt DT (1976)]. O tampão utilizado para a pré-hibridização e hibridização demonstra a seguinte composição: 6 x SSC [Maniatis et al (1982)] + 5 x Denhardt [Maniatis et al (1982)]+ 0,5 % SDS + 0,2 mg/ml DNA de "esperma de salmão" desnaturado. A pré-hibridização é realizada a 65°C e dura 3 horas, enquanto que a reacção de hibridização em si está completa após 20 horas. Para a hibridização é adicionado um fragmento Pvul que abrange 3,5 Kb, marcado com 32P [105 cpm por cm2 filtro], desnaturado, do plasmídeo pSJB55. Após a hibridização o filtro é primeiro lavado 2x15 minutos em SSC concentrado 2 vezes a uma temperatura de 65°C, posteriormente 30 minutos em 2 x SSC + 0,1 % SDS também a 65°C e por último uma outra vez em 0,5 x SSC [15 minutos a 65°C]. A autoradiografia subsequente é realizada com a utilização de um filme de raios X [por exemplo filme de raios X FUJY].

Os autoradiogramas dos transconjugantes não mostram bandas, que correspondem à presença de DNA plasmidico pSJB55 livre, espiralizado. Em comparação encontra-se no entanto um sinal positivo na região cromossomal da membrana de filtro. O plasmídeo pSJB55 digerido por Smal produz três bandas de 8,9, 6,7 e 1,6 Kb. O padrão de hibridização da estirpe paternal SJ3 mostra após digestão por Smal também três bandas, uma das quais corresponde ao fragmento interno que abrange 1,6 Kb do inserto Sorangium clonado no plasmídeo pSJB55. O padrão de hibridização do DNA dos transconjugantes digerido por Smal mostra 5 bandas [8,9 e 6,7 Kb do plasmídeo pSJB55 assim como bandas SJ3] incluindo a banda de 1,6 Kb comum a todos os três.

Após digestão por Sall encontra-se para o plasmídeo pSJB55 uma banda de 14,1 Kb (o outro fragmento Sall que abrange 3,1 de pSJB55 não hibridiza com a sonda). O padrão de hibridização do DNA SJ3 digerido porSalI -41 -

M

mostra também uma banda de 5 Kb. Nos transconjugantes o fragmento de 14,1 Kb do plasmídeo pSJB55 desaparece assim como o fragmento de 5 Kb de SJ3 após digestão por Sall. Estas são substituídas por duas novas bandas de 11,5 Kb e 7,7 Kb.

Os dados Smal mostram, que todos os fragmentos pSJB55 se encontram intactos no genoma dos transconjugantes. Assim a possibilidade de uma recombinação específica para um local está excluída, pois nesse caso pelo menos um dos fragmentos Smal tinha de ter desaparecido.

Os resultados da digestão Sall tomam além disso claro, que o plasmídeo pSJB55 foi integrado no genoma do Sorangium e com efeito, no local onde se encontra a zona de DNA homóloga ao pSJB55 (=3,5 Kb fragmento Pvul). Esta integração realiza-se a seguir a uma recombinação homóloga entre o inserto que abrange 3,5 Kb de Sorangium de pSJB55 e do mesmo inserto no interior do genoma de Sorangium.

MEIOS E SOLUÇÕES TAMPÃO

Meio G51b fpH 7.41 Glucose 0,2 % Amido 0,5 % [Amido de batata, tipo Noredux; CERESTARITALIA S.p.a., Mailand, Itália] Peptona [DIFCO Laboratories, USA] 0,2 % Probion S 0,1 % [Single Cell Protein; HÔCHST AG, Frankfurt, BRD] CaCl2 x 2 H20 0,05 % MgS04 x 7 H20 0,05 % HEPES [FLUKA] 1,2% -42- Á P ! c

Meio G51t(pH 7,4)

Glucose 0,2 %

Amido 0,5 % [Amido de batata, tipo Noredux; CERESTARITALIA S.p.a., Mailand, Itália] Trypton [MARCO, Hackensack, NJ USA] 0,2 %

Probion S 0,1 % [Single Cell Protein; HÕCHST AG, Frankfurt, BRD]

CaCl2 x 2 H20 0,05%

MgS04 x 7 H20 0,05 % HEPES [FLUKA] 1,2 %

MeioG52ç(pH7,4)

Glucose 2,0 g/1

Amido 8,0 g/1 [Amido de batata, tipo Noredux; CERESTAR ITALIA S.p.a., Mailand, Itália] Milho de soja com a gordura retirada 2,0 g/1 [MUCEDOLA S.r.l., Settimo Milanese, Itália]

Extracto de fermento 2,0 g/1 [FOULD & SPRINGER, Maison Alfort, França]

CaCl2 x 2 H20 1,0 g/1

MgS04 x 7 H20 1,0 g/1

Fe-EDTA [8 g/1 solução original] 1,0 ml HEPES [FLUKA] 2,0 g/1 Água destilada ad. 1000 ml O valor de pH é ajustado antes da esterilização [20 minutos a 120°C] com NaOH a 7,4. -43- Aí b-rt' C—J. pH após a esterilização; 7,4 Meio SolE ídH 7.4) Glucose* 0,35 % Triptona [MARCO, Hackensack, NJ USA] 0,05 % MgS04 x 7 H20 0,15 % Sulfato de amónio* 0,05 % CaCl2 x 2 H20* 0,1 % k2hpo4* 0,006 % Ditionito de sódio* 0,01 % Fe-EDTA* 0,0008 % HEPES [FLUKA] 1,2 % Sobrenadante de uma cultura S. cellulosum estacionária, este- 3,5 % (v/v) rilizada* Agar 1,5 % *Adição ocorre após esterilização O valor de pH é ajustado antes da esterilização [20 minutos a 120°C] com NaOH a 7,4.

Meio LB

Triptona 10,0 g/1

Extracto de fermento 5,0 g/1

NaCl 5,0 g/1

Tampão STE (pH 8,0)

Sacarose 25 %

EDTANa2 1 mM -44-

f

Tampão RLM fpH 7.6) SDS 5% EDTANa2 125 mM Tris-HCl 0,5 mM Tampão TER Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM 1 mM EDTANa2 1 mM RNAse 10 pg/ml Tamnão de li sacão MgCl2 0,1 M Tris-HCl (pH 7,8) 0,5 M

TABELAS

Tabela 1: Estirpes de bactérias e plasmídeos

Estirpe_ Escherichia coli W3101Nal HB101 ED8767 Sorangium cellulosum So ce 26 So ce 26/SJ3

Características relevantes

RecA13, trpE, NalR F-, hsds20 (r-, m-), recA13, aral4, proA2, lacYl, galK2, rpsL20 (SmR), xyl-5, mtl-1, sup E 44, lambda-recA, supE, supF, hsdS

Estirpe selvagem

Mutante espontâneo SmR_ -45- Λ } <u* -Λ

Plasmídeo pSUP2021 Ap, Cm, Km, Ph pSJB50 Cm, Km, Ph pSJB55 Cm, Km, Ph pSJB58 Cm, Km, Ph pME305 Ap, Tc pUZ8 Tc, Km, Hg

DEPÓSITO

No âmbito do presente requerimento de patente os seguintes microrganismos e plasmídeos foram depositados na "Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" (colecção alemã de microrganismos e culturas celulares) em Braunschweig (BRD) reconhecida de acordo com a convenção de Budapeste como local de depósito internacional conforme as exigências para o reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para efeito do registo da patente.

Microrganismo / Data de depósito Número de Data do certificado Plasmídeo depósito de vitalidade pSJB55 (clonado em E. coli) 25.01.1991 DSM 6321 25.01.1991 Sorangium 25.01.1991 DSM 6380 14.02.1991 cellulosum So ce 26/S.T3 -46-

At tx-rt'

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Lisboa, 1 de Outubro de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industriai RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (30)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para manipulação genética de mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium, caracterizado por (a) material genético de origem homóloga ou heteróloga ou uma combinação de material genético de origem homóloga assim como heteróloga, que é homólogo ou então pelo menos essencialmente homólogo a uma zona correspondente no cromossoma da mixobactéria; ou então (b) material genético, o qual não contém naturalmente nenhum segmento homólogo ou então pelo menos essencialmente homólogo a uma zona correspondente no cromossoma da mixobactéria, e o qual é por isso associado artificialmente com a ajuda de técnicas rDNA em si conhecidas com tais segmentos homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos, em que o material genético a ser introduzido é flanqueado pelos ditos segmentos de DNA homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos; ser introduzido na célula da mixobactéria e aí via recombinação homóloga ser integrado num local exactamente definido no cromossoma da dita mixobactéria devido à homologia existente entre o DNA introduzido e o próprio DNA da bactéria.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito material genético a ser introduzido se tratar de DNA expressável, que está associado de forma operacional com as sequências de expressão funcionais na célula da mixobactéria.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caractcrizado por a introdução do material genético ocorrer através de um organismo doador com capacidade de troca de informação semelhante à conjugação com o organismo alvo mixobactéria, do dador para o recipiente mixobactéria.
4. 4. Processo para manipulação genética de mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium de acordo com a reivindicação 1, que é caracte-rizado pelos seguintes passos: (a) Preparação do DNA total do organismo alvo mixobactéria ou de um organismo aparentado; (b) Fragmentação do DNA total isolado de acordo com (a); (c) Clonagem dos fragmentos produzidos de acordo com (b) num vector plasmídeo apropriado e transformação dos ditos vectores num organismo hospedeiro utilizado usualmente para efeitos de clonagem; (d) Selecção das colónias, que contêm um plasmídeo com fragmento de DNA de mixobactéria integrado e isolamento dos ditos plasmídeos; (e) Transformação do DNA plasmídico isolado de acordo com (d) num organismo doador com capacidade de troca de informação semelhante à conjugação com o organismo alvo mixobactéria; (f) Transferência conjugal dos plasmídeos DNA recombinantes para o organismo alvo mixobactéria; (g) Cultivo das células de mixobactérias transformadas e selecção de transformantes positivos.

   -3-
5. 5. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o material genético a ser introduzido se tratar de um plasmídeo, que eventualmente contém um ou vários segmentos de DNA expressáveis e por conterporções clonadas de DNA homólogas ou então pelo menos essencialmente homólogas.
6. 6. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o grau de homologia entre os ditos segmentos de DNA homólogos e as zonas correspondentes no cromossoma da mixobactéria se situar entre 80 e 100 %.
7. 7. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por os ditos segmentos de DNA homólogos abrangerem pelo menos 100 pb.
8. 8. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por os ditos segmentos de DNA homólogos abrangerem entre 0,3 e 4kb.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se utilizar como organismo hospedeiro para a clonagem dos fragmentos de DNA da mixobactéria, ou seja, como organismo doador no âmbito da transferência de DNA conjugal, procarióticas escolhidos do grupo constituído por E. coli, pseudomonados, actinomicetes, salmonelas assim como a própria mixobactéria.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se utilizar como organismos hospedeiros para a clonagem dos fragmentos de DNA da mixobactéria, ou seja, como organismo doador no âmbito da transferência de DNA conjugal, uma estirpe de bactéria negativa à restrição ou deficiente na restrição.
11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se realizar a clonagem dos fragmentos de DNA da mixobactéria directamente num organismo doador com capacidade de troca de informação semelhante à conjugação com o organismo alvo mixobactéria.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se submeter as células da mixobactéria imediatamente antes da transferência de DNA conjugal a um curto tratamento de calor.
13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o tratamento de calor se realizar durante um período de 1 a 120 minutos a uma temperatura de 35° C a 60° C.
14. 14. Molécula de DNA recombinante, que possibilita uma integração de material genético numa zona definida no genoma de mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium, caracterizada por a dita molécula de DNA recombinante conter o DNA a ser integrado, e o dito DNA apresentar numa certa medida homologias com as regiões de DNA correspondentes no genoma da mixobactéria ou então é flanqueado por uma tal ou várias sequências de DNA homólogas, que na transformação da célula da mixobactéria que contém as regiões de DNA homólogas se efectuar uma integração do dito DNA a ser introduzido num local exactamente definido no genoma da mixobatéria devido à homologia presente entre o DNA introduzido e o próprio DNA da bactéria via recombinação homologa.
15. 15. Molécula de DNA recombinante de acordo com a -5-reivindicação 14, caracterizada por o grau de homologia entre o dito segmento de DNA homólogo e as zonas correspondentes no cromossoma da mixobactéria compreender entre 80 e 100 %.
16. 16. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o dito segmento de DNA homólogo abranger uma zona de pelo menos 100 pb.
17. 17. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por a dita sequência de DNA a introduzir já apresentar ela própria uma homologia suficientemente grande para com as regiões de DNA correspondentes no genoma bacteriano, de forma que pode ocorrer uma troca directa desta sequência de DNA contra o dito DNA genómico homólogo facilitada pela recombinação homóloga.
18. 18. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o dito DNA a ser introduzido se tratar de DNA de cadeia dupla.
19. 19. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o dito DNA a ser introduzido se tratar de DNA de cadeia simples.
20. 20. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o dito DNA a ser introduzido se tratar de DNA expressável, que está associado de forma operacional com as sequências de expressão funcionais na célula da mixobactéria.
21. 21. Molécula de DNA recombinante de acordo com a -6- reivindicação 14, caracterizada por os ditos segmentos de DNA que ílanqueam se encontrarem fundidos numa unidade como componente da molécula de DNA fechada em círculo.
22. 22. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o dito segmento de DNA homólogo provir do genoma da própria mixobactéria.
23. 23. Vector de clonagem contendo uma molécula de DNA recombinante de acordo com uma das reivindicações 14 a 22.
24. 24. Plasmídeo de DNA para a transferência conjugal de um organismo doador para um recipiente mixobactéria do grupo Sorangium/Polyangium, caracterizado por o dito plasmídeo de DNA conter juntamente com o DNA a ser introduzido segmentos de DNA homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos assim como funções de transferência (tra) e de mobilização (mob) apropriadas para uma transferência para a célula da mixobactéria.
25. 25. DNA plasmídico de acordo com a reivindicação 24 contendo uma molécula de DNA recombinante de acordo com uma das reivindicações 14 a 22.
26. 26. Processo para produção de uma molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o DNA a ser introduzido, que apresenta numa certa medida homologias com as regiões de DNA correspondentes no genoma da mixobactéria, que na transformação do genoma da mixobactéria que contém as ditas regiões homólogas se efectuar uma integração do dito DNA a ser introduzido num local exactamente definido no -7- Af- genoma da mixobactéria devido à homologia presente entre o DNA introduzido e o DNA próprio da bactéria via recombinação homologa. (a) se isolar de uma origem apropriada, que contenha segmentos de DNA homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos; ou (b) contanto que o referido DNA a integrar não contenha naturalmente nenhum segmento homólogo ou então pelo menos essencialmente homologo a uma zona correspondente no cromossoma da mixobactéria, este é associado artificialmente com a ajuda de técnicas rDNA em si conhecidas com segmentos correspondentes de DNA homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos.
27. 27. Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por o dito DNA a ser introduzido se encontrar num plasmídeo, e as sequências de DNA homólogas serem clonadas em qualquer local do DNA plasmídico, sem no entanto destruir a integridade funcional do DNA a ser introduzido.
28. 28. Processo para produção de mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium geneticamente modificadas de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por (aj) material genético de origem homóloga ou heteróloga ou uma combinação de material genético de origem homóloga assim como heteróloga, que é homólogo ou então pelo menos essencialmente homólogo a uma zona correspondente no cromossoma da mixobactéria; ou então (a2) material genético, o qual naturalmente não contém segmentos homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos a uma zona correspondente no cromossoma da mixobactéria e por isso ó associado artiíicialmente com a ajuda de técnicas rDNA em si conhecidas com tais segmentos homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos, em que o material genético a ser introduzido é flanqueado pelos ditos segmentos de DNA homólogos ou então pelo menos essencialmente homólogos, se introduzir na célula da mixobactéria e aí via recombinação homóloga ser integrado num local exactamente definido no cromossoma da dita mixobactéria devido à homologia existente entre o DNA introduzido e o próprio DNA da bactéria; e (b) transformantes positivos seleccionados com a ajuda de processos de selecção em si conhecidos e cultivados como cultura pura.
29. 29. Células de mixobactérias genéticamente modificadas produzidas de acordo com um dos processos de acordo com uma das reivindicações 1 a 13 assim como 28.
30. 30. Células de mixobactérias do grupo Sorangium/Polyangium genéticamente modificadas contendo DNA exógeno de origem homóloga e/ou heteróloga integrado via recombinação homóloga no genoma da mixobactéria. Lisboa, 1 de Outubro de 2001

    ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA