CN108354943A - 新生霉素用于制备抑制trpv1表达和转运功能的药物的用途 - Google Patents

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赵博欣
张庆
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Abstract

本发明涉及新生霉素用于制备抑制TRPV1表达和转运功能的药物的用途。本发明应用过表达TRPV1细胞和大鼠作为考察模型，发现5‑50μM新生霉素能浓度依赖性地抑制辣椒素经肠粘膜的透过量，同时能对大鼠肠黏膜组织上TRPV1蛋白和mRNA的表达产生抑制作用，并在过表达TRPV1细胞通模型中，新生霉素也具有浓度依赖性地下调TRPV1表达的能力，并且减弱辣椒素在过表达细胞中的蓄积作用。在体内实验中，确切证实新生霉素对TRPV1的抑制作用。本发明证明新生霉素是一种新型的TRPV1抑制剂，首次发现其抑制TRPV1表达的药理作用，进而还会对TRPV1通道的转运能力有所影响。

Description

新生霉素用于制备抑制TRPV1表达和转运功能的药物的用途
技术领域
本发明属于药物领域，涉及新生霉素的新用途，特别涉及新生霉素用于制备抑制TRPV1(瞬态电压感受器阳离子通道子类V成员1)表达和转运功能的药物的用途。
背景技术
新生霉素是一种香豆素类抗生素，对DNA回旋酶有很好的抑制作用，由于其对BCRP有抑制作用，故能与受到BCRP调控的抗癌药联合应用，逆转抗癌药的耐药性。新生霉素可治疗耐药金葡菌、肺炎双球菌等多种革兰氏阳性感染,具有抗感染的。在日常用药过程中，经常会出现避免与辛辣食品(多含辣椒素)同时服用的提示。研究证实，某些抗生素与辣椒素同时使用，会影响抗生素体内药动学的变化。Sumano L等发现0.01％-0.5％辣椒素能增加环丙沙星70％生物利用度。辣椒素能够影响头孢氨苄和头孢唑林的口服吸收率，然而在腹腔注射非特异性TRP通道抑制剂钌红后，辣椒素改变头孢氨苄和头孢唑林口服吸收的能力消失，说明头孢氨苄和头孢唑林口服吸收率的改变是与肠粘膜组织中的TRPV1通道相关。然而暂时尚未有研究证实新生霉素与辣椒素之间的相互作用。
TRPV1(transient receptor potential cation channel,subfamily V,member1)是指“瞬态电压感受器阳离子通道，子类V，成员1”，它是一个蛋白质，在人类基因组中由TRPV1基因所编码。它属于一种离子通道，是瞬态电压感受器族中的一员，属于TRPV组(即瞬态电压感受器阳离子通道，子类V)。
TRPV1是一个离子选择性通道，与配体结合后介导细胞内Ca2+跨膜流动，进而激活一系列细胞内信号。由于TRPV1通道能被辣椒素激活，因此又称辣椒素受体，激活后能促使一些大阳离子化合物的透过。Myrdal SE等发现在肾脏细胞内TRPV1能够调节庆大霉素的透过。同时研究也发现，由于TRPV1在耳蜗表皮和肾内的大量分布，庆大霉素能通过TRPV1通道吸收进入细胞，而应用TRPV1抑制剂钌红(一种化学染料)能大幅度地减少庆大霉素的吸收，进而减弱庆大霉素引起的耳毒性和肾毒性。因此，TRPV1不仅能够介导细胞间离子的进出，还可以协助药物进入胞内。Duan等研究发现辣椒素在肠粘膜透过具有区段差异性，证实区段差异性与TRPV1在肠粘膜中的分布差异性相关，TRPV1可以作为肠粘膜转运通道影响辣椒素的转运。
基于辣椒素的转运受到TRPV1的影响，那么新生霉素对辣椒素转运的影响是否会与TRPV1相关？因此，在本研究中我们应用TRPV1过表达细胞和大鼠作为考察模型，探索新生霉素对TRPV1表达的体外和体内调控作用机制，并且应用辣椒素作为TRPV1通道透过底物，研究新生霉素对TRPV1通道物质转运的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供新生霉素的新用途。
本发明提供了新生霉素用于制备抑制TRPV1表达和转运功能的药物的用途。
本发明阐述新生霉素能有效地抑制肠道TRPV1表达量，加上新生霉素本身所具备的抗生素作用，因此，新生霉素的新药理作用为以下疾病治疗提供了新的药物治疗制剂：急性结直肠高敏感症、肠易激综合征和肠炎等。本发明有利于新生霉素制剂的开发。
本发明应用大鼠肠黏膜组织和大鼠类肠道细胞作模型，具体是利用SD大鼠和过表达TRPV1的IEC-6细胞作为模型，应用Ussing chamber扩散池、western blot、RT-PCR、HPLC、LC-MS/MS等实验方法，以辣椒素转运透过量、蓄积量、血药浓度、TRPV1蛋白和mRNA表达量等为考察指标，同时以经典TRPV1抑制剂钌红作为阳性对照，最终证明新生霉素抑制TRPV1表达和转运功能作用的新药理作用。
根据本发明所述的验证方法进行实验，所述验证方法包括以下步骤：取出SD大鼠的空肠、回肠和结肠，应用Ussing Chamber扩散池技术，在给药池给予5～50μM新生霉素与100μM辣椒素混合物，分别于30、60、75、90、120min在接收池取样，并使用HPLC建立的辣椒素检测方法进行检测样品中的浓度，计算出辣椒素表观渗透系数(Papp)；而后继续应用Ussing Chamber扩散池技术，在给药池给予20μM钌红与100μM辣椒素混合物，分别于30、60、75、90、120min在接收池取样，并使用HPLC建立的辣椒素检测方法进行检测样品中的浓度，计算出辣椒素表观渗透系数(Papp)；提前应用5～50μM新生霉素、20μM钌红和生理盐水给SD大鼠灌胃14天，然后处死大鼠分离出空肠、回肠和结肠提取组织蛋白和mRNA，应用westernblot和RT-PCR技术检测后分析；使用TRPV1载体质粒转染大鼠肠道细胞IEC-6，构建过表达TRPV1的IEC-6细胞模型，我们应用CCK-8和LDH试剂盒确定在24h孵育时长内，新生霉素10μM、辣椒素25μM和10μM钌红对IEC-6/TRPV1+细胞及其细胞膜无显著毒性破坏。对受实验药物孵育12和24小时后的IEC-6/TRPV1+细胞分别进行蛋白和mRNA表达量的考察；用2.5～10μM新生霉素和钌红孵育IEC-6/TRPV1+细胞24小时后，加入25μM辣椒素，分别于给药后5、15、30、60min收集细胞，运用LC-MS/MS建立的辣椒素检测方法检测细胞内辣椒素蓄积量；最后，SD大鼠灌胃给予规定剂量的药液，于给药后30、60、120、180、210、240、270、340、420、720min，从颈静脉采血(0.3mL)置于肝素化离心管中，运用LC-MS/MS建立的辣椒素检测方法检测大鼠血浆中辣椒素血药浓度。
在本发明中，首次发现新生霉素具有抑制TRPV1表达的药理作用，并且产生的抑制作用具有浓度依赖性。新生霉素对TRPV1的抑制作用能够影响经由TRPV1通道转运透过的物质的肠粘膜转运或细胞的蓄积。本发明证明新生霉素是一种新型的TRPV1抑制剂，这一抑制作用不仅体现在体外模型而且在体内也同时具备。RT-PCR和western blot实验数据提供了直接证据，证明新生霉素对TRPV1表达量的抑制作用，进而还会影响TRPV1通道的转运能力。
附图说明
图1钌红对新生霉素经经空肠、回肠和结肠转运的影响作用。
图2A新生霉素对空肠(a)、回肠(b)和结肠(c)的TRPV1 mRNA表达量的影响；*p<0.05，与NC(钌红)对比。
图2B新生霉素对空肠上TRPV1蛋白表达量的影响。*p<0.05，与NC对比。
图2C新生霉素对回肠上TRPV1蛋白表达量的影响。*p<0.05，与NC对比。
图2D新生霉素对结肠上TRPV1蛋白表达量的影响。*p<0.05，与NC对比。
图3A孵育新生霉素12h后对过表达TRPV1 IEC-6细胞的TRPV1 mRNA表达量的影响。
图3B孵育新生霉素24h后新生霉素对过表达TRPV1 IEC-6细胞的TRPV1mRNA表达量的影响。
图3C新生霉素对过表达TRPV1 IEC-6细胞的TRPV1蛋白表达量的影响。
图3D TRPV1蛋白在转染细胞和未转染细胞上表达的差异。
图4显示新生霉素对辣椒素在过表达TRPV1 IEC-6细胞胞内蓄积能力的影响。(A)辣椒素在未转染和转染细胞中的蓄积情况；(B)辣椒素在过表达TRPV1 IEC-6细胞的蓄积情况。
图5显示口服给予辣椒素(10mg·kg-1)与新生霉素(12.5-100mg·kg-1)后辣椒素在大鼠体内经时血药浓度曲线。
具体实施方式
本用途发明是应用TRPV1过表达细胞和大鼠作为考察模型，探索新生霉素对TRPV1表达的体外和体内调控作用机制，并且应用辣椒素作为TRPV1通道透过底物，研究新生霉素对TRPV1通道物质转运的影响。
以下通过具体实施例对本发明做详细阐述。
实施例1
雄性SD大鼠，体重在250±20g范围内，提前空腹16-18h，禁食不禁水,腹腔注射3﹪戊巴比妥钠(12mL·Kg-1)麻醉，延腹中线将腹部切开2.5cm，将小肠顶部去除5cm，然后将紧接的10cm小肠作为空肠，最后的10cm作为回肠。大肠的最初2cm去除，接着的6cm被作为结肠。用生理盐水分别轻轻清洗干净，放置入通有混合气(95％O2:5％CO2)的冰浴的Hepes-Tris缓冲液中培养。剪取3-4cm空肠肠道，迅速将浆膜侧的浆膜层剥离，保证冰上操作，而后将肠黏膜固定在扩散池上，扩散室的有效面积为1.78cm2，回肠及结肠采用与空肠相同的操作方法。在扩散室加入7mL实验药物溶液，实验药物的组合分别为100μM辣椒素与新生霉素(5μM、10μM、25μM和50μM)，100μM辣椒素与10μM钌红，100μM辣椒素与生理盐水的混悬实验溶液。接收室中加入预热至37.5℃7mL Hepes-Tris缓冲液；整个实验过程保持37.5℃，并且通入混合气体(95％O2:5％CO2)。最后按照实验设计，分别在30、60、75、90、120min于接收室取样0.5mL，并同时补充相同体积相同温度的Hepes-Tris缓冲液。将样品离心后，取一定量进高效液相色谱对辣椒素浓度进行检测。
高效液相色谱法检测接收室取样溶液中辣椒素的含量。色谱条件：色谱柱为Ecosil C18(150mm×4.6mm,5μm),检测器为紫外检测器(SPD-20A)，进样量20μL。流动相组成是甲醇和水，比例组成是70：30，流速是1.0mL·min-1，检测时长是10min，检测波长是280nm。将药物浓度代入下列公式计算透过结果：累计透过量(Qtn)：单位：mg，0.5和7表示取样体积和加入药液量，分别为0.5mL和7mL；Ctn表示时间点下接收室药物浓度；累计透过率：Qtn/D×100，单位：％，D为给药剂量；表观渗透系数(Papp)：Papp＝(dQ/dt)×(1/AC0)，单位：cm·s-1，其中dQ/dt表示稳态时时间-累计透过量线性回归所得斜率，A为有效渗透面积1.78cm2，C0为扩散室加入的初始药物浓度。计算出累计渗透量和表观渗透系数Papp进行数据分析处理。
实施例2
雄性SD大鼠，体重在250±20g范围内，提前空腹16-18h，禁食不禁水,腹腔注射3﹪戊巴比妥钠(12mL·Kg-1)麻醉，延腹中线将腹部切开2.5cm，将小肠顶部去除5cm，然后将紧接的10cm小肠作为空肠，最后的10cm作为回肠。大肠的最初2cm去除，接着的6cm被作为结肠。用生理盐水分别轻轻清洗干净，放置入通有混合气(95％O2:5％CO2)的冰浴的Hepes-Tris缓冲液中培养。剪取3-4cm空肠肠道，迅速将浆膜侧的浆膜层剥离，保证冰上操作，而后将肠黏膜固定在扩散池上，扩散室的有效面积为1.78cm2，回肠及结肠采用与空肠相同的操作方法。在扩散室加入7mL实验药物溶液，实验药物的组合分别为10μM钌红与新生霉素(5μM、10μM、25μM和50μM)，10μM钌红与生理盐水的混合实验溶液。接收室中加入预热至37.5℃7mL Hepes-Tris缓冲液；整个实验过程保持37.5℃，并且通入混合气体(95％O2:5％CO2)。最后按照实验设计，分别在30、60、75、90、120min于接收室取样0.5mL，并同时补充相同体积相同温度的Hepes-Tris缓冲液。将样品离心后，取一定量进高效液相色谱对新生霉素浓度进行检测。
高效液相色谱法检测接收室取样溶液中新生霉素的含量。色谱条件：色谱柱为Ecosil C18(150mm×4.6mm,5μm),检测器为紫外检测器(SPD-20A)，进样量20μL。流动相组成是甲醇和磷酸水(0.1％)，比例组成是90:10，流速是1.0mL·min-1，检测时长是7min，检测波长是340nm。将药物浓度代入下列公式计算透过结果：累计透过量(Qtn)：单位：mg，0.5和7表示取样体积和加入药液量，分别为0.5mL和7mL；Ctn表示时间点下接收室药物浓度；累计透过率：Qtn/D×100，单位：％，D为给药剂量；表观渗透系数(Papp)：Papp＝(dQ/dt)×(1/AC0)，单位：cm·s-1，其中dQ/dt表示稳态时时间-累计透过量线性回归所得斜率，A为有效渗透面积1.78cm2，C0为扩散室加入的初始药物浓度。计算出累计渗透量和表观渗透系数Papp进行数据分析处理。
实施例3
雄性SD大鼠，体重在250±20g范围内，将雄性SD大鼠随机分成8组，每组4只，实验组大鼠药物灌胃浓度分别为：5μM、10μM、25μM、50μM新生霉素、10μM钌红和生理盐水。按照5mL·kg-1剂量灌胃给予相应浓度的实验溶液，每天两次，连续14天。在第15天灌胃结束后处死大鼠，分离出空肠、回肠和结肠肠段，分别用于组织中TRPV1的mRNA和蛋白提取及后续分析。
RT-PCR用以测定TRPV1的mRNA表达量。运用RNA分离试剂盒(Takara Shuzo,Kyoto,Japan)，根据说明书操作将细胞和组织中的总RNA进行提取和浓度测定。而后按照Premix Ex TaqTMⅡ(Takara Shuzo,Kyoto,Japan)说明书操作进行反转录。序列如下：TRPV1为5’-CACAGAGTGGACCCAGATACG-3’和5’-CACTCGAGATAGACATGCCACC-3’,而GAPDH 5'-AGAAGGCTGGGG CTCATTTG-3'和5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。并且应用罗氏LightCycler480系统进行扩增荧光定量分析，mRNA的结果是根据各样品Ct值，利用2-△△Ct法对数据进行分析。
Western blot用以测定TRPV1的蛋白表达量。应用全蛋白提取试剂盒(KeyGEN,Jiangsu,China)将收集到的细胞或组织进行全蛋白提取，而后按照BCA蛋白定量试剂盒(Beyotime,Shanghai,China)说明书的操作方法对蛋白进行定量。蛋白在10％PAGE胶分离后转膜至PVDF膜上，应用TRPV1抗体(Novus Biologicals,LLC.Catalog:NB100-1617)和GAPDH抗体(Bioworld Technology,Inc.,Catalog:BS6007M)孵育后，应用羊抗兔二抗(CellSignaling Technology,Inc.Catalog:7074)再次孵育，最终应用ECL技术发光成像。蛋白条带的结果是以Image J软件对胶片照片中各条带灰度值的计算与分析。
实施例4
使用TRPV1 pENTER(NM_080704)质粒，按照3000(InvitrogenTM,CA,USA)说明书的操作规范，将质粒瞬时转染进大鼠肠上皮细胞IEC-6进而构建过表达TRPV1的细胞。将转染细胞种植在96孔板，贴壁后加入1.25-50μM新生霉素，12.5-50μM辣椒素和5-20μM钌红分别孵育12和24小时，而后加入MTT溶液孵育4小时，应用490nm作为检测波长测定各孔OD值，将各样品孔的OD值代入下列公式计算细胞生存率：生存率＝1-(OD样品–OD空白)/(OD对照–OD空白)；认为细胞受处理后生存率>0.8时，药物在该浓度下对细胞无毒性影响。
使用LDH释放量检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定药物对细胞LDH释放量的影响，用以评价药物在非毒性浓度刺激下对细胞膜的作用。将转染细胞种植至12孔板内，待融合率达80％后，加入非毒性浓度的新生霉素、钌红和辣椒素刺激转染细胞12和24小时。然后细胞板1000g离心5分钟，取50μL上清和细胞，并将细胞进行破碎处理，按照LDH释放量测试试剂盒说明书操作，用450nm作为测定波长，测定各样品的上清和细胞悬液的OD值，将OD值代入下列公式计算出上清LDH活性和细胞LDH活性：LDH活性(U·mL-1)＝[(OD样品–OD对照)/(OD标准–OD空白)]×0.2×N；细胞LDH活性(U·gprot-1)＝LDH活性÷细胞蛋白浓度；LDH释放度％(gprot·mL-1)＝上清液LDH活性/细胞悬液上清液LDH活性；N,稀释倍数；0.2，标准溶液浓度。对比各实验组见LDH释放度变化，用以评价药物对细胞膜的影响。
实施例5
将转染细胞种植至12孔板和60mm培养皿内，待融合率达80％后，加入非毒性浓度的新生霉素和钌红分别孵育12和24小时后收集细胞。收集12孔板的细胞应用RT-PCR技术分析TRPV1mRNA表达量，收集60mm培养皿的细胞应用western blot技术分析TRPV1蛋白表达量。
运用RNA分离试剂盒(Takara Shuzo,Kyoto,Japan)，根据说明书操作将细胞和组织中的总RNA进行提取和浓度测定。而后按照Premix Ex TaqTMⅡ(Takara Shuzo,Kyoto,Japan)说明书操作进行反转录。序列如下：TRPV1为5’-CACAGAGTGGACCCAGATACG-3’和5’-CACTCGAGATAGACATGCCAC C-3’,而GAPDH 5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'和5'-AGGGGCCATCCA CAGTCTTC-3'。并且应用罗氏LightCycler480系统进行扩增荧光定量分析，mRNA的结果是根据各样品Ct值，利用2-△△Ct法对数据进行分析。
应用全蛋白提取试剂盒(KeyGEN，江苏)将收集到的细胞或组织进行全蛋白提取，而后按照BCA蛋白定量试剂盒(Beyotime，上海)说明书的操作方法对蛋白进行定量。蛋白在10％PAGE胶分离后转膜至PVDF膜上，应用TRPV1抗体(Novus Biologicals,LLC.Catalog:NB100-1617)和GAPDH抗体(Bioworld Technology,Inc.,Catalog:BS6007M)孵育后，应用羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology,Inc.Catalog:7074)再次孵育，最终应用ECL技术发光成像。蛋白条带的结果是以Image J软件对胶片照片中各条带灰度值的计算与分析。
实施例6
将转染细胞种植至12孔板内，待融合率达80％后，加入非毒性浓度的新生霉素和钌红分别孵育24小时。然后再统一加入25μM辣椒素，并在加入后的5、15、30和60分钟收集细胞。使用超声破碎仪将收集的细胞逐一裂解，并从裂解液中应用甲醇沉淀蛋白，萃取出细胞内辣椒素，应用LC-MS/MS方法进行检测处理后样品中的辣椒素含量，条件如下：色谱柱：Agilent SB-C18(3.5μm,2.1mm×150mm)，流动相：乙腈-0.1％甲酸水(80:20，v:v)，柱温：30℃；流速：0.2mL·min-1。离子源所采用的是电喷雾离子源(ESI源)；所选用的毛细管电压为4000V；干燥气流速10L·min-1；干燥气温度350℃；雾化气压力30psi。辣椒素和维拉帕米选用碰撞能分别为10eV和22eV，辣椒素质荷比为m/z 306→137，内标维拉帕米质荷比为m/z455→165，扫描时间均为200ms。
实施例7
雄性SD大鼠，体重在240-260g范围内，空腹18h，实验前称量大鼠的体重，使用3﹪戊巴比妥钠(32mg·kg-1)进行腹腔注射麻醉。灌胃给予10mg·kg-1辣椒素和相应实验剂量的新生霉素。从灌胃结束开始计时，于给药后30、60、120、180、210、240、270、340、420、720min，从颈静脉采血(0.3mL)置于肝素化离心管中，血样立即离心3500rpm·min-1 8min，小心转移上清至新离心管内，在-20℃冰箱中保存，使用前在室温放置复温。另外每次取血以后，从尾静脉注射0.3mL生理盐水补充大鼠体液。将收集到的血浆进行进样前处理，吸取血浆100μL于1.5mL离心管内，加入400μL含有50ng·mL-1内标的甲醇提取溶剂，涡旋1min，超声提取1h，转移至高速低温离心机4℃，14000rpm·min-1，离心30min，吸取适量上清液至上样小管内待测，应用LC-MS/MS方法进行辣椒素血药浓度检测，条件如下：色谱柱：AgilentSB-C18(3.5μm,2.1mm×150mm)，流动相：乙腈-0.1％甲酸水(80:20，v:v)，柱温：30℃；流速：0.2mL·min-1。离子源所采用的是电喷雾离子源(ESI源)；所选用的毛细管电压为4000V；干燥气流速10L·min-1；干燥气温度350℃；雾化气压力30psi。辣椒素和维拉帕米选用碰撞能分别为10eV和22eV，辣椒素质荷比为m/z 306→137，内标维拉帕米质荷比为m/z 455→165，扫描时间均为200ms。
实验及结果分析
(1)比较不同浓度的新生霉素(5μM、10μM、25μM和50μM)对辣椒素经肠粘膜透过的影响，对应实施例1，结果如表1所示。由于钌红是TRPV1抑制剂，应用10μM钌红能够抑制辣椒素经肠粘膜的透过。而且与对照组相比，在回肠和结肠抑制转运作用具有显著差异，因此后续应用10μM钌红作为体外肠粘膜阳性对照药物浓度。从结果发现，新生霉素对辣椒素肠粘膜的透过呈现抑制作用。5～25μM新生霉素能显著地抑制辣椒素经空、回和结肠粘膜的透过，同时50μM新生霉素对空肠和结肠也具有显著抑制转运作用。更有趣的是，对比新生霉素与RR对辣椒素肠粘膜透过的作用，结果在回肠和结肠肠段中10μM和25μM新生霉素能显示出较RR更强的抑制作用。实验结果如下表：
表1 新生霉素和钌红对辣椒素经空肠、回肠和结肠黏膜透过的影响
注：数据以均值±标准差表示(n＝5)。*p<0.05,**p<0.01，是与比对。抑制率是将不含新生霉素或钌红的辣椒素透过组的Papp与含有新生霉素或钌红的辣椒素透过组的Papp相比而得。
(2)为了验证新生霉素经肠粘膜透过是否受TRPV1通道调控，我们使用竞争性TRPV1抑制剂RR抑制TRPV1通道，考察新生霉素的肠粘膜转运透过是否发生改变，对应实施例2。结果可以看出，在10μM RR作用下5-50μM新生霉素在空肠、回肠和结肠透过的Papp并未发生变化，说明竞争性抑制TRPV1通道不能影响新生霉素肠粘膜的转运，提示新生霉素不是TRPV1竞争性底物，实验结果见图1。
(3)为了考察新生霉素对肠黏膜组织上TRPV1的影响，我们使用新生霉素对大鼠实施灌胃刺激14天，而后取其空肠、回肠和结肠粘膜组织对其TRPV1 mRNA和蛋白表达量的改变进行分析，对应实施例3。结果显示各个浓度的新生霉素均能显著抑制空肠、回肠和结肠TRPV1 mRNA的表达，从均值上来看，新生霉素产生的抑制作用具有浓度依赖性，抑制能力表现为：空肠<回肠<结肠，对应图2A。而western blot的结果也同时显示不同浓度的新生霉素刺激空肠、回肠和结肠均能对TRPV1蛋白水平的表达产生显著的抑制作用，从均值上看，抑制作用具有浓度依赖性，对应结果图2B和图2C。虽然5μM新生霉素并未能抑制TRPV1在结肠中的表达，这可能是因为TRPV1在结肠中分布更广泛，需要更大浓度的新生霉素才能发挥对TRPV1的抑制作用，对应结果图2D。
通过上述(1)至(3)的结果，提示新生霉素可能是一种TRPV1表达抑制剂，能够通过抑制TRPV1的表达进而对TRPV1在肠粘膜转运能力产生影响，这可能是新生霉素抑制辣椒素肠粘膜透过的重要影响因素，也是新生霉素呈现浓度依赖性抑制作用的主要因素。
(4)除了应用抑制剂进行体外实验比对外，为进一步验证新生霉素对TRPV1的确切作用，我们使用过表达TRPV1大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6/TRPV1+)为模型，考察新生霉素对过表达TRPV1的IEC-6细胞中TRPV1表达量的影响。首先，成功构建过表达TRPV1的IEC-6细胞模型，结果见图3D。其次，应用MTT试剂盒和LDH释放量测定试剂盒检测新生霉素、钌红和辣椒素在不同浓度下对细胞生存状态的影响，并寻找对IEC-6/TRPV1+生长无影响的最大实验浓度，对应实施例4。在MTT实验中，设定细胞存活率大于80％时，该浓度下药物对细胞存活无影响。从结果可知，孵育12h状态下，最大浓度至50μM新生霉素、50μM辣椒素和20μM钌红均对细胞存活无显著影响；孵育24h状态下，最大浓度至50μM新生霉素、25μM辣椒素和10μM钌红均对细胞存活无显著影响。
实验结果见下表：
表2 新生霉素，辣椒素和钌红对IEC-6/TRPV1+细胞的生存率的影响
注：数据以均值±标准差表示。细胞存活率是通过MTT方法检测获得。
另一方面，本发明应用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测试细胞膜完整性用以评价无影响实验浓度下，新生霉素、辣椒素和钌红对IEC-6/TRPV1+细胞的毒性作用。结果显示，IEC-6/TRPV1+细胞在2.5、5和10μM新生霉素，25μM辣椒素和10μM钌红孵育12和24h后，相较对照组，各组中的LDH值没有显著变化。
实验结果见下表：
表3 新生霉素、辣椒素和钌红对IEC-6/TRPV1+细胞的细胞活力影响。细胞膜完整性(LDH释放量比值)用以评价细胞毒性
注：数据以均值±标准差表示。LDH释放量是用细胞上清液LDH活性与细胞内LDH活性之比。
通过上述(4)结果，证实本发明中体外细胞刺激实验，选择新生霉素10μM、辣椒素25μM和钌红10μM浓度作为最大药物刺激浓度，而且将新生霉素10μM作为高浓度，5和2.5μM作为中浓度和低浓度进行后续的刺激浓度。
(5)按照实施例4所确定的实验浓度，将转染细胞种植至细胞板或培养皿中，对受实验药物孵育12和24小时后的IEC-6/TRPV1+细胞分别进行蛋白和mRNA表达量的考察，对应实施例5。实验结果发现新生霉素能够浓度依赖性地下调TRPV1 mRNA的表达水平，并且下调作用存在浓度依赖性，结果见图3A和3B。相似地发现，新生霉素能浓度依赖性地抑制TRPV1蛋白的表达，而且与钌红产生的抑制效果相当，结果见图3C。因此，新生霉素能抑制TRPV1在IEC-6/TRPV1+细胞的表达。
(6)接下来的为进一步确证了TRPV1的表达与细胞透过能力的相关性，继续考察新生霉素对辣椒素胞内蓄积量的影响，对应实施例6。首先结果显示，辣椒素在过表达TRPV1的IEC-6细胞中的蓄积量远多于未转染IEC-6细胞，再次证实辣椒素的体外透过能力与TRPV1表达水平直接相关，结果见图4A。接下来，在IEC-6/TRPV1+细胞中提前使用新生霉素和钌红孵育24h后，再观察辣椒素在细胞间的透过情况。结果显示钌红作用下，辣椒素胞内蓄积量显著减少，10μM新生霉素的抑制透过效果与钌红相当。与对照组相比，2.5-10μM新生霉素均能显著抑制辣椒素在IEC-6/TRPV1+中的蓄积量，而且呈现浓度依赖性，结果见图4B。这种蓄积量的改变与TRPV1在细胞膜中的蛋白表达量相关，说明新生霉素能够抑制TRPV1在IEC-6/TRPV1+细胞的表达，进而影响辣椒素向IEC-6/TRPV1+细胞内的透过。
通过上述(4)至(6)的结果，不仅说明新生霉素浓度依赖性地下调细胞中TRPV1的表达，而且新生霉素刺激下TRPV1表达的减少还会导致经由TRPV1透过的辣椒素在细胞内的蓄积量减少，证实本发明中新生霉素是一种新型TRPV1抑制剂，抑制作用主要表现在对TRPV1表达的抑制。
(7)体内吸收作用的影响
根据人每日口服剂量，按照人和动物等效剂量换算公式计算，将人口服剂量换算成大鼠口服剂量，并依次设置实验浓度，对应实施例7。结果表明，口服辣椒素达到最大血药浓度(Cmax)的时间为240min左右，各实验剂量下的新生霉素并没有显著改变辣椒素达峰时间(Tmax)。25及50mg·kg-1新生霉素对口服辣椒素的Cmax和AUC与空白组相比呈现显著地降低，意味着该剂量下新生霉素能抑制体内辣椒素的吸收，影响辣椒素体内药动学。在新生霉素剂量为12.5-50mg·kg-1范围内，随着剂量的增加，新生霉素对辣椒素体内药动学参数，如Cmax和AUC0-720min，呈现渐强的抑制能力。这与体外产生的抑制作用相吻合，提示新生霉素对辣椒素转运透过的影响在大鼠体内存在相似的作用。
实验结果见下表：
表4 同时服用辣椒素(10mg/kg)与新生霉素(12.5-100mg/kg)后对大鼠体内辣椒素药动学参数的影响
注：数据以均值±标准差表示。*p<0.05,与空白组相比。
从药时曲线图中说明，从药时曲线上更能清晰地看出12.5～100mg·mL-1新生霉素与空白组的曲线下面积的变化，结果见图5。体内实验证明，新生霉素的影响是具有剂量依赖性，新生霉素的确能够剂量依赖性地影响辣椒素吸收等药动学参数。

Claims (2)

1.新生霉素用于制备抑制TRPV1表达和转运功能的药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抑制TRPV1表达和转运功能的药物用于治疗以下适应症：急性结直肠高敏感症、肠易激综合征和肠炎等。
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