JPH04228081A - Ｄｎａ物質伝達のためのベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は広い宿主域を有する転位
可能なクローニングベクター、該ベクターを用いてのＤ
ＮＡ挿入方法、該方法で作られた新規微生物、ならびに
それらにおいて用いる新規プラスミドに関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、改善された有用な性質を有する新
しい微生物を作り出すための微生物の遺伝子操作法を開
発することに多大な関心が寄せられている。そのような
遺伝子操作法はここ１０年のうちに工業的に次第に重要
になって来ると信じられる。遺伝子操作法においては、
普通、ある微生物（場合によっては何か別の源）からＤ
ＮＡ物質を採り、そしてそれを別の微生物中へ伝達する
ことが必要である。ＤＮＡ物質を伝達するのに用いられ
る担体は、「ベクター」と称される。現在、広い宿主域
の転位可能ベクターの開発に対する要求がある。

【０００３】最近、細菌のプラスミドおよびフアージか
ら誘導した多くの特殊ベクターが開発されてきておりこ
れによりクローン化ＤＮＡ断片の表現の研究およびコン
トロールが可能となってきている。しかしこれらの公知
ベクタは、限定された宿主域を有し、また充分な安定性
を欠くので、潜在的に有用な微生物の生化学において永
久的な変性を行うのには適当でないことが判明している
。これらの変性は、受容体微生物の染色体中へ必要な遺
伝子（ＤＮＡ物質）を導入することにより最も良く達成
される。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】トランスポソンは、プ
ラスミド、その他の（微生物性）粒子および微生物間で
の遺伝子（ＤＮＡ）物質の伝達に非常に有用なＤＮＡ配
列である。トランスポソンは、相異なる微生物、プラス
ミド等の間で容易に移動しうる能力を有している。その
能力は、トランスポソンの全体の配列の中に含まれるＤ
ＮＡ配列によって暗号化（コード化）されているもので
あり、そのようなＤＮＡ配列はトランスポソン中の転位
機能規定配列と称される。従って、ＤＮＡ中にトランス
ポソンを含んでいるプラスミドは、ある微生物から他の
微生物へ遺伝子を運ぶための有用なベクターを形成する
（その際に当該遺伝子はトランスポソンのＤＮＡ中へ導
入される）。しかし、そのようなベクターの有用性は、
安定性の欠如のために制限されてきた。すなわち、トラ
ンスポソンの移動性は、トランスポソンが、受容体微生
物における有害な遺伝的変化をもたらしうることあるい
はそのような変化によって喪失されうることを意味する
のである。さらには、従前のトランスポソンの使用によ
っては、受容体微生物中への遺伝子の導入についての選
択が可能でなかった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、グラム
陰性細菌同志間でのＤＮＡ物質の伝達のための、第１の
プラスミドおよび第２のプラスミドを含むベクターであ
って：転位機能を規定する配列を含むＤＮＡ部分が取り
除かれているトランスポソン（Ａ）を、該第１のプラス
ミドが有し；トランスポソン（Ａ）の転位機能を規定す
る配列を含むトランスポソン（Ａ）からのＤＮＡ断片を
、該第２のプラスミドが有する；ことを特徴とするベク
ターが提供される。

【０００６】さらに本発明のベクターは、ある受容体グ
ラム陰性細菌の染色体中へ該細菌が本来有しない外来Ｄ
ＮＡ物質（Ｂ）を挿入するに際して： （ｉ）　　キャリヤープラスミドとヘルパープラスミド
とを含むベクターを含有する微生物を構成する工程、〔
ただし、受容体細菌中へ挿入されるべき外来ＤＮＡ物質
（Ｂ）がそのＤＮＡ中に既に含まれ、そして転位機能を
規定する配列を含むＤＮＡ部分が取り除かれている適宜
なトランスポソン（Ａ）を、該キャリヤープラスミドが
担持し；そしてトランスポソン（Ａ）の転位機能を規定
する配列を含む、トランスポソン（Ａ）からのＤＮＡ断
片を、該ヘルパープラスミドが担持している。〕（ｉｉ
）　　該キャリヤーおよびヘルパー両プラスミドを、ベ
クター含有微生物から、直接または間接的に、受容体細
菌中へ伝達する工程、そして （ｉｉｉ）　　　挿入外来ＤＮＡ物質（Ｂ）が受容体細
菌の染色体中へ入り込むのに充分な世代にわたって適切
な条件下で該受容体細菌を増殖させる工程、を含むこと
を特徴とする上記外来ＤＮＡ物質（Ｂ）の挿入方法にお
いて使用されうる。

【０００７】ベクター含有微生物から受容体細菌へのキ
ャリヤープラスミドおよびヘルパープラスミドの「間接
的な伝達」とは、複数の工程を含むいずれかの伝達方式
を意味するものであり、例えばベクター含有微生物から
出したプラスミドを、一またはその以上の中間（媒介）
微生物中へ一端入れた後に受容体細菌中へ導入する伝達
方式がある。

【０００８】適当には、上記の方法の工程（ｉｉｉ）中
またはその後に、受容体細菌からキャリヤープラスミド
を喪失させる。適当には、挿入外来ＤＮＡ物質（Ｂ）が
受容体細菌の染色体中へ入り込んだ後に、該受容体細菌
中にヘルパープラスミドと非相容性のプラスミド（非相
容性プラスミド）を導入することによりヘルパープラス
ミドを受容体細菌から排除する。

【０００９】さらに本発明によれば、本発明の前記ベク
ターおよび前記挿入方法により染色体中へ外来ＤＮＡ物
質を導入された新規なグラム陰性細菌；そのような変性
細菌を用いて実施する方法（例えば単細胞蛋白の生産方
法）；ならびに前記のベクターや挿入方法において用い
るための新規なプラスミドおよびトランスポソン（これ
らはこの明細書中に言及されている）；が提供される。 本発明の新規なプラスミドとしては、本発明のベクター
中の第１のプラスミドとして有用なもの；本発明のベク
ター中の第２のプラスミド（本発明の挿入方法における
ヘルパープラスミドに対応）として有用なもの；本発明
の挿入方法のキャリヤープラスミド〔すなわち、ＤＮＡ
物質（Ｂ）を含むトランスポソンを運ぶ第１のプラスミ
ド〕として有用なもの；および非相容性プラスミド（す
なわち、ヘルパープラスミドと非相容性）として使用す
るのに指示された新規なプラスミド；が包含される。本
発明が関連する特定なプラスミドの例としては、キャリ
ヤープラスミドｐＮＪ５０７３、該プラスミドの修飾体
、および該プラスミドまたは該修飾体から由来する第１
のプラスミド；第２すなわちヘルパープラスミドｐＮ９
２７９および該プラスミドの修飾体；ならびに非相容性
プラスミドｐＧＳＳ１５および該プスミドの修飾体；が
ある。

【００１０】以下では、本発明を外来ＤＮＡ物質挿入方
法に関して説明することにする。本発明の挿入方法にお
いて、実際上は、使用トランスプソンは、部分部分に分
割されているように見做すことができる。トランスポソ
ンの転位機能を規定するＤＮＡ配列を含む一方の部分は
、ヘルパープラスミド上に位置しているが；本発明方法
を用いて伝達されるべきＤＮＡ物質によってその転位機
能規定配列が置換えされている他方の部分は、キャリヤ
ープラスミド上に位置している。ヘルパープラスミドお
よびキャリヤープラスミドの両者が受容体細菌中へ伝達
される。キャリヤープラスミドは不安定なプラスミドで
それが受容体細菌から容易に失なわれるものであるのが
適当である。受容体細菌が多数の世代（好ましくは少な
くとも５０世代）にわたって適当な条件下で増殖された
場合、伝達された外来ＤＮＡ物質は、受容体細菌の染色
中へ入り込み、そしてもしキャリヤープラスミドが不安
定であるならばそれは該細菌から失われる。この段階で
、ヘルパープラスミドと非相容性のあるプラスミド（非
相容性プラスミド）を受容体細菌中へ導入して、ヘルパ
ープラスミドも該細菌から失なわれるようにすることが
できる。もちろん、以上の記述においては、トランスポ
ソンの該二つの部分は、必ずしも同一個のトランスポソ
ン配列からのものではなく、あるいは同一個のトランス
ポソン配列からのものであることもある。ことは理解さ
れるべきである。転位機能を含むＤＮＡは、公知の方法
でトランスポソンの全ＤＮＡ配列から切り出すことがで
きる。理想的には、転位機能を規定するその配列のみを
切り出し、そしてヘルパープラスミド上に位置させる。 しかし、これは達成され難いので、一般的には、ヘルパ
ープラスミドで運ばれるトランスポソンＤＮＡは、転位
機能規定配列以外のＤＮＡをも含むことになる。このよ
うな余分のＤＮＡは出来る限り少なくするのが好ましい
。

【００１１】本発明のＤＮＡ挿入方法は、ある細菌中へ
、その細菌の一般的生化学特性を変性またはそれに別の
特性を付加する遺伝子物質を伝達したい場合に非常に有
用である。

【００１２】キャリヤープラスミドおよびヘルパープラ
スミドは、ペクター含有微生物（普通は、細菌）から受
容体細菌中へ一段階で接合により伝達されるのが好まし
い。キャリヤーおよびヘルパー両プラスミドは、広い宿
主域を有するプラスミドであるのが適当であり、そして
少なくともキャリヤープラスミドは、受容体細菌から容
易に失なわれる不安定プラスミドであるのが好ましい。 好ましいキャリヤープラスミドは、無差別プラスミドＲ
Ｐ４の誘導体であり、そして好ましいヘルパープラスミ
ドはプラスミドＲ３００Ｂの誘導体である。その他の好
ましいキャリヤープラスミドとしては、Ｒ７５１および
Ｒ７Ｋがあり、またその他の適当なヘルパープラスミド
としてはＲ６７８およびＰＢ１６５がある。適当な非相
容性プラスミドの例としてはｐＧＳＳ１５およびＡｐ２
０１がある。使用されるプラスミドは、それぞれに適当
なマーカー（標識）を有するべきであり、そのような標
準は、普通、特定な抗生物質に対する耐性、例えばカナ
マイシン耐性（ＫｍＲ　）、テラマイシン耐性（ＴｃＲ
　）、トリメトプリン耐性（ＴｐＲ　）、およびストレ
プトマイシン耐性（ＳｍＲ　）を規定するＤＮＡ配列で
あり、このようにして細体中における特定のプラスミド
の存在、不存在が確認できるようにすべきである。本発
明のＤＮＡ挿入方法は、広範囲の有用な遺伝子操作を実
施するのに使用できる。実施しうる遺伝子操作の例とし
ては、ある細菌を新規なエネルギー源を使用しうるよう
にする遺伝情報またはエネルギー転換効率を改善する遺
伝情報を、その細菌の染色体中へ導入することがある。 ベクター含有微生物として、あるいは受容体細菌として
使用しうる細菌の例としては、Ｅ、ｃｏｌｉの菌株およ
びメチルロフイルス・メチロトロフス（Ｍｅｔｈｙｌｏ
ｐｈｉｌｕｓ　ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ；従前は
シュードモナス・メチロトロファＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈａ　と命名されていた）
の菌株がある。シュードモナス・メチロトロファ種の細
菌については、我々の英国特許第１３７０８９２号明細
書にその諸性質が記載されており、また多くの特定な菌
株、すなわちＮＣＩＢ寄託第１０５０８〜１０５１５号
、および同第１０５９２〜１０５９６号菌株も記載され
ている。

【００１３】本発明の実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉおよび
メチロフイルス・メチロトロフス種に本発明の挿入方法
を使用したものが例示されている。変性された菌株の培
養物は、ＮＣＩＢすなわちザ・ナショナル・コレクショ
ン・オブ・インダストリアル・バクテリア（英国スコッ
トランド、アバーティーン、トーリイ・リサーチ・ステ
ーション）に寄託されており、ＮＣＩＢ寄託第１１７１
４号および同第１１７１５号（変性Ｅ．ｃｏｌｉ菌株）
の寄託番号が付与されている。

【００１４】トランスポソンのほとんどのものは（例え
ばＴｎ１からＴｎ７までのいずれのものも）、本発明の
挿入方法において使用できる（我々はトランスポソンＴ
ｎ８またはＴｎ１０については関知してない）。しかし
、トランスポソンＴｎ７が好ましい。制限酵素Ｈｉｎｄ
　ＩＩＩ　またはＢａｍ　　ＨＩによって発生されたい
ずれのＤＮＡ断片も、Ｔｈ７のＤＮＡ中へ（例えば実施
例２および第１図に示すようなプラスミドｐＮＪ５０７
０で）直接に挿入できる。

【００１５】本発明の添付図によって説明する。

【００１６】図１〜２は、以下の実施例１の（ａ）に記
載されているキャリヤープラスミドｐＮＪ５０７３の誘
導操作を示す。図３は実施例１の（ｂ）に記載されてい
るヘルパープラスミドの誘導操作を示す。

【００１７】本発明を以下の実施例で説明する。実施例
１はベクターの成分プラスミドであるキャリヤープラス
ミドｐＮＪ５０７３およびヘルパープラスミドｐＮＪ９
２７９の誘導を示すものであり、実施例２および３Ｅ．
ｃｏｌｉおよびメチロトフイラス・メチロトロフスにお
ける上記ベクターの使用を示す。

【００１８】

【実施例】実施例１ 転位可能ベクター系で使用されるプラスミドの調製（ａ
）プラスミドｐＮＪ５０７３ 出発点プライミドＲＰ４であり、このものは非相容性グ
ループＰ（Ｉ　ｎｅｐ）に属し、そして抗生物質アンピ
シリン（Ａｐ）、テトラサイクリン（Ｔｅ）およびカナ
マイシン（（Ｋｍ）に対する耐性を暗号化する天然プラ
スミドである。このプラスミドは、広範囲のグラム陰性
細菌中へ接合により自身を伝達する能力を決定する遺伝
子をも有している。その分子寸法はほぼ５６キロベース
（ｋｂ）であり、ＤＮＡ分子上における遺伝子の配置は
図１に示される通りである。図１は接合伝達に関与する
領域（Ｔｒａ１、Ｔｒａ２およびＴｒａ３）の位置と、
その細菌宿主内での該プラスミドの復製および維持に必
須な機能の位置（　ｔｒｆＡ　ｔｒｆＢおよびｏｒｉ　
Ｖ）とを示している。

【００１９】次の段階は、図示した部位において前記の
１３Ｋｂ（キロベース）ＤＮＡ配列のトランスポソン７
（Ｔｎ７）を挿入して、誘導体ｐＲＰ１を与えることで
ある。このような挿入を行なうための標準的な方法は、
トランスポソン７（Ｔｎ７）を含むプラスミドからの転
位であり、かかる方法操作の詳細は、例えば「Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ」（１８３，２，１９８１年第３８０〜３８７頁）に
記載されている。Ｔｎ７は、抗生物質トリメトプリン（
Ｔｐ）およびストレプトマイシン（Ｓｍ）に対する抗性
を暗号化する遺伝子、ならびに、この１３ＫｂＤＮＡ配
列が自身を一方のＤＮＡ分子から他方のＤＮＡ分子へ転
位する能力を授与する遺伝子を有している。図１には、
ｐＲＰ１のマップも示されている。ｐＲＰ１ＤＮＡ分子
の周囲に文字Ｐで印を付けられている８個の部位は、制
限酵素ＰｓｔＩがそのプラスミド分子を開裂する位置を
示している。試験管内Ｐｓｔ１切断の後に、ｐＲＰ１の
各断片は酵素ＤＮＡリガーゼを用いて種々の組合せでア
ニールされ（接合され）、次いでトランスフォーメーシ
ョンにより、細菌エシエリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ　）Ｋ１２中へ再導入される。 この方法により得られた新規なタイプのプラスミドの一
つを次の工程のために使用した。

【００２０】ｐＲＰ１上に存在してＡｐＲ　、ＫｍＲ　
、ＴｐＲ　およびＳｍＲ　を決定する遺伝子を、ｐＮＪ
５０００は失なっているが、そのｐＮＪ５０００はＴｃ
Ｒ　ならびに複製、維持および、接合による伝達に関す
るすべての遺伝子を保持している。ｐＮＪ５０００増殖
媒地中にテラマイシンの存在により選択されないと、一
世代につき約５％の細胞ポピュレーションを喪失されて
、高度に不安定になってもいる。トランスポソン７（Ｔ
ｎ７）はこの段階で、図示のように再挿入されてプラス
ミドｐＮＪ５０７０を発生させる。

【００２１】ｐＮＪ５０００の形成の際にｐＲＰ１から
削除されるＤＮＡ配列は、該プラスミド上に、制限酵素
Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　およびＢａｍＨ１によって認識され
るすべての部位を含んでいる。従って、Ｔｎ７をｐＮＪ
５０００に挿入してｐＮＪ５０７０を発生させるときに
、ｐＮＪ５０７０上のＨｉｎｄＩＩＩ　およびＢａｍＨ
１部位のみがＴｎ７内のものである（図２参照）。

【００２２】ｐＮＪ５０７０はＨｉｎｄ　ＩＩＩ　で切
断し（それによってＴｎ７の大きな中央部を除き）、次
いで、エシエリキア・コリＫ１２のｔｒｐＥ遺伝子を含
むＨｉｎｄ　ＩＩＩ　発生ＤＮＡ断片と結合させてｐＮ
Ｊ５０７３を発生させた（図２）。

【００２３】（ｂ）　　プラスミドｐＮＪ９２７９ｐＮ
Ｊ９２７９は、プラスミドｐＴＢ９２から誘導した。ｐ
ＴＢ９２自体は、天然の広宿主域プラスミドのＲ３００
Ｂの誘導体である。ｐＴＢ９２は、非相容性グループＱ
（ＩｎｃＱ）に属し、抗生物質スルフォンアミド（Ｓｕ
）およびカナマイシン（Ｋｍ）に対する耐性を与える。 それは接合による伝達についての機能をエンコードしな
いが、接合系を決定する別のプラスミド（例：ＲＰ４）
が同一細菌細胞中に存在すれば、容易に伝達（可動化）
される。

【００２４】ｐＴＢ９２は、制限酵素ＰｓｔＩにより認
識される二つのＤＮＡ配列を含んでいる（図３）。これ
らの配列はＳｕ耐性を規定する遺伝子の両端にある。ｐ
ＴＢ９２ＤＮＡをＰｓｔＩで切断し（それによりＳｕ耐
性遺伝子を除き）、Ｔｎ７のほとんどを含むＰｓｔＩ断
片（ｐＲＰＩの）と、ＤＮＡリガーゼにより、結合させ
た。この断片は、ｐＮＪ５０７３から除かれた抗生物質
耐性遺伝子および領域を含んでいる。しかし、これは転
位ができない、なんとなればトランスポソンの一端部か
らのＤＮＡ配列を欠くからである。かくして得られるプ
ラスミドｐＮＪ９２７０はトランスフォーメーションに
よりエシエリキア・コリＫ１２中へ再導入された。

【００２５】最終の段階として、もはやＴｐ耐性を与え
ない突然変異株を選択した。これをｐＮＪ９２７９と指
称することにした。

【００２６】実施例２ Ｅ．ｃｏｌｉにおける転位可能ベクター系の使用ここに
おける実験はすべて、ｔｒｐＥ遺伝子における突然変異
のためにアミノ酸トリプトファンの不存在下で増殖しえ
ない細菌細胞について実施した。特に言及するもの以外
のすべての段階はトリプトファンの存在下に実施した。

【００２７】プラスミドｐＴＢ９２およびｐＮＪ９２７
９を、カナマイシン耐性（ＫｍＲ　）についての選択に
よるトランスフォーメーションで導入した。ｐＮＪ５０
７０およびｐＮＪ５０７３は、テトラサイクリン耐性（
ＴｃＲ　）についての選択を行い、接合により伝達した
。そして下記の組合せが確立された。

【００２８】１．　　ｐＮＪ　　５０７０２．　　ｐＮ
Ｊ　　５０７３ ３．　　ｐＮＪ　　５０７３＋ｐＴＢ９２４．　　ｐＮ
Ｊ　　５０７３＋ｐＮＪ９２７９各プラスミド組合せの
代表を、トリプトファンなしでの増殖能力につき試験し
た。ｐＮＪ５０７３（これはＴｎ７中へ挿入されたｔｒ
ｐＥ遺伝子を有する）を取込んだ細菌のみがトリプトフ
ァンなしで増殖できた。

【００２９】各プラスミド組合せを有する細菌の代表例
を、次いで、トリプトファンおよびＴｐ（Ｔｎ７につい
て選択のため）を含む培地中で増殖させた。ｐＴＢ９２
またはｐＮＪ９２７９が存在した場合にはＫｍも添加し
た。そのときに、培養物はその培地中に細菌生育の約５
０世代の間保持した。このような時間によって、不安定
プラスミド（ｐＮＪ５０７０またはｐＮＪ５０７３）は
喪失されうるようになる（ただし、それがまずＴｎ７の
コピイを細菌染色体に与え得ることを条件とする）。こ
の不安定プラスミドの喪失によって、細菌はＴｃに対し
感受性となる。前記の四つのプラスミド組合せのそれぞ
れからの３０の別々の単離物をＴｃに対する感受性、Ｔ
ｐＲ　、およびトリプトファンなしでの増殖能力につい
て試験し、下記の結果を得た。

【００３０】 　　１．　　３０／３０ＴｃＳ　ＴｐＲ　トリプトファ
ン依存（Ｔｒｐ−　）　　２．　　３０／３０ＴｃＲ　
ＴｐＲ　トリプトファン不依存（Ｔｒｐ＋　）　　３．
　　３０／３０ＴｃＲ　ＴｐＲ　Ｔｒｐ＋　　　４．　
　１６／３０　　ＴｃＲ　ＴｐＲ　Ｔｒｐ＋　　　　　
　　　　　　８／３０　　ＴｃＲ　ＴｐＲ　Ｔｒｐ＋　
　　　　　　　　　　６／３０　　ＴｃＲ　ＴｐＲ　Ｔ
ｒｐ−　上記の結果は、正常Ｔｎ７を含むｐＮＪ５０７
０はトランスポソンを与えてから細菌宿主から失なわれ
うること；しかし中央域からのＤＮＡ除去を受けたＴｎ
７を含むｐＮＪ５０７３とトランスポソンを与えること
ができず、従ってそのプラスミドは細菌によって保持さ
れたままであること；を示している。さらには、ｐＴＢ
９２の存在はこれに何らの影響を与えない。しかし、Ｎ
ｏ４におけるようにＴｎ７の中央域を有するｐＮＪ９２
７９が存在する場合には、試験した単離体の約１／２は
それらが受けた転位と一致する特性を有する。これはＮ
ｏ４から二つのＴｃＳ　ＴｐＲ　Ｔｒｐ＋　単離体を採
り、アンピシリン耐性（ＡｐＲ　）について選択するプ
ラスミドｐＧＳＳ１５のＤＮＡでそれらをトランスフォ
ーメーション（転換）することにより、確認された。ｐ
ＧＳＳ１５はｐＮＪ９２７９と同じ非相容性グループ（
ＩｎｅＱ）のプラスミドであり、従ってそれを導入する
ことによりｐＮＪ９２７９が喪失されることになる（こ
れはＫｍに対して細菌が感受性となることによって示さ
れる）。しかし両方の場合にｐＧＳＳ１５を含む細菌は
ＴｐＲ　を維持し、またトリプトファンなしでもなお増
殖できた。このことはクローン化ｔｒｐ　Ｅ遺伝子をも
つＴｎ７の転位は細菌染色体に対し起ったことを示して
いる。Ｔｎ７およびｔｒｐ　Ｅの染色体への挿入が安定
であることを示すために、それを含む単離物中へＲＰ４
を接合により導入し、また染色体中に正常Ｔｎを含む単
離物へもＲＰ４を接合により導入した。両方のＲＰ４含
有細菌を次いで、ＲＰ４（ＴｃＲ　）またはＴｎ７（Ｔ
ｐＲ　）のいずれかの伝達についての選択をもつ区別し
うるＥ．ｃｏｌｉへの接合ドナーとして用いた。そのド
ナーが正常Ｔｎ７を含んだ場合には、１０，０００個の
細菌のうちのほぼ５個がＲＰ４を受け取りまた遺伝性Ｔ
ｎ７は転位によりＲＰ４へ伝達され次いで接合中に伝達
された。しかしドナーが、挿入ｔｒｐＥ遺伝子をもつ欠
陥Ｔｎ７を含んだ場合には、ＴｐＲ　の伝達は検出され
なかった（すなわち少なくとも１０００倍効率が劣る）
。このことは、その能力化されたＴｎ７が染色体の安定
な部分であることを示している。

【００３１】実施例３ メチロフイルス・メチロトロフスＮＣＩＢ第１０５１５
号菌株における転位可能ベクター系の使用ｐＮＪ５０７
３およびｐＮＪ９２７９の両者を含むＥ．ｃｏｌｉ菌株
を用いて、接合により両プラスミドメチロフイルス・メ
チロトロフス菌株へ伝達した（ＴｃＲ　およびＫｍＲ　
について選択）。この二重耐性メチロフイルス・メチロ
トロフス菌株の単離物をＴｐおよびＫｍ選択で約５０世
代にわたり増殖させた。この増殖時間の終了時に、それ
ぞれからの１０の単離物を、それらの抗生物質耐性パタ
ーンについて試験した。すべてはＴｃＳ　ＴｐＲ　Ｋｍ
Ｒ　であった。すなわち、それらはそれらが受けた転位
と一致する特性を有していた。染色体への転位が起った
ことを確認するために、ｐＧＳＳ１５を三つのＴｃＳ　
ＴｐＲ　ＫｍＲ　単離物中へ、ｐＮＪ５０５５での可動
化により導入した。（ｐＮＪ５０５５はＲＰ４から得ら
れる不安定な誘導体の１つである）。ＫｍＳによって示
されるように、ｐＮＪ９２７９は排除されたが、ＴｐＲ
　は三つの場合のすべてにおいて保持された。このこと
は、メチロフイルス・メチロトロフス菌株染色体への転
位が生じたことを確認するものである。さらには、約５
０世代にわたりＴｐ選択なしで増殖させ、次いでＴｐＲ
　の喪失について試験することにより、挿入は安定であ
ることが示された。試験した１００の単離物のうちの１
００について喪失が認められなかった。

【００３２】Ｅ．ｃｏｌｉの菌株中のプラスミドｐＮＪ
５０７３およびｐＮＪ９２７９は、英国スコットランド
、アバーデイーン、トーリイ・リサーチ・ステーション
のザ・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリ
アル・バクテリア（ＮＣＩＢ）において寄託番号第１１
７１４および１１７１５号でそれぞれ寄託されている（
ブタペスト条約に基く受託日：１９８２年１月２７日）
。

【００３３】プラスミドの接頭記号「ｐＮＪ」は米国コ
ネチカット州スタンフォード大学医学微生物学部のエス
サー・Ｍ・レーダーバーグ（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ　）に
よって維持されているザ・プラスミド・リファレンス。 センターに登録されている。

【００３４】

【図面の簡単な説明〕

【００３５】

【図１】プラスミドＲＰ４からのプラスミドｐＮＪ５０
００の誘導操作の線図である。

【００３６】

【図２】プラスミドｐＮＪ５０７０からのプラスミドｐ
ＮＪ５０７３の誘導操作の線図である。

【００３７】

【図３】プラスミドｐＴＢ９２からのプラスミドｐＮＪ
９２７９の誘導操作の線図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　グラム陰性細菌同志間でのＤＮＡ物質
   の伝達のための、第１のプラスミドおよび第２のプラス
   ミドを含むベクターであって：転位機能を規定する配列
   を含むＤＮＡ部分が取り除かれているトランスポソン（
   Ａ）を、該第１のプラスミドが有し、トランスポソン（
   Ａ）の転位機能を規定する配列を含む、トランスポソン
   （Ａ）からのＤＮＡ断片を、該第２のプラスミドが有す
   る、ことを特徴とする上記ベクター。
2. 【請求項２】　　プラスミドｐＮＪ５０７３。
3. 【請求項３】　　プラスミドｐＮＪ９２７９。
4. 【請求項４】　　ＮＣＩＢ寄託第１１７１４号のＥ．ｃ
   ｏｌｉ菌株、およびプラスミドｐＮＪ５０７３を含む該
   菌株の変異株および突然変異株。
5. 【請求項５】　　ＮＣＩＢ寄託第１１７１５号のＥ．ｃ
   ｏｌｉ菌株およびプラスミドｐＮＪ９２７９を含む該菌
   株の変異株および突然変異株。