KR20190065331A - 종양의 진단 및 치료에서 fsh 호르몬 수용체의 리간드 - Google Patents

종양의 진단 및 치료에서 fsh 호르몬 수용체의 리간드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양의 진단 및 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 수용체의 리간드에 관한 것이다.

Description

종양의 진단 및 치료에서 FSH 호르몬 수용체의 리간드
본 발명은 의학 분야에서, 특히 종양의 진단 및 치료에 적용된다.
난포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone: FSH)은 갑상선 자극 호르몬(thyroid-stimulating hormone: TSH), 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone: LH) 및 융모막 생식선자극호르몬(chorionic gonadotropin: CG)과 같은 높은 구조적 유사성을 특징으로 하는 단백질을 포함하는 당단백질 호르몬(glycoprotein hormones: GPH)의 부류에 속하는 당 단백질이다.
FSH는 뇌하수체 전엽에서 합성되어 생식샘 자극 호르몬-분비 호르몬(gonadotropin-releasing hormone: GnRH) 자극의 결과로 혈류로 방출된다.
FSH는 여성의 난소 난포의 성숙을 유도하는, 생식의 생리학에서 중요한 역할을 하는 반면, 남성에서는 정자 형성을 촉진하는 세르톨리 세포(Sertoli cell)를 자극한다(Simoni et al. 1997).
Puregon® 및 Gonal-F®와 같은 재조합 FSH-기반 제제 또는 Fostimon®과 같은 소변의 추출물은 여성과 남성 및 보조 출산 프로토콜에서 불임을 치료하는 데 임상에서 일상적으로 사용된다(De Barross et al. 2013).
FSH는 두 개의 비-공유적으로 결합된 서브유닛인 α와 β의 이종이량체이다.
α 서브유닛은 모든 GPH에 공통적인 반면, β 서브유닛은 상이한 당단백질 호르몬에 따라 다르며 그들의 특이적인 생물학적 활성을 정의한다.
인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(FSHβ)(UniProt code : P01225)은 약 12.5 kDa의 분자량을 가지고 있으며, 111 개의 아미노산 잔기로 이루어져 있으며 이 중 12 개의 시스테인 잔기가 6 개의 디술피드 브릿지의 형성에 관여한다. 상기 단백질에는 아스파라긴 7 및 아스파라긴 24 잔기의 수준에서 2 개의 N-글리코실화 부위가 있다.
FSH 호르몬의 생체활성은 α 사슬의 아스파라긴 52 잔기의 글리코실화 상태에 의존하는데, 이것은 생물학적 반응을 유도하는데 중요한 역할을 한다.
더욱이, FSHβ 수준의 글리코실화 패턴은 특정 수용체에 대한 호르몬 결합 능력에 영향을 미친다.
저글리코실화된 형태는 인 비트로(in vitro)에서 수용체에 대한 더 큰 친 화력을 갖지만 인 비보(in vivo)에서 더 짧은 반감기를 제공하는 반면, 완전한 글리코실화를 특징으로 하는 동형체(isoform)에는 반대 현상이 관찰된다(Ulloa-Aguirre et al. 2011).
혈류에서 방출되는 FSH는 미세 순환을 통해 생물체의 모든 구역에 도달할 수 있다. FSH는 특정 수용체(FSH receptor: FSHR)의 결합 및 활성화를 통해 그의 생리적 작용을 발휘한다.
생리 조건 하에서, 상기 수용체는 남성에서 고환의 세르톨리 세포에서만, 및 여성에서 과립층 난소 세포(granulosa ovarian cell)에서만 발현된다.
상기 FSH 수용체는 G-단백질 커플링된 수용체 군에 속하며, 리간드-수용체 복합체의 형성은 일련의 캐스케이드 신호를 유발하고, 그의 대사적 중요성이 완전히 알려지지 않았다.
가장 많이 연구된 생리학적 효과는, 이차 메신저 시클릭 아데노신-모노포스페이트(cyclic adenosine-monophosphate: cAMP)에서 아데노신 모노포스페이트(adenosine monophosphate: AMP)를 전환시켜 그의 세포질 농도를 증가시키는 아데닐일 시클라제 효소의 활성화이다.
cAMP는 세포의 생명에 필수적인 다양한 과정의 조절에 중요한 효소를 대표하는 단백질 키나제 A(protein kinase A: PKA)의 강력한 활성제이다.
예를 들어, 세르톨리 세포에서, FSHR의 활성화는, 테스토스테론을 17β-에스트라디올로 전환시키는 효소인 아로마타제의 발현을 증가시켜 그와 연관된 대사 과정을 자극한다(Ulloa-Aguirre et al. 1998).
이미 1999-2000 년에 과학계는 전립선 암에서 FSHR의 비정상적인 발현을 강조하였지만, 무엇보다도 난소 암에서 강조하기 시작하였다(Ben-Josef et al. 1999; Zheng et al. 2000).
몇 년 후, 그러한 효과에 대한 증거는 상당히 증가했지만, 2010 년이 되어서야 Radu와 동료(Radu et al. 2010)들은 FSHR이 많은 고형 종양의 미세 순환 내피 조직의 수준에서 비정상적인 방식으로 발현된다는 것을 입증하였다.
이후, 난소 종양에서 FSHR의 과다 발현이 질환의 중증도와 상관 관계가 있다는 증거가 강화되었다; Radu의 연구(Radu et al. 2010)를 확인하였으며, FSHR이 다른 유형의 원발성 또는 전이성 고형 종양에서 높은 수준으로 발현된다는 것을 증명하는 몇 가지 증거가 생산되었다(Pawlikowski et al. 2015; Planeix et al. 2015; Siraj et al. 2013; Sardella et al. 2012; Siraj et al. 2010).
개발 중인 FSHR 리간드
현재, FSHR 특이적 리간드에 대한 연구는 두 가지 주요 방법론, 즉 i) 합성 펩티드의 개발, Ⅱ) 단일 클론 항체의 개발을 따른다.
두 가지 전략 모두 펩티드의 경우 제한된 특이성 또는 항체의 경우 고유한 불안정성과 같은 중요한 결점이 있다.
현재까지 알려진 FSHR에 대한 가장 높은 결합 특이성을 갖는 분자는 혈류에서 나노몰(nanomole: nM)의 농도로 생리적으로 존재하는 FSH이다.
그러므로, FSH 수용체가 관련된 암을 특이적으로 도달, 진단 및 치료할 수 있도록 하는, 기존의 것에 대한 새롭고 유효한 대안을 확인하는 것이 필요하다.
선행 기술 문헌 Luo S. et al.(European Journal of nuclear medicine and molecular imaging, vol. 40, no. 2, 16 October 2013)은 전립선 암의 진단을 위한 FSHβ 서브유닛 펩티드를 개시한다. 이는 신경모세포종(neuroblastoma)에 대한 적용을 개시하지는 않았다.
Zhang Xiaoyan et al.의 간행물(International Journal of Pharmaceutics, vol. 453, no. 2, 2013)은 암의 치료에서 FSHβ 서브유닛 펩티드와 파클리탁셀의 접합을 개시한다.
유럽 특허 출원 EP 2,090,322 A1(Inst. Nat. Rech. Med.)은 FSH에 의해 대표될 수 있는 종양의 이미지화 및 치료를 위한 FSHR의 리간드를 개시하고 있다. 알려진 바와 같이, FSH는 두 개의 서브유닛(α 및 β)을 포함한다.
유럽 특허 출원 EP 2,924,049 A1은 영양 호르몬(trophic hormone)-관련 질환의 치료에서 키메라 생식선 자극 호르몬의 용도를 개시하였다.
국제 특허 출원 WO 2014/078533 A1은 리틱 도메인(lithic domain)에 결합된 FSHβ 서브유닛 또는 FSHβ 서브유닛의 단편을 포함하는 융합 구조물을 개시한다. 그것은 신경모세포종 치료를 위한 사용에서 어떠한 증거도 나타내지 않았다.
국제 특허 출원 WO 2016/054153 A1은 FSH 또는 FSHβ 서브유닛의 단편을 포함하는 유전자 구조물을 개시한다.
Zhang 등의 간행물(Cancer Research, vol. 69, no. 16, 15 August 2009)은 암의 치료에서 파클리탁셀과 FSHβ 서브유닛의 단편과의 접합을 개시한다.
본 발명은 놀랍게도, 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(FSHβ)이 FSHR에 높은 친화성으로 결합할 수 있음을 발견한 것에 근거한다.
특히, 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(FSHβ)이 FSHR을 불활성화시킬 수 있다는 것이 발견되었다.
또한, 본 특허 출원의 발명자들은 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득된 FSHβ 서브유닛의 형태도 매우 안정한 형태로 생산될 수 있다는 것을 발견하였다.
이러한 형태는 FSHR에 높은 친화도로 결합하여 특별하고 놀라운 이점을 제공하는 것으로 나타났다.
본 발명의 목적
본 발명의 제 1 목적은 인간 난포 자극 호르몬 β(FSHβ) 서브유닛의 의학적 용도로 대표된다.
특정 양상에 따르면, 상기 인간 난포 자극 호르몬 β(FSHβ) 서브유닛은 종양의 치료 및/또는 진단에서 의학적 용도로 적용될 수 있다.
이의 제 2 목적은, 본 발명은 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛을 재조합 형태(ABRβ)로 제조하기 위한 생명공학적 플랫폼을 개시한다.
이러한 플랫폼으로 수득된 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(ABRβ)은 본 발명의 추가적인 목적이다.
이러한 서브유닛의 의학적 용도, 특히 암의 치료 및/또는 진단에서의 의학적 용도는 본 발명의 추가적인 목적이다.
또 다른 양상에 따르면, FSHβ 및 ABRβ 서브유닛를 투여하기 위한 약학적 제제가 개시된다.
그러한 제제에서, 상기 FSHβ 및 ABRβ 서브유닛은 치료 또는 진단 활성을 가지는 분자와 접합될 수 있다.
개시된 재조합 형태를 수득하기 위해 사용된 구조물 및 벡터의 뉴클레오티드 서열은 개시된 신규한 아미노산 서열로서, 각각 본 발명의 추가적인 양상을 나타낸다.
이의 또 다른 목적으로, 본 발명은 FSHβ 또는 ABRβ 서브유닛의 용도를 포함하는 암의 치료 및/또는 진단 방법을 개시한다.
본 발명의 추가적인 목적에서, FSH 수용체(FSHR) 불활성화에 대한 FSHβ 또는 ABRβ 서브유닛의 용도가 개시된다.
본 발명의 추가적 양상에 따르면, 인간 난포 자극 호르몬(ABRβ 또는 ABRβ1) 수용체의 리간드를 제조하는 방법이 본원에 기술되고, 이는 KDEL 서열의 도입으로 나타나는 C-말단 영역의 변형을 가지는 재조합 인간 난포 자극 호르몬의 β서브유닛(FSHβ)의 제조를 포함한다.
특정 양상에서, 그러한 방법은 His-태그의 도입으로 나타나는 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(FSHβ)의 서열의 N-말단에서의 변형을 더 포함할 수 있다.
따라서, 인간 난포 자극 호르몬(FSHβ) 수용체의 리간드를 제조하기 위한 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(FSHβ) 서열 중, C-말단에서 KDEL 서열의 용도 및 가능하게는 N-말단에서 His-태그의 용도는 본 발명의 추가적인 목적을 나타낸다.
도 1은 바이너리 벡터 pABR의 구조를 나타낸다: 특정한 재조합 부위로 왼쪽 가장자리와 오른쪽 가장자리인 RB/LB; tumor morphology large DNA의 프로모터인 Tml_p; 네오마이신 포스포트란스퍼라제 Ⅱ인 NPT Ⅱ; tumor morphology large DNA의 종결인자인 Tml_t; 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)의 프로모터인 CaMV35x2_p; 번역되지 않는 TEV 서열인 TEV 5'; 노팔린 산타제(nopalyne synthase)의 종결인자인 Nos_t;
도 2는 정제된 ABRβ1의 전기영동 분석의 결과를 나타낸다;
도 3은 정제된 ABRβ1의 탈글리코실화 후의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다;
도 4는 정제된 ABRβ1의 질량 스펙트럼을 나타낸다(25kDa에서의 밴드);
도 5는 HPLC에서 크기 배제 크로마토그래피를 통하여 리간드 ABRβ1의 응집 상태를 분석한 결과를 나타낸다;
도 6은 형광 측정 기술에 의한 리간드 ABRβ1의 안정성 분석 결과를 나타낸다;
도 7은 세르톨리 세포에서 에스트라디올(E2)의 생산의 측정을 통하여 FSHR의 활성화에 대한 ABRβ1의 효과를 분석한 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD(n=3)로 나타내었다. CTR: 처리되지 않은 세포; Gonal F: 시판되는 약물로 처리된 세포; ABRβ1: 정제된 리간드 ABRβ1으로 처리된 세포; T: 테스토스테론으로 보충된 세포;
도 8은 암 세포에서 NBD로 표지된 ABRβ1과 FSHR의 결합의 분석 결과를 나타낸다;
도 9는 인간 FSHR로 형질전환된 HeLa 세포에서 Gonal F(패널 A 및 B) 및 ABRβ1(패널 C 및 D)의 내재화(internalization) 분석 결과를 나타낸다. 세포는 FITC 이차 항체만으로 인큐베이트되었다(패널 A 및 C);
도 10은 Gonal F에 의해 유도되고 리간드 ABRβ1에 의해 중화된 cAMP 생산 결과를 나타낸다;
도 11은 암세포의 성장에 대한 리간드 ABRβ1의 효과를 나타낸다;
도 12는 암세포의 성장에 대한 Alexa Fluor 647로 표지된 리간드 ABRβ1의 영향을 나타낸다;
도 13은 유세포 분석 기술로 수행된, 암 세포에서 리간드 ABRβ1의 내재화의 분석 결과를 나타낸다;
도 14는 리간드 ABRβ1의 위치 및 암 세포의 리소좀 구획에서 그것의 위치를 나타낸다;
도 15는 인간 암세포 패널에서 면역유동 세포계수 기술(immunoflow cytometry technique)에 의한 FSHR의 발현 분석 결과를 나타낸다;
도 16은 ArrayExpress(EMBL) 데이터베이스를 쿼리하여 수행한 FSHR 유전자 발현 데이터 분석으로부터의 결과로 수득된 박스 플롯의 예를 나타낸다. 분석된 데이터 세트는 504 명의 인간 유아 신경모세포종 시료를 포함한다;
도 17은 NB3 세포에서 NBD로 표지된 ABRβ1의 FSHR에 대한 결합 분석 결과를 나타낸다;
도 18은 NB3 세포에서 NBD로 표지된 ABRβ1의 내재화 분석 결과를 나타낸다(처리된 세포의 96 % 이상의 분획은 세포질 소포에 국한된 신호의 출현을 나타낸다(패널 B, n=3). 비처리된 세포(패널 A));
도 19는 트립신 소화(CAM : 카르바미도-메틸시스테인; (1): 누락된 절단; MSO: 메티오닌 술폭시드)된 리간드 ABRβ1의 탈글리코실화된 형태의 질량 분광 분석을 통한 아미노산 서열 범위를 나타낸다;
도 20은 인간 신경모세포종 암 세포에서 면역유동 세포계수 기술에 의한 FSHR 발현 분석을 나타낸다;
도 21은 마우스 모델에서 ABRβ1의 꼬리 정맥 주사의 효과(경시적)를 나타낸다.
정의
본 발명의 설명에서, 다르게 지시되지 않는 한, 용어는 이후에 설명되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
"FSHR"은 인간 난포 자극 호르몬(FSH) 수용체를 의미한다; 상기 호르몬은 두 α 및 β 서브유닛을 포함한다.
"FSHβ"는 인간 난포 자극 호르몬(FSH)의 단일 베타 서브유닛을 의미한다; 상기 서브유닛은 서열번호 1에 상응하는 서열을 특징으로 한다.
　"ABRβ"는 본 발명에 따른 생명공학적 플랫폼을 사용하여 수득될 수 있는 인간 난포 자극 호르몬(FSH)의 베타 서브유닛을 의미한다.
"ABRβ1"은 본 발명에 따른 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 식물 세포에서의 생산을 위해 생명공학적 플랫폼을 사용하여 수득된 인간 난포 자극 호르몬(FSH)의 특이적 베타 서브유닛을 의미한다; 상기 서브유닛은 서열번호 2에 상응하는 아미노산 서열을 특징으로 한다.
보다 일반적으로, 상기 FSHβ, ABRβ 및 ABRβ1 서브유닛은 FSHR 수용체 그 자체에 결합할 수 있기 때문에 상기 FSHR 수용체의 "리간드"로 언급될 수 있다.
본 발명의 제 1 목적에 따르면, 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(FSHβ)의 의학적 용도가 개시된다.
구체적으로, 본 발명은 암의 치료 및/또는 진단에서의 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(FSHβ)의 용도를 개시한다.
상기 용어 암은 종양 및 암, 즉 조절되지 않는 세포 증식에 의해 야기되는 비정상적인 성장을 특징으로 하는 그러한 조직을 의미한다.
바람직한 양상에서, 그러한 종양 또는 암은 원발성 또는 전이성 고형 종양이다.
상세하게는, 전립선(특히 전립선 샘암), 유선, 결장, 췌장, 신장, 폐, 간, 고환, 난소, 뇌 및 갑상선 종양 및 암이 포함되고; 육종도 또한 포함된다.
본 발명의 일 양상에 따르면, 이러한 의학적 용도는 유아 신경모세포종의 치료에 적용될 수 있다.
구체적으로, 이러한 의학적 용도는 소아 환자 및, 바람직하게는 6 세 이하의 환자에게서 개시된다.
본 발명의 목적을 위해, 상기 FSHβ 서브유닛은 암 치료제에서 그대로 또는 항암제와 조합하여 사용된다.
임의의 약물에 접합되지 않은 형태에서, 상기 FSHβ 서브유닛은 FSHR과의 결합에서 FSH 경쟁자로서 사용될 수 있고, 따라서 상기 수용체의 활성을 차단할 수 있다.
상기 β 서브유닛에 접합하여 사용될 수 있는 항암제에 관해 말하자면, 이는 하기에 속할 수 있다:
-세포 독성제의 부류. 바람직하게는, 상기 화합물은 카페시타빈과 같은 피리미딘 길항제, 캄토테신 군, 예를 들어 이리노테칸과 같은 효소 저해제를 포함하는 그룹으로부터 선택된다;
-알킬화제의 부류. 바람직하게는, 상기 화합물은 시스플라틴과 같은 금속 염 군, 독소루비신과 같은 DNA 인터칼레이터, 안트라사이클린 군을 포함하는 그룹으로부터 선택된다;
-단백질 합성 조절제의 부류. 바람직하게는, 상기 화합물은 보르테조밉(bortezomib)과 같은 프로테아좀 억제제 군, 템시롤리무스와 같은 mTOR 억제제 군을 포함하는 그룹으로부터 선택된다;
-유사 분열 억제제의 부류.
바람직하게는, 상기 화합물은 메이탄신과 같은 안사미토신 군, 아우리스타틴 E와 같은 미세소관 중합 억제제 군을 포함하는 그룹으로부터 선택된다;
-β-방출 방사성동위원소의 부류. 바람직하게는, 상기 화합물은 131I, 169Er, 177Lu, 186Re, 153Sm, 89Sr 및 90Y를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양상에 따르면, 상기 FSHβ 서브유닛은 종양의 진단에 사용된다.
구체적으로, 상기는 전술한 종양 및 암이다.
일단 적절하게 접합되면, 상기 FSHβ 서브유닛은 종양학에서의 진단 이미지에서의 검출을 허용한다.
이를 위하여 사용된 기술로는 예를 들어: 양전자 방출 단층촬영(Positron Emission Tomography: PET), 핵자기 공명(Nuclear Magnetic Resonance: NMR), 단일 광자 방출 단층촬영(Single Photon Emission Tomography: SPECT) 및 초음파를 포함한다; 따라서, 상기 FSHβ 서브유닛은 양전자 방출 단층촬영(PET), 핵자기 공명(NMR), 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT) 및 초음파와 같은 기술을 사용하여 진단에 적합한 분자와 적절하게 접합될 수 있다.
본 목적을 위해, 상기 용어 진단은 또한 치료적 처리 동안 시간 경과에 따른 종양 진행 및/또는 그것의 진행 또는 회귀를 확인하는 능력을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, 진단은 또한 실험적 목적을 위해 인 비트로 분석을 수행하기 위해 FSHβ 서브유닛을 사용함을 의미한다.
제 1 양상에 따르면, 상기 FSHβ 서브유닛은 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate: FITC), 피코에리트린(phycoerythrin: PE) 또는 인도시아닌(indocyanine: Cy5)과 같은 형광 분자와 적절하게 접합될 수 있다.
핵 의학 분야에서, 상기 FSHβ 서브유닛은 123I, 111In, 188Re, 18F, 35S, 99Tc와 같은 방사성 분자와 접합될 수 있다.
특정 양상에서, 상기 FSHβ 서브유닛은 또한 상이한 성질의 나노 입자와 접합될 수 있다.
상기 나노 입자와의 접합은 적절한 링커를 통해 일어날 수 있다.
나노입자
예를 들어, 약물, 방사성 동위원소, 형광 분자 또는 효소에 대한 담체로서 의학에서 사용되는 상기 나노입자는 일반적으로 1 nm 내지 1 μm의 크기이다.
상기 나노 입자는 평활하거나 고르지 않은 표면을 가질 수 있고, 고체, 세관(canaliculi)에 의해 교차되는 중공일 수 있으며, 렌즈형 구조로 이루어질 수 있다.
나노 입자는 무기 또는 유기 물질로 만들어진 입자이고; 무기 물질에 근거한 것은 Au, Ag, Si, Se, Cd 또는 그래핀과 같은 탄소 화합물로 이루어질 수 있는 반면, 유기 기원으로 근거한 것은, 예를 들어 당 또는 지질(미셀, 리포솜)의 중합체 또는 폴리(락트-코-글리콜)산(poly(lactic-co-glycolic) acid: PLGA)과 같은 분자로 이루어질 수 있다.
나노 입자의 목적은 언급한 부위에 그들 내에 함유된 다량의 분자를 운반하는 것이다.
본 발명의 목적을 위해, 상기 용어 "접합된(conjugated)"은 상기 FSHβ 서브유닛 또는 ABRβ 서브유닛, 또는 보다 구체적으로는 ABRβ1 서브유닛이 진단적 또는 치료적 활성을 갖는 분자에 적절하게 연결되는 것을 의미한다.
이러한 결합은 특히, 적절한 링커에 의해 지시되거나 수득되는 공유 화학 결합 또는 배위 결합(coordination bond)으로 나타낼 수 있다.
상기 FSHβ 서브유닛의 기원에 관해서 말하자면, 이는 인간 뇨의 정제로부터 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득될 수 있다; 상기는 또한 Fertinex®, Metrodin HP®, Gonal-F®(Serono), Follistim®, Puregon®(Merk Sharp & Dohme)과 같은 시판 제품에서도 수득될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 치료 활성을 가지는 분자와 접합된 형태 또는 비접합 형태에서 상기 FSHβ 서브유닛은 치료제와 조합하여 종양을 치료하는 방법(병용 요법)에 사용된다.
상기 FSHβ 서브유닛과 치료제의 조합은 시너지 효과를 제공할 수 있다.
이러한 치료제는 특정 형태의 암의 치료에 사용되는 분자 그룹으로부터 선택될 수 있다.
제 2 목적에서, 본 발명은 식물 세포, 보다 구체적으로는 니코티아나 벤타미아나로부터의 인간 난포 자극 호르몬의 β-서브유닛(ABRβ1)의 제조를 위한 생명공학적 플랫폼을 개시한다.
보다 일반적으로, 상기 생명공학적 플랫폼은, 상기 FSHβ 서브유닛의 아미노산 서열이 세포질 세망(endoplasmic reticulum)으로 향하기 위해 식물 세포의 특징적인 신호 펩티드를 삽입하기 위하여 적절하게 변형되는 과정을 사용한다.
따라서, 본 발명은 특히 세포질 세망에 단백질을 유지하기 위해 인간 난포 자극 호르몬의 β서브유닛(FSHβ)의 C-말단 영역을 변형시키기 위해 KDEL 서열을 사용한다.
따라서, 결과의 단백질은 특유의 글리코실화 과정을 겪으므로, 놀랍게도 단백질 접힘이 변화되지 않도록 가이드하는 과정을 남겨둔다.
특히, 본 발명의 ABRβ1 리간드는 성숙 단백질의 아스파라긴 잔기 13 및 30에 글리코실화된다.
보다 상세하게는, 상기 글리코실화 부위는 만노오스 잔기의 분지된 구조를 포함한다.
만노오스 잔기는 약 45-75, 바람직하게는 약 50-70, 및 더욱 바람직하게는 약 58-62의 총 수이고, 여기서 그들은 60 또는 61일 수 있다.
각각의 글리코실화 부위는 2 개의 N-아세틸글루코사민 잔기 및 만노오스 잔기의 분지된 구조를 포함한다.
특히, 각각의 분지형 구조는 29, 30 또는 31 개의 만노오스 잔기를 포함한다.
각각의 만노오스 잔기는 인산화, 술포릴화 또는 메틸화를 포함할 수 있다.
더욱이, 다당류 부분은 페놀 기를 포함하는 분자에 결합될 수 있다.
페놀 기를 포함하는 분자는 식물 세포의 특성이다.
특히, 상기 페놀 기는 니코티아나 벤타미아나의 식물 세포에서 전형적이다.
특정 양상에서, 본 발명의 목적은 본원에 개시된 과정으로 수득된 FSHβ 서브유닛(ABRβ1)이다.
특히, 이러한 과정은 C-말단에서 KDEL 서열을 갖는 변형 및 N-말단에서 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(FSHβ)의 6 개의 His-태그로 변형을 포함한다.
따라서, 본 발명에 개시된 플랫폼은 C-말단에서 KDEL 서열을 사용하고, 가능하게는 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드를 제조하기 위해, 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(FSHβ)의 서열의 N-말단에서 His-태그를 또한 사용한다.
따라서, 바람직한 양상에 따르면, 본 발명은 난포 자극 호르몬(FSH)의 β 서브유닛의 재조합 형태를 제조하는 방법을 개시하고, 이는 하기 단계들:
I) 서열 번호 3에 상응하는 서열을 함유하는 플라스미드로 형질 전환된 적절한 벡터를 수득하는 단계;
Ⅱ) 상기 단계 I)의 벡터로 Nicotiana benthamiana 세포를 형질 전환시키는 단계;
Ⅲ) 형질 전환된 니코티아나 벤타미아나 세포를 선택하는 단계;
Ⅳ) 안정한 니코티아나 벤타미아나 세포를 성장시키는 단계;
V) 세포 추출물을 제조하는 단계;
Ⅵ) FSHR 수용체 리간드를 정제하는 단계를 포함한다.
바람직한 양상에서, 상기 단계 I)의 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 나타낸다.
특히, 단계 Ⅱ)에서, 상기 형질전환은 어두운 곳에서 약 25 ℃ 및 일정한 교반 하에 48 시간 동안 공동배양을 수행한다.
그 후, 상기 세포가 선택된다.
바람직하게는, 상기 단계 Ⅲ)에서, 0.9 % w/v 아가 및 항생제가 보충된 MS를 포함하는 선별 배지가 사용된다.
바람직한 양상에서, 이러한 목적을 위해 다음이 사용된다: 카르베니실린 및 카나마이신, 보다 바람직하게는 250 mg/L의 카르베니실린 및 100 mg/L의 카나마이신.
본 발명의 바람직한 양상에서, 단계 (V)에서, 상기 니코티아나 벤타미아나 세포는 현탁액으로 배양된다.
다른 바람직한 양상에서, 배양액은 최종 배양 체적의 10 %와 동일한 니코티아나 벤타미아나 세포의 초기 접종을 제공한다.
세포 배양은 수크로오스, 나프탈렌-아세트산(naphthalene-acetic acid: NAA) 및 키네틴(kinetin)이 보충된 및 50-100 mbar의 통기도를 유지하는 MS 배지(Murashige 1962)에서 24-27 ℃로 15 일 동안 인큐베이션으로 유지된다.
또한, 서브-배양물은 신선한 배지에서 세포 현탁액의 분액을 옮겨 7 일마다 제조된다.
상기 세포를 어두운 곳에서 25 ℃의 일정한 온도로 교반하면서 인큐베이트한다.
본 발명에 따르면, 단계 V)는 50 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, 20 mM 시트르산, 40 mM 아스코르브산, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.05 %(v/v) Tween-20, pH 6.5를 포함하고, 1 %(w/v) XAD-4 및 1 %(w/v) 폴리비닐폴리피롤리돈(polyvinylpolypyrrolidone: PVPP)으로 보충된 추출 완충액의 사용을 포함한다.
그 후, 70 % 포화 농도를 수득할 때까지 황산 암모늄이 추출물에 첨가되며, 일정한 교반 하에 1 시간 동안 4 ℃로 인큐베이트된다.
그 다음, 침전물을 원심 분리에 의해 회수하고 IMAC 완충액에 재현탁한다.
제제를 원심 분리하고 여과한다.
결과의 용액을 컬럼상의 통로에 의해 단계 Ⅵ)에서 정제한다.
특히, 상기 용액은 IMAC 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩된다.
바람직하게는, Ni Sepharose 6 FF 컬럼이 사용된다.
이어서, 관심있는 분획이 조합되고 탈염 컬럼 상에 로딩된다.
바람직하게는, Sephadex G-25 Medium 컬럼이 사용된다.
이어서, 관심있는 분획이 조합되고 이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩된다.
바람직하게는 SP Sepharose HP 컬럼이 사용된다.
정제하는 동안, 흡광도는 280 및 254 nm에서 모니터링된다.
전술한 바와 같이, 본원에 개시된 방법에 따라 수득된 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(FSHβ)(ABRβ1) 및 종양의 치료 및/또는 진단에서 이의 의학적 용도는 본 발명의 추가적인 목적이다.
특히, 본 발명은 암의 치료 및/또는 진단에서 ABRβ 서브유닛의 용도를 개시한다.
상기 용어 암은 종양 및 암, 즉 조절되지 않는 세포 증식에 의해 야기되는 비정상적인 성장을 특징으로 하는 그러한 조직을 나타낸다.
바람직한 양상에서, 그러한 종양 또는 암은 원발성 또는 전이성 고형 종양이다.
상세하게는 전립선, 유선, 결장, 췌장, 신장, 폐, 간, 고환, 난소, 뇌 및 갑상선 종양 및 암이 포함되고; 육종도 또한 포함된다.
본 발명의 일 양상에 따르면, 이러한 의학적 용도는 유아 신경모세포종의 치료에 적용될 수 있다.
특히, 이러한 의학적 용도는 소아 환자 및, 바람직하게는 6 세 이하의 환자에게서 개시된다.
전술한 바와 같이, 상기 ABRβ1 서브유닛은 현탁액에서 니코티아나 벤타미아나의 식물 세포의 배양으로부터 생명공학적 경로에 의해 수득된다.
본 발명의 대안적인 양상에 따르면, 상기 ABRβ 서브유닛은 포유류, 효모, 박테리아 세포 또는 다른 식물 세포와 같은 다른 세포에서 생명공학적 경로에 의해 수득될 수 있다.
특히, 식물 세포 중 다우쿠스 카로타(Daucus carota), 오리자 사티바(Oryza saiva), 글리신 막스(Glycine max), 마이즈 세포(Maize cell) 등을 사용할 수 있다.
또 다른 양상에 따르면, FSHβ 및 ABRβ 서브유닛, 보다 구체적으로 ABRβ1 서브유닛을 투여하기 위한 약학적 제제가 개시된다.
보다 구체적으로, 이러한 제제는 FSHβ 서브유닛 또는 ABRβ 서브유닛, 또는, 보다 구체적으로는 ABRβ1 서브유닛 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양상에서, 이러한 서브유닛은 FSHβ 서브유닛과 관련하여 전술한 바와 같이, 치료 또는 진단 활성을 갖는 적절한 분자와 접합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에 따르면, ABRβ1 서브유닛은, 치료 활성을 갖는 분자와 접합된 형태 또는 비접합된 형태로, 또한 치료제와 조합하여 암을 치료하는 방법에 사용될 수 있다(병용 요법).
ABRβ1 서브유닛과 치료제의 조합은 상승 효과를 제공할 수 있다.
이러한 치료제는 특정 형태의 암의 치료에 사용되는 분자 군으로부터 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 개시된 ABRβ1, FSHβ 서브유닛 또는 다른 ABRβ 서브유닛(다른 세포에 적용된 재조합 DNA 기술로 수득가능함)을 포함하는 진단 및 치료 제형을 제공한다.
보다 구체적으로, 이러한 제제는 정맥내 투여를 위해 제형화된다.
추가적인 목적에 따르면, 본 발명은 FSHβ, ABRβ1 서브유닛 또는 다른 ABRβ 서브유닛의 용도를 포함하는 종양의 치료 및/또는 진단 방법을 개시한다.
특히, 이러한 방법은 가능한 적절한 약학적 제제로 제형화된, 약학적으로 유효한 양의 FSHβ 또는 ABRβ 또는 ABRβ1 서브유닛을, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 목적을 위해, 환자는 원발성 또는 전이성 고형 종양으로 고통받는 개체이도록 의도된다.
상세하게는, 전립선(특히 전립선 샘암), 유선, 결장, 췌장, 신장, 폐, 간, 고환, 난소, 뇌 및 갑상선 종양 및 암이 포함되고; 육종도 또한 포함된다.
특정 양상에 따르면, 이러한 방법은 유아 신경모세포종의 치료에 적용될 수 있다.
특히, 이러한 의학적 용도는 소아 환자 및, 바람직하게는 6 세 이하의 환자에게서 개시된다.
진단 방법은 또한 치료적 처리 동안 시간 경과에 따라 종양 진행 및/또는 그것의 진행 또는 회귀를 확인하는 능력을 나타낸다.
달리 말하면, 상이한 시간 및 후속 시간(예컨대 시간 t0 및 시간 t1)에 개체에서 종양의 정도를 결정하는 단계를 포함하는, 치료적 처리 동안 시간 경과에 따른 종양의 진행 및/또는 그것의 진행 또는 회귀를 확인하는 방법을 참조하며, 상기 시간들(예컨대, t0 및 t1) 사이에 종양 치료 단계가 수행될 수 있다.
본 발명은 약학적으로 활성인 양의 FSHβ 또는 ABRβ 또는 ABRβ1 서브유닛을 투여하는 단계를 포함하는, FSHR 수용체의 인 비보 불활성화 방법을 제공한다.
이러한 방법은 대안적으로 상이한 목적을 위해 실험실의 인 비트로에서 수행될 수 있다.
본 발명의 추가적인 양상에 따르면, FSHR 수용체를 불활성화시키기 위한 FSHβ 또는 ABRβ 또는 ABRβ1 서브유닛의 용도가 개시된다.
특히, 이러한 불활성화는 인 비보 또는 인 비트로에서 수행될 수 있다.
그러므로, 본 특허 출원에서, 다음의 서열이 개시된다:
서열번호 1 인간 FSHβ 서브유닛의 서열
서열번호 2 ABRβ1 서열
서열번호 3 ABRβ1 코딩 서열
ABRβ1 서브유닛의 서열과 관련하여, FSHR 수용체와의 상호 작용을 변형시키지 않는 것과 같은, 서열번호 2와 유사성을 가지는 모든 서열은 본 발명의 목적에 포함되는 것으로 의도된다
특히, "유사성(similarity)"은 상이한 또는 구조적으로 동등한 아미노산으로 치환될 수 있는 동일한 위치를 차지하는 아미노산의 백분율을 의미하며, 여기서 100 %로 동일한 유사성은 두 서열이 동일하다는 것을 의미한다.
상기 유사성은 특히 CLUSTALW 또는 BLAST와 같은 하나 이상의 알려져 있는 알고리즘 또는 프로그램에 따라 수행되는, 정렬에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양상에서, 유사성의 백분율은 FSHβ 서브유닛의 서열과 공통적인 ABRβ1 서브유닛의 서열만을 기준으로 한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 유사성의 백분율은 상기 수용체와의 상호 작용에 관여된 아미노산을 포함하지 않는 ABRβ1 서열의 아미노산의 비율만을 기준으로 한다.
상기 수용체와의 상호 작용에 관여하는 ABRβ1의 아미노산은 FSHβ 서열의 아미노산 33-53에 상응한다.
본 발명의 목적을 위해, 상기 유사성은 약 90 % 초과, 바람직하게는 약 90-99.9 % 및 보다 바람직하게는 약 95-97 %이다.
실험 파트
1. ABR 리간드의 생산 및 정제
인간 FSHβ(UniProt: P01225)의 단백질 서열은 물질 및 방법과 관련하여 다음 섹션에서 개시한 것과 같이 in silico로 변형되었다. 시그널 펩티드 영역(ABRβ1 리간드)을 포함하는, 신규한 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 식물에서의 발현을 위해 최적화되었다(서열 번호 3).
그 다음, 상기 뉴클레오티드 서열을 바이너리 벡터 pABR 발현 카세트에 삽입하고(도 1), 식물 세포 형질전환 시스템으로서 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하여 ABRβ1 리간드의 최고 수준을 발현하는 니코티아나 벤타미아나의 안정한 클론을 수득하고 선택하였다.
상기 ABRβ1 리간드를 현탁액에서 배양된 식물 세포로부터 순차적 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
2. ABRβ1 리간드의 화학적 특성
정제 공정을 최적화한 후 수득된 ABRβ1 리간드를 SDS-PAGE 전기영동을 사용하여 분석하였다.
쿠마시 브릴리언트 블루 또는 더 민감한 은 염색으로 염색한, 인간 FSHβ 특이적 항체 및 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 면역블로팅 분석으로 상기 ABRβ1 리간드가 95-98%의 순도를 달성한다는 것을 보여준다. 상기 분석으로 FSHβ 항체에 대한 두 개의 반응성 종의 존재가 밝혀졌다.
도 2는 정제된 ABRβ1의 전기 영동 분석 결과를 나타낸다. 정제된 ABRβ1 0.1 μg을 SDS-PAGE에서 분석하였다. MW는 분자량 마커; SS는 은 염색; WB는 인간 FSHβ 특이적 항체를 사용한 면역블로팅. 은 염색에 의해 검출된 25 및 37 kDa에서의 형태는 인간 FSHβ 특이적 항체에 반응성이 있다. 25 kDa과 37 kDa의 겉보기 분자량의 두 종은 상이한 단백질 글리코실화 패턴의 결과이다. 글리코실라제(PNGase F)로 시료를 처리하면 두 가지 고분자량 종이 소실되고 14 kDa의 겉보기 분자량의 단일 형태로 생산된다.
도 3은 정제된 ABRβ1의 탈글리코실화 후의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 0.1 μg의 정제된 ABRβ1을 탈글리코실화 프로토콜에 적용하고 SDS-PAGE 및 이어지는 은 염색에서 분석하였다. 왼쪽에는 분자량 마커; 1은 정제되었지만 탈글리코실화되지 않은 ABRβ1 리간드; 2는 정제되고 탈글리코실화된 ABRβ1 리간드. 25 및 37 kDa에서 글리코실화된 형태는 탈글리코실화 후에 사라지고, 14 kDa의 겉보기 중량을 갖는 비-탈글리코실화된 형태의 생성이 관찰된다.
정확한 분자량 및 그의 아미노산 서열을 결정하기 위해 모든 분자 종을 상이한 질량 분광 기술로 분석하였다. 상기 글리코실화된 종은 각각 24493.2 Da 및 37654.57 Da의 분자량을 할당하며, 상기 탈글리코실화된 단백질은 13783.6 Da의 분자량을 갖는다.
단백질 지문 분석은 ABRβ1 리간드의 아미노산 서열이 본 특허출원에 개시된 바와 같이 변형된 성숙한 인간 FSHβ의 아미노산 서열과 동일함을 나타내었다(도 19).
3 차 구조는 FSHR과의 효율적인 결합에 필수적이므로, ABRβ1 리간드의 디술피드 결합의 조립 패턴을 입증하였다. ABRβ1 리간드의 부분적 단백질 분해에 의해 수득된 시료의 질량 분광 분석은 디술피드 결합의 형성에 관여된 시스테인 쌍의 동정을 가능하게 하였다. 디술피드 결합의 형성에 관여된 시스테인 쌍의 동정은 성숙한 인간 FSHβ에서 관찰된 것과 동일한 패턴을 보여주며, ABRβ1 리간드가 올바른 단백질 접힘을 가지고 있음을 확인하였다.
3. 글리코실화
상기 ABRβ1 리간드는 C 말단에 KDEL 아미노산 서열을 갖는다. 2 개의 글리코실화된 단백질 형태 및 탈글리코실화된 단백질 형태의 분자량을 고려하면, 단백질 내의 글루코오스 부분의 질량을 유도할 수 있다. 동일한 단백질 형태로 존재하는 2 개의 아스파라긴 잔기에서 유사한 글리코실화 패턴을 갖는다고 가정하면, 24493 Da의 단백질에는 N-아세틸글루코사민 및 30 개의 만노오스 잔기로 이루어진 제 1 글루코오스 부분 및 2 개의 N-아세틸글루코사민 및 31 개의 만노오스 잔기로 이루어진 제 2 글루코오스 부분이 있다고 추측할 수 있다. 37654 단백질 형태에는 N-아세틸글루코사민과 70 개의 만노오스 잔기로 이루어진 글루코스 부분과 2 개의 N-아세틸글루코사민과 71 개의 만노오스 잔기로 이루어진 제 2 글루코오스 부분이 있다.
ABRβ1 리간드의 생산 및 정제 공정의 제 2 단계에서, 공정 최적화 및 단일 및 특정 형태의 글리코실화된 ABRβ1의 생산을 달성하기 위해 세포 배양 조건을 변형하였다. 따라서, 수득된 ABRβ1의 유일한 형태는 13783.6의 탈글리코실화된 아미노산 서열의 분자량을 가진다. 24493의 글리코실화 형태에 상응하는 밴드에는, 질량 분광 분석에서 보여지듯이, 하나 또는 두 개의 만노오스 포스페이트 잔기의 존재로 인해 서로 다른 3 가지 글리코실화 이소형이 있다(도 4). 이러한 과글리코실화 배열은 포유류 세포, 특히 인간의 글리코실화 패턴과는 완전히 예기치 못하게 매우 다르다.
4. 안정성 및 응집
ABRβ1 리간드의 안정성 및 응집 경향을 입증하기 위해, 정제된 단백질을 3 회의 동결/해동 사이클, 진공 하에 냉동 건조 또는 20 ℃ 및 37 ℃에서 72 시간 동안 인큐베이트하였다.
응집성 평가는 HPLC에서 크기 배제 크로마토그래(SEC) 기술을 사용하여 수행되었다.
분석 결과, 정제 공정의 마지막에서 ABRβ1 리간드의 총 단백질에 대한 응집된 단백질 백분율은 4 % 미만인 것으로 밝혀졌다.
도 5는 HPLC에서 크기 배제 크로마토그래피를 통한 ABRβ1 리간드의 응집 상태 분석 결과를 나타낸다; 상기 ABRβ1 리간드는 가용성 형태에 상응하는 하나의 주요 피크만 존재하는 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다. 피크 아래 면적의 분석은 분석된 모든 시료에서 4 % 미만의 응집을 나타낸다(n=3, p≤0.05).
경시적으로, 정제된 ABRβ1 리간드 및 용액 내에서의 안정성은 형광 측정 기술에 의하여 분석되었다. ABRβ1의 분액을 해동하고 최종 부피 1600 μl(20mM HEPES 완충액, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1 % PEG-8000(w/v)로 1μM 농도)로 하였다. 그 다음에, 시료를 즉시 분석하였고, 이어서 4 ℃에서 냉장고에 저장하였다. 상기 시료를 시간이 지남에 따라 재분석하여, 형광 방출 스펙트럼을 측정하고 기록하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, ABRβ1의 형광 스펙트럼 특성은 1 차 분석으로부터 7 일까지 경시적으로 변화하지 않았다.
전술한 바와 같이, 처리를 한, 정제된 단백질의 시료는 응집의 백분율에 어떤 유의한 변화도 나타내지 않았고, 이러한 조건에서 상기 단백질이 우수한 용해도 및 경시적 안정성을 특징으로 한다는 것을 나타낸다.
5. 세르톨리 세포에서 FSHR 수용체의 활성화에 대한 ABRβ1 리간드의 효과.
세르톨리 세포는 FSH 및 "인 비트로"에서 FSHR의 활성화에 대해 연구하기 위해 선택한 모델을 나타낸다. 이러한 세포들에서, 상기 FSHR의 활성화는 테스토스테론을 에스트라디올로 전환시키는 아로마타제 효소의 발현 증가를 유도한다. 따라서, 생산된 에스트라디올의 증가는 분자가 FSHR을 활성화할 수 있는지 여부를 결정하는 중요한 파라미터를 나타낸다. 이러한 모델에서, Gonal-F®는 비처리 세포와 관련하여 에스트라디올 생산을 약 300 % 증가시키도록 유도한다. 놀랍게도 동일한 실험 조건에서, 상기 ABRβ1 리간드는 에스트라디올 생산에 어떠한 변화도 야기하지 않으므로 전혀 FSHR을 활성화시킬 수 없다는 것을 증명하였다.
도 7은 세르톨리 세포에서 에스트라디올(E2)의 생산의 측정을 통하여 FSHR의 활성화에 대한 ABRβ1의 효과를 분석한 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD(n=3)로 표현된다. CTR: 처리되지 않은 세포; Gonal F: 시판되는 약물로 처리된 세포; ABRβ1: 정제된 리간드 ABRβ1으로 처리된 세포; T: 테스토스테론이 보충된 세포. 다양한 시약이 도면에 나타낸 농도로 사용된다. Gonal F는 FSHR에 결합하여 Ctr에 대하여 E2를 약 300 % 증가시키는 결과를 초래하고, 상기 ABRβ1 리간드는 FSHR을 활성화할 수 없으며 E2의 생산은 무효하다(p≤0.0001). 테스토스테론으로 처리하는 것은 상이한 조건 하에서 최대의 잠재적 아로마타제 활성을 드러낸다(실험 대조군).
6. ABRβ1 리간드 표지 및 FSHR에의 결합
ABRβ1 리간드가 FSHR에 특이적이고 효율적으로 결합할 수 있다는 가설을 증명하기 위해, 정제된 단백질을 형광 프로브로 유도체화시켜 리간드-수용체 결합 분석을 인 비트로의 세포 모델에서 수행될 수 있도록 하는 것이 필요하였다.
이를 위해, 형광 현미경검사 및 유세포 분석기에 기초한 기술을 사용하였다. 상기 ABRβ1 리간드를 2 개의 상이한 형광 분자인 4-클로로-7-니트로벤조퓨라잔(4-Chloro-7-nitrobenzofurazan: NBD) 및 Alexa Fluor 647로 유도체화시켰다.
인간 불멸화 세포주(난소 암 모델인), OVCAR-3, OVCAR-5, CAOV-3는 FSHR을 발현하는 인 비트로 모델로 선택하였다. 형광 ABRβ1 리간드와 단시간 동안 인큐베이트된 상기 세포는 인큐베이션 시 사용된 형광 단백질의 농도와 상관되고, FSHR과 ABRβ1 리간드의 결합의 특이성을 입증하기 위해 Gonal-F®와 공동 인큐베이션하는 경우 사라지는 균질하고 현저한 세포막 무늬를 나타낸다.
유세포 분석기의 분석은 총 세포에 대하여 표지된 세포의 백분율이 모든 경우에 96 % 이상임을 나타낸다.
LS-180(인간 결장암 모델)과 같은 다른 세포주에서도 또한 동일한 결과가 수득되었다.
도 8은 암 세포에서 NBD로 표지된 ABRβ1과 FSHR의 결합 분석 결과를 나타낸다.
도면에 나타낸 암 세포를 표지된 ABRβ1 리간드로 처리한 다음 형광 신호(FL; FITC 채널)를 분석하기 전에 식염수로 세척하였다. 실험은 유세포 분석기를 사용하여 수행되었다. 상기 분석은 ABRβ1(밝은 회색 피크)에 결합하는 세포가 처리된 전체 세포(진한 회색 피크)의 96 % 이상을 나타낸다는 것을 보여주었다(n=3).
7. ABRβ1의 내재화 분석
FSHR 수용체의 내재화 동역학에 대한 ABRβ1 리간드의 효과 분석은 면역 형광법 및 공초점 현미경 검사에 의하여 수행되었다. 슬라이드 상에 시딩된 HeLa 세포(완전 DMEM 배지에서 배양됨)를 인간 FSHR의 과발현을 가능하게 하는 플라스미드로 형질 감염시키고, 세포를 시딩하고 24 시간 후에 0.1 μg/ml Gonal-F®, ABRβ1 또는 NBD로 표지된 ABRβ1으로 처리하였다.
NBD로 표지된 ABRβ1으로 처리된 세포를 고정시키고(재료 및 방법 섹션에 개시된 바와 같음) 공초점 현미경을 사용하여 형광 현미경으로 분석하였다. Gonal-F® 또는 표지되지 않은 ABRβ1 리간드로 처리한 세포를 고정시키고 면역세포화학 프로토콜을 수행하였다. 이 경우, 상기 FSHR의 내재화를 인간 FSHR에 대한 특이적 항체 및 공초점 형광 현미경에서 이의 표출을 가능하게 하는 2 차 항체의 사용을 통해 강조하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 형광 세포질 소포의 출현이 모든 경우에서 관찰된다. 슬라이드 상에 부착된 HeLa 세포는 인간 FSHR 발현을 위한 플라스미드로 형질전환되었다. 형질감염 24 시간 후, 세포를 Gonal F 또는 ABRβ1 리간드와 함께 인큐베이트(15 분 동안 100 ng/mL)한 다음, 식염수로 세척하고, 37 ℃에서 30 분간 추가로 인큐베이트한 후 고정시키고, 인간 FSHR 특이적 항체 및 공초점 형광에 의해 검출되는 FITC와 접합된 이차 항체를 사용하여 면역조직화학 분석을 수행하였다. 상기 분석은 Gonal F(패널 A와 B)와 ABRβ1 리간드(패널 C와 D)가 세포질 소포에서 국소화된 신호의 출현으로 입증된 바와 같이 높은 내재화율을 가진다는 것을 나타낸다. 세포를 2 차 FITC 항체 단독으로 인큐베이트하였다(패널 A 및 C).
사용된 다른 기술은 관찰된 현상이 FSHR의 특이적 리간드-유도된 내재화에 기인한다는 것을 드러내고 확인한다.
8. Gonal-F®-유도된 cAMP 생산 및 ABRβ1-유도된 중화의 분석
FSHR에 대한 ABRβ1 리간드의 결합 특이성 및 효율을 검증하기 위해, cAMP 생산에 대한 그것의 효과(수용체 결합 및 활성화의 결과)를 Gonal-F®와의 경쟁 연구로 평가하였다. HEK293 세포를 인간 FSHR을 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드 및 형광 현미경에 의해 cAMP의 변화를 측정하게 하는 단백질 프로브 Epac1-camps를 코딩하는 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. Gonal-F®를 이용한 예비적 용량-반응 분석은, Gonal-F®가 가장 큰 효과를 발휘하는 민감도, 시스템의 동적 반응 범위 및 농도를 정의할 수 있게 하였다. 상기 ABRβ1 리간드의 농도를 500 ng/ml로 고정하고 Gonal-F®의 농도를 1-100 ng/ml의 범위로 변화시킨 경쟁 실험에서 cAMP 변화의 측정은 Gonal-F®/ABRβ1 리간드 경쟁 곡선을 생성하게 하였다.
도 10은 Gonal F에 의해 유도되고 ABRβ1 리간드에 의해 중화된 cAMP 생산의 결과를 나타낸다. HEK293 세포는 인간 FSHR, 및 FRET(Epac2-camps)에 의한 형광에서 cAMP의 세포질 농도를 측정할 수 있게 하는 프로브로 형질 감염시켰다. Gonal F는 cAMP 생산을 용량-의존적 방식으로 유도한다(검정색 선). 500 ng/ml 농도의 ABRβ1 리간드(회색 라인)의 존재에서, 경쟁이 없을 때 최대 활성의 50 %를 수득하기 위해 50 ng/mL의 Gonal F의 첨가를 필요로 한다. Dr/R/min는 기저 형광에 대해 정규화된 형광 변화. 데이터는 평균 ± SD로 표시하였다(* = p≤0.01; ** = p≤0.05).
수득된 데이터는 500 ng/ml의 ABRβ1 리간드 존재에서 경쟁이 없는 경우 약물의 최대 활성의 50 %를 달성하기 위해 50 ng/ml의 Gonal-F®를 필요로 하는 것을 나타낸다. 따라서, 가장 강력한 FSHR 리간드로 알려진 Gonal-F®의 50 ng/ml을 중화하기 위해서, 500 ng/ml의 ABRβ1 리간드는 충분하다. 이러한 농도비, 즉 1:10은 매우 낮은 것으로 판명되었으며 인간 FSHR에 대해 Gonal-F®와의 경쟁에서 ABRβ1의 극단적인 효과를 강조하고, 또한 극도의 친화도 및 이의 특이성을 확인한다.
9. 암 세포의 성장 속도에 대한 ABRβ1 리간드의 효과: Gonal F와의 경쟁
FSHR의 활성화가 세포 성장을 조절하는 메카니즘에 관여하기 때문에, 본 발명자들은 CAOV-3, OVCAR-3(난소 종양) 및 MDA-MB-231(삼중 음성 유방암)의 인간 종양의 3 가지 모델주에서 세포 성장 속도에 대한 ABRβ1 리간드의 효과를 시험하였다. 모든 세포주에서 Gonal F(0.1 μg/ml)로 처리하면 투여 48 시간 후 세포 성장 속도의 유의한 증가가 유도된다(CAOV-3, MDA-MB-231 + 40 % OVCAR-3 + 20 %). 대조군 조건에서 측정된 것에 대하여, ABRβ1 리간드(0.1 μg/ml)로 처리하면 CAOV-3 세포에서 세포 성장률이 15 % 감소하고 OVCAR-3 세포에서는 40 % 감소한다. 놀랍게도, 모든 세포주에서 상기 ABRβ1 리간드는 세포 성장에 대한 Gonal F의 효과를 제거하여 그것의 효과를 무효화할 수 있다.
도 11은 암 세포의 성장에 대한 ABRβ1 리간드의 효과를 나타낸다. 도면에 나타낸 암 세포는 단일 용량으로 t=0 시간에 ABRβ1 리간드(0.1 μg/ml), Gonal F(0.1 μg/ml) 또는 Gonal F + ABRβ1의 혼합물(둘 다 0.1 μg/ml 농도)로 처리되었다. Gonal F는 대조군(Ctr)에 대하여 48 시간에서 CAOV-3 세포와 MDA-MB-231에서 약 40 %(p≤0.05), OVCAR-3에서 약 20 %(p≤0.05) 성장 속도의 증가를 유도하였다. 상기 ABRβ1 리간드는 48 시간에서 CAOV-3 세포에서 약 15 %(p≤0.1), OVCAR-3 세포에서 약 40 %(p≤0.05) 성장 속도의 감소를 유도한다. 세포주에서, 상기 ABRβ1 리간드는 Gonal F와 경쟁하여 세포 성장에 대한 이의 효과를 무효화한다(p≤0.005). 명확성을 위해, S.D.(n=3)는 도면에 나타내지 않았다.
이는 "인 비트로"에서 상기 ABRβ1 리간드가 비슷한 농도의 Gonal F와 경쟁하여 FSHR과 상호 작용한다는 것을 의미한다.
10. Alexa fluor 647로 표지된 ABRβ1 리간드가 암 세포의 성장 속도에 미치는 효과: Gonal F와의 경쟁
"인 비보" 실험에서 동물에서 추적할 수 있는 분자를 수득하기 위하여 상기 ABRβ1 리간드를 Alexa Fluor 647로 표지하였다. 예를 들어, 이것은 동물에서 유도된 종양 덩어리 내에서 특정 ABRβ1 리간드의 축적을 확인하기 위하여 중요하다. 표지하는 과정이 ABRβ1 리간드의 FSHR에 대한 결합 능력에 영향을 미치지 않는지를 확인하기 위해, 문단 8에 개시된 실험을 반복하였다. ABRβ1 Alexa Fluor 647은 표지되지 않은 ABRβ1 리간드와 관련하여 다소 덜 효율적인 방식으로 Gonal F와 경쟁할 수 있다(도 12).
특히, 도 12는 암세포 성장에 대한 Alexa Fluor 647로 표지된 ABRβ1 리간드의 효과를 나타낸다. 암 세포를 단일 용량으로 t=0 시간에 Alexa Fluor 647로 표지한 ABRβ1 리간드(ABRβ1_FL)(0.1 μg/ml), Gonal F(0.1 μg/ml) 또는 Gonal F + ABRβ1_FL(둘 다 0.1 μg/ml 농도)의 혼합물로 처리하였다. 상기 ABRβ1_FL 리간드는 ABRβ1 리간드에 의해 생산된 것과 유사한 방식으로 Gonal F의 효과를 억제하여 Alexa Fluor 647 표지가 오직 부분적으로 이의 효과에 영향을 미친다는 것을 증명한다. 명확성을 위해, S.D.(n=3)는 도면에 나타내지 않았다. 효율의 상실은 ABRβ1 리간드와 FSHR의 상호 작용 능력을 손상시키는 형광 분자와의 결합으로 인한 것이다. 관찰된 효과는 여전히 포함되어 있으며 ABRβ1 Alexa Fluor 647이 "인 비보" 실험에 사용될 수 있음을 확인한다.
11. OVCAR-3 및 MDA-MB-231에서 ABRβ1 NBD의 내재화에 대한 유세포 분석기 분석.
실험 24 시간 전에 세포(4 x 10^4 OVCAR-3 또는 MDA-MB-231)를 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 최상의 실험 조건을 확인하기 위하여, 증가하는 농도의 형광 ABRβ1 리간드와 함께 세포를 인큐베이트하였다. 배양 1 시간 후, 세포를 베르센(Versene) 용액으로 세척하고, 200 μL FBS를 첨가하여 중화시킨 트립신을 사용하여 상기 플레이트에서 분리하였다. 원심 분리된 세포를 FACS 형광 측정을 위해 베르센 용액으로 재현탁하였다. 488 nm 레이저는 형광단 여기(NBD로 유도체화된 ABRβ1)를 위해 사용되었다. 1x10^4 이벤트를 3 회 각 실험에 대해 분석하였다. 데이터 분석은 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 세포 내 형광 리간드의 내재화는 인큐베이션에 사용되는 형광 리간드의 농도에 달려 있다.
12. ABRβ1은 OVCAR-3 및 MDA-MB-231에서 내재화 후에 리소좀에 축적된다.
Alexa Fluor 647로 유도체화된 리간드를 사용하여 ABRβ1 리간드의 내재화 및 세포 내 국소화를 수행하고, FSHR OVCAR-3 및 MDA-MB-231을 과발현하는 세포에서 공초점 현미경을 통해 평가하였다. 상기 세포(1x10^5 OVCAR-3 및 8x10^4 MDA-MB-231)를 형광 리간드와 함께 인큐베이션하기 24 시간 전에 공초점 현미경 검사를 위하여 슬라이드 상에 시딩하였다. 그 다음, 세포를 완전 배지에서 37 ℃로 1 시간 동안 표지된 ABRβ1 리간드(500 ng/ml ABRβ1 Alexa Fluor 647 및 LysoTracker Green DND-26, 75nM)와 함께 공동인큐베이트 하였다. 이미지 획득 전에, 상기 세포를 HBSS 용액으로 2 회 세척하고, 동일한 완충액에서 유지하고 공초점 현미경으로 즉시 분석하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 두 세포주 모두에서, 세포 리소좀에 특이적으로 축적되는 LysoTracker Green으로 인한 신호가 ABRβ1 신호와 국소적으로 공존한다. 이것은 내재화 후, ABRβ1이 세포 리소좀에서 구획화된다는 것을 의미한다.
13. 종양 세포주 패널에서 FSHR 발현 분석.
인간 종양의 세포주 모델의 패널을 FACS에서 분석하여 세포 표면 상에 FSHR의 존재를 증명하였으며, 상기 분석을 인간 FSHR에 대해 개발된 특이적 일차 항체를 사용하여 수행하였다. 세포(0.5x10^6/시료)를 배양 플라스크로부터 수확하고 실험 기간 내내 유세포 분석 튜브에서 얼음으로 유지시켰다. 각각의 세포주에 대해 3 가지 시료를 준비하였다: ⅰ) 비처리된 세포, ⅱ) 토끼(SAB4501041, Sigma-Aldrich)에서 개발된 FSHR에 대한 일차 항체 및 Alexa Fluor® 488 (TermoFisher)와 접합된 항-IgG 2차 항체와 함께 인큐베이트한 세포, ⅲ) 2 차 항체 단독으로 인큐베이트한 세포. 표지하는 프로토콜이 끝나면 FACS에서 세포를 분석하고 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 2x10^5 이벤트를 각 시료에 대해 획득하며 분석한다. 분석된 세포주의 목록 및 결과는 도 15에 나타내었다.
14. 유아 신경모세포종에서 ABRβ1과 FSHR
유아 신경모세포종(infant neuroblastoma: NB)에서 FSHR 유전자 발현 패턴을 정의하기 위해, The European Molecular Biology Laboratory EMBL에 기탁된 "E-MTAB-16"이라고 하는 데이터세트를 분석하였다.
데이터베이스에서, 마이크로어레이 기술을 사용하여 수득된 유전자 발현 분석을 수집하였다.
수집물은 위험 등급, 종양 발달 단계, MYCN 유전자 상태, 생존자/사망자, 재발, 진단 시 연령 및 진단 후 생존과 같이 열거된 7 가지 분류로 그룹화된 504 NB 시료로 구성된다.
일차 데이터는 정규화된 데이터로 데이터베이스로부터 검색되었다(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/files/E-MTAB-161/E-MTAB-161.processed.1.zip)
관심이 있는 유전자에 대한 프로브로 확인된 서열을 bowtie2 소프트웨어를 사용하여 참조 게놈 hg19에 재할당하였다.
관심이 있는 유전자를 높은 특이성 및 신뢰도로 확인하는 프로브만이 후속 분석에 사용되었다.
동일한 유전자에 나타나는 다른 프로브의 경우에 수득된 유전자 발현 수준은 이용 가능한 데이터의 중간 값을 사용하여 정규화되었다. 상기 분석은, 진단 시 환자 연령, 종양 병기, MYCN 발현 상태와 같은 NB 분류에 사용된 많은 다양한 파라미터와 관련하여 FSHR 유전자 발현을 묘사하기 위해 수행되었다.
FSHR 유전자 발현의 박스 플롯(도 16)을 Wilcoxon의 통계 테스트를 사용하여 생산 및 분석하였으며, 통계적 유의성 값을 다른 그룹에 관한 데이터에 할당하였다.
본 특허 출원의 발명자들은 병리학적 상태의 진행의 상태에 관계없이, 환자의 그룹을 형성하는 모든 시료에서, FSHR이 유아 신경모세포종 FSHR에서 과발현됨을 발견하였다.
FSHR은 조기 진단 및 높은 생존 확률을 가지는 환자로부터의 시료와 후기 진단 및 사망한 환자로부터의 시료 모두에서 과발현되는 것이 유의미하였다.
신경모세포종에서 FSHR 단백질의 존재 발현을 증명하기 위해, NB3 세포를 사용하였다(신경모세포종 세포 모델). 세포를 형광 ABRβ1 리간드와 함께 인큐베이트하고 형광 현미경 및 유세포 분석기로 분석하였다.
이러한 데이터는 (형광) ABRβ1 리간드로 표지된 세포의 백분율과 세포 표면에 FSHR을 발현하는 백분율이 분석된 모든 세포에서 96 % 이상임을 나타낸다.
도 17은 NB3 세포에서 FSHR에 대해 NBD로 표지된 ABRβ1의 결합을 분석한 결과를 나타낸다. NB3 세포(인 비트로 신경모세포종 모델)를 표지된 ABRβ1 리간드로 처리한 후 FITC 채널에서 유세포 분석기로 수행한 형광 신호(fluorescence signal: FL)를 분석하기 전에 식염수로 세척하였다. 상기 분석은 ABRβ1에 결합하는 세포(패널 B)가 처리된 전체 세포(패널 A)의 96 % 이상을 차지한다는 것을 나타낸다(n=3).
또한, 현미경 실험은, 분석된 세포의 96 % 이상에서 형광 세포질 소포의 출현에 의해 입증된 바와 같이, 세포 NB3에서 ABRβ1 리간드가 세포의 대부분에 영향을 미치는 높은 내재화율을 가지고 있음을 나타낸다.
도 18은 NB3 세포에서 NBD로 표지된 ABRβ1의 내재화 결과를 나타낸다. 슬라이드에 부착된 NB3 세포는 표지된 ABRβ1 리간드와 인큐베이트(150 ng/ml로 15 분 동안)한 후, 식염수로 세척하고, 형광 현미경 분석(FITC 채널) 전에 37 ℃에서 30 분 동안 다시 인큐베이트하였다. 분석은 ABRβ1 리간드가 높은 내재화율을 가지고 있음을 나타낸다. 처리된 세포의 96 % 이상의 분획은 세포질 소포(패널 B)에 국한된 신호의 출현을 나타낸다(n=3). 처리되지 않은 세포(패널 A). 인간 신경모세포종 모델 세포인 IMR-32 및 SH-SY5Y에 대한 인간 FSHR에 대해 특이 항체를 사용하는 유세포 분석은 도 20에서 세포막 상의 수용체의 존재를 드러낸다.
15. ABRβ1 리간드의 급성 독성의 예비 분석
예비 연구에서, 인 비보 ABRβ1 리간드의 급성 독성을 평가하였다. 이를 위해, ABRβ1 리간드(담체: 140mM NaCl, 50mM NaHPO4, 60 μM Tween 20, pH 6.8)로 12-14 주령의 CD1 균주 수컷 마우스(n=3)와 암컷 마우스(n=3)를 처리하였다. 각 마우스를 0.22 μm PES 막에 미리 여과된 1.25 mg/ml의 농도의 ABRβ1을 함유하는 200 μl/25 g의 용액으로 처리하였다. 용액 50 μl를 LB/펩톤/아가에 도말하고 37 ℃에서 3 일 동안 인큐베이트하며(C.F.U.=0), 엔도톡신 함량을 결정하였다(E.U.<0.1/1 μg ABRβ1). 대조군 마우스는 처리되지 않은 동물(n=2) 또는 담체 단독으로 처리된 동물(n=2)을 나타낸다. 상기 동물을 처리하기 전에 칭량하고, 24 시간에, 및 이어서 I.V. 주사 이후 15 일까지 72 시간마다 칭량하였으며, 행동은 처리 후 2 시간 동안 그리고 이후의 칭량 작업마다 관찰되었고, 그것은 아침 9 시부터 10시 사이에 수행되었다.
담체 단독으로 처리된 동물은 처리 시간 및 이후 2 시간 동안 통증의 징후를 나타내지 않았다. 다음 15 일에 걸친 행동 관찰에서는 이상의 출현 또는 고통의 징후가 나타나지 않았다. 치료 후 2 시간 또는 15 일 동안 ABRβ1 리간드(10 ㎎/㎏)로 처리된 마우스에서는 어떤 통증도 관찰되지 않았다. 체중은 모든 경우에 15 일 이상 유지되어 치료 전 측정된 것과 일치하며(도 21), 같은 성별의 다른 동물 그룹 간에 유의한 차이가 없음을 나타낸다.
처리 후 15 일째에 마우스를 희생시키고 주요 장기의 상태를 육안으로 평가하였다. 관찰된 모든 장기(흉선, 심장, 폐, 위, 간, 비장, 창자, 신장, 부신, 난소, 고환)에서, 담체 또는 ABRβ1(10 mg/kg)으로 처리로 인한 어떤 유의한 육안적 변화(대조군과 비교하여)도 관찰되지 않았다.
재료 및 방법
벡터의 구성
박테리아와 식물 세포의 형질전환을 위하여, 본 발명자는 폴리클로닝 부위와 lacZ 유전자 서열을 제거하고 진핵 생물에서 카나마이신 저항성을 부여하는 유전자를 함유하는 새로운 서열 및 새로운 발현 카세트로 치환된 바이너리 벡터 pGreenⅡ에서 유래된 pABR 벡터를 사용하였다.
상기 발현 카세트는, 복제된 콜리플라워 모자이크 바이러스(Cauliflower mosaic virus)인 CaMV 35Sx2(Franck et al. 1980)의 유전자 전사의 프로모터에 의해 형성되며, 그것의 하류에 인간 단백질을 코딩하는 유전자의 전사 및 번역을 촉진시키는 TEV 서열이 삽입되었다(Nopo et al. 2012).
생산된 mRNA의 안정성과 그것의 번역을 종결하는 효율을 개선하도록 하는 VTE 서열과 노팔린 신타제 종결인자(Luo Z. et al. 2007) 사이에는 외인성 단백질을 코딩하는 cNDA 서열을 삽입하기 위한 폴리클로닝 부위가 있다(도 1, RB/LB: 재조합-특이적 부위, 좌우 경계; Tml p: 종양 형태의 큰 DNA 프로모터; NPT Ⅱ: 네오마이신 포스포트란스퍼라제 Ⅱ; Tml t: 종양 형태의 큰 DNA 종결인자; CaMV35 x2_p: 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터; TEV 5': 번역되지 않은 TEV, 5'서열; Nos t: 노팔린 신타제 종결인자).
ABRβ1 리간드(인간 FSHβ)를 코딩하는 서열의 구성
인간 FSHβ의 아미노산 서열은 www.expasy.org에서 입수할 수 있는 UniProtKB 데이터베이스를 조회함으로써 유도되었다. 단백질 식별 번호는 P01225이다.
성숙 단백질의 서열은 본 발명의 목적을 위해 적절하게 변형되어 하기에 나타낸 새로운 아미노산 서열을 수득하였다:
Figure pct00001
생물 정보학 도구(bioinformatics tools)의 사용을 통하여, 그러한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 형성된 후, 그러한 서열은 식물 세포에서의 발현을 위해 최적화되었다.
그러한 서열의 5' 및 3'에는 pABR 벡터의 발현 카세트 내에서 정확한 클로닝을 위한 제한 효소 Eco RI 및 Xba I에 대한 인식 부위가 있다.
이러한 서열에 상응하는 DNA 단편은 실험실에서 유전자 합성 과정을 통해 수득되었다.
세포질 세망로 향하는 신호 펩티드를 포함한, ABRβ1 리간드를 코딩하는 새로운 서열을 하기에 나타내었다.
Figure pct00002
니코티아나 벤타미아나 의 현탁액에서 세포 배양
니코티아나 벤타미아나의 세포 배양물을 250ml 부피의 액체 MS 배지(Murashige 1962), 30 g/L 수크로오스 및 2 mg/L 나프탈렌-아세트산(NAA) 및 0.2 mg/L 키네틴에서 유지된다.
계대배양(Sub-culture)은 신선한 배지에서 세포 현탁액의 125ml의 분액을 옮겨 7 일마다 제조하였다.
세포를 어두운 곳에서 25 ℃의 항온으로 교반(120 rpm)하여 인큐베이트하였다.
니코티아나 벤타미아나 세포 배양의 안정적인 형질전환
pABR 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스(LBA4404)를, 100 mg/L의 스트렙토마이신 및 50 mg/L의 카나마이신(Duchefa)으로 보충된 YEP 배지(0.5 % w/v 효모 추출물, 0.5 % w/v 식물 펩톤, 25 g/L LB-브로스 Miller)에서 배양하였다.
25 ml 박테리아 배양물을 1 OD에 도달할 때까지 28 ℃, 120 rpm으로 인큐베이트된 100 ml 플라스크에서 제조하였다.
그 다음 상기 박테리아를 원심 분리(실온에서 4000 g로 10 분)에 의해 수확하고 25 ml MS에서 재현탁하였다. 상기 박테리아 현탁액 200 μl를 니코티아나 벤타미아나 배양물 25 ml(식물 세포의 신선한 무게 9 g과 동일)에 접종하였다.
25 ℃ 및 120rpm으로 어두운 곳에서 공동배양으로 48시간 후, 상기 세포를 나일론 메쉬(nylon mesh)를 사용하여 여과하고, 과량의 배양 배지로 세척한 후 동일한 배지 25 ml에 재현탁시켰다. 이어서 세포를, 0.9 % w/v 아가, 250 mg/L 카르베니실린 및 100 mg/L 카나마이신(Duchefa)으로 보충된 MS로 이루어진 선택 배지를 함유하는 페트리디쉬 위에 시딩하였다.
캡슐을 유합조직(calluse)의 출현까지 약 3 주 동안 어두운 곳에서 25 ℃로 인큐베이트하였다. 이어서, 상기 유합조직을 2 개월 동안 15 일마다 신선한 선택 배지로 옮겼다. 이 기간 후, 항생제 없는 MS에서 안정한 클론을 유지한다.
니코티아나 벤타미아나 의 현탁액에서 세포 배양물로부터의 ABRβ1 리간드의 정제 프로토콜
1. 추출 완충액의 제조
추출 완충액: 50 mM Na2HPO4, 150mM NaCl, 20mM 시트르산, 40mM 아스코르브산, 5mM EDTA, 1mM PMSF, 0.05 %(v/v) Tween-20, pH 6.5, 1 % (w/v) XAD-4 및 1 % (w/v) 폴리비닐폴리피롤리돈(PVPP)으로 보충됨.
폴리스티렌 수지 XAD-4는 추출 완충액에 첨가하기 전에 적어도 1 또는 2 시간 동안 메탄올에서 세척한 후 탈이온수로 충분히 헹구는 것으로 이루어지는 처리를 필요로 한다.
PVPP는 이의 수화를 가능하게 하기 위해 적어도 사용하기 2-4 시간 전에 추출 완충액에 첨가되어야 한다.
2. 추출
브레이드(약 50 ㎛의 컷-오프)에서 여과되고 -80 ℃에서 저장된 현탁액에서 세포의 분액을 4 ℃에서 두고 밤새 해동하였다. 20 mM Na2HPO4, 10 mM EDTA, pH 7.2의 완충액을 2 : 1의 비율로, 즉 세포 1 g 당 2 ml 완충액으로 첨가하였다. 상기 현탁액을 1 시간 동안 일정하게 교반하면서 4 ℃에서 유지시킨 다음 4 ℃로 조절된 온도에서 18000 rpm으로 20 분 동안 원심 분리하여 상등액을 버렸다.
추출 완충액을 3:1(3 ml/g 셀)의 비율로 펠렛에 첨가하고 4 ℃에서 1 시간 동안 유지하였다. 그 다음, 추출물을 4 ℃의 온도에서 20 분간 18000 rpm으로 원심 분리하여 상층액을 회수하였다.
3. 황산 암모늄에 의한 침전
황산 암모늄을 70 % 포화 농도(ABRβ1 리간드의 완전한 침전이 입증된 농도)를 수득할 때까지 추출물에 첨가하였다.
일정한 교반 하에서 용액을 4 ℃의 온도로 1 시간 동안 유지하였다. 4 ℃에서 18000 rpm으로 20 분간 원심 분리한 후, 상등액을 버리고 침전물을 단백질과 IMAC 수지 사이의 상호 작용을 촉진시키는 데 적절한 완충액에서 초기 부피의 1/10로 재현탁하였다.
4. IMAC 크로마토그래피
황산 암모늄으로 처리한 후 수득된 침전물을 20 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 8.0의 완충액에서 초기 부피의 1/10로 재현탁시키고, 18000 rpm에서 원심 분리하고 0.22 μm로 여과하였다. 결과의 용액을 20 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 8.0의 완충액과 균형을 이루는 Ni Sepharose 6 FF 수지(GE Healthcare, 17-5318-01)가 충전된 컬럼에 로딩하고, 다중 단계 구배를 사용하여 20 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 8.0의 완충액으로 용출(elute)시켰다. 흡광도는 280 및 254 nm에서 모니터링하였다.
검출 기술로서 SDS-PAGE 전기 영동 및 증강된 화학발광(Enhanced ChemiLuminescence: ECL)을 사용하는 면역블로팅 기술로 분획을 수확하였다.
이러한 분석은 토끼에서 발현되는 항-hFSHβ 폴리클로날 일차 항체(Abcam, AB171431), 호스라디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)로 유도체화된 2 차 IgG 항-토끼 항체(KPL, 474-1506) 및 참조 표준으로서 대장균에서 발현되는 인간 재조합 hFSH-β(Abnova, H00002488-Q01)를 사용한다.
5. 크기-배제 크로마토그래피
ABRβ1 리간드가 발견되는 IMAC 크로마토그래피에서 유래된 분획을 조합하여 Sephadex G-25 Medium 수지(GE Healthcare, 17-0033-01)로 충전된 컬럼 상에 로딩하였다. 상기 컬럼은 50 mM 아세트산 나트륨, 150 mM NaCl, 60 μM Tween-20, pH 5.5의 완충액으로 균형을 이루고 용출된다. 흡광도는 280 및 254 nm에서 모니터링된다.
크로마토그래피 피크에서 수확된 용출액을 그 안에 재조합 단백질의 존재를 모니터링하기 위하여 SDS-PAGE 전기 영동 및 ECL 검출을 이용한 면역블로팅 기술로 분석하였다. 이러한 분석은 토끼에서 발현되는 항-hFSHβ 폴리클로날 일차 항체(Abcam, AB171431), 호스라디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)로 유도체화된 2 차 IgG 항-토끼 항체(KPL, 474-1506) 및 참조 표준으로서 대장균에서 발현되는 인간 재조합 hFSH-β(Abnova, H00002488-Q01)를 사용한다.
6. 이온 교환 크로마토그래피
ABRβ 리간드의 존재에 대해 양성으로 밝혀진 분자 배제 크로마토그래피로부터 유래된 분획을 조합하여 50 mM 아세트산 나트륨, 150 mM NaCl, 60 μM Tween-20, pH 5.5의 완충액으로 균형을 이루는 SP Sepharose HP 수지(GE Healthcare, 17-1087-01)로 충전된 컬럼에 로딩하고, 다중 단계 구배를 사용하여 50 mM 아세트산 나트륨, 1 M NaCl, 60 μM Tween-20, pH 5.5의 완충액으로 용출시켰다. 흡광도는 280 및 254 nm에서 모니터링된다.
이전의 크로마토그래피와 마찬가지로, 그 안에 인간 재조합 단백질의 존재를 결정하기 위하여 수확된 분획을 분석하는 것이 필요하다.
PNGase F를 통한 탈글리코실화
이온-교환 크로마토그래피로부터 ABRβ1 리간드의 분액을 약 10 kDa의 컷-오프(cut-off)를 갖는 Vivaspin(VS0403, Sartorious)을 사용하여 0.5 mg/ml로 농축시키고, 50 mM NH4HCO3, 0.1 % (v/v) Rapigest SF(Waters, Manchester, UK) pH 7.9의 완충액으로 상기 완충액을 대체하였다.
단백질 농도는 제조자에 의하여 개시된 프로토콜을 사용하여 비신초닌산 분석(bicinconinic acid assay)(QuantiPro ™ BCA Assay Kit, QPBCA, Sigma Aldrich)으로 결정하였다.
1:50의 몰비(효소:기질)의 PNGase F(Roche Custom Biotech, Mannheim, Germany)를 보충한 시료를 37 ℃의 항온에서 밤새 인큐베이트하였다.
반응 종료 시, 용액을 45 트리플루오르아세트산(w/v)으로 보충하고 13,000 rpm에서 10 분간 원심 분리하였다.
그 다음, 시료를 12 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE(Laemmli 1970) 및 고성능 질량분석기로 분석하였다.
인 시투(in situ) 트립신 소화
쿠마시 브릴리언트 블루G250으로 염색된 폴리아크릴아미드 겔을 초순수 물로 헹구고 서열이 될 단백질에 상응하는 전기영동 밴드를 절개한다. 상기 밴드를 작은 조각으로 자르고 5 분 동안 100-150 μl의 초순수 물로 세척한다. 이를 원심 분리하고 액체는 제거한다. 절편 부피의 3-4 배와 동등한 양의 아세토니트릴(CH3CN) 부피가 첨가되고 큐브의 "주름진(creased)" 수축이 일어날 때까지 10-15 분 동안 기다린다.
상등액을 제거하고 동결 건조기에 의해 건조시켰다. 절편을 커버할 때까지 0.1 M NH4HCO3, 10 mM DTT의 완충액으로 재커버(recover)하고, 단백질의 디술피드 결합을 감소시키기 위하여 56 ℃에서 30 분 동안 인큐베이트하였다.
이를 원심 분리하고, 액체는 제거하고 및 상기한 바와 같이 아세토니트릴로 다시 처리하였다.
아세토니트릴을 0.1 M NH4HCO3, 55 mM 요오도아세트아미드의 완충액으로 대체하고, 시스테인 잔기를 유도체화하기 위해 실온에서 20 분 동안 빛으로부터 보호하여 인큐베이트한다.
요오도아세트아미드 용액을 제거하고 약 150 μl의 0.1M NH4HCO3 완충액으로 15 분 동안 세척하였다.
이를 원심 분리하고, 액체를 제거하고, 아세토니트릴로 다시 처리하였다.
겔 단편이 여전히 파란색 염색을 가진다면, 이를 0.1 M NH4HCO3 완충액 150 μl로 10-15 분 동안 재수화(rehydrate)시켰다.
그 다음, 같은 부피의 아세토니트릴을 첨가하고 20 분 동안 회전식 진탕기(orbital shaker)에 보관하였다.
이를 원심 분리하여 용액을 제거하고 아세토니트릴로 처리하고, 동결 건조기로 건조시켰다.
이러한 단계는 파란색 염색이 지속될 때까지 반복된다. 이어서 12.5 ng/μl의 트립신 변형 용액 13 μl를 첨가하고(Sequencing Grade Modified Trypsin V5111, Promega) 및 단편을 μg 50 mM NH4HCO3로 덮는다.
시료를 4 ℃에서 약 30-45 분 동안 보관하여 단편이 효소를 함유하는 용액을 재수화하고 흡수하도록 한다.
상기 단계 동안, 용액의 부피가 단편을 덮기에 충분한지 확인하고 50 mM NH4HCO3의 완충액을 선택적으로 첨가한다. 상기 시료를 37 ℃의 제어된 온도에서 24 시간 동안 인큐베이트하였다.
배양 종료 시, 트립신 단백질 분해로부터 유래된 펩티드가 추출되었다.
1) 25 mM NH4HCO3 완충액 10-15 μl를 용액에 첨가하고 상기 시료를 thermomixer를 사용하여 37 ℃에서 15 분간 교반하였다. 이를 원심 분리하고 겔 단편 부피의 1-2 배 부피의 CH3CN을 첨가하였다. 이를 thermomixer에서 37 ℃에서 15 분간 교반하였다. 이를 원심 분리하고 상등액을 수집하였다.
2) 잔류 겔 단편을 5 % (v/v)의 포름산(HCOOH) 40-50 μl와 혼합하였다. 시료를 37 ℃에서 15 분 동안 일정하게 교반하였다. 이를 원심 분리하고 겔 단편 부피의 1-2 배 부피의 CH3CN을 첨가하였다. 이를 thermomixer에서 37 ℃에서 15 분간 교반하였다. 이를 원심 분리하고 상등액을 수집하였다.
추출물들을 조합하고 동결 건조기에서 증발건조시켰다.
트립신 소화의 크로마토그래피 분석
인 시투에서 단백질 분해 후, 상기 단백질 물질을 동결 건조시키고 포름산:아세토니트릴:물을 2:3:95에서 재현탁시켰다.
20 μl를 2 %(v/v) 아세토니트릴 수용액, 2 %(v/v) 포름산으로 균형화된 Vydac C18 컬럼(1x150 mm, 5 μm 입자 크기, 300Å 다공성) 상에 로딩하였다. 상기 컬럼을 25 분에 걸쳐 아세토니트릴 3-65 %의 선형 구배로 50 μl/분으로 용출시켰다.
질량 분석기 Xevo G2-XS Q-TOF를 사용하여 총 이온 전류(Total Ion Current: TIC)를 모니터링함으로써 용출액을 검사하였다.
분자 배제 크로마토그래피에 의한 응집 백분율의 결정
ABRβ1 리간드의 표준 응집 상태는 10-600 kDa의 분할 간격을 갖는 YARRA 컬럼, 3 mm SEC 3000, 150 mm x 7.8 mm(Phenomenex)를 사용하는 분자 배제 크로마토그래피에 의해 평가되었다.
ABRβ1 리간드(160 μg/ml)의 분액 20 μl를 로드하고 컬럼을 20 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.4의 완충액으로 용출시켰다.
형광 분석 기술에 의한 안정성 분석
ABRβ1의 알리코트(250 μl의 정제된 단백질)를 최종 부피 1600 μl(20 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.1 % PEG-8000(w/v)의 완충액으로 1 μM과 동일한 ABRβ1의 최종 농도)로 희석하였다. 시료를 분석하고(T0), 그 다음 4 ℃에서 1 주일 동안 저장하였다. 동일한 시료에 대해 24 시간 간격으로 분석을 반복하였다. 형광 스펙트럼은 T=25 ℃, λexc=280 nm, λem=295-500 nm의 조건 하에서 수행되었다.
술피드 결합 할당
ABRβ1 리간드의 알리코트를 전술한 바와 같이 PNGase F를 통한 효소적 탈글리코실화하고 반응 혼합물을 비환원성 조건에서 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 분석하였다. 상기 겔은 Coumassie Brilliant Blue G250으로 염색되었다. 완전히 탈글리코실화된 ABRβ1 리간드에 상응하는 밴드를 전술한 바와 같이 인 시투에서 3 배 소화시키되 술피드 결합은 온전하게 유지하고 시스테인 잔기의 환원 및 알킬화를 피하였다.
트립신 단백질 분해로부터 유도된 펩티드 혼합물의 동결 건조된 산물을 효소:기질의 몰 비율이 1: 50인 서브틸리신(Subtilisin Carlsberg P-5380, Sigma)으로 보충된 50 mM NH4HCO3, 1 mM CaCl2, pH 8.2의 완충액에서 회수하였다.
상기 용액을 37 ℃의 조절된 온도로 밤새 인큐베이트한 후 동결 건조시켰다.
상기 시료를 다시 포름산:아세토니트릴:물 2 : 3 : 95에 용해시켰다.
20 μl의 부피를 Vydac C18 컬럼(1x150 mm, 5 μm 입자 크기, 300Å 공극률) 상에 로딩하였다. 상기 컬럼을 12 분에 걸쳐 3 % 내지 65 %의 아세토니트릴의 선형 구배로 50 μl/분의 일정한 흐름으로 용출시켰다.
질량 분석기 Xevo G2-XS Q-TOF를 사용하여 총 이온 전류(Total Ion Current: TIC) 신호를 기록함으로써 분석을 모니터링하고 존재하는 종의 분자량을 각 크로마토그래피 피크에 대해 결정하였다.
세르톨리 세포의 단리 및 배양
사춘기 전의 수컷 동물, 7-15일 된 큰 요크셔 돼지 품종(Large-White breed)으로부터 새끼 돼지의 고환을 세르톨리 세포 준비에 사용하였다. 상기 물질은 교배에 관한 거세의 일상적인 작업 동안 자격을 갖춘 자에 의하여 적절히 수집되고 보관되었으므로, 연구 목적을 위한 인 비트로 실험에서 이의 사용은 지역 윤리위원회의 승인이 필요하지 않았다.
SC 단리 절차는 마취된 새끼 돼지로부터 고환을 제거하는 것을 포함한다. 섬유질 캡을 제거한 후, 상기 고환을 미세하게 파쇄하여 균일한 조직 단편화를 수득한 후, Hanks 평형 식염수(HBSS, Sigma-Aldrich)에서 2 mg/ml 콜라게나제 P(Roche Diagnostics)를 사용하여 연속적인 효소 소화를 하였다.
상기 소화는 세정관(seminiferous tubule)의 물리적 분해까지 계속된다.
세척 후, 분해된 조직의 현탁액을 트립신 및 DNase I로 보충된 HBSS 용액과 함께 15 분 동안 인큐베이트하였다(Sigma-Aldrich).
이 두 번째 소화가 끝날 시, 옮겨 부은 후 수득된 조직의 펠렛을 HBSS에서 두 번 세척한 다음 120 rpm에서 3 분간 원심 분리하였다. 생성된 펠렛을 스테인레스 스틸 500 마이크로미터 메쉬를 통해 여과하고 2 M 글리신, 2 mM EDTA, pH 7.2로 이루어진 완충액에 재현탁시켰다. 목적은 모든 잔여 레이디그 세포(Leydig cell)를 제거하는 것이다.
그 다음, 관주위 세포(peritubular cell)가 없는 잔류 세관을 수확하고 0.166 nM 레티노산(Sigma-Aldrich) 및 5 ml/500 ml 인슐린/셀레늄(Becton Dickinson)의 존재 하에 배양하여 유지하였다. 세포 배양은 37 ℃에서 인큐베이터 내에 준비된다. 3 일간 배양한 후, 임의의 잔류 생식 세포를 제거하기 위하여 세포를 처리하였다(Galdieri et al. 1981; Korbutt et al. 1997; Luca et al. 2005; Luca et al.2007).
아로마타제 효소 활성의 측정
다양한 호르몬 치료를 진행하기 전에, 형광 현미경(Nikon Optiphot-2, Nikon Corporation)에서 에티듐 브로미드와 플루오레세인 디아세테이트(Sigma-Aldrich)로 염색하여 배양된 세포의 생존력을 평가하였다. α-아로마타제의 활성을 평가하기 위해, 20×106을 상이한 농도의 난포 자극 호르몬(Gonal-F)로 또는 동일한 농도의 ABRβ1 리간드로 3 일 동안 처리하였고; 처리 기간이 끝날 때, 0.2 mg/ml 테스토스테론을 배양물에 첨가하고 추가로 8 시간 동안 배양하였다.
자극이 끝날 시, 생산된 17β-에스트라디올(E2)이 세포 배양 배지에서 방출되고 특이적 고감도 키트(ADⅥA Centaur, Estradiol-6 Ⅲ, Bayer Diagnostics)를 사용하여 평가되었다.
형광 분자를 이용한 ABRβ1 리간드 표지
인 비트로 결합 및 인 비보 국소화 실험을 위해, 상기 ABRβ1 리간드를 4-클로로-7-니트로벤조푸라잔(NBD)(Sigma) 및 Alexa Fluor 647(Thermo Fisher Scientific)의 두 가지 상이한 형광 분자와 접합시켰다.
NBD 표지를 위해, 형광 탐침의 아세토니트릴에서 50 mM의 농축 용액을 제조하였다.
50 mM 아세트산 나트륨, 500 mM NaCl, 60 μM Tween 20, 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid: EDTA), 30 mM 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄(Tris/HCl) pH 7.0 및 5 mM NBD의 용액에서 ABRβ1 리간드 50 μM/ml의 표지 반응이 일어난다(Bernal-Perez et al. 2012).
상기 용액을 24 ℃에서 16 시간 동안 인큐베이트하고, 단백질의 표지와 응집체의 존재 가능성을 형광광도계 및 형광 현미경 분석(exc. 465 nm; em. 515 nm)을 통해 평가하였다. ABRβ1 리간드와 Alexa Fluor 647(exc. 650 nm; em. 665 nm)의 접합에 관해서는, 제조자가 제공한 지침에 따라 상용 키트 Alexa Fluor 647 항체 표지 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다.
유세포 분석기에 의한 ABRβ1 리간드 수용체에 대한 결합 분석
안정된 인간 세포주(난소암의 OVCAR-3, OVCAR-5 및 결장암의 LS180) 및 일차 난소 암종 A116을 10 % 열에 의해 불활성화된 우태아 혈청, 1 % 글루타민 및 1 % 페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI1640 배지에서 배양하였다.
일부 대조군 실험은 혈청 성분 또는 항생제에 의한 임의의 간섭을 배제하기 위해 항생제가 없거나, 무-혈청 배지에서 24 시간 동안 배양한 후에 수행되었다.
면역 형광 분석에서 세포를 트립신-EDTA로 배양하여 배양 지지체로부터 떼어내었고, 계수한 후 그들을 100,000 세포/100 μl의 농도로 희석하여 형광 ABRβ1 리간드와 함께 인큐베이트하였다. 세포형광 분석(cytofluorimetric analysis)을 사용한 직접 면역형광(direct immunofluorescence)은 NBD로 표지된 10 μl/ml(350 ng) ABRβ1 리간드와 함께 37 ℃에서 15 분 동안 사전 배양된 세포에서 수행되었고, 상기 분석은 유세포 분석기에서 FITC 채널을 사용하여 수행되었다. 상기 세포 표지는 또한 ABRβ1 리간드의 더 낮은 농도에서 강조될 수 있으며, 상기 세포가 70 ng/ml 미만의 ABRβ1 리간드 농도와 사전 배양될 때 형광 신호는 더 이상 분명하지 않다. 유세포 분석 전에, 특정 수용체로부터 리간드의 분리를 야기함으로써 결과를 변경할 수 있는 단백질분해 효소의 개입없이 세포 생존력 및 ABRβ1 리간드의 결합을 평가하기 위하여, 일부 실험을 기질로부터 세포 분리없이 수행하였으며, 이러한 분석은 공초점 현미경 Olympus FV500을 사용하여 수행되었다.
ABRβ1 내재화
FSHR 수용체의 내재화 동역학에 대한 ABRβ1 리간드의 효과 분석은 면역 형광 및 공초점 현미경을 통해 수행되었다. 슬라이드 상에 시딩된 HeLa 세포(완전한 DMEM 배지에서 배양)를 인간 FSHR의 과발현을 가능하게 하는 플라스미드로 형질감염시키고, 상기 세포를 시딩하고 24 시간 후에 0.1 μg/ml Gonal-F®, ABRβ1 또는 NBD로 표지된 ABRβ1으로 처리하였다.
그 다음 세포를 4 ℃에서 30 분간 4 % 파라포름알데히드(w:v PBS1X, Phosphate-buffered saline)에 고정시키고 PBS 1X(각각 5 분 3 회 세척)로 세척하였다. 면역 형광법의 경우, 상기 고정된 세포를 1 % BSA(우혈청 알부민) 및 0.1 % Triton-X100(Sigma)을 보충한 PBS 1X로 5분 동안 실온에서 인큐베이트하여 침투시켰다. PBS 1X로 세척하여 투과성 용액을 제거하였다(각각 5 분씩 3 회 세척). 그 다음, 세포를 37 ℃에서 2 시간 동안 1 % BSA가 보충된 생리 식염수로 희석된 1 차 항체(항-FSHR SAB4501041)와 함께 인큐베이트하였다. 배양이 끝날 시 PBS 1X로 세척(각각 5 분 3 회)하여 1 차 항체를 제거하였고 상기 세포를 1 % BSA가 보충된 PBS 1X로 희석한 적절한 2 차 항체와 함께 37℃에서 30 분 동안 배양하였다. 상기 연구에서는, 시아닌-3에 접합된 2 차 항체를 사용하였다(550 nm에서 여기되어 570 nm에서 적색 빛을 방출함). 그 다음, 상기 세포를 PBS 1X로 세척(각각 5 분 3 회 세척)하고, 핵을 DAPI(4',6-디아미딘-2-페닐인돌)(PBS 1X에서 1:5000, v:v)(Sigma)로 실온에서 5분 동안 표지하였다. 상기 슬라이드를 Elvanol에 장착하고, 4℃ 에서 저장하고 공초점 현미경 Leica SP5 또는 형광 현미경 LEICA DFC300FX로 분석한다. NBD로 표지된 ABRβ1으로 처리하는 경우, 세포를 세척 후에 고정시키고, FITC 채널에서 관찰을 위해 한 쌍의 필터를 사용하여 현미경으로 관찰을 위해 즉시 준비한다(전술한 바와 같음).
세포 성장 곡선의 분석
CAOV-3 세포를 10 % 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민(Sigma)으로 보충된 DMEM에서 배양하였고, MDA-MB-231 세포를 10 % 우태아 혈청으로 보충된 L15 배지(ATCC)에서 배양하였다. OVCAR-3 세포를 20 % 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민 및 0.01 mg/ml 인슐린(Sigma)으로 보충된 RPMI에서 배양하였다.
세포 배양물은 37 ℃의 인큐베이터에 보관한다. 성장 속도의 분석을 위해, 상기 세포는 세포주에 따라 적합한 배지의 존재 하에 5x104 세포/웰의 농도로 6-웰 플레이트 상에 시딩하였다. 상기 세포를 Gonal-F®, ABRβ1 리간드 또는 둘 모두로 0.1 μg/ml의 농도로 처리하였다. 세포 성장을 Gonal-F® 및 ABRβ1을 배양 배지에 첨가한 후 24 시간, 48 시간 및 72 시간 후에 평가하였다. 세포 증식 속도는 생존력 테스트인 Trypan blue exclusion test를 사용하여 지시된 시간에 세포 계수를 통해 평가하였다.
인간 종양 주에서 FSHR 발현의 분석.
상기 분석은 인간 FSHR에 대해 개발된 특이적 일차 항체를 사용하여 유세포 분석기에서 수행되었다. 상기 세포를 배양 플라스크로부터 수확하고 측정까지 얼음에 보관하였다. 3가지 비교 시료를 각 실험을 위해 준비하였다: ⅰ) 비처리된 세포, ⅱ) 토끼(SAB4501041, Sigma-Aldrich)에서 개발된 FSHR에 대한 일차 항체 및 Alexa Fluor® 488 (TermoFisher)와 접합된 항-IgG 2차 항체와 함께 배양한 세포, ⅲ) 2 차 항체 단독으로 배양한 세포. 세 가지 실험 조건을 준비하면 신호 양성을 할당하고 임의의 위양성(false positive)을 배제하도록 한다. 표지 및 세척이 끝나면, 상기 세포를 FACS에서 분석하였다. 각 시료에 대해 2x10^5 이벤트(세포)를 획득하고 분석하였다.
NB3 세포(유아 신경모세포종 모델)에서 FSHR에 대한 ABRβ1의 결합 분석
NBD로 표지된 ABRβ1 리간드를 사용하여 FACS 분석에 의해 수득된 데이터는 분석된 모든 세포에서 세포 표면 상에 FSHR을 발현하는 표지화된 세포의 백분율이 96 % 초과임을 나타낸다.
NBD로 표지된 ABRβ1의 내재화에 대한 유세포 분석기 분석.
실험 24 시간 전에 세포(4x10^4 OVCAR-3 또는 MDA-MB-231)를 24-웰 플레이트에 시딩하고 형광 ABRβ1 리간드 농도를 증가시키면서 1 시간 동안 인큐베이트하였다. 세포를 베르센 용액으로 세척하고 트립신으로 배양 플레이트에서 분리한 후 FBS 200 μL를 첨가하여 중화시켰다. 그 다음, 세포를 원심 분리하고 유세포 분석기 측정을 위해 베르센 용액에 재현탁하였다. 488 nm 레이저를 형광단 여기(NBD로 유도체화된 ABRβ1)를 위하여 사용하였다.
내재화 후의 리소좀 내 ABRβ1 축적 분석
상기 리간드 ABRβ1 리간드의 내재화 및 세포내 국소화는 공초점 현미경을 사용하여 수행하였다. Alexa Fluor 647로 유도체화된 형광 ABRβ1 리간드와 함께 인큐베이트하기 24 시간 전에 세포를 공초점 현미경 검사를 위해 슬라이드에 시딩하였다. 상기 세포를 표지된 ABRβ1 리간드(250 ng/ml ABRβ1 및 LysoTracker Green DND-26, 75 nM)와 함께 완전 배지에서 37 ℃로 1 시간 동안 공동 인큐베이트하였다. 이미지를 획득하기 전에, 상기 세포를 HBSS 용액으로 두 번 세척하고, 동일한 완충액에 보관하여 즉시 현미경으로 분석하였다.
NB3 세포에서 ABRβ1의 내재화
NB3 세포를 DMEM에서 배양하고 실험 24 시간 전에 슬라이드에 시딩하였다. 상기 세포를 37 ℃ 인큐베이터에서 15 분 동안 NBD로 표지된 ABRβ1 리간드 150 ng/ml로 인큐베이트하였다. 처리 종료 시에, 세포를 식염수로 세척하고, 상이한 기간 동안 완전 배양 배지에서 인큐베이트하고, 식염수로 헹구고, FITC를 위한 필터 쌍을 사용하여 형광 현미경 하에서 관찰하였다. 이것은 세포질에 국소화된 형광 소포의 출현으로 인해 세포에서 형광 ABRβ1의 내재화를 평가할 수 있다.
Gonal-F®-유도된 cAMP 생산의 분석 및 ABRβ1에 의한 중화
본 분석은 HEK293 세포를 사용하였으며, 인간 FSHR(HG15960-UT DBA) 및 시클릭 AMP-(cAMP), Epac1-camps에 대한 바이오센서의 외인성 발현은 두 구조를 코딩하는 유전자의 일시적인 공동-형질감염을 통해 수득되었다. 상기 분석은, 실험실에서 이전에 최적화되고 검증된 프로토콜로, 단일 생존 세포에서 형광 현미경을 사용하였다.
효능제 Gonal-F®로 인간 FSHR의 활성화에 의하여 유도된 세포내 cAMP 변이의 동적 측정을 ABRβ1 리간드의 부재 또는 존재 하에서 다양한 사용 농도로 비교하였다. FSHR 수용체의 내재화 동역학에 대한 ABRβ1 리간드의 효과 분석은 면역 형광 및 공초점 현미경을 통해 수행되었다.
HEK293 세포의 형질 감염은 실험실에서 최적화된, 제조사의 지침에 따라 리포펙타민(Invitrogen)을 통해 수득되었다. 공동-형질감염 혼합물은 Epac2-camps와 FSHR의 DNA를 1:1의 비율로 혼합하여 수득된다. 공동-형질감염 절차가 끝나면, 상기 세포를 세척하고 37 ℃에서 48 시간 동안 DMEM 배양 배지에서 인큐베이트하였다(형질감염된 외인성 단백질 합성을 허용하기 위해).
ABRβ1 분자의 약학적 분석은, FSH 수용체 활성화에 의해 합성이 매우 신속하고 활성화된, 생존 세포에서 cAMP의 세포내 수준의 변화를 측정함으로써 수행되었다. 상기 방법은 cAMP에 대한 FRET 기술에 기초한 바이오센서의 세포에서의 발현에 기초한다(Nikolaev et al. 2006). 상기 바이오센서는 cAMP 고친화성 단백질 도메인에 의해 연결된 형광 단백질 GFP의 두 가지 색상 변이를 코딩한다. 2 개의 GFP 변이체의 방출의 상대적인 강도는 cAMP의 세포내 농도에 따라 변한다. 형광 변화의 측정은, 검증된 감광성 방출 비율 방법(sensitized emission ratio method)에 따라, 480 +/- 25 nm 채널에서의 방출 강도와 535 +/- 35 nm 채널에서의 방출 강도 사이의 비율을 계산하여, 단일 셀의 형광 현미경에 의해 수행된다. HEK293 세포를 24 mm 직경을 가진 슬라이드에 시딩하고 EPAC1-cAMP 및 FSHR을 공동-발현하도록 형질감염시켰다. 상기 슬라이드는 이미지 실험을 위해 도립 현미경과 함께 사용하기에 적절한 작은 챔버에 장착된다. 배양 배지를 제거하고 Hepes로 완충시킨 링거 생리 식염수(변형된 링거: 125 NaCl, 5 KCl; 1 Na3PO4; 1 MgSO4; 5.5 글루코오스; 20 Hepes; 1.8 CaCl2, H2O 중에, pH 7.4)로 대체하였다.
cAMP 합성을 결정하기 위해, 상기 세포를 1 내지 100 ng/ml의 농도의 Gonal-F®로 처리하였다. 상기 효능제 약물은 기준선 FRET 수준을 추정하는 것을 목표로 2 분 동안 획득한 후 이미지 용액에 직접 첨가하였다. 별도의 실험 세트에서, 상기 cAMP 측정은 ABRβ1 리간드와 함께 10-500 ng/ml 범위의 농도로 5 분간 인큐베이트한 세포에서 동일한 농도의 Gonal-F®로 수행되었다. 이미지 획득 및 분석은 Image J 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD, USA)에 의해 수행되었다. 실험 그룹 간의 비교는 통계학적으로 유의한 P<0.05를 고려하여 Anova 테스트를 사용하여 수행되었다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
당업자는 전술한 설명으로부터 본 발명의 이점을 이해할 수 있을 것이다.
FSH의 β 서브유닛에 관해서는 놀랍게도 그것이 소위 cAMP 캐스케이드를 활성화시키지 않는다는 것이 발견되었다.
대신에, 재조합적으로 생산된 β 서브유닛, 및 특히, 니코티아나 벤타미아나 에서 재조합 기술 및 발현에 의하여 수득된 ABRβ1 서브유닛에 관해서는, 이는 치료 단백질 생산에서 보통 사용되는 바이러스, 종양 유전자(oncogene), 프리온, 독소 또는 유해한 시약 잔류물에 의한 오염의 위험이 거의 제로이기 때문에 높은 품질 및 생물학적 안전성을 포함하는 많은 이점을 제공할 수 있음이 증명되었다.
식물 숙주에서 그러한 ABRβ1 서브유닛을 수득하는 능력은 똑같이 유용하고 놀랍다.
또한, 상기 ABRβ1 서브유닛은 FSH 및 항체보다 유의하게 훨씬 더 높은, 놀라운 안정성을 입증하였다.
이러한 이점은 FSH 수용체에 대한 활성 및 친화성을 손상시키지 않았다; 특히, 친화성은 나노몰(nM) 수준이었다.
추가적 이점은 또한 cAMP 캐스케이드의 비-활성화에 의하여 입증되는 바와 같이, ABRβ1 서브유닛이 FSH 수용체를 활성화시키지 않는다는 것이다.
이러한 특성은 특히 효모, 곤충, 포유 동물 및 구체적으로 인간 세포의 FSHβ 서브유닛의 글리코실화 패턴과는 다른 글리코실화 패턴에 비추어 볼 때 놀랍고 예기치 못한 것이었다.
FSHβ 및 ABRβ1 서브유닛 모두에 대해, FSHR과의 특이적 결합은 암 세포의 성장률을 증가시키지 않는 것으로 나타났다.
수용체를 활성화시키지는 않은 반면, 상기 ABRβ1은 모델 시스템으로 사용된 세포에서 유의한 내재화율을 나타내었다.
선행 기술은 치료법에서 FSHβ 서브유닛의 펩티드 단편의 가능한 적용을 개시하였다.
이는 어떤 방식으로도 FSHβ 서브유닛의 치료적 적용을 명백하게 만들지는 않는다.
사실상 두 구조는 유의한 차이를 가진다.
예를 들어, Agris et al.(J. Prot. Chem. 1992)로부터 알려져 있는, FSH33-53 펩티드의 구조는 잔기 41-46과 50-52 사이에 2 개의 턴(turn)을 포함하는 반면, FSHβ 서브유닛의 동일한 영역에서는 β-가닥 구조(β-strand conformation)를 갖는다. 더욱이, 상기 펩티드는 아미노산 34-36 사이에 작은 나선(helix) 영역을 가지지만, FSHβ-서브유닛에서는 동일한 영역이 β-가닥이다. 또 다른 차이점은 시스테인 Cys51이 FSHβ 서브유닛에서 디술피드 결합을 형성한다는 것이며, 이 결합은 상기 펩티드에는 없다.
본 발명의 절대적으로 중요한 이점은 신경모세포종의 치료 및 진단에 대한 잠재적 적용에 있다.
신경모세포종은 사실상 유아기에 가장 흔한 두개외 고형암으로, 신경 능선(neural crest)의 미분화 세포에서 기원한다.
이는 1 세 이하의 소아에서 가장 흔한 암이며, 6 세 이하의 연령대에 널리 퍼져 있다.
원발성 종양은 종종 부신의 속질 영역 또는 척수주위 신경절(paraspinous ganglia)에서 발견되며, 불행하게도 진단 당시에는 전이가 이미 50 % 이상의 사례에서 존재한다.
신경모세포종을 가진 환자에서, MYCN 종양유전자 발현 분석(V-Myc Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene Neuroblastoma)은 사례 중 20 %에서 양성이며, 이는 치명적 예후의 높은 위험과 밀접하게 상관 관계가 있다.
현재, MYCN 증폭은 신경모세포종에서의 위험 분담(allocation)에 대한 최선의 유전자 마커를 나타낸다.
사망 위험의 분담은, 신경모세포종의 진행 단계(Brodeur et al. 1993), 진단 시 연령(Brodeur et al. 1988), MYCN의 증폭(Seeger et al. 1985) 및 조직학적 검사(Shimada et al. 1984)를 포함하는, 여러 임상적 및 생물학적 요인을 통합한 것에 기초한다.
이러한 모든 기준들 중에서, 나이와 조기 진단은 전이 환자에서 위험의 분담에 대한 가장 중요한 변수이다.
중간 위험 그룹은 출생 1 년이 되기 전에 진단받은 환자를 포함한다.
대신에, 진단이 지연된 환자는 고위험 부류에 포함되는 반면, 저 위험과 중간 위험 환자는 일반적으로 약 80 %의 생존율로 양호한 예후를 가진다.
생존율이 40 % 이하로 떨어지는 고위험 환자에서의 상황은 극히 불리하다.
또한, 항암 요법에 대한 반응이 없거나 재발이 높은 확률로 발생하는 "초고위험" 부류의 환자가 최근 확인되었다(Maris et al. 2007; Matthay et al. 2012).
신경모세포종의 치료를 위해 현재 연구되고 있는 치료법은, 건강한 조직에 관련하여 우선적으로 종양에 포착되는 방사성 표지 분자, 표면 종양 항원에 대한 단일클론 항체를 사용하는 면역요법 및 세포 주기를 조절하는 키나제의 합성 억제제에 기초한다.
그러나 항체의 불안정성과 종양 조직에 대한 다른 분자의 제한된 특이성으로 인해, 심각한 부작용이 환자에게 발생하여 치료 프로토콜의 효과가 제한된다(Matthay et al. 2012b).
본 발명은 현재 이용가능한 치료에 대한 유망한 대안을 나타낼 수 있다.
<110> ABR - Active Botanicals Research S. r. L. <120> Ligands of the FSH hormone receptor in the diagnosis and treatment of tumors <130> @E0111478 <150> IT 102016000101852 <151> 2016-10-11 <150> IT 102016000101862 <151> 2016-10-11 <150> IT 102016000101870 <151> 2016-10-11 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30 Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln 35 40 45 Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro 50 55 60 Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 75 80 Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val 85 90 95 Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu 100 105 110 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FSHR ligand <400> 2 His His His His His His Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile 1 5 10 15 Ala Ile Glu Lys Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr 20 25 30 Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro 35 40 45 Ala Arg Pro Lys Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr 50 55 60 Glu Thr Val Arg Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp 85 90 95 Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe 100 105 110 Gly Glu Met Lys Glu Lys Asp Glu Leu 115 120 <210> 3 <211> 472 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding SEQ ID. n. 2 <400> 3 gaattcaaca atggctactc agagaagggc taacccatct tctcttcacc tgattaccgt 60 gttctctctg cttgtggctg tggtgtctgc tgaggtgttc catcatcacc atcatcacaa 120 ttcttgcgag ctgaccaaca tcaccattgc tatcgagaaa gaagagtgca ggttctgcat 180 cagcatcaac actacttggt gcgctggtta ctgctacacc agggatcttg tgtacaagga 240 tcctgctagg cctaagatcc aaaagacctg caccttcaaa gagctggttt acgagactgt 300 tagggtgcca ggttgtgctc atcatgctga ttctctgtac acctaccctg ttgctactca 360 gtgccattgc ggtaagtgcg atagcgattc tactgattgc accgtgagag gtctgggacc 420 ttcttactgt tctttcggtg agatgaaaga aaaggatgag ctgtagtcta ga 472

Claims (50)

  1. 서열 번호 2에 상응하는 서열 또는 이와 적어도 약 90%, 바람직하게는 약 90-99.9% 및 보다 바람직하게는 약 95-97%의 유사성을 가지는 서열을 특징으로 하는 인간 난포 자극 호르몬 수용체(human follicle stimulating hormone receptor: FSHR)의 리간드.
  2. 서열 번호 3에 상응하는 서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 성숙 단백질의 아르기닌 잔기 N13 및 N30에 글리코실화 부위를 포함하고, 상기 글리코실화 부위는 각각 2 개의 N-아세틸글루코사민 잔기 및 만노오스 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 의학적 사용을 위한 것인 인간 난포 호르몬 수용체의 리간드.
  5. 청구항 1 내지 4에 있어서, 종양의 치료 및/또는 진단에서의 의학적 사용을 위한 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  6. 청구항 4 또는 5에 있어서, 종양의 치료 및/또는 진단에 사용하기 위한 것으로, 상기 종양은 원발성 또는 전이성 고형 종양인 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  7. 청구항 4 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 종양의 치료에 사용하기 위한 것으로, 상기 종양은 전립선 암, 구체적으로 전립선 샘암, 유선, 결장, 췌장, 신장, 폐, 간, 고환, 난소, 뇌 및 갑상선 암, 육종을 포함하는 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  8. 청구항 4 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 종양의 치료에 사용하기 위한 것으로,
    상기 리간드는:
    -세포 독성제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 카페시타빈(capecitabine)과 같은 피리미딘 길항제, 캄토테신 군(camptothecins family), 예를 들어 이리노테칸(irinotecan)과 같은 효소 억제제를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 세포 독성제의 부류;
    -알킬화 제제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 시스플라틴(cisplatin)과 같은 금속 염 군, 독소루비신(doxorubicin)과 같은 DNA 인터칼레이터(DNA intercalator), 안트라사이클린 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 알킬화제의 부류;
    -단백질 합성 조절제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 보르테조밉(bortezomib)과 같은 프로테아좀 억제제 군, 템시롤리무스(temsirolimus)와 같은 mTOR 억제제 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 단백질 합성 조절제의 부류;
    -유사 분열 억제제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 메이탄신(maytansine)과 같은 안사미토신 군(ansamitocin family), 아우리스타틴 E(auristatin E)와 같은 미세소관 중합 억제제 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 유사 분열 억제제의 부류;
    -β-방출 방사성동위원소의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 131I, 169Er, 177Lu, 186Re, 153Sm, 89Sr 및 90Y를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 β-방출 방사성동위원소의 부류를 포함하는 그룹으로부터 선택된 항-종양 활성을 가지는 분자와 접합된 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  9. 청구항 4 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 항 종양 활성을 가지는 하나 이상의 활성제와 조합하여 종양의 치료에 사용하기 위한 것으로, 접합되거나 비접합된 형태인 것인, 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  10. 청구항 4 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 종양의 진단에 사용하기 위한 및/또는 인 비트로(in vitro) 분석을 위한 것으로,
    상기 리간드는:
    -플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate: FITC), 피코에리트린(phycoerythrin: PE) 또는 인도시아닌(indocyanine: Cy5)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 형광 분자; 또는
    -123I, 111In, 188Re, 18F, 35S, 99Tc를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방사성 분자;
    -나노 입자에 접합된 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  11. 청구항 1 또는 2또는 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리간드는:
    -세포 독성제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 카페시타빈과 같은 피리미딘 길항제, 캄토테신 군, 예를 들어 이리노테칸과 같은 효소 억제제를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 세포 독성제의 부류;
    -알킬화 제제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 시스플라틴과 같은 금속 염 군, 독소루비신과 같은 DNA 인터칼레이터, 안트라사이클린 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 알킬화제의 부류;
    -단백질 합성 조절제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 보르테조밉과 같은 프로테아좀 억제제 군, 템시롤리무스와 같은 mTOR 억제제 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 단백질 합성 조절제의 부류;
    -유사 분열 억제제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 메이탄신과 같은 안사미토신 군, 아우리스타틴 E와 같은 미세소관 중합 억제제 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 유사 분열 억제제의 부류;
    -β-방출 방사성동위원소의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 131I, 169Er, 177Lu, 186Re, 153Sm, 89Sr 및 90Y를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 β-방출 방사성동위원소의 부류를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 항-종양 활성을 가지는 분자에 접합된 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  12. 청구항 1 또는 2 또는 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리간드는:
    -플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE) 또는 인도시아닌(Cy5)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 형광 분자;
    -123I, 111In, 188Re, 18F, 35S, 99Tc를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방사성 분자;
    -나노 입자를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 진단 활성을 가지는 분자에 접합된 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  13. 청구항 1 또는 2 또는 3에 따른 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 제제.
  14. 청구항 11 또는 12에 따른 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드 및/또는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 제제.
  15. 청구항 13 또는 14에 있어서, 정맥내 투여를 위한 것인 약학적 제제.
  16. 청구항 1 또는 2 또는 3에 따른 상기 수용체의 인 비트로 불활성화를 위한 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드의 용도.
  17. 아미노산 서열 KDEL의 도입을 통하여 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(the β subunit of the human follicle stimulating hormone: FSHβ)의 서열의 C-말단 영역을 변형시키는 단계를 포함하는, 청구항 1 또는 2 또는 3 중 어느 한 항에 따른 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드를 제조하는 방법.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(FSHβ)의 N-말단 서열에 His-태그를 도입하는 단계를 더 포함하는 것인, 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드를 제조하는 방법.
  19. 의학적 사용을 위하여 인간 난포 자극 호르몬의 β 서브유닛(FSHβ)에 의해 나타내어지는 것을 특징으로 하는 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  20. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 종양의 치료 및/또는 진단에서의 의학적 사용을 위한 것인, 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  21. 청구항 19 또는 20에 있어서, 종양의 치료 및/또는 진단에 사용하기 위한 것으로, 상기 종양은 원발성 또는 전이성 고형 종양인 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  22. 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 종양은 전립선 암 및, 구체적으로 전립선 샘암, 유선, 결장, 췌장, 신장, 폐, 간, 고환, 난소, 뇌 및 갑상선 암, 육종을 포함하는 것인, 인간 난포 자극 호르몬 수용체의 리간드.
  23. 청구항 4 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 종양의 치료에 사용하기 위한 것으로,
    상기 리간드는:
    -세포 독성제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 카페시타빈과 같은 피리미딘 길항제, 캄토테신 군, 예를 들어 이리노테칸과 같은 효소 억제제를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 세포 독성제의 부류;
    -알킬화 제제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 시스플라틴과 같은 금속 염 군, 독소루비신과 같은 DNA 인터칼레이터, 안트라사이클린 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 알킬화제의 부류;
    -단백질 합성 조절제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 보르테조밉과 같은 프로테아좀 억제제 군, 템시롤리무스와 같은 mTOR 억제제 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 단백질 합성 조절제의 부류;
    -유사 분열 억제제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 메이탄신과 같은 안사미토신 군, 아우리스타틴 E와 같은 미세소관 중합 억제제 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 유사 분열 억제제의 부류;
    -β-방출 방사성동위원소의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 131I, 169Er, 177Lu, 186Re, 153Sm, 89Sr 및 90Y를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 β-방출 방사성동위원소의 부류를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 항-종양 활성을 가지는 분자에 접합된 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  24. 청구항 19 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 접합되거나 비접합된 형태로, 항-종양 활성을 가지는 활성제와 조합하여 종양의 치료에 사용하기 위한 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  25. 청구항 19 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 종양의 진단에 사용하기 위한 및/또는 인 비트로 분석을 위한것으로,
    상기 서브유닛은:
    -플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE) 또는 인도시아닌(Cy5)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 형광 분자; 또는
    -123I, 111In, 188Re, 18F, 35S, 99Tc를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방사성 분자;
    -나노 입자에 접합된 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  26. 청구항 19 내지 25 중 어느 한 항에 있어서,
    -세포 독성제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 카페시타빈과 같은 피리미딘 길항제, 캄토테신 군, 예를 들어 이리노테칸과 같은 효소 억제제를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 세포 독성제의 부류;
    -알킬화 제제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 시스플라틴과 같은 금속 염 군, 독소루비신과 같은 DNA 인터칼레이터, 안트라사이클린 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 알킬화제의 부류;
    -단백질 합성 조절제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 보르테조밉과 같은 프로테아좀 억제제 군, 템시롤리무스와 같은 mTOR 억제제 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 단백질 합성 조절제의 부류;
    -유사 분열 억제제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 메이탄신과 같은 안사미토신 군, 아우리스타틴 E와 같은 미세소관 중합 억제제 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 유사 분열 억제제의 부류;
    -β-방출 방사성동위원소의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 131I, 169Er, 177Lu, 186Re, 153Sm, 89Sr 및 90Y를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 β-방출 방사성동위원소의 부류를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 항-종양 활성을 가지는 분자에 접합된 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  27. 청구항 19 내지 26 중 어느 한 항에 있어서,
    -플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE) 또는 인도시아닌(Cy5)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 형광 분자;
    -123I, 111In, 188Re, 18F, 35S, 99Tc를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방사성 분자;
    -나노 입자를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 진단 활성을 가진 분자에 접합된 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체의 리간드.
  28. 청구항 19 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서브유닛은 인간 기원 또는 재조합 DNA 기술에 의해 수득된 것인 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드.
  29. 청구항 19 내지 28 중 어느 한 항에 따른 인간 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR)의 리간드 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 제제.
  30. 청구항 29에 있어서, 정맥내 투여를 위한 것인 약학적 제제.
  31. FSHR 수용체의 인 비트로 불활성화를 위한 인간 난포 자극 호르몬(FSHR)의 FSHβ 서브유닛의 용도.
  32. 신경모세포종의 치료 및/또는 진단에서의 의학적 사용을 위한 난포 자극 호르몬(FSH)의 리간드.
  33. 청구항 1 내지 32 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리간드는:
    -난포 자극 호르몬의 β 서브유닛의 서열; 또는
    -서열 번호 2에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 난포 자극 호르몬(FSH)의 리간드.
  34. 청구항 1 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 성숙 단백질의 아르기닌 잔기 N13 및 N30에서 글리코실화 부위를 포함하고, 상기 글리코실화 부위는 각각 2 개의 N-아세틸글루코사민 잔기 및 만노오스 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 난포 자극 호르몬(FSH)의 리간드.
  35. 청구항 32 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 소아 환자, 및 바람직하게는 6 세 이하의 환자에게 존재하는 것인 리간드.
  36. 청구항 32 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 신경모세포종의 치료에서의 의학적 사용을 위한 것으로,
    상기 리간드는:
    -세포 독성제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 카페시타빈과 같은 피리미딘 길항제, 캄토테신 군, 예를 들어 이리노테칸과 같은 효소 억제제를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 세포 독성제의 부류;
    -알킬화 제제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 시스플라틴과 같은 금속 염 군, 독소루비신과 같은 DNA 인터칼레이터, 안트라사이클린 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 알킬화제의 부류;
    -단백질 합성 조절제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 보르테조밉과 같은 프로테아좀 억제제 군, 템시롤리무스와 같은 mTOR 억제제 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 단백질 합성 조절제의 부류;
    -유사 분열 억제제의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 메이탄신과 같은 안사미토신 군, 아우리스타틴 E와 같은 미세소관 중합 억제제 군을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 유사 분열 억제제의 부류;
    -β-방출 방사성동위원소의 부류로서, 상기 화합물은 바람직하게는 131I, 169Er, 177Lu, 186Re, 153Sm, 89Sr 및 90Y를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 β-방출 방사성동위원소의 부류를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 항-종양 활성을 가지는 분자에 접합된 것인 난포 자극 호르몬(FSH)의 리간드.
  37. 청구항 32 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 신경모세포종의 치료에서의 의학적 사용을 위한 것으로, 상기 리간드는, 접합 또는 비접합된 형태로, 단독 또는 항-종양 활성을 가지는 활성제와 조합하여 사용되는 것인 난포 자극 호르몬(FSH)의 리간드.
  38. 청구항 32 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 신경모세포종의 진단에 사용하기 위한 것으로,
    상기 서브유닛은:
    -플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE) 또는 인도시아닌(Cy5)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 형광 분자; 또는
    -123I, 111In, 188Re, 18F, 35S, 99Tc를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방사성 분자; 또는
    -나노 입자에 접합된 것인 난포 자극 호르몬(FSH)의 리간드.
  39. 청구항 32 내지 38 중 어느 한 항에 따른 난포 자극 호르몬(FSH)의 리간드 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 것으로, 신경모세포종의 치료 및/또는 진단에서의 의학적 사용을 위한 약학적 제제.
  40. 청구항 1 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내 투여를 위한 것인 약학적 제제.
  41. 난포 자극 호르몬(FSH)의 β 서브유닛에 의해 나타내어지는 난포 자극 호르몬(FSH) 수용체의 리간드를 제조하는 방법으로서,
    I) 서열 번호 3에 상응하는 서열을 함유하는 플라스미드로 형질전환된 적절한 벡터를 수득하는 단계;
    Ⅱ) 니코티아나 벤타미아나 세포를 상기 단계 I)의 벡터로 형질전환시키는 단계;
    Ⅲ) 상기 니코티아나 벤타미아나 세포를 선택하는 단계;
    Ⅳ) 안정한 상기 니코티아나 벤타미아나 세포를 성장시키는 단계;
    V) 세포 추출물을 제조하는 단계;
    Ⅵ) FSHR 수용체 리간드를 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  42. 청구항 1 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 I)의 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 나타내어지는 것인 공정.
  43. 청구항 41 또는 42에 있어서, 단계 Ⅱ)에서 상기 형질전환은 어두운 곳에서 약 25 ℃ 및 일정한 교반 하에 48 시간 동안 공동배양을 수행하는 것인 방법.
  44. 청구항 41 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 선택 배지가 단계 Ⅲ)에서 사용되고, 이는 0.9 % w/v 아가 및 항생제로 보충된 MS를 포함하는 것인 방법.
  45. 청구항 41 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 카르베니실린 및 카나마이신이 단계 Ⅲ)에서 사용되는 것인 방법.
  46. 청구항 41 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 단계 V)에서, 상기 니코티아나 벤타미아나 세포가 현탁액에서 배양되는 것인 방법.
  47. 청구항 41 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 단계 V)에서, 상기 니코티아나 벤타미아나 세포가, 수크로오스, 나프탈렌-아세트산(naphthalene-acetic acid: NAA) 및 키네틴으로 보충된 MS 배지(Murashige 1962)에서 24-27 ℃으로 15 일의 기간 동안 인큐베이션으로 유지되고 및 50-100 mbar의 통기도를 유지하는 것인 방법.
  48. 청구항 41 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 단계 V)에서, 50 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, 20 mM 시트르산, 40 mM 아스코르브산, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.05 %(v/v) Tween-20, pH 6.5를 포함하고, 1 %(w/v) XAD-4 및 1 %(w/v) 폴리비닐폴리피롤리돈(polyvinylpolypyrrolidone: PVPP)으로 보충된 추출 완충액이 사용되는 것인 방법.
  49. 청구항 41 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 단계 Ⅵ)는 크로마토그래피 컬럼 IMAC, 탈염 컬럼 및 이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 순서대로 사용하여 수행되는 것인 방법.
  50. 청구항 41 내지 49 중 어느 한 항의 공정에 의하여 수득가능한 난포 자극 호르몬(FSH)의 서브유닛 β에 의해 나타내어지는 난포 자극 호르몬(FSH) 수용체의 리간드.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2755000C2 (ru) * 2016-10-11 2021-09-08 Онкогреен Тхерапеутикс Са Лиганды к рецептору фолликулостимулирующего гормона (FSH) в диагностике и лечении опухолей
KR20230117390A (ko) * 2020-12-04 2023-08-08 캔웰 (지제트) 바이오테크 리미티드 항-fshr 항체 및 이의 항체-약물 접합체의 제조 및용도
WO2023012281A1 (en) 2021-08-04 2023-02-09 Fshr Theranostics Use of fsh-receptor ligands for diagnosis and therapy of atherosclerosis
WO2024100548A1 (en) * 2022-11-08 2024-05-16 Oncogreen Therapeutics S.A. Compound with anti-metastatic effect
WO2024100549A1 (en) * 2022-11-08 2024-05-16 Oncogreen Therapeutics S.A. Compounds for use in macrophage reprogramming

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150122625A (ko) * 2012-11-15 2015-11-02 에스퍼란스 파마슈티컬스, 인코포레이티드 난포-자극 호르몬(fsh)/용해 도메인 융합 작제물 및 이의 제조 및 이용 방법
WO2018069831A2 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 Abresearch S.R.L. Ligands of the fsh hormone receptor in the diagnosis and treatment of tumors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1206302B (it) * 1987-06-26 1989-04-14 Serono Cesare Ist Ricerca Ormone follicolo-stimolante urinario
EP2090322A1 (en) * 2008-02-18 2009-08-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of fsh receptor ligands for diagnosis and therapy of cancer
CN103509121B (zh) * 2012-11-22 2015-01-28 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 一种fsh融合蛋白及其制备方法和用途
LT3200815T (lt) * 2014-10-02 2021-07-26 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Būdai ir kompozicijos, skirti vėžio gydymui

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150122625A (ko) * 2012-11-15 2015-11-02 에스퍼란스 파마슈티컬스, 인코포레이티드 난포-자극 호르몬(fsh)/용해 도메인 융합 작제물 및 이의 제조 및 이용 방법
JP2016506373A (ja) * 2012-11-15 2016-03-03 エスペランス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 卵胞刺激ホルモン（ｆｓｈ）／溶解ドメイン融合コンストラクト及びその作製及び使用の方法
WO2018069831A2 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 Abresearch S.R.L. Ligands of the fsh hormone receptor in the diagnosis and treatment of tumors

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
rHu-FSH-beta, ABR(온라인주소: https://web.archive.org/web/20160806105921/http://www.abres.it/product.php)(2016.08.06.) 1부.* *

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