KR20150122625A - 난포-자극 호르몬(fsh)/용해 도메인 융합 작제물 및 이의 제조 및 이용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 융합 작제물, 융합 작제물을 이용하는 방법 및 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과증식 장애, 예를 들어, 종양, 암, 신생물 및 악성종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원
본 출원은 전체내용이 참조로서 본원에 명백히 포함되는 2012년 11월 15일에 출원된 출원 일련 번호 61/726,935호에 대한 우선권을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 융합 작제물, 융합 작제물을 이용하는 방법, 및 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과증식 장애, 예를 들어, 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
서론
암 환자의 5년 생존률을 고려하는 경우 원발성 종양 및 전이의 치료를 위한 새로운 치료법을 개발할 필요가 의심할 여지 없이 명백하며, 원격 전이 질병으로 진단되는 경우에 폐암, 결장직장암, 유방암 및 전립선암을 갖는 환자의 단지 10-40%가 생존한다.
개요
본 발명은 융합 작제물 또는 컨쥬게이트로 본원에서 언급되는, 결합 모이어티에 융합되거나 컨쥬게이션된 용해 도메인을 적어도 부분적으로 기초로 한다. 세포와 용해 도메인의 접촉은 세포 사멸을 발생시키는 세포막의 파괴를 야기시키는 것으로 생각된다. 결합 모이어티는 요망되지 않거나 비정상적인 증식하는 세포 또는 과증식하는 세포, 예를 들어, 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양을 포함하는 용해 도메인에 의한 파괴를 위한 세포를 표적으로 한다. 다수의 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양 세포는 수용체 또는 리간드를 과발현한다. 예를 들어, 많은 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양은 융합 작제물의 결합 모이어티로 사용될 수 있는 호르몬(예를 들어, 난포-자극 호르몬(FSH), 황체형성호르몬/융모생식샘자극호르몬(LH/CG), 또는 황체형성호르몬분비호르몬(LHRH 등), 성장 인자, 사이토카인, 항체 등에 대한 수용체를 발현한다.
융합 작제물은 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 발현하는 임의의 세포 또는 세포 집단을 표적으로 하도록 설계될 수 있다. 결합 모이어티, 예를 들어, 리간드, 항체 및 이의 단편, 성장 인자, 사이토카인 등은 수용체, 항원, 항체, 리간드 등을 발현하거나 함유하는 세포의 표적화된 사멸을 제공함으로써 세포 증식 또는 성장을 감소시키거나 억제하기 위해 용해 도메인에 연결될 수 있다.
융합 작제물은 표적 세포를 사멸시키기 위해 분열하는 세포를 필요로 하지 않는다. 또한, 융합 작제물은 면역원성일 가능성이 없는데, 이는 이들이 크기에 있어서 비교적 작게 제조될 수 있기 때문이다. 또한, 융합 작제물은 다약제 내성 세포를 사멸시킨다.
본 발명에 따르면, 제 1 및 제 2 도메인을 포함하는 융합 작제물이 제공된다. 한 구체예에서, 융합 작제물은, 예를 들어, KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하는 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개 잔기의 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열로 구성된 제 1 도메인, 및 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이들로 구성된 제 2 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 융합 작제물은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열로 구성된 제 1 도메인, 및 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이들로 구성된 제 2 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다. 추가 구체예에서, 융합 작제물은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열로 구성된 제 1 도메인, 및 상기 제 1 도메인과 다른 1-25개의 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열(예를 들어, 표적화 또는 결합 모이어티)로 구성된 제 2 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다.
본 발명에 따르면, 제 1 도메인을 포함하거나 이로 구성되는 분리되고 정제된 펩티드가 또한 제공된다. 다양한 구체예에서, 분리되거나 정제된 펩티드는 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 또는 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA이다. 추가 구체예에서, 분리되거나 정제된 펩티드는 K 잔기 중 하나 이상이 F 또는 L 잔기 중 임의의 것으로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 K, A 또는 L 잔기 중 임의의 것으로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 K, F 또는 L 잔기 중 임의의 것으로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 또는 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA이다.
융합 작제물은 수용체, 리간드, 또는 항원에 결합하는 결합 모이어티를 포함한다. 결합 모이어티는 또한 리간드, 항원 또는 항체를 포함한다. 리간드는 수용체, 예를 들어, 수용체 효능제 또는 길항제에 결합하는 분자를 포함하거나 이들로 구성된다. 결합 모이어티는 선형 또는 고리형 구조를 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.
결합 모이어티의 특정한 비제한적인 예는 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질), 핵산 및 탄수화물을 포함한다. 결합 모이어티의 특정한 비제한적인 부류는 수용체에 결합하는 호르몬, 호르몬 유사체, 호르몬 및 호르몬 유사체의 단편, 및 호르몬 및 호르몬 유사체의 키메라 또는 융합체, 성장 인자, 사이토카인, 항체 등을 포함한다.
호르몬의 특정한 비제한적인 예는 난포-자극 호르몬(FSH) 또는 이의 유사체, 생식샘자극호르몬-분비 호르몬 또는 이의 유사체, 황체형성호르몬 베타 사슬, 황체형성호르몬, 융모생식샘자극호르몬, 융모생식샘자극호르몬 베타 서브유닛, 멜라닌세포자극호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스테롤, 락토페린, 도파민, 소마토스타틴 또는 이의 유사체, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 안드로겐, 프로게스테론, 갑상샘자극호르몬(TSH), 인슐린, 카테콜아민, 부신피질자극호르몬(ACTH), 안지오텐신, 항이뇨호르몬, 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 봄베신, 코르티코트로핀-분비 호르몬, 가스트린, 그렐린, 글루카곤, 성장호르몬분비호르몬 및 이의 유사체, 인히빈, 오렉신, KiSS 펩티드(GPR54), 키스펩틴(kisspeptin), 프로락틴, 프로락틴 분비 호르몬, 성장호르몬, Her2/neu, 폴레이트, 비타민 H, 페리틴, 부갑상샘호르몬, 릴렉신, 세크레틴, 갑상샘자극호르몬분비호르몬, 엔도텔린, 레닌, 리포트로핀, 멜라토닌 등을 포함한다. 성장 인자의 특정한 비제한적인 예는 표피성장인자 (EGF), 인슐린-유사 성장 인자-1 및 2(IGF-1, IGF-2), 혈관내피성장인자(VEGF), 신경성장인자(NGF), 섬유모세포성장인자(FGF), 전환성장인자 알파 및 베타(TGFα, TGFβ, 혈소판유래성장인자(PDGF), 간세포성장인자(HGF), 세룰로플라스민 등이다. 사이토카인 또는 리간드의 특정한 비제한적인 부류는 인터루킨(예를 들어, 인터루킨 2, 인터루킨 17, CD154, Fas 리간드 등), 종양괴사인자(TNF), 인터페론 등이다.
난포-자극 호르몬(FSH)의 특정한 비제한적인 예는 FSH 수용체에 결합하는 FSH 베타-사슬 및 FSH 알파-사슬, 및 FSH 베타-사슬 및 FSH FSH 알파-사슬의 단편을 포함한다. FSH 서열의 비제한적인 특정한 예, 예를 들어, FSH 베타-사슬 또는 FSH 알파-사슬, 및 FSH 베타-사슬의 단편 및 FSH FSH 알파-사슬 단편은 포유동물(예를 들어, 인간) FSH 서열이다.
따라서, 특정 구체예에서, 융합 작제물은 FSH 수용체에 결합하는 난포 자극 호르몬(FSH) 또는 FSH 단편, FSH 유사체 또는 FSH 키메라 및 용해 도메인을 포함하며, 상기 FSH 단편 또는 유사체 또는 키메라는 용해 도메인에 컨쥬게이션된다. 다양한 구체예에서, 융합 작제물은 FSH 수용체에 결합하는 FSH 또는 FSH 단편 또는 FSH 유사체, 및 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA로부터 선택된 펩티드 서열, 또는 K 잔기 중 하나 이상이 F 또는 L 잔기 중 임의의 것으로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 K, A 또는 L 잔기 중 임의의 것으로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 K, F 또는 L 잔기 중 임의의 것으로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하거나 이들로 구성된 용해 도메인을 포함한다.
FSH 및 FSH 단편의 비제한적인 특정 예는 NH2-Asn - Ser - Cys - Glu - Leu - Thr - Asn - Ile - Thr - Ile - Ala - Ile - Glu - Lys - Glu - Glu - Cys - Arg - Phe - Cys - Ile - Ser - Ile - Asn - Thr - Thr - Trp - Cys - Ala - Gly - Tyr - Cys - Tyr - Thr - Arg - Asp - Leu - Val - Tyr - Lys - Asp - Pro - Ala - Arg - Pro - Lys - Ile - Gln - Lys - Thr - Cys - Thr - Phe - Lys - Glu - Leu - Val - Tyr - Glu - Thr - Val - Arg - Val - Pro - Gly - Cys - Ala - His - His - Ala - Asp - Ser - Leu - Tyr - Thr - Tyr - Pro - Val - Ala - Thr - Gln - Cys - His - Cys - Gly - Lys - Cys - Asp - Ser - Asp - Ser - Thr - Asp - Cys - Thr - Val - Arg - Gly - Leu - Gly - Pro - Ser - Tyr - Cys - Ser - Phe - Gly - Glu - Met - Lys - Glu-OH로 기재되는 인간 FSH 베타 사슬 서열의 FSH 서열 또는 FSH 단편을 포함한다.
FSH 단편의 비제한적인 특정 예는 FSH 베타 사슬 아미노산 서열 33-53; FSH 베타 사슬 아미노산 서열 81-95; FSH 베타 사슬 아미노산 서열 81-89; FSH 베타 사슬 아미노산 서열 90-95; 또는 FSH 베타 사슬 아미노산 서열 33-53; FSH 베타 사슬 아미노산 서열 81-95; FSH 베타 사슬 아미노산 서열 81-89; 또는 적어도 하나의 시스테인(C)이 알라닌(A)으로 치환된 FSH 베타 사슬 아미노산 서열 90-95를 포함하거나 이들로 구성된다. 특정 양태에서, FSH 단편은 CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT; QAHAGKADSDSTDAT; QCHCGKCDSDSTDCT; QAHAGKADS; QCHCGKCDS 또는 DSTDCT, 또는 하나 이상의 시스테인(C) 잔기가 알라닌(A) 잔기로 치환된 상기 서열 중 임의의 서열을 포함하거나, 이들로 구성된다.
본원에 기재된 바와 같이, 결합 모이어티는 임의로 세포 상에서 발현될 수 있다. 결합 모이어티(예를 들어, 수용체, 리간드, 항원, 항체)를 발현하거나, 본 발명의 방법에 따라 표적화될 수 있는 세포는 과증식 세포를 포함한다. 수용체, 리간드, 또는 항원을 발현하거나, 본 발명의 방법에 따라 표적화될 수 있는 세포는 또한 유방, 난소, 자궁, 자궁경부, 전립선, 고환, 췌장, 피부, 혈액 세포, 부신, 뇌하수체, 혈관 또는 혈관구조, 및 자궁내막 세포를 포함한다. 세포에서 발현된 결합 모이어티의 특정한 비제한적인 부류는 호르몬(FSH 수용체, LHRH 수용체, βCG 수용체 등), 사이토카인, 성장 인자(예를 들어, EGF 수용체, Her2/neu, ROR1), 페리틴, 트랜스페린 수용체, 세포 부착 분자 등에 대한 수용체이다. 항체 또는 이의 단편을 이용하여 표적화될 수 있는 증식하는 세포에서 발현된 항원의 특정한 비제한적인 예는 CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD154, 면역글로불린-유사 수용체 등이다. 추가 항원은, 예를 들어, 전립선 특이 항원(PSA), 전립선 특이 막 항원(PSMA), 암배아 항원(CEA), 알파태아단백질(AFP), 전립선 특이 항원(PSA), 암 항원 125(CA-125) 및 본원에 개시된 리간드에 결합하는 다른 수용체 분자를 포함한다.
제 1 및 제 2 도메인은 아미노산, 또는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 특정 양태에서, 제 1 또는 제 2 도메인은 약 1 내지 10개, 10 내지 20개, 15 내지 20개(즉, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산), 20 내지 30개, 30 내지 40개, 40 내지 50개, 60 내지 70개, 70 내지 80개, 80 내지 90개, 90 내지 100개 또는 그 초과의 아미노산 잔기를 갖는다. 용해 도메인은 통상적으로 10 내지 14개, 15 내지 20개(즉, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산), 10 내지 20개, 20 내지 30개, 30 내지 40개, 또는 40 내지 50개이나, 임의로 더 길거나(50개 또는 그 초과) 더 짧을(10개 미만) 수 있다.
특정 양태에서, 제 1 도메인은 양친매성 알파-헬리칼 구조를 포함하거나 이로 구성된다. 추가의 특정한 양태에서, 제 2 도메인은 CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT; QAHAGKADSDSTDAT; QCHCGKCDSDSTDCT; QAHAGKADS; QCHCGKCDS 또는 DSTDCT, 또는 CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT; QAHAGKADSDSTDAT; QCHCGKCDSDSTDCT; QAHAGKADS; QCHCGKCDS 또는 DSTDCT 중 임의의 것의 단편, 또는 CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT; QAHAGKADSDSTDAT; QCHCGKCDSDSTDCT; QAHAGKADS; QCHCGKCDS 또는 DSTDCT 중 임의의 것의 단편, 또는 FSH 수용체에 결합하는 CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT; QAHAGKADSDSTDAT; QCHCGKCDSDSTDCT; QAHAGKADS; QCHCGKCDS 또는 DSTDCT 중 임의의 것의 단편으로 기재된 FSH 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
제 1 및 제 2 도메인은 서로에 대해 NH2-말단 또는 C-말단에 위치될 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 제 1 (용해 펩티드) 도메인은 제 2 (결합 모이어티 또는 리간드) 도메인과 관련하여 NH2-말단에 위치되고, 또 다른 구체예에서, 제 2 (결합 모이어티 또는 리간드) 도메인은 제 1 (용해 펩티드) 도메인과 관련하여 C-말단에 위치된다.
제 1 및 제 2 도메인은 하나 이상의 D-아미노산 및/또는 하나 이상의 L-아미노산을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 특정 양태에서, 제 1 도메인은, 예를 들어, 임의의 K, F 또는 A 잔기에서 D-아미노산을 갖는다.
제 1 및 제 2 도메인은 추가 도메인을 추가로 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 따라서, 다양한 양태에서, 융합 작제물은 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7 도메인 등을 포함하며, 이들 중 임의의 것 또는 모두는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
제 1 및 제 2(및 임의의 추가) 도메인은 공유 결합에 의해 연결될 수 있다. 예를 들어, 제 1 및 제 2 도메인은 펩티드 또는 비-펩티드 링커에 의해 연결될 수 있다. 특정 양태에서, 제 1 및 제 2 도메인은 약 1 내지 25개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드(링커) 서열, 또는 비-펩티드(링커), 예를 들어, 선형 탄소 사슬에 의해 연결된다. 더욱 특정한 양태에서, 제 1 및 제 2 도메인은 하나 이상의 A, S 또는 G 아미노산 잔기를 포함하거나 이들로 구성된 펩티드(링커) 서열에 의해 연결된다. 추가의 특정 양태에서, 제 1 및 제 2 도메인은 GSGGS, ASAAS, GS, AF, FK, VK, FFK, FA, GSGRSA, RVRRSV, SS, Cit-V(Cit=시트룰린(H2NC(O)NH(CH2)3CH(NH2)CO2H); Val=발린), F-Cit(F=페닐알라닌, Cit=시트룰린, 또는 비-펩티드(링커) 선형 탄소-사슬, Cn(여기서, n은 사슬 내의 탄소(C)의 수(예를 들어, 1-100), 예를 들어, C, CC, CCC, CCCC, CCCCC, CCCCCC, CCCCCCC, CCCCCCCC 등임)을 포함하거나 이들로 구성되는 펩티드(링커) 서열에 의해 연결된다.
융합 작제물은 분리되고 정제된 형태를 포함하거나 이로 구성된다. 융합 작제물은 또한 혼합물을 포함하거나 이로 구성된다. 상기 제형 및 혼합물은 조성물, 예를 들어, 융합 작제물 및 대상체로의 투여 또는 대상체와의 생체내 접촉에 적절한 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제의 혼합물, 또는 융합 작제물 및 세포 증식 억제제 또는 면역자극제의 혼합물을 포함한다.
융합 작제물은 단위 투여 형태를 포함하거나 이로 구성된다. 한 구체예에서, 융합 작제물은 요망되지 않는 세포 증식 또는 세포 증식 장애를 갖는 대상체를 치료하는데 효과적인 양의 단위 투여 형태이다. 또 다른 구체예에서, 융합 작제물은 신생물, 종양 또는 암을 갖는 대상체를 치료하는데 효과적인 양의 단위 투여 형태이다. 추가 구체예에서, 융합 작제물은 대상체의 생식력을 감소시키는데 효과적인 양의 단위 투여 형태이다.
융합 작제물은 임의로 방법을 실시하기 위한 설명서와 함께 키트 내에 포함될 수 있다. 한 구체예에서, 키트는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하거나, 과증식 세포의 증식을 감소시키거나 억제하거나, 신생물, 종양 또는 암 세포의 증식을 감소시키거나 억제하거나, 과증식 장애를 갖는 대상체를 치료하거나, 신생물, 종양 또는 암을 갖는 대상체를 치료하거나, 동물의 생식능력을 감소시키기 위한 융합 작제물 및 설명서를 포함한다.
본 발명에 따르면, 융합 작제물을 인코딩하는 핵산이 또한 제공된다. 한 구체예에서, 핵산은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하는 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개 잔기의 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열로 구성된 제 1 도메인, 및 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이들로 구성된 제 2 도메인을 포함하거나 이들로 구성된 융합 작제물을 인코딩한다. 또 다른 구체예에서, 핵산은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열로 구성된 제 1 도메인, 및 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이들로 구성된 제 2 도메인을 포함하거나 이들로 구성된 융합 작제물을 인코딩한다. 추가 구체예에서, 핵산은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열로 구성된 제 1 도메인, 및 상기 제 1 도메인과 다른 1-25개의 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열(예를 들어, 표적화 또는 결합 모이어티)을 포함하거나 이들로 구성된 제 2 도메인을 포함하는 융합 작제물을 인코딩한다.
핵산은 벡터, 예를 들어, 세포에서 발현되는 경우 융합 작제물을 인코딩하는 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 숙주 세포는 세포가 핵산에 의해 인코딩된 융합 작제물을 발현하도록 벡터 내의 핵산으로 형질전환될 수 있다.
융합 작제물은 특히 세포의 증식을 감소시키거나 억제하거나, 세포 증식을 감소시키거나 억제하거나, 과증식하는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하거나, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포의 증식을 감소시키거나 억제하거나, 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식, 예를 들어, 과증식하는 세포 또는 과증식 장애를 치료하는데 유용하다. 과증식 장애의 비제한적인 예는 양성 과다형성, 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 또는 악성종양(예를 들어, 고형 또는 액형 종양, 골수종, 림프종, 백혈병, 암종, 육종, 흑색종, 신경, 그물내피 및 조혈)을 포함한다.
본 발명에 따르면, 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법; 세포 증식을 감소시키거나 억제하는 방법; 과증식하는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법; 및 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법이 추가로 제공된다. 다양한 구체예에서, 상기 방법은 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물과 세포를 접촉시키고; 세포 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물과 세포를 접촉시키고; 과증식하는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물과 세포를 접촉시키고; 및 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물과 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명에 따르면, 수용체(예를 들어, FSH, LHRH, βCG 등에 결합하는 호르몬 수용체) 또는 항원을 발현하는 세포의 증식을 선택적으로 감소시키거나 억제하고; 수용체(예를 들어, FSH, LHRH, βCG 등에 결합하는 호르몬 수용체) 또는 항원을 발현하는 과증식하는 세포의 증식을 선택적으로 감소시키거나 억제하고; 수용체(예를 들어, FSH, LHRH, βCG 등에 결합하는 호르몬 수용체) 또는 항원을 발현하는 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포의 증식을 선택적으로 감소시키거나 억제하는 방법이 또한 제공된다. 다양한 구체예에서, 상기 방법은 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물과 세포를 접촉시키고(상기 펩티드의 결합 모이어티는 세포에 의해 발현된 수용체(예를 들어, FSH, LHRH, βCG 등에 결합하는 호르몬 수용체), 리간드, 또는 항원에 결합함); 과증식하는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물과 세포를 접촉시키고(상기 펩티드의 결합 모이어티는 과증식하는 세포에 의해 발현된 수용체(예를 들어, FSH, LHRH, βCG 등에 결합하는 호르몬 수용체), 리간드, 또는 항원에 결합함); 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물과 세포를 접촉시키는(상기 융합 작제물의 결합 모이어티는 세포에 의해 발현된 수용체(예를 들어, FSH, LHRH, βCG 등에 결합하는 호르몬 수용체), 리간드, 또는 항원에 결합함) 것을 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 표적화된 세포는 수용체(예를 들어, FSH, LHRH, βCG 등에 결합하는 호르몬 수용체), 또는 항원, 예를 들어, 호르몬 수용체, 예를 들어, 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 또는 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 수용체를 발현하는 세포를 포함한다. 본 발명의 방법에 따라 표적화된 세포는 또한 난포-자극 호르몬(FSH), 생식샘자극호르몬-분비 호르몬 I, 생식샘자극호르몬-분비 호르몬 II, 칠성장어 III 황체형성호르몬 분비 호르몬, 황체형성호르몬 베타 사슬, 황체형성호르몬, 융모생식샘자극호르몬, 융모생식샘자극호르몬 베타 서브유닛, 멜라닌세포자극호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스테롤, 도파민, 소마토스타틴, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 프로게스테론, 안드로겐, 프로락틴, 프로락틴 분비 호르몬, 항이뇨호르몬, 안지오텐신, 카테콜아민, 표피성장인자(EGF), 인슐린 유사 성장 인자-1 및 2(IGF-1, IGF-2), 성장 호르몬(GH), Her2/neu, 비타민 H, 폴레이트, 트랜스페린, 갑상샘자극호르몬(TSH), 부갑상샘호르몬(PTH), 엔도텔린, 봄베신, 레닌, 리포트로핀, 멜라토닌 호르몬, 릴렉신, 세크레틴, 성장 호르몬, 혈관내피성장인자(VEGF), 혈관작용성 장 펩티드, 락토페린, 인테그린(예를 들어, 알파-5 베타 3 또는 알파-5 베타 1 인테그린), 신경성장인자, 전환성장인자 알파 및 베타(TGF-α 및 β), 간세포성장인자(HGF), 섬유모세포성장인자(FGF), CD-33, CD19, CD20, CD40, ROR1, IGF-1, 암배아 항원(CEA), 알파태아단백질(AFP), 전립선 특이 항원(PSA), 전립선 특이 막 항원(PSMA), 암 항원 125(CA-125), 인터루킨 17, CD154, 가용성 인터루킨-2(IL-2) 수용체, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, 당단백질(gp) 75, gp100, 베타-카테닌, PRAME, MUM-1, ZFP161, 유비퀴틴-1, HOX-B6, YB-1, 오스테오넥틴(Osteonectin), ILF3, 폴산 또는 이의 유도체, 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리 일원, TNF-알파, TNF-베타(림프독소, LT), TRAIL, Fas, LIGHT, 41BB, 전환성장인자 알파, 전환성장인자 베타, 인슐린, 세룰로플라스민, HIV-tat, RGD 서열 모티프를 포함하는 펩티드 또는 단백질, 단당류, 이당류, 올리고당류, 시알산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 또는 아세틸뉴라민산에 결합하는 수용체를 발현하는 세포를 포함한다.
수행된 방법은 특히 세포, 예를 들어, 과증식 세포 또는 요망되지 않게 증식하는 세포의 증식, 생존, 분화, 사멸, 또는 활성을 억제하거나, 감소시키거나, 예방할 필요가 있는 대상체에 접촉시키는 것을 포함한다. 예시적 대상체는 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체; 및 양성 과다형성, 또는 비-전이성 또는 전이성 신생물, 암, 종양 또는 악성종양(예를 들어, 고형 또는 액형 종양, 골수종, 림프종, 백혈병, 암종, 육종, 흑색종, 신경, 그물내피 및 조혈 신생물)을 갖거나, 가질 위험이 있는 대상체를 포함한다.
본 발명에 따르면, 과증식 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법, 및 신생물, 종양, 암 또는 악성종양(전이성, 비-전이성 또는 양성)을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 추가로 제공된다. 다양한 구체예에서, 상기 방법은 과증식 장애를 치료하는데 충분한 양의 융합 작제물을 대상체에 투여하고; 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물을 대상체에 투여하고, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 혈관구조의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
상기 방법은 전이를 갖거나 전이를 가질 위험이 있는 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 예를 들어, 융합 작제물의 양은 종양, 암 또는 신생물의 대상체 내의 다른 부위, 위치 또는 영역으로의 확산 또는 파종을 감소시키거나 억제하는데 효과적이다. 다양한 구체예에서, 상기 방법은 원발성 종양 또는 암의 하나 이상의 다른 부위로의 전이, 하나 이상의 다른 부위, 위치 또는 영역에서 전이의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제함으로써 종양 또는 암의 재발 또는 종양 또는 암의 진행을 감소시키거나 억제한다. 추가의 구체예에서, 상기 방법은 전이를 발생시키거나 전이를 잠재적으로 발생시키는 종양 또는 암세포(예를 들어, 파종된 종양 세포)의 성장, 증식, 이동성 또는 침습성을 감소시키거나 억제하거나; 원발성 종양 또는 암으로부터 원발성 종양 또는 암과 별개인 하나 이상의 다른 부위, 위치 또는 영역으로 발생하는 전이의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하거나; 전이가 형성되거나 확립된 후 원발성 종양 또는 암과 별개인 하나 이상의 다른 부위, 위치 또는 영역에서 전이의 성장 또는 증식을 감소시키거나 억제하거나; 전이가 형성되거나 확립된 후 추가 전이의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 재발 또는 진행을 감소시키거나 억제한다.
본 발명에 따르면, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 다른 부위로의 전이를 감소시키거나 억제하는 방법, 또는 원발성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양으로부터 원위에 있는 다른 부위에서의 전이성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하는 방법이 또한 추가로 제공된다. 다양한 구체예에서, 상기 방법은 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 다른 부위로의 전이, 또는 원발성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양으로부터 원위에 있는 다른 부위에서의 전이성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에 따라 치료가능한 신생물, 종양, 암 및 악성종양은 고형 세포 덩어리, 조혈 세포, 또는 암종, 육종(예를 들어, 림프육종, 지방육종, 뼈육종, 연골육종, 평활근육종, 횡문근육종 또는 섬유육종), 림프종, 백혈병, 샘종, 샘암종, 흑색종, 신경아교종, 아교모세포종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 별아교세포종, 핍지세포종, 중피종, 그물내피, 림프 또는 조혈(예를 들어, 골수종, 림프종 또는 백혈병) 신생물, 종양, 암 또는 악성종양을 포함한다.
본 발명에 따라 치료가능한 신생물, 종양, 암 및 악성종양은 폐(소세포폐암 또는 비소세포폐암), 갑상샘, 두경부, 코인두, 인후, 코 또는 굴, 뇌, 척추, 유방, 부신, 뇌하수체, 갑상샘, 림프, 위장(구강, 식도, 위, 십이지장, 회장, 공장(소장), 결장, 직장), 비뇨생식관(자궁, 난소, 자궁경부, 자궁내막, 방광, 고환, 음경, 전립선), 신장, 췌장, 간, 뼈, 골수, 림프, 혈액, 근육, 피부 또는 줄기세포 신생물, 종양, 암, 또는 악성종양에 존재할 수 있거나, 이들에 침범할 수 있다.
상기 방법은 다른 치료 또는 요법(예를 들어, 외과적 절제, 방사선요법, 이온화 또는 화학 방사선 요법, 화학요법, 면역요법, 국소 또는 국부 열(고열) 요법, 또는 예방접종)과 함께 실시될 수 있다. 상기 치료 또는 요법은 융합 작제물의 투여 전, 투여와 실질적으로 동시에(별개로 또는 혼합하여), 또는 투여 후에 제공될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 방법은 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항-암 또는 면역-증강 치료 또는 요법을 제공하는 것을 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 방법은 알킬화제, 항-대사물, 식물 추출물, 식물 알칼로이드, 니트로소우레아, 호르몬, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체; 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 아자티오프린(azathioprine), 사이클로스포린 A(cyclosporin A), 프레드니솔론(prednisolone), 멜팔란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 메클로르에타민(mechlorethamine), 부술판(busulphan), 메토트렉세이트(methotrexate), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 5-아자시티딘(5-azacytidine)(5-AZC) 및 5-아자시티딘 관련 화합물, 블레오마이신(bleomycin), 액티노마이신 D(actinomycin D), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신 C(mitomycin C), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 세무스틴(semustine), 스트렙토조토신(streptozotocin), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥시플라틴(oxiplatin), 미토탄(mitotane), 프로카르바진(procarbazine), 다카르바진(dacarbazine), 탁산(taxane)(예를 들어, 탁솔(taxol) 또는 파클리탁셀(paclitaxel)), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 독소루비신(doxorubicin) 또는 디브로모만니톨(dibromomannitol), 국소이성화효소 억제제(이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide)), 젬시타빈(gemcitabine), 페메트렉세드(pemetrexed) 등을 투여하는 것을 포함한다. 세포 또는 면역요법은 림프구, 형질 세포, 대식세포, 수지상 세포, T-세포, NK 세포 또는 B-세포; 항체, 세포 성장 인자, 세포 생존 인자, 세포 분화 인자, 호르몬, 사이토카인 또는 케모카인(예로 인터루킨 IL-2, IL-1α, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-7, 과립구-대식세포-집락 자극 인자(GMCSF), IFN-γ, IL-12, TNF-α, TNFβ, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, SDF-1, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, 에오탁신(eotaxin), 에오탁신-2, I-309/TCA3, ATAC, HCC-1, HCC-2, HCC-3, LARC/MIP-3α, PARC, TARC, CKβ, CKβ6, CKβ7, CKβ8, CKβ9, CKβ11, CKβ12, C10, IL-8, GROα, GROβ, ENA-78, GCP-2, PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2, Mig, PBSF/SDF-1, 또는 림포탁틴(lymphotactin)가 있음)을 포함한다.
융합 작제물과 함께 적용가능한 추가 작용제는 표적화된 약물 또는 생물학적 약제, 예를 들어, 항체 또는 소분자이다. 모노클로날 항체의 비제한적인 예는 특히 본 발명에 따른 융합 작제물과 조합하여 사용될 수 있는 리툭시맙(rituximab)(Rituxan®), 트라스투주맙(trastuzumab)(Herceptin®), 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin®), 라니비주맙(ranibizumab)(Lucentis®), 세툭시맙(cetuximab)(Erbitux®), 알렘투주맙(alemtuzumab)(Campath®), 파니투무맙(panitumumab)(Vectibix®), 퍼투주맙(pertuzumab)(Perjeta®), 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin®), 이필리무맙(ipilimumab)(Yervoy®), 토시투모맙(tositumomab)(Bexxar®) 등을 포함한다. 융합 작제물과의 사용에 적용가능한 다른 표적화된 약물은 이마티니브(imatinib)(Gleevec®), 제피티니브(gefitinib)(Iressa®), 보르트조미브(bortzomib)(Velcade®), 라파티니브(lapatinib)(Tykerb®), 수니티니브(sunitinib)(Sutent®), 소라페니브(sorafenib)(Nevaxar®), 닐로티니브(nilotinib)(Tasigna®), 잘루투무맙(zalutumumab), 달로투주맙(dalotuzumab), 피지투무맙(figitumumab), 라무시루맙(ramucirumab), 갈릭시맙(galiximab), 파를레투주맙(farletuzumab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오파투무맙(ofatumumab)(Arzerra®), 토시투무맙(tositumumab), 2F2(HuMax-CD20), 7D8, IgM2C6, IgG1 2C6, 11B8, B1, 2H7, LT20, 1F5 또는 AT80 다클리주맙(Zenapax®), 및 항-LHRH 수용체 항체, 예를 들어, 클론 A9E4, F1G4, AT2G7, GNRH03, GNRHR269 등이다.
본 발명의 방법은 대상체에 이점을 제공하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 치료 방법은 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포 덩어리, 부피, 크기 또는 세포의 수의 부분적 또는 완전한 파괴, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포 괴사, 용해 또는 아폽토시스의 자극, 유도 또는 증가, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 부피 크기, 세포 덩어리의 감소, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 부피, 덩어리, 크기 또는 세포 수의 진행 또는 증가의 억제 또는 예방, 또는 수명의 연장을 발생시키거나; 신생물, 종양, 암 또는 악성종양과 관련되거나 이에 의해 야기된 유해한 증상 또는 합병증의 중증도, 기간 또는 빈도를 감소시키거나 저하시키거나; 동통, 불쾌, 구역, 쇠약 또는 기면을 감소시키거나 저하시키거나; 증가된 에너지, 식욕, 개선된 움직임 또는 심리적 웰빙을 발생시킨다.
본 발명에 따르면, 동물의 생식력을 감소시키는 방법; 자궁내막증, 양성 전립선 비대증, 섬유증 또는 폴립을 치료하거나 감소시키는 방법이 또한 추가로 제공된다. 다양한 구현예에서, 상기 방법은 생식력을 감소시키기에 충분한 양의 융합 작제물을 동물(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 투여하고; 자궁내막증을 치료하거나 감소시키는데 충분한 양의 융합 작제물을 동물(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 투여하고; 양성 전립선 비대증을 치료하거나 감소시키기에 충분한 양의 융합 작제물을 동물(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 투여하고; 섬유증 또는 폴립을 치료하거나 감소시키기에 충분한 양의 융합 작제물을 동물(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에 방법에 따라 치료가능한 대상체는 포유동물을 포함한다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간이다.
도면의 설명
도 1은 LHRH-Phor21이 Phor21-βCG-ala보다 신속하게 암세포를 사멸시키는 것을 도시한다. 인간 유방암 세포(MDA-MB-435S.luc, 다양한 계대 번호)는 Phor21-βCG-ala 또는 LHRH-Phor21과 함께 인큐베이션되었다.
도 2는 Phor21-βCG-ala에 비한 용해 도메인 내에 21(Phor21), 18(Phor18 (338983) = CLIP71) 및 15(Phor15) 아미노산을 갖는 βCG-ala 융합 작제물의 MDA-MB-435S.luc 세포에 대한 세포독성(마이크로몰 IC50)을 도시한다.
도 3은 βCG-ala 및 LHRH 융합 작제물의 MDA-MB-435S.luc 세포에 대한 세포독성(마이크로몰 IC50)을 도시한다. Phor21-βCG-ala보다 MDA-MB-435S.luc 세포에 대해 더욱 독성인 융합 작제물은 도면의 우측에 나열되어 있다.
도 4는 LHRH 융합 작제물의 MDA-MB-435S.luc 세포에 대한 세포독성(마이크로몰 IC50)을 도시한다. 융합 작제물은 323033 = Phor21-βCG-ala, 337479 = LHRH-Phor21, 337480 = Phor21-LHRH, 338611 = D-ala-Phor21-LHRH, 338612 = Phor18-ASAAS-LHRH, 338613 = Phor18-LHRH, 339385 = D-ala-Phor18-LHRH, 및 339347 = Phor18-Lupron이다.
도 5는 Phor21-βCG-ala에 비한 인간 적혈구 세포에 대한 βCG-ala 및 LHRH 융합 작제물의 급성 용혈능(마이크로몰 HA50)을 도시한다. LHRH-Phor21, Phor21-LHRH 및 Phor18-Lupron(QHWSY(D-Leu)LRPNEt = Lupron)을 제외한 모든 융합 작제물은 Phor21-βCG-ala보다 유의하게 낮은 용혈능을 갖는다.
도 6은 세포독성 및 용혈능의 비교를 도시한다. 화살표로 표시된 펩티드는 Phor21-βCG-ala보다 세포에 대해 더 독성이다.
도 7은 처리 스케줄 개요이다.
도 8A-8J는 컨쥬게이션되지 않은 Phor21, 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 (338983)= (CLIP71) 및 (KKKFAFA)3 컨쥬게이트(338984)와 비교한 3개의 βCG 컨쥬게이트를 이용한 처리 동안 및 연구 종점에서의 종양 상태의 개요이다. 융합 작제물 코드, 33 = Phor21β-CG-ala; 76 = Phor18-βCG-ala; 81 = D-ala-Phor21-βCG-ala; 85 = D-ala-Phor18-LHRH; 47 = Phor18-Lupron; 13 = Phor18-LHRH; 11 = D-ala-Phor21-LHRH; 12 = Phor18-ASAAS-LHRH; 71 = Phor15-βCG-ala; 및 74 = Phor15-C6-βCG-ala가 연구에서 사용된 작제물의 양에 후속된다.
도 9A-9H는 염수에 비한 처리 군의 종양 부피 및 A) Phor21-βCG-ala (33); B) D-ala-Phor21-LHRH (11); C) Phor18-Lupron (47); D) Phor18-ASAAS-LHRH (12); E) Phor18-LHRH (13); F) (KKKFAFA)3-LHRH; G) 30일 이하의 표시된 기간에서의 D-ala-Phor18-LHRH (85); 및 H) 기준선에 비한 기준선 값을 도시한다.
도 10A-10E는 A) 종양 중량, B) 기준선에 비한 종양 중량 변화, C) 살아 있는 종양 세포의 전체 수, D) 기준선에 비한 살아 있는 종양 세포의 전체 수의 변화, 및 E) 체중에 대한 Phor21-βCG-ala에 비한 5개의 LHRH 컨쥬게이트를 이용한 연구 종점에서의 종양 상태의 요약을 도시한다. 338614 = (KKKFAFA)3 LHRH, 338612 = Phor18-ASAAS-LHRH, 338613 = Phor18-LHRH, 및 339385 = D-ala-Phor18-LHRH.
도 11은 표시된 양의 독소루비신의 존재하에서의 증가하는 농도의 Phor21-βCG-ala와 함께 인큐베이션된 다약제 내성인 난소암 세포(OVCAR 3), 및 조합에 의한 가장 높은 독소루비신 농도에서의 200배만큼의 세포 사멸의 강화작용을 도시한다.
도 12는 LHRH 및 Phor21 및 βCG 및 Phor21 융합 작제물을 이용한 MDA-MB-435S.luc 세포에 비한 CHO(차이니즈 햄스터 난소) 및 TM4 세포 세포독성을 도시한다. TM4 세포는 LHRH 수용체 음성이고, CHO 세포는 CG 수용체 음성이고, MDA-MB-435S.luc 세포는 LHRH 및 CG 수용체 둘 모두를 발현한다.
도 13은 FSH-용해 펩티드 컨쥬게이트가 생체내에서 인간 전립선암 세포의 성장을 억제하는 것을 도시한다. 정상 염수(비히클 대조군), FSH 90-95(1mg/kg), FSH90-95-Phor18(0.1mg/kg, 1mg/kg), FSH81 -95(1mg/kg), FSH81 -95-Phor18(0.1mg/kg, 1mg/kg), 및 FSH33 -53(1mg/kg), FSH33-53-Phor18(0.1mg/kg, 1mg/kg) 처리로 처리된 누드 마우스에서의 종양 부피에서의 변화. 데이터는 종양 부피의 평균 ± S.E.(n = 8)로 제공된다. * p < 0.05.
도 14A-14C는 부검시의 종양 부피를 도시한다. 데이터는 평균 ± S.E.(n = 8)이다. 부검시의 종양 부피는 비히클 처리된 군에 비해 FSH90 -95-Phor18 및 FSH81 -95Phor18 및 FSH33-53-Phor18 처리된 마우스에서 유의하게 감소되었다. *p < 0.05.
도 15A-15C는 부검시의 종양 중량을 도시한다. 데이터는 평균 ± S.E.(n = 8)이다. 부검시의 종양 중량은 비히클 처리된 군에 비해 FSH90 -95-Phor18 및 FSH81 -95-Phor18 처리된 마우스에서 유의하게 감소되었다. *p < 0.05.
도 16은 체중을 도시한다. 데이터는 평균 ± S.E.(n = 8)이다. 부검시의 체중은 처리 군에서 상이하지 않았다.
도 17은 1 μM FSH81 - 89Phor18 및 FSH81 - 89aPhor18 단독 및 FSH의 존재하에서의 상대적 활성을 도시한다. 활성의 상실이 10 μM의 FSH 농도에서 유의하였다(p<0.05). FSH81 - 89Phor18 및 FSH81 - 89aPhor18은 MES-SA-Dx5 자궁 육종 세포(N=6)에 대해 FSH 수용체를 특별히 표적으로 한다.
상세한 설명
본 발명은 제 2 도메인 결합 부분에 연결되거나 융합된 제 1 도메인 용해 부분을 포함하는 융합 작제물을 적어도 부분적으로 기초로 한다. 통상적인 형태에서, 융합 작제물 제 1 도메인은 세포에 직접적 또는 간접적으로 독성이어서, 세포 증식 또는 생존을 감소시킬 수 있거나, 세포 죽음, 사멸 또는 아폽토시스를 자극하거나, 유도하거나, 증가시키거나, 향상시킬 수 있는 용해 부분을 포함하고; 융합 작제물 제 2 도메인은 결합 모이어티 존재물로 언급되는 세포를 표적으로 하는 부분을 포함한다.
본 발명에 따르면, 제 1 "용해" 도메인을 포함하거나 이로 구성되고, 제 2 "표적화" 또는 "결합" 도메인을 포함하거나 이로 구성되는 융합 작제물이 제공된다. 한 구체예에서, 융합 작제물은 펩티드 서열(리신 = K, 페닐알라닌 = F 및 알라닌 = A와 같은 아미노산으로부터 선택됨), 예를 들어, KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK를 포함하는 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개 잔기의 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열로 구성된 제 1 도메인, 및 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이들로 구성된 제 2 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 융합 작제물은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열로 구성된 제 1 도메인, 및 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이들로 구성된 제 2 도메인을 포함한다. 추가 구체예에서, 융합 작제물은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열로 구성된 제 1 도메인, 및 상기 제 1 도메인과 다른 1-25개의 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열(예를 들어, 표적화 또는 결합 모이어티)로 구성된 제 2 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다.
작제물과 관련하여 사용되는 경우 본원에서 사용되는 용어 "융합" 또는 "키메라" 및 이의 문법적 변형은 작제물이 서로 다르고, 자연에서 통상적으로 함께 존재하지 않는 2개의 상이한 분자 존재물로부터 유래되거나, 수득되거나, 분리되거나, 이들을 기초로 하거나, 이들 뒤에서 모델링되는 부분 또는 섹션을 함유하는 것을 의미한다. 즉, 예를 들어, 융합 작제물의 한 부분은 용해 부분을 포함하거나 이로 구성되고, 작제물의 제 2 부분은 표적화 부분, 예를 들어, 결합 능력을 갖는 모이어티를 포함하거나 이들로 구성되며, 제 1 및 제 2 도메인 각각은 구조적으로 다르다. 융합 작제물은 또한 "컨쥬게이트"로 언급될 수 있으며, 상기 컨쥬게이트는 제 1 도메인 용해 부분 및 제 2 도메인 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이들로 구성된다.
융합 작제물의 제 1 도메인 및/또는 제 2 도메인은 아미노산 서열(펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 렉틴), 핵산(DNA, RNA) 및 탄수화물(당류, 시알산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 아세틸뉴라민산 등)을 포함하거나 이들로 구성된다. 용어 "아미노산 서열", "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 2개 이상의 아미노산, 또는 아미드 결합 또는 동등물에 의해 공유적으로 연결된 "잔기"를 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 융합 아미노산 잔기는 공유 또는 비-공유 결합에 의해 연결될 수 있다. 공유 결합의 비제한적인 예는, 예를 들어, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 이기능성 말레이미드, N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC)를 포함하는 아미드 결합, 비-자연 및 비-아미드 화학 결합이다. 아미드 결합에 대해 대안적인 결합기는, 예를 들어, 케토메틸렌(예를 들어, -C(=O)-NH-에 대해 -C(=O)-CH2-), 아미노메틸렌(CH2-NH), 에틸렌, 올레핀(CH=CH), 에테르(CH2-O), 티오에테르(CH2-S), 테트라졸(CN4-), 티아졸, 레트로아미드, 티오아미드, 또는 에스테르를 포함한다(예를 들어, 문헌[Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide and Backbone Modifications," Marcel Decker, NY] 참조).
융합 작제물 또는 키메라의 제 1 및 제 2 도메인은 L-아미노산 서열, D-아미노산 서열 및 L-아미노산과 D-아미노산의 혼합물을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 제 1 및 제 2 도메인의 아미노산 서열은 선형 또는 고리 구조일 수 있고, 다른 모이어티(예를 들어, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7 등의 도메인)에 컨쥬게이션되어 분자내 또는 분자간 이황화결합을 형성하고, 또한 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 더 고등의 다른 다합체 또는 올리고머, 또는 다른 분자를 형성할 수 있다.
융합 작제물의 예시적 길이는 약 5 내지 15, 20 내지 25, 25 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 또는 200 내지 300 또는 그 초과의 아미노산 잔기 길이이다. 특정 구체예에서, 제 1 또는 제 2 도메인은 약 1 내지 10, 10 내지 20, 15 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100 또는 그 초과의 잔기의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. 더욱 특정한 구체예에서, 제 1 도메인은 15, 16, 17, 18, 19, 20, 28개 또는 그 초과의 잔기의 아미노산 서열로 구성된다.
단독이거나 제 2 도메인과 조합된 융합 작제물 제 1 도메인은 임의로 양친매성 알파-헬릭스를 형성한다. 양친매성 알파-헬릭스는 알파-헬릭스의 한 측면에 주로 친수성 아미노산을 함유하고, 나머지 측면은 주로 소수성 아미노산을 함유한다. 알파 헬릭스는 3.6 잔기마다 완전한 턴(turn)을 이루므로, 양친매성 알파 헬릭스의 아미노산 서열은 3 내지 4개 잔기마다 친수성 잔기와 소수성 잔기 사이에서 번갈아 나타난다. PNNPNNP 반복 패턴 또는 모티프는 양친매성 알파-헬릭스를 형성할 것으로 예측되고, 여기서 P는 양성으로 하전된 아미노산 잔기를 나타내고, N은 중성 아미노산 잔기이다. PNNPNNP 반복 패턴은 음성으로 하전된 세포막에 대한 용해 펩티드에 대한 양이온성 결합 부위 및 막 상호작용/침투에 대한 소수성 부위를 제공한다. 따라서, 융합 작제물은 양친매성 알파-헬릭스를 형성할 수 있는 하나 이상의 연속된 PNNPNNP 반복 패턴 또는 모티프, 또는 하나 이상의 불연속 PNNPNNP 반복 패턴 또는 모티프를 갖는 제 1 도메인을 포함한다. 예를 들어, 15 또는 18개 잔기의 아미노산 서열, 예를 들어, KFAKFAKKFAKFAKK 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAK는 연속 및 불연속 PNNPNNP 반복 모티프를 갖는다.
융합 작제물 제 2 도메인, 예를 들어, 표적화 또는 결합 모이어티는 리간드, 항체(또는 이의 항원-결합 단편), 항원, 인테그린, 인테그린 수용체(예를 들어, "RGD" 서열 모티프를 함유하는 단백질 또는 펩티드, 및 세포외기질(ECM)에 존재할 수 있는 성분, 예를 들어, 단당류, 이당류 또는 올리고당류, 시알산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 아세틸뉴리민산), 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 및 수용체, 항체, 항원, 인테그린, 인테그린 수용체(예를 들어, "RGD" 서열 모티프를 함유하는 단백질 또는 펩티드, 및 세포외기질(ECM)에 존재할 수 있는 성분, 예를 들어, 단당류, 이당류 또는 올리고당류, 시알산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 아세틸뉴리민산), 성장 인자 수용체, 사이토카인 수용체, 및 케모카인 수용체에 결합하는 표적화 및 결합 모이어티를 포함하거나 이들로 구성된다.
"수용체"는 통상적으로 세포 상(예를 들어, 막 수용체) 또는 세포 내에 존재한다. 수용체는 세포막 표면과 회합될 수 있거나, 세포막을 가로지를 수 있다. 예를 들어, 수용체 단백질은 임의로 세포질에 존재하거나, 세포외에 존재하거나, 둘 모두에 존재하는 부분을 갖는, 세포막을 가로지르는 막횡단 도메인을 가질 수 있다. 따라서, 수용체는 세포외, 막횡단 또는 세포질 부분을 함유하는 전장의 온전한 자연 수용체, 뿐만 아니라 이의 트렁케이션된 형태 또는 단편(예를 들어, 수용체의 세포외, 막횡단 또는 세포질 부분 또는 서열 단독, 또는 이들의 조합)을 포함한다. 예를 들어, 가용성 수용체는 통상적으로 막횡단 부분이 결핍되어 있고, 임의로 또한 자연 세포외 또는 세포질 영역(존재시, 자연 수용체 내)의 전부 또는 일부가 결핍될 수 있다. 이러한 트렁케이션된 수용체 형태 및 단편은 리간드에 대한 적어도 부분적 결합을 보유할 수 있다.
융합 작제물의 표적화 및 결합 모이어티 도메인은 특이적 또는 비특이적으로 수용체에 결합하고, 수용체 리간드를 나타내는 임의의 존재물을 포함하거나 이들로 구성된다. 따라서, 표적화 및 결합 모이어티의 비제한적인 예는 호르몬 수용체에 결합하는 호르몬, 호르몬 유사체, 호르몬 또는 호르몬 유사체의 단편, 수용체에 결합하는 성장 인자, 성장 인자 유사체, 성장 인자 또는 성장 인자 유사체의 단편, 호르몬 또는 호르몬 수용체에 결합하는 호르몬 수용체 또는 리간드, 및 호르몬 수용체에 결합하는 호르몬, 호르몬 유사체, 호르몬 또는 호르몬 유사체의 단편, 호르몬 또는 호르몬 수용체에 결합하는 호르몬 수용체 또는 리간드, 수용체에 결합하는 성장 인자, 성장 인자 유사체, 성장 인자 또는 성장 인자 유사체의 단편, 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 결합하는 성장 인자 수용체 또는 리간드 등에 결합하는 표적화 및 결합 모이어티를 포함한다.
결합 모이어티로서 유용한 예시적 호르몬은 난포-자극 호르몬(FSH), 생식샘자극호르몬-분비 호르몬 I, 생식샘자극호르몬-분비 호르몬 II, 칠성장어 III 황체형성호르몬 분비 호르몬, 황체형성호르몬 베타 사슬, 황체형성호르몬(LH), 융모생식샘자극호르몬(CG), 융모생식샘자극호르몬 베타 서브유닛(β- 또는 베타-CG), 멜라닌세포자극호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스테롤, 도파민, 소마토스타틴, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 프로게스테론, 안드로겐 및 이들의 유도체를 포함한다. 결합 모이어티로서 유용한 예시적 호르몬 수용체는 생식샘자극호르몬-분비 호르몬 I 수용체, 생식샘자극호르몬-분비 호르몬 II 수용체, 칠성장어 III 황체형성호르몬 분비 호르몬 수용체, 황체형성호르몬 수용체, 융모생식샘자극호르몬 수용체, 멜라닌세포자극호르몬 수용체, 에스트라디올 수용체, 도파민 수용체, 소마토스타틴 수용체, 난포-자극 호르몬(FSH) 수용체, 표피성장인자(EGF) 수용체, 성장 호르몬(GH) 수용체, Her2-neu 수용체, 글루코코르티코이드 호르몬 수용체, 에스트로겐 수용체, 테스토스테론 수용체, 프로게스테론 수용체 및 안드로겐 수용체를 포함한다.
예시적 성장 인자는 표피성장인자(EGF), 성장 호르몬(GH), 및 Her2-neu를 포함한다. 예시적 성장 인자 수용체는 표피성장인자(EGF) 수용체, 성장 호르몬(GH) 수용체, 및 Her2-neu 수용체, IGF-1을 포함한다.
표적화 또는 결합 모이어티의 특정한 비제한적인 예는 FSH, LHRH 및 βCG; FSH, LHRH 및 βCG의 기능성(결합) 단편; FSH, LHRH 및 βCG 유사체; 및 FSH, LHRH 및 βCG 키메라를 포함한다. LHRH는 완전히 기능성인 리간드이고, 리간드 수용체 상호작용을 통한 약리학적 효과, 예를 들어, 신호전달 경로의 활성화를 유도할 수 있다. βCG-ala는 임의의 약리학적 효과를 유도하지 않고 세포막에 결합할 수 있는 hCG의 단편이다. FSH 수용체 표적화 또는 결합 모이어티의 특정한 비제한적인 예는 Asn - Ser - Cys - Glu - Leu - Thr - Asn - Ile - Thr - Ile - Ala - Ile - Glu - Lys - Glu - Glu - Cys - Arg - Phe - Cys - Ile - Ser - Ile - Asn - Thr - Thr - Trp - Cys - Ala - Gly - Tyr - Cys - Tyr - Thr - Arg - Asp - Leu - Val - Tyr - Lys - Asp - Pro - Ala - Arg - Pro - Lys - Ile - Gln - Lys - Thr - Cys - Thr - Phe - Lys - Glu - Leu - Val - Tyr - Glu - Thr - Val - Arg - Val - Pro - Gly - Cys - Ala - His - His - Ala - Asp - Ser - Leu - Tyr - Thr - Tyr - Pro - Val - Ala - Thr - Gln - Cys - His - Cys - Gly - Lys - Cys - Asp - Ser - Asp - Ser - Thr - Asp - Cys - Thr - Val - Arg - Gly - Leu - Gly - Pro - Ser - Tyr - Cys - Ser - Phe - Gly - Glu - Met - Lys - Glu; 및 이들의 단편, 예를 들어, FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 33-53; FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 81-95; FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 81-89; FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 90-95; 또는 FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 33-53; FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 81-95; FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 81-89; 또는 FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 90-95를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 시스테인(C)은 알라닌(A) 잔기로 치환된다. 더욱 특정한 예에서, FSH 단편은 CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT; QAHAGKADSDSTDAT; QCHCGKCDSDSTDCT; QAHAGKADS; QCHCGKCDS 또는 DSTDCT, 또는 하나 이상의 시스테인(C) 잔기가 알라닌(A) 잔기로 대체된 상기 서열 중 임의의 서열, 또는 CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT; QAHAGKADSDSTDAT; QCHCGKCDSDSTDCT; QAHAGKADS; QCHCGKCDS 또는 DSTDCT 중 임의의 것의 단편을 포함하거나 이들로 구성된다. FSH 수용체에 결합하는 FSH 단편 및 유사체의 특정한 비제한적인 예는 또한 ser-gly-ser-asn-ala-thr-gly-ser-gly-ser-asn-ala-thr-ser-gly-ser; 및 gly-ser-gly-ser-asn-ala-thr-gly-ser-gly-ser-asn-ala-thr-ser-gly-ser을 포함한다. FSH 수용체에 결합하는 FSH 키메라의 특정한 예는 문헌[US Patent No. 7,202,215; US 2008/0234186; Weenen et al., J. Clin . Endocrinol . Metab . 89:5204 (1989); Klein et al., Fertil . Steril . 77:1248 (2002); 및 Pearl et al., Endocrinology 151:388 (2010)]에 기재되어 있다.
표적화 및 결합 모이어티는 신생물, 종양 또는 암세포, 및 신생물, 종양 또는 암세포와 관련된 림프관 또는 혈관에서 배타적으로 또는 우선적으로 발현되는 리간드에 대한 항원을 추가로 포함한다. 상기 항원은 편리하게는 "종양 관련 항원" 또는 "TAA"로 언급될 수 있고, 이는 몇 가지 예를 들면 암배아 항원(CEA), 알파태아단백질(AFP), 전립선 특이 항원(PSA), 전립선 특이 막 항원(PSMA), CA-125(잔여 상피성 난소암), 가용성 인터루킨-2(IL-2) 수용체, RAGE-1, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, 당단백질(gp) 75, gp100, 베타-카테닌, PRAME, MUM-1, ZFP161, 유비퀴틴-1, HOX-B6, YB-1, 오스테오넥틴, 및 ILF3, IGF-1을 포함한다. 표적화될 수 있는 다른 항원은 CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD154, 면역글로불린-유사 수용체 등이다.
표적화 및 결합 모이어티는 추가로 트랜스페린, 폴산 및 이의 유도체(예를 들어, 폴레이트), 및 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리 일원 및 TNF 수용체, 예를 들어, TNF-알파, TNF-베타(림프독소, LT), TRAIL, Fas, LIGHT, 41BB를 포함한다.
제 2 도메인이 표적화 또는 결합 도메인을 포함하거나 이들로 구성된 융합 작제물은 항원, 수용체 또는 리간드, 인테그린, 항체 또는 항원을 생성하거나 이들을 발현하는 세포, 또는 제 2 도메인이 결합하는 TAA에 결합할 수 있다. 세포의 비제한적인 예는 과증식 세포 및 비정상적이거나 요망되지 않은 과증식을 나타내는 세포를 포함한다. 특정한 비제한적인 예에서, 상기 세포는 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양 세포, 뿐만 아니라 파종성 신생물, 암, 종양 및 악성종양 세포 및 잠복성 신생물, 암, 종양 및 악성종양 세포를 포함한다. 추가의 비제한적인 예는 혈관구조의 세포, 예를 들어, 신생물, 암, 또는 종양의 혈관구조에 라이닝된 내피 세포를 포함한다. 비-표적(예를 들어, 정상) 또는 과증식하지 않는 세포에 비해 상승된 수준으로 항원, 수용체, 리간드, 인테그린, TAA 등을 발현하는 세포는 상기 세포의 선택성을 제공한다. 따라서, 표적화 또는 결합 모이어티는 표적 세포, 예를 들어, 과증식 세포(예를 들어, 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양, 및 파종성 및 잠복성 신생물, 암, 종양 및 악성종양 세포)에서 발현되거나 이들에 의해 생성되나, 검출가능하게 발현되지 않거나, 정상 또는 과증식하지 않는 세포에 의해 비교적 낮은 수준으로 발현됨으로써, 세포의 우선적 표적화를 제공하는 항원, 수용체, 리간드, 인테그린 또는 TAA에 결합할 수 있다. 항원, 수용체, 리간드, 인테그린 또는 TAA를 발현하는 예시적인 비제한적인 세포 및 조직 유형은 유방, 난소, 자궁, 자궁경부, 전립선, 고환, 부신, 뇌하수체, 췌장, 간, 위장, 피부, 근육, 자궁내막 및 혈관구조를 포함한다.
결합 모이어티의 추가 예는 항체 및 항체 단편을 포함한다. "항체"는 임의의 모노클로날 또는 폴리클로날 면역글로불린 분자, 예를 들어, IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, 및 이들의 임의의 서브클래스를 나타낸다. IgG에 대한 예시적 서브클래스는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4이다. 항체는 세포, 예를 들어, B 세포에 의해 생성되거나 세포, 예를 들어, B 세포에서 발현된 것을 포함한다. 항체 단편 또는 하위서열은 비교 전장 항체의 적어도 부분적 항원 결합 능력을 보유한 전장 항체의 부분을 나타낸다. 예시적 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, 단쇄 Fv(scFv), 이황화 결합된 Fvs(sdFv), VL, VH, 삼중특이적(Fab3), 이중특이적(Fab2), 디아바디(diabody)((VL-VH)2 또는 (VH-VL)2), 트리아바디(triabody)(3가), 테트라바디(tetrabody)(4가), 미니바디(minibody)((scFV-CH3)2), 이중특이적 단쇄 Fv(Bis-scFv), IgGdeltaCH2, scFv-Fc, (scFv)2-Fc, 또는 온전한 면역글로불린의 다른 항원 결합 단편을 포함한다.
융합 작제물은 아미노-말단에 제 1 도메인 및 카르복실-말단에 제 2 도메인을 갖는 것을 포함한다. 융합 작제물은 또한 카르복실-말단에 제 1 도메인 및 아미노-말단에 제 2 도메인을 갖는 것을 포함한다. 추가 도메인(예를 들어, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7 등의 도메인)이 존재하는 경우, 제 1 도메인은 제 2 도메인과 관련하여 NH2-말단에 위치되거나, 제 2 도메인은 제 1 도메인과 관련하여 NH2-말단에 위치된다.
본원에 기재된 다양한 서열의 하위서열 및 아미노산 치환, 예를 들어, KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, 또는 결합 모이어티가 또한 포함된다. 특정 구체예에서, 제 1 또는 제 2 도메인의 하위서열은 적어도 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25, 25 내지 30, 30 내지 35개 또는 그 초과의 아미노산 잔기를 갖는다.
따라서, 본 발명은 제 1 또는 제 2 도메인, 또는 제 1 및 제 2 도메인 둘 모두의 변형 또는 변화, 예를 들어, 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 따라서, 펩티드 서열 제 1 또는 제 2 도메인을 포함하는 융합 작제물은 치환이 제 1 또는 제 2 도메인의 활성(용해 또는 결합)을 파괴하지 않는 한 임의의 수의 보존성 또는 비-보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 변형된 용해 부분(제 1 도메인)은 변형되지 않은 제 1 도메인의 적어도 부분적 용해 활성, 예를 들어, 세포 사멸 또는 아폽토시스를 보유할 수 있고, 변형된 결합 모이어티 또는 이의 모방체는 변형되지 않은 결합 모이어티의 적어도 부분적 결합 활성을 보유할 수 있다.
"보존성 치환"은 하나의 아미노산의 생물학적, 화학적 또는 구조적으로 유사한 잔기에 의한 대체이다. 생물학적으로 유사하다는 것은 치환이 생물학적 활성, 예를 들어, 용해 활성과 양립되는 것을 의미한다. 구조적으로 유사하다는 것은 아미노산이 알라닌, 글리신 및 세린과 같이 유사한 길이를 갖거나, 유사한 크기를 갖는 측쇄를 갖거나, 제 1, 제 2 또는 추가 도메인의 구조가 양친매성 알파 헬릭스과 같이 유지됨을 의미한다. 화학적 유사성은 잔기가 동일한 전하를 갖거나 친수성 또는 소수성 둘 모두임을 의미한다. 특정 예로는 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기의 다른 소수성 잔기로의 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 다른 극성 잔기로의 치환, 예를 들어, 리신 대신 아르기닌, 아스파르트산 대신 글루탐산, 또는 아스파라긴 대신 글루타민, 트레오닌 대신 세린의 치환 등을 포함한다. 통상적인 검정을 이용하여 융합 작제물 변이체가 활성, 예를 들어, 용해 활성 또는 결합 활성을 갖는 지를 결정할 수 있다.
특정한 예는 펩티드 제 1 또는 제 2 도메인의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 또는 그 초과) 잔기의 치환 또는 결실을 포함한다. 변형된 융합 작제물은 참조 서열(예를 들어, 제 1 도메인, 예를 들어, KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 또는 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, 또는 제 2 도메인, 예를 들어, 결합 모이어티)과 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 가질 수 있다.
특정 구체예에서, 융합 작제물은 K 잔기 중 하나 이상이 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개 잔기의 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된 펩티드 제 1 도메인을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 융합 작제물은 K 잔기 중 하나 이상이 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열로 구성된 펩티드 제 1 도메인; 및 결합 모이어티를 포함하거나 이로 구성된 펩티드 제 2 도메인을 포함한다. 추가 특정 구체예에서, 융합 작제물은 K 잔기 중 하나 이상이 F 또는 L 잔기 중 임의의 것으로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 K, A 또는 L 잔기 중 임의의 것으로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 K, F 또는 L 잔기 중 임의의 것으로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열로 구성된 펩티드 제 1 도메인, 및 상기 제 1 도메인과 다른 1-25개의 L-아미노산 또는 D-아미노산 서열(예를 들어, 결합 모이어티)로 구성된 펩티드 제 2 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다.
용어 "동일성" 및 "상동성" 및 이의 문법상의 변형은 2개 이상의 언급된 존재물이 동일함을 의미한다. 따라서, 두 아미노산 서열이 동일한 경우, 이들은 동일한 아미노산 서열을 지닌다. "동일성 구역, 영역 또는 도메인"은 2개 이상의 언급된 존재물의 부분이 동일함을 의미한다. 따라서, 2개의 아미노산 서열이 하나 이상의 서열 영역에 걸쳐 동일하거나 상동인 경우, 이들은 이러한 영역에서 동일성을 공유한다. 핵산 서열에 관하여 사용될 때 용어 "상보적인"은 언급된 영역이 100% 상보적이고, 즉 미스매치 없이 100% 염기쌍 형성을 나타냄을 의미한다.
구조적 및 기능적으로 관련된 단백질 사이에 서열 보존량의 변화로 인해, 기능 또는 활성(예를 들어, 용해 또는 결합)을 보유하는데 요구되는 서열 동일성 양은 단백질, 영역 및 기능 또는 그 영역의 활성에 의존적이다. 예를 들어, 용해 펩티드 서열에 대해, 다수의 PNNPNNP 서열 반복 패턴 또는 모티프가 존재할 수 있으나, 하나 이상의 연속된 또는 불연속 PNNPNNP 서열 반복 패턴 또는 모티프가 존재할 필요는 없다.
2개의 서열 사이의 동일성의 정도는 당 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리듬을 이용하여 확인될 수 있다. 퍼센트 서열 동일성(상동성)을 계산하는 이러한 알고리듬은 일반적으로 비교 영역 상에서 서열 갭 및 미스매치를 설명한다. 예를 들어, BLAST(예를 들어, BLAST 2.0) 검색 알고리듬(예를 들어, 문헌[Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403 (1990)] 참조, NCBI를 통해 공개적으로 이용가능함)은 하기와 같은 예시적인 검색 파라미터를 지닌다: 미스매치 -2; 갭 오픈 5; 갭 연장 2. 폴리펩티드 서열 비교를 위해, BLASTP 알고리듬은 통상적으로 PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 또는 BLOSUM 50과 같은 스코어링 매트릭스와 함께 사용된다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3) 및 SSEARCH 서열 비교 프로그램을 또한 사용하여 동일성 정도를 정량한다(Pearson et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol . 132:185 (2000); 및 Smith et al., J. Mol . Biol . 147:195 (1981)). 델라우니(Delaunay)-기재 위상 맵핑을 이용하여 단백질의 구조적 유사성을 정량하기 위한 프로그램이 또한 개발되었다(Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun . 304:320 (2003)).
개별적 잔기 및 제 1, 제 2 및 추가 도메인은 공유 또는 비공유 결합에 의해 연결될 수 있다. 공유 결합의 비제한적인 예는 아미드 결합, 비-자연 및 비-아미드 화학 결합이며, 이는, 예를 들어, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 이기능성 말레이미드, N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC)를 포함한다. 아미드 결합에 대안적인 결합기는, 예를 들어, 케토메틸렌(예를 들어, -C(=O)-NH-에 대해 -C(=O)-CH2-), 아미노메틸렌(CH2-NH), 에틸렌, 올레핀(CH=CH), 에테르(CH2-O), 티오에테르(CH2-S), 테트라졸(CN4-), 티아졸, 레트로아미드, 티오아미드, 또는 에스테르를 포함한다(예를 들어, 문헌[Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide and Backbone Modifications," Marcel Decker, NY] 참조).
제 1 및 제 2 도메인은 공유 또는 비공유 결합에 의해 서로 융합되거나 가까이에 인접하여 연결될 수 있다. 제 1 및 제 2 도메인은 사이에 존재하는 영역, 예를 들어, 제 1 도메인과 제 2 도메인 사이에 위치된 힌지, 스페이서 또는 링커에 의해 분리될 수 있다. 링커 또는 스페이서의 예는 비-펩티드 링커 또는 스페이서, 예를 들어, 연속 탄소 원자(C) 사슬(예를 들어, CCCCC)을 포함한다. 다중-탄소 사슬은 카르복실산(예를 들어, 디카르복실산), 예를 들어, 글루타르산, 숙신산 및 아디프산을 포함한다. 특정한 비제한적인 예는 6 탄소 링커, 예를 들어, α-아미노-카프로산이다.
또 다른 구체예에서, 제 1 및 제 2 도메인은 제 1 도메인과 제 2 도메인 사이에 위치된 아미노산, 또는 펩티드 힌지, 스페이서 또는 링커에 의해 연결된다. 펩티드 힌지, 스페이서 또는 링커 서열은 임의의 길이일 수 있으나, 통상적으로 약 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 또는 40-50개의 아미노산 잔기의 범위일 수 있다. 특정 구체예에서, 제 1 도메인과 제 2 도메인 사이에 위치된 펩티드 힌지, 스페이서 또는 링커는 1 내지 25개의 L-아미노산 또는 D-아미노산 잔기, 또는 1 내지 6개의 L-아미노산 또는 D-아미노산 잔기이다. 제 1 도메인과 제 2 도메인 사이에 위치된 서열 내에 포함되는 특정 아미노산 잔기는 A, S 또는 G 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함한다. 제 1 도메인과 제 2 도메인 사이에 위치된 단백질의 특정한 비제한적인 예는 GSGGS, ASAAS, 또는 특정 링커 서열 (GSGGS)n 또는 (ASAAS)n의 다합체 내의 서열 또는 이에 기재된 서열을 포함하며, 여기서 n은 1-5, 5-10, 10-20 등이다. 아미노산 및 펩티드의 유도체는 2개(또는 그 초과의) 도메인 사이에 위치될 수 있다. 아미노산 유도체의 특정한 비제한적인 예는 리신 유도체이다.
힌지, 스페이서 또는 링커, 또는 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7 등의 도메인을 갖거나 갖지 않는 융합 작제물은 오로지 자연 아미노산 또는 합성, 비-자연 아미노산 또는 아미노산 유사체로 구성될 수 있거나, 유도체화된 형태를 포함할 수 있다. 다양한 구체예에서, 융합 작제물은 제 1 또는 제 2 도메인 내에 L-아미노산으로 치환된 하나 이상의 D-아미노산, D-아미노산 및 L-아미노산의 혼합물, 또는 오로지 D-아미노산 잔기로 구성된 서열을 포함한다.
융합 작제물은 a) 자연 아미드 결합("펩티드 결합") 결합이 아닌 잔기 결합 그룹; b) 자연 발생 아미노산 잔기 대신의 비-자연 잔기; 또는 c) 이차 구조 모방을 유도하는, 즉, 이차 구조, 예를 들어, 알파 헬릭스 형태를 유도하거나 안정화시키는 잔기의 통상적으로 3개의 구조적 그룹으로부터 유래되는 비-자연 구조 성분의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 융합 작제물은 고리형 구조, 예를 들어, 분자의 아미노-말단과 카르복시-말단 사이의 말단-말단 아미드 결합 또는 분자내 또는 분자간 이황화 결합(들)을 포함한다. 융합 작제물은 시험관내 또는 생체내에서 변형될 수 있고, 예를 들어, 당 또는 탄수화물 잔기, 포스페이트기, 지방산, 지질 등을 포함하도록, 예를 들어, 번역후 변형될 수 있다.
첨가의 특정 예는 제 3, 제 4, 제 5, 제 6 또는 제 7 도메인을 포함한다. 따라서, 제 1 및 제 2 도메인을 갖는 융합 작제물은 별개 또는 상보적 기능 또는 활성을 제공하기 위해 이에 공유적으로 연결된 하나 이상의 추가 도메인(제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7 등)을 포함한다. 예시적인 추가 도메인은, 예를 들어, 고정된 금속에 대한 정제를 가능케 하는 금속 킬레이트화 펩티드, 예를 들어, 폴리히스티딘 트랙 및 히스티딘-트립토판 모듈; 고정된 면역글로불린에 대한 정제를 가능케 하는 단백질 A 도메인; 및 FLAGS 연장/친화성 정제 시스템(Immunex Corp, Seattle WA)에서 이용되는 도메인을 포함하는 분리를 촉진하는 도메인을 포함한다. 정제 도메인과 융합 작제물 사이의 분해성 서열, 예를 들어, 인자 Xa 또는 엔테로키나제의 임의의 포함이 정제를 촉진하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 6개의 히스티딘 잔기에 연결된 융합 작제물-인코딩 핵산 서열, 및 그 뒤에 티오레독신 및 엔테로키나제 분해 부위를 포함할 수 있다. 히스티딘 잔기는 융합 작제물의 검출 및 정제를 촉진하는 한편, 엔테로키나제 분해 부위는 나머지 단백질로부터 작제물을 정제하기 위한 수단을 제공한다(예를 들어, 문헌[Kroll, DNA Cell. Biol . 12:441 (1993)] 참조).
융합 작제물 활성은 다양한 요인에 의해 영향을 받을 수 있고, 이에 따라 융합 작제물은 상기 요인 중 하나 이상을 고려하여 설계되거나 최적화될 수 있다. 상기 요인은, 예를 들어, 세포에 대한 독성에 영향을 줄 수 있는 융합 작제물의 길이를 포함한다. 알파 헬릭스 형성 용해 펩티드 도메인의 세포 사멸 활성은 또한 헬릭스의 안정성에 좌우될 수 있다. 힌지 및 스페이서는 제 1 도메인과 펩티드 용해 도메인의 헬리칼 구조의 막 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 더 짧은 융합 작제물, 예를 들어, 임의로 스페이서 또는 힌지를 포함하는 21개 미만의 아미노산의 작제물은 증가된 헬릭스 안정성으로 인해 증가된 세포독성을 나타낼 수 있다. 특히, 스페이서, 예를 들어, ASAAS 및 6 아미노카프로산은 더 짧은 융합 작제물의 독성을 증가시키는 경향이 있다. 도메인 내에 존재하는 특정 아미노산 잔기에 의해 부분적으로 결정되는 용해 펩티드 도메인의 전하가 또한 세포 사멸 효능에 영향을 미친다.
용해 도메인에 비한 결합 모이어티의 위치결정(N-말단 또는 C-말단)은 또한 융합 작제물의 세포 사멸 활성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 용해 도메인에 비한 C-말단에 위치된 결합 모이어티는 용해 도메인에 비해 N-말단에 위치되는 경우보다 더 큰 세포 사멸 활성을 갖는다.
융합 작제물 생체내 반감기는 하나 이상의 비-자연 발생 아미노산 또는 유도체를 갖는 융합 작제물 펩티드를 작제함으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, D-아미노산(예를 들어, 모든 잔기의 30% 이하 또는 그 초과가 D-거울상 이성질체임)을 갖는 융합 작제물은 혈청 단백질분해에 대해 내성이며, 이에 따라 더 긴 시간 동안 활성일 수 있어 생체내 효능을 증가시킬 수 있다. 또한, 하나 이상의 비-자연 발생 아미노산 또는 유도체를 갖는 융합 작제물 펩티드 도메인을 작제하는 것은 용혈 활성을 감소시킬 수 있다. D-거울상 이성질체를 갖는 상기 융합 작제물은 또한 용액 중에서 단량체인 더 큰 경향을 가지며, 이들은 유의하게 응집하지 않는다.
본 발명에 따르면, 세포 세포독성을 달성하는데 필요한 융합 작제물의 양을 나타내는 더 낮은 IC50 값에 의해 확인되는 바와 같은 Phor21-βCG-ala, Phor21-GSGGS-βCG-ala, Phor21-ASAAS-βCG-ala, 또는 Phor14-βCG-ala 중 하나 이상보다 큰 항-세포 증식 활성을 갖는 융합 작제물이 제공된다. 본 발명에 따르면, Phor21-βCG-ala, Phor21-GSGGS-βCG-ala, Phor21-ASAAS-βCG-ala, 또는 Phor14-βCG-ala보다 IC50/HA50(용혈 활성) 비에 의해 표현되는 더 작은 용혈 활성을 갖는 융합 작제물이 또한 제공된다. 본 발명에 따르면, 약 0.02, 0.01, 또는 0.005 미만의 IC50/HA50(용혈 활성) 비에 의해 표현되는 용혈 활성을 갖는 융합 작제물이 추가로 제공된다. 세포 세포독성 및 용혈 활성을 결정하기 위한 대표적 검정 조건은 실시예 1에 기재되어 있다.
펩티드 및 펩티도미메틱이 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 생성되고 분리될 수 있다. 펩티드는 당 분야에 공지된 화학적 방법을 이용하여 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Caruthers (1980). Nucleic Acids Res. Symp . Ser . 215; Horn (1980); 및 Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA] 참조). 펩티드 합성은 다양한 고체상 기술을 이용하여 수행될 수 있고(예를 들어, 문헌[Roberge Science 269:202 (1995); Merrifield, Methods Enzymol . 289:3(1997)] 참조), 자동화된 합성은, 예를 들어, 제조업체의 설명서에 따라 ABI 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)를 이용하여 달성될 수 있다. 펩티드 및 펩티드 모방체는 또한 조합 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 합성 잔기 및 폴리펩티드 포함 모방체는 당 분야에 공지된 다양한 절차 및 방법을 이용하여 합성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman, et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY] 참조). 변형된 펩티드는 화학적 변형 방법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440 (1997); Frenkel, Free Radic . Biol . Med. 19:373 (1995); 및 Blommers, Biochemistry 33:7886 (1994)] 참조).
본 발명은 본 발명의 융합 작제물을 인코딩하는 핵산 및 융합 작제물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 특정 구체예에서, 핵산은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하는 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개 잔기의 아미노산 서열로 구성된 제 1 도메인, 및 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이들로 구성된 제 2 도메인을 포함하는 융합 작제물을 인코딩한다. 또 다른 구체예에서, 핵산은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 제 1 도메인, 및 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이들로 구성된 제 2 도메인을 포함하는 융합 작제물을 인코딩한다. 추가 구체예에서, 핵산은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 제 1 도메인, 및 상기 제 1 도메인과 다른 1-25개의 아미노산 서열(예를 들어, 표적화 또는 결합 모이어티)로 구성된 제 2 도메인을 포함하거나 이들로 구성된 융합 작제물을 인코딩한다.
유전자, 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드 서열, 프라이머, 올리고뉴클레오티드 또는 프로브로 본원에서 또한 언급될 수 있는 핵산은 임의의 길이의 자연 또는 변형된 퓨린-함유 및 피리미딘-함유 중합체, 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 또는 이들의 혼합된 폴리리보-폴리데옥시리보 뉴클레오티드 및 α-아노머 형태를 나타낸다. 2개 이상의 퓨린-함유 및 피리미딘-함유 중합체는 통상적으로 포스포에스테르 결합 또는 이의 유사체에 의해 결합된다. 상기 용어는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 핵산의 모든 형태를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 핵산은 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 삼중가닥, 선형 또는 원형일 수 있다. 핵산은 유전체 DNA, cDNA, 및 안티센스를 포함한다. RNA 핵산은 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA, tRNA 또는 안티센스일 수 있다. 핵산은 자연 발생, 합성, 뿐만 아니라 뉴클레오티드 유사체 및 유도체를 포함한다.
유전 부호의 축퇴의 결과로서, 핵산은 본 발명의 융합 작제물을 인코딩하는 서열과 관련된 서열 축퇴를 포함한다. 따라서, 융합 작제물을 인코딩하는 축퇴 핵산 서열이 제공된다.
핵산은 임의의 다양한 공지된 표준 클로닝 및 화학적 합성 방법을 이용하여 생성될 수 있고, 당업자에게 공지된 부위-특이적 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 의해 고의로 변화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 순도는 서열분석, 젤 전기영동, UV 분광법을 통해 결정될 수 있다.
핵산은 핵산의 발현이 본원에서 "발현 카세트"로서 언급되는 "발현 조절 요소"에 의해 영향을 받거나 조절되는 핵산 작제물로 삽입될 수 있다. 용어 "발현 조절 요소"는 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하거나 영향을 미치는 하나 이상의 핵산 서열 요소를 나타낸다. 발현 조절 요소는 적절한 경우 단백질-인코딩 유전자 앞에 프로모터, 인핸서, 전사 종료자, 유전자 사일런서(silencer), 개시 코돈(예를 들어, ATG) 등을 포함할 수 있다.
핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 요소는 핵산 서열의 전사 및 적절한 경우 번역을 조절한다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 언급된 구성요소가 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 근접위치를 나타낸다. 통상적으로, 발현 조절 요소는 유전자의 5' 또는 3' 말단에 나란히 놓여지나 또한 인트론에 존재할 수 있다.
발현 조절 요소는 유도성이거나(즉, 활성화를 위해 외부 시그널을 필요로 함) 또는 탈억제성인(즉, 전사를 전환시키기 위해 시그널을 필요로 함; 시그널이 더 이상 존재하지 않는 경우, 전사는 활성화되거나 "탈억제됨"), 항시적으로 전사를 활성화시키는 요소를 포함한다. 또한, 본 발명의 발현 카세트에는 유전자 발현이 특이적 세포-유형 또는 조직에 대해 조절가능하도록 하기에 충분한 조절 요소(즉, 조직-특이적 조절 요소)가 포함된다. 통상적으로, 상기 요소는 코딩 서열의 업스트림 또는 다운스트림(즉, 5' 및 3')에 위치된다. 프로모터는 일반적으로 코딩 서열의 5' 측에 위치된다. 재조합 DNA 또는 합성 기술에 의해 생성된 프로모터를 이용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 전사를 제공할 수 있다. "프로모터"는 전사를 유도하기에 충분한 최소의 서열 요소를 의미한다.
핵산은 숙주 세포로의 증식을 위해 그리고 요망되는 경우 후속하는 유전적 조작을 위해 플라스미드에 삽입될 수 있다. 플라스미드는 숙주 세포에서 안정적으로 증식될 수 있는 핵산이며, 플라스미드는 핵산의 발현을 유도하기 위해 발현 조절 요소를 임의로 함유할 수 있다. 벡터는 본원에서 플라스미드와 동의어로 사용되며, 또한 숙주 세포에서의 발현을 위한 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 플라스미드 및 벡터는 일반적으로 세포 및 프로모터에서의 증식을 위한 복제 기점을 적어도 함유한다. 따라서, 플라스미드 및 벡터는 핵산을 인코딩하는 융합 작제물의 유전적 조작에 유용하여, 융합 작제물 또는 안티센스 핵산을 생성하고, 예를 들어, 숙주 세포 및 유기체에서 융합 작제물을 발현시킨다.
박테리아 시스템 프로모터는 T7 및 유도성 프로모터, 예를 들어, 박테리오파지 λ의 pL, plac, ptrp, ptac(ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 및 테트라사이클린 반응성 프로모터를 포함한다. 곤충 세포 시스템 프로모터는 항시성 또는 유도성 프로모터(예를 들어, 엑디손(ecdysone))를 포함한다. 포유동물 세포 항시성 프로모터는 SV40, RSV, 소 유두종 바이러스(BPV) 및 기타 바이러스 프로모터, 또는 포유동물 세포의 유전체(예를 들어, 메탈로티오네인 IIA 프로모터; 열 충격 프로모터) 또는 포유동물 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기(late) 프로모터; 유도성 마우스 유암 바이러스 긴 말단 반복)로부터 유래된 유도성 프로모터를 포함한다. 대안적으로, 레트로바이러스 유전체는 적절한 숙주 세포에서 융합 작제물을 도입하고 이의 발현을 유도하도록 유전학적으로 변형될 수 있다.
발현 시스템은 생체내 사용을 위해 설계된 벡터를 추가로 포함한다. 특정한 비제한적인 예는 아데노바이러스 벡터(U.S. Patent Nos. 5,700,470 및 5,731,172), 아데노-관련 벡터(U.S. Patent No. 5,604,090), 단순 헤르페스 바이러스 벡터(U.S. Patent No. 5,501,979), 레트로바이러스 벡터(U.S. Patent Nos. 5,624,820, 5,693,508 및 5,674,703), BPV 벡터(U.S. Patent No. 5,719,054) 및 CMV 벡터(U.S. Patent No. 5,561,063)을 포함한다.
효모 벡터는 항시성 및 유도성 프로모터(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ch. 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al. Methods in Enzymology, 153:516 (1987), eds. Wu & Grossman; Bitter Methods in Enzymology, 152:673 (1987), eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.; 및, Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II] 참조)를 포함한다. ADH 또는 LEU2와 같은 항시성 효모 프로모터 또는 GAL과 같은 유도성 프로모터가 이용될 수 있다(R. Rothstein In: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol.11, Ch. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986). 예를 들어, 동종 재조합을 통한 외래 핵산 서열의 효모 염색체로의 통합을 촉진하는 벡터가 당 분야에 공지되어 있다. 삽입된 폴리뉴클레오티드가 더 통상적인 벡터에 비해 지나치게 큰 경우(예를 들어, 약 12 Kb 초과), 효모 인공 염색체(YAC)가 통상적으로 사용된다.
발현 벡터는 또한 선택압 또는 인식가능한 마커(예를 들어, 베타-갈락토시다제)에 내성을 부여하는 선택가능한 마커를 함유할 수 있어, 벡터를 갖는 세포가 선택되고, 성장하고, 확장되도록 한다. 대안적으로, 선택가능한 마커는 융합 작제물을 인코딩하는 핵산을 함유하는 제 1 벡터와 함께 숙주 세포로 공트랜스펙션되는 제 2 벡터 상에 있을 수 있다.
선택 시스템은 각각 tk-, hgprt_ 또는 aprt_ 세포에서 이용될 수 있는 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 유전자(Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스페라제 유전자(Szybalska et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 48:2026 (1962)), 및 아데닌 포스포리보실트랜스페라제(Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) 유전자를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 추가로, 항대사물 내성은 메토트렉세이트에 대해 내성을 부여하는 dhfr(O'Hare et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1527 (1981)); 미코페놀산에 대해 내성을 부여하는 gpt 유전자(Mulligan et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드 G-418에 대해 내성을 부여하는 네오마이신 유전자(Colberre-Garapin et al., J. Mol . Biol . 150:1(1981)); 푸로마이신; 및 하이그로마이신에 대해 내성을 부여하는 하이그로마이신 유전자(Santerre et al., Gene 30:147 (1984))에 대한 선택의 기초로서 사용될 수 있다. 추가의 선택가능한 유전자는, 세포가 트립토판 대신 인돌을 사용하도록 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 사용하도록 하는 hisD(Hartman et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 85:8047 (1988)); 및 오르니틴 데카르복실라제 억제제인 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO에 대해 내성을 부여하는 ODC(오르니틴 데카르복실라제)를 포함한다(McConlogue (1987) In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory).
융합 작제물을 발현하는 숙주 세포, 및 융합 작제물을 인코딩하는 핵산 및 융합 작제물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 또한 제공된다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포이다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포이다. 다양한 양태에서, 진핵생물 세포는 효모 또는 포유동물(예를 들어, 사람, 영장류 등) 세포이다.
본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 증식될 수 있거나, 전사될 수 있거나, 융합 작제물을 발현하도록 인코딩될 수 있는 핵산이 도입되는 세포이다. 상기 용어는 또한 숙주 세포의 임의의 자손 또는 서브클론을 포함한다. 숙주 세포는 융합 작제물을 발현하는 세포 및 융합 작제물을 발현하지 않는 세포를 포함한다. 융합 작제물을 발현하지 않는 숙주 세포는 융합 작제물을 인코딩하는 핵산 또는 안티센스를 포함하는 핵산 또는 벡터를 증식시키기 위해 사용된다.
숙주 세포는 박테리아 및 효모와 같은 미생물; 및 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 재조합 박테리오파지 핵산, 플라스미드 핵산 또는 코스미드 핵산 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 양배추꽃 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 및 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스)로 감염된 동물 세포 시스템, 또는 일시적이거나 안정한 증식 또는 발현을 위해 조작된 형질전환된 동물 세포 시스템이 있다.
융합 작제물, 융합 작제물을 인코딩하는 핵산, 벡터, 및 융합 작제물을 발현하거나 융합 작제물을 인코딩하는 핵산 및 안티센스로 형질전환된 숙주 세포는 분리되고 정제된 형태를 포함한다. 본 발명의 조성물의 수식 어구로서 사용된 용어 "분리된"은 조성물이 실제로 완전히 또는 적어도 부분적으로 자연 발생 생체내 환경으로부터 사람 손에 의해 만들어지거나 분리됨을 의미한다. 일반적으로, 분리된 조성물에는 자연상태에서 이와 정상적으로 회합되는 하나 이상의 물질, 예를 들어, 하나 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 세포막이 실제로 없다. 용어 "분리된"은 다합체/올리고머, 변이체, 변형체 또는 유도체화된 형태와 같은 조성물의 대안적인 물리적 형태, 또는 사람 손에 의해 생성된 숙주 세포에서 발현된 형태를 배제하지 않는다. 용어 "분리된"은 또한 그 중 어느 하나가 사람 손에 의해 제조된, 조합물로서 존재하는 형태(예를 들어, 약학적 제형 및 조합 조성물)를 배제하지 않는다.
"분리된" 조성물은 또한 자연상태에서 이와 통상적으로 회합되는 물질들 중 일부, 실질적인 수, 대부분 또는 전부가 없을 때 "정제"된 것일 수 있다. 따라서, 또한 실질적으로 순수한 분리된 융합 작제물은, 예를 들어, 단백질 라이브러리의 단백질 또는 유전체 또는 cDNA 라이브러리에 있는 핵산과 같이, 수 백만의 다른 서열 중에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. "정제된" 조성물은 하나 이상의 다른 분자와 조합될 수 있다.
본 발명에 따르면, 융합 작제물과 조합 조성물의 혼합물이 제공된다. 한 구체예에서, 혼합물은 하나 이상의 융합 작제물과 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 혼합물은 하나 이상의 융합 작제물과 항-세포 증식, 항-종양, 항-암 또는 항-신생물 치료제 또는 작용제를 포함한다. 추가의 구체예에서, 혼합물은 하나 이상의 융합 작제물과 면역 증강제를 포함한다. 항-세포 증식, 항-종양, 항-암 또는 항-신생물 치료제 또는 작용제, 및 면역 증강 치료제 또는 작용제 중 하나 이상과 함께, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제에 존재하는 하나 이상의 융합 작제물과 같은 조합물이 또한 제공된다.
본 발명의 융합 작제물, 예를 들어, 제 1 용해 도메인 및 제 2 결합 모이어티 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 용해, 세포 사멸 또는 아폽토시스를 위해 표적 세포에 대해 사용될 수 있다. 상기 세포는 선택적으로 표적화될 수 있다. 예를 들어, 수용체, 리간드, 항원 또는 항체를 발현하는 세포는 융합 작제물에 의해 표적화될 수 있어서, 수용체, 리간드, 항원 또는 항체를 덜 발현하는 세포에 비해 우선적으로 사멸될 수 있다.
본 발명에 따르면, 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법, 및 세포 증식을 감소시키거나 억제하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 세포와 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물을 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 세포와 세포 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물을 접촉시키는 것을 포함한다.
또한, 과증식 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법, 및 과증식하는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 과증식 세포 또는 과증식하는 세포와 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물을 접촉시키는 것을 포함한다.
비-전이성 또는 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법이 추가로 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 신생물, 암, 종양 또는 악성종양 세포와 상기 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물을 접촉시키는 것을 포함한다.
잠복 또는 분열하지 않는 비-전이성 또는 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법이 또한 추가로 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 잠복 또는 분열하지 않는 신생물, 암, 종양 또는 악성종양 세포와 잠복 또는 분열하지 않는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물을 접촉시키는 것을 포함한다.
수용체, 리간드, 항체 또는 항원을 발현하는 세포(예를 들어, 과증식하는 세포)의 증식을 선택적으로 감소시키거나 억제하는 방법이 추가로 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 세포와 세포(예를 들어, 과증식하는 세포)의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물을 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 펩티드의 결합 모이어티는 세포에 의해 발현된 수용체, 리간드, 항체 또는 항원에 결합한다.
수용체, 리간드, 항체 또는 항원을 발현하는 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포의 증식을 선택적으로 감소시키거나 억제하는 방법이 또한 추가로 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 세포와 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물을 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 융합 작제물의 결합 모이어티는 세포에 의해 발현된 수용체, 리간드, 항체 또는 항원에 결합한다.
용어 "접촉시키는"은 두개 이상의 존재물 사이(예를 들어, 융합 작제물과 세포 사이)의 직접적 또는 간접적 결합 또는 상호작용을 의미한다. 본원에서 사용되는 접촉은 용액에서, 고체 상에서, 시험관내에서, 생체외에서, 세포에서 및 생체내에서의 접촉을 포함한다. 생체내에서의 접촉은 투여하는, 또는 투여로 언급될 수 있다.
증식을 비선택적으로 또는 선택적으로 감소시키거나 억제하기 위해 표적화되는 세포는 융합 작제물의 결합 모이어티가 결합하는 임의의 분자를 발현하는 세포를 포함한다. 예시적 세포는 수용체(예를 들어, 호르몬 수용체, 성장 인자 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체), 리간드(예를 들어, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인) 또는 항체 또는 항원, 또는 인테그린 또는 인테그린 수용체("RGD" 서열 모티프를 함유하는 펩티드), 또는 세포외 기질(ECM)에 존재하는 성분, 예를 들어, 단당류, 이당류 또는 올리고당류, 시알산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 아세틸뉴라민산, "RGD" 서열 모티프를 함유하는 펩티드 등을 발현하는 세포를 포함한다.
표적 세포는 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 또는 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 수용체를 발현하는 세포를 포함한다. 표적 세포는 또한 난포-자극 호르몬(FSH), 생식샘자극호르몬-분비 호르몬 I, 생식샘자극호르몬-분비 호르몬 II, 칠성장어 III 황체형성호르몬 분비 호르몬, 황체형성호르몬, 융모생식샘자극호르몬, 멜라닌세포자극호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스테롤, 도파민, 소마토스타틴, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 프로게스테론, 안드로겐, 표피성장인자(EGF), Her2/neu, 비타민 H, 폴산 또는 이의 유도체(예를 들어, 폴레이트), 트랜스페린, 갑상샘자극호르몬(TSH), 엔도텔린, 봄베신, 성장 호르몬, 혈관작용성 장 펩티드, 락토페린, 인테그린(예를 들어, 알파-5 베타 3 또는 알파-5 베타 1 인테그린), 신경성장인자, CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD154, 면역글로불린-유사 수용체, ROR1, IGF-1, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원(PSA), 전립선 특이 막 항원(PSMA), 전환성장인자 알파, 전환성장인자 베타, 인슐린-유사 성장 인자, 혈관내피성장인자, 인슐린, 세룰로플라스민, 또는 HIV-tat에 결합하는 수용체를 발현하는 세포를 포함한다.
표적 세포는 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 또는 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 수용체에 결합하는 수용체를 발현하는 세포를 추가로 포함한다. 또한, 표적 세포는 난포-자극 호르몬 (FSH), 생식샘자극호르몬-분비 호르몬 I, 생식샘자극호르몬-분비 호르몬 II, 칠성장어 III 황체형성호르몬 분비 호르몬, 황체형성호르몬 베타 사슬, 황체형성호르몬, 융모생식샘자극호르몬, 융모생식샘자극호르몬 베타 서브유닛, 멜라닌세포자극호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스테롤, 도파민, 소마토스타틴, 글루코코르티코이드, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 프로게스테론, 안드로겐, 표피성장인자(EGF), Her2/neu, 비타민 H, 폴산 또는 이의 유도체(예를 들어, 폴레이트), 트랜스페린, 갑상샘자극호르몬(TSH), 엔도텔린, 봄베신, 성장 호르몬, 혈관작용성 장 펩티드, 락토페린, 인테그린(예를 들어, 알파-5 베타 3 또는 알파-5 베타 1 인테그린), 신경성장인자, CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD154, 면역글로불린-유사 수용체, ROR1, IGF-1, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이 항원(PSA), 전립선 특이 막 항원(PSMA), 전환성장인자 알파, 전환성장인자 베타, 인슐린, 세룰로플라스민, HIV-tat, 또는 이의 유사체(예를 들어, 미페리스톤(mifepristone), 플루타미드(flutaminde), 루프론(lupron), 즉솔라덱스(zxoladex), 수프렐린(supprelin), 시나텔 트리프토렐린(synatel triptorelin), 부세렐린(buserelin), 센트로렐릭신(centrorelix), 가니렐릭신(ganirelix), 아바렐릭스(abarelix), 안티드(antide), 테베렐릭스(teverelix) 또는 데가렐릭스(degarelix)(Fe200486))에 결합하는 수용체를 발현하는 세포를 포함한다.
비-선택적으로 또는 선택적으로 증식을 감소시키거나 억제하기 위한 표적에 대한 세포는 추가로 "종양 관련 항원", 예를 들어, 암배아 항원(CEA), 알파태아단백질(AFP), 전립선 특이 항원(PSA), 전립선 특이 막 항원(PSMA), CA 125(잔여 상피성 난소암), 가용성 인터루킨-2(IL-2) 수용체, RAGE-1, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, 당단백질(gp) 75, gp100, 베타-카테닌, PRAME, MUM-1, ZFP161, 유비퀴틴-1, HOX-B6, YB-1, 오스테오넥틴, 및 ILF3를 발현하는 세포를 포함한다. 비-선택적으로 또는 선택적으로 증식을 감소시키거나 억제하기 위한 표적에 대한 세포는 또한 추가로 트랜스페린, 폴산 및 이의 유도체(예를 들어, 폴레이트), 및 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리 일원 또는, 예를 들어, TNF-알파, TNF-베타(림프독소, LT), TRAIL, Fas, LIGHT, 및 41BB, 및 이들에 대한 수용체를 발현하는 세포를 포함한다.
본 발명의 융합 작제물 및 방법은 또한 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 및 과증식 장애를 치료하는데 적용가능하다. 따라서, 본 발명에 따르면, 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 및 과증식 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과증식 장애를 치료하는데 충분한 융합 작제물의 양을 대상체(치료를 필요로 함)에 투여하는 것을 포함한다.
용어 "과증식 장애"는 임의의 요망되지 않거나 비정상적인 세포 생존(예를 들어, 프로그램화된 세포 사멸 또는 아폽토시스를 겪는데 실패), 성장 또는 증식을 나타낸다. 상기 장애는 양성 과다형성, 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양을 포함한다. 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 및 과증식 장애는 대상체의 임의의 세포, 조직, 기관에 영향을 미칠 수 있다. 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 및 과증식 장애가 대상체에 국소적, 국부적 또는 전신적으로 존재할 수 있다. 과증식 장애는 다른 이차 부위, 영역 또는 위치로 전이되거나 전이되지 않을 수 있는 유방, 폐(예를 들어, 소세포 또는 비소세포), 갑상샘, 두경부, 뇌, 코인두, 인후, 코 또는 굴, 림프, 부신, 뇌하수체, 갑상샘, 림프, 위장(구강, 식도, 위, 십이지장, 회장, 공장(소장), 결장, 직장), 비뇨생식관(자궁, 난소, 질, 자궁경부, 자궁내막, 난관, 방광, 고환, 음경, 전립선), 신장, 췌장, 간, 뼈, 골수, 림프, 혈액, 근육, 피부, 피부, 및 줄기 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다수의 조직 및 기관으로부터 발생할 수 있다.
본 발명의 융합 작제물 및 방법은 또한 임의의 세포, 기관 또는 조직 기원의 전이성 또는 비전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 뿐만 아니라 임의의 세포, 기관 또는 조직 기원의 전이성 또는 비전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물의 혈관구조에 적용가능하다. 상기 장애는 임의의 세포 또는 조직 유형, 예를 들어, 암종, 육종, 흑색종, 신경, 및 그물내피 또는 조혈 신생물 장애(예를 들어, 골수종, 림프종 또는 백혈병)에 실질적으로 영향을 미칠 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "신생물" 및 "종양"은 정상 대응부 세포의 성장, 증식 또는 생존보다 성장, 증식 또는 생존이 더 큰 세포 또는 세포의 집단, 예를 들어, 세포 증식 또는 분화 장애를 나타낸다. 종양은 별개의 덩어리 또는 성장을 형성하는 신생물이다. "암" 또는 "악성종양"은 인접한 공간, 조직 또는 기관을 침습할 수 있는 신생물 또는 종양을 나타낸다. "전이"는 이의 원발성 부위로부터 대상체 내의 하나 이상의 이차 부위, 위치 또는 영역으로 전이되거나 퍼지는 신생물, 종양, 암 또는 악성종양을 나타내며, 상기 부위, 위치 또는 영역은 원발성 종양 또는 암과 별개이다.
신생물, 종양, 암 및 악성종양 세포(전이성 또는 비-전이성)는 잠복 또는 남아있는 신생물, 종양, 암 및 악성종양 세포를 포함한다. 상기 세포는 통상적으로 분열되지 않은(G0-G1 정지) 잔유물 종양 세포로 구성된다. 이들 세포는 최소 한도의 남아 있는 질병으로서 원발성 부위에 또는 전이된 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포로서 존속할 수 있다. 이들 잠복 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포는 증상이 없는 (unsymptomatic) 채로 남아 있으나, 일단 이들 잠복 세포가 증식하면 심각한 증상 및 사멸을 초래할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 잠복 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포의 증식을 감소시키거나 억제시킬 수 있고, 이는 차례로 종양 또는 암 재발이나 종양 또는 암 전이 또는 진행을 억제하거나 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 치료하는데(예를 들어, 증식을 감소시키거나 억제하기에) 충분한 융합 작제물의 양을 대상체(치료를 필요로 함)에 투여하는 것을 포함한다.
전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물은, 예를 들어, 초기이거나 진행된 것과 같은 임의의 단계일 수 있고, 예를 들어, I, II, III, IV 또는 V기 종양이다. 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물은 사전 치료될 수 있거나 안정화되거나(진행하지 않음) 또는 소실될 수 있다.
전이와 관련하여, 본 발명의 방법을 이용하여 원발성 종양 또는 암의 다른 부위로의 전이, 또는 원발성 종양 또는 암으로부터 원위에 있는 다른 부위에서의 전이성 종양 또는 암의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제함으로써 종양 또는 암 재발이나 종양 또는 암 진행을 억제하거나 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 특히 1) 잠재적으로 전이를 발생시키거나 전이를 발생시키는(예를 들어, 전이된 종양 세포, DTC) 종양 또는 암 세포의 성장, 증식, 운동성 또는 침습성의 감소 또는 억제; 2) 원발성 종양 또는 암으로부터 원발성 종양 또는 암과 별개인 하나 이상의 다른 부위, 위치 또는 영역으로 발생하는 전이의 형성 또는 확립의 감소 또는 억제; 3) 전이가 형성되거나 확립된 후에 원발성 종양 또는 암과 별개인 하나 이상의 다른 부위, 위치 또는 영역에서의 전이의 성장 또는 증식의 감소 또는 억제; 및 4) 전이가 형성되거나 확립된 후 추가 전이의 형성 또는 확립의 감소 또는 억제를 포함한다.
전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물의 세포는 "고형" 세포 덩어리로 응집될 수 있거나 분산되거나 확산될 수 있다. "고형" 종양은 통상적으로 함께 응집하여 덩어리를 형성하는 암, 신생물 또는 전이를 나타낸다. 특정한 비제한적인 예는 내장 종양, 예를 들어, 흑색종, 유방암, 췌장암, 자궁암 및 난소암, 고환암, 예를 들어, 고환종, 위암 또는 결장암, 간암, 부신암, 신암종 및 방광 암종, 폐암, 두경부암 및 뇌종양/암을 포함한다.
상피 또는 내분비 조직의 악성종양을 나타내는 암종은 호흡계 암종, 위장계 암종, 비뇨생식계 암종, 고환 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 내분비계 암종, 및 흑색종을 포함한다. 예시적인 암종으로는 자궁, 자궁경부, 폐, 전립선, 유방, 두경부, 결장, 췌장, 고환, 부신, 신장, 식도, 위, 간 및 난소로부터 형성된 것들을 포함한다. 상기 용어는 또한, 예를 들어, 암종성 및 육종성 조직으로 구성된 악성종양을 포함하는 암육종을 포함한다. 샘암종은 샘 조직의 암종을 포함하거나, 종양이 샘 유사 구조를 형성한다.
육종은 중간엽 세포 기원의 악성종양을 나타낸다. 예시적인 육종은, 예를 들어, 림프육종, 지방육종, 뼈육종, 연골육종, 평활근육종, 횡문근육종 및 섬유육종을 포함한다.
신경 신생물은 신경아교종, 아교모세포종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 별아교세포종 및 핍지세포종을 포함한다.
"액상 종양"은 통상적으로 고형 덩어리를 형성하지 않으므로, 자연상태에서 분산되거나 확산된 신생물을 나타낸다. 특정 예는 그물내피 또는 조혈계의 신생물, 예를 들어, 림프종, 골수종 및 백혈병을 포함한다. 백혈병의 비제한적인 예는 급성 및 만성 림프모구, 골수모구 및 다발 골수종을 포함한다. 통상적으로, 상기 질병은 충분하지 않게 분화된 급성 백혈병, 예를 들어, 적혈모구 백혈병 및 급성 거핵모구성 백혈병으로부터 발생한다. 특정한 골수성 장애는 급성 전골수성 백혈병(APML), 급성 골수 백혈병(AML) 및 만성 골수 백혈병(CML)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 림프구 악성종양은 B-직계성 ALL 및 T-직계성 ALL을 포함하는 급성 림프모구 백혈병(ALL), 만성 림프성 백혈병(CLL), 전림프구성 백혈병(PLL), 털세포 백혈병(HLL) 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정한 악성 림프종은 비-호지킨 림프종 및 변이체, 말초 T 세포 림프종, 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATL), 피부 T-세포 림프종(CTCL), 대과립 림프구성 백혈병(LGF), 호지킨병 및 리드-슈테르베르크병을 포함한다.
본원에 개시된 바와 같이, 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과증식 장애는 자궁, 유방, 질, 자궁경부 및 자궁관에서 발생할 수 있다. 자궁내막증은 자궁의 세포가 자궁의 외부로부터 다른 영역, 예를 들어, 난소, 방광 또는 장으로 성장하는 경우에 발생한다. 유섬유종 및 폴립이 자궁,유방, 질, 자궁경부 및 자궁관에 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면, 자궁내막증 및 유섬유종 또는 폴립을 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 자궁내막증을 치료하는데 충분한 양의 융합 작제물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 유섬유종 또는 폴립을 치료하는데 충분한 양의 융합 작제물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
표적 세포는 생식 또는 생식력에 관여하거나 이를 필요로 하는 세포를 포함한다. 따라서, 본 발명에 따르면, 동물의 생식력을 감소시키는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 생식력을 감소시키거나 임신의 가능성을 감소시키거나, 수컷 동물에서 정자 생성을 감소시키기에 충분한 양의 융합 작제물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
본원에 또한 개시된 바와 같이, 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과증식 장애가 전립선에서 발생할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 양성 전립선 과다형성 또는 전이성 전립선 신생물을 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 양성 전립선 과다형성 또는 전이성 전립선 신생물을 치료하는데 충분한 양의 융합 작제물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
항-세포 증식 활성 또는 효과를 갖는 임의의 조성물, 치료, 프로토콜, 요법 또는 섭생은 융합 작제물과 조합될 수 있거나, 본 발명의 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 작제물 및 방법은 과증식 장애, 예를 들어, 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 성장, 진행, 전이, 증식 또는 생존이나 시험관내 또는 생체내 악화를 억제하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 늦추거나, 감소시키거나 예방하는 임의의 다른 조성물, 치료, 프로토콜 또는 치료 섭생을 포함하는, 항-증식, 항-종양, 항-암, 항-신생물 및 항-전이 치료를 포함한다. 항-증식(예를 들어, 종양) 요법의 특정한 비제한적인 예는 화학요법, 면역요법, 방사선요법(이온화 또는 화학적), 국소 열(고열) 요법, 외과적 절제 및 예방접종을 포함한다. 융합 작제물은 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항-암, 항-전이 또는 면역-증강 치료 또는 요법의 투여 전에, 실질적으로 동시에, 또는 이후에 투여될 수 있다. 융합 작제물은 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항-암, 항-전이 또는 면역-증강 치료 또는 요법, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물과의 조합 조성물로서 투여될 수 있다.
항-증식, 항-신생물, 항-종양, 항-암 및 항-전이 조성물, 요법, 프로토콜 또는 치료는 세포 주기 진행 또는 세포 증식을 예방하거나, 붕괴시키거나, 방해하거나, 억제하거나, 지연시키거나; 아폽토시스 또는 세포 사멸을 자극하거나 향상시키거나, 핵산 또는 단백질 합성 또는 대사를 억제하거나, 세포 분열을 억제하거나, 세포 생존 또는 필요한 세포 생존 인자, 성장 인자 또는 신호전달 경로(세포외 또는 세포내)의 생성 또는 이용을 저하시키거나, 감소시키거나, 억제하는 것들을 포함한다. 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항-암 및 항-전이 활성을 갖는 화학제 부류의 비제한적인 예는 알킬화제, 항-대사물, 식물 추출물, 식물 알칼로이드, 니트로소우레아, 호르몬, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항-암 및 항-전이 활성을 갖는 약물의 특정 예는 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 사이클로스포린 A, 프레드니솔론, 멜팔란, 클로람부실, 메클로르에타민, 부술판, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 티오구아닌, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드, AZT, 5-아자시티딘(5-AZC) 및 5-아자시티딘 관련 화합물, 예를 들어, 데시타빈(5-아자-2'데옥시시티딘), 시타라빈, 1-베타-D-아라비노푸라노실-5-아자시토신 및 디히드로-5-아자시티딘, 블레오마이신, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 미토마이신 C, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조토신, 하이드록시우레아, 시스플라틴, 미토탄, 프로카르바진, 다카르바진, 탁산(예를 들어, 탁솔 또는 파클리탁셀), 빈블라스틴, 빈크리스틴, 독소루비신 및 디브로모만니톨 등을 포함한다.
융합 작제물 및 방법에 적용가능한 추가의 작용제가 당업자에게 공지되어 있고, 이용될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 약제, 예를 들어, 항체, 세포 성장 인자, 세포 생존 인자, 세포 분화 인자, 사이토카인 및 케모카인이 투여될 수 있다. 모노클로날 항체의 비제한적인 예는 특히 본 발명에 따른 융합 작제물과 조합하여 사용될 수 있는 리툭시맙(Rituxan®), 트라스투주맙(Herceptin®), 베바시주맙(Avastin®), 라니비주맙(Lucentis®), 세툭시맙(Erbitux®), 알렘투주맙(Campath®), 파니투무맙(Vectibix®), 퍼투주맙(Perjeta®), 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin®), 이필리무맙(ipilimumab)(Yervoy®), 토시투모맙(Bexxar®) 등을 포함한다. 융합 작제물과의 사용에 적용가능한 다른 표적화된 약물은 이마티니브(imatinib)(Gleevec®), 제피티니브(gefitinib)(Iressa®), 보르트조미브(bortzomib)(Velcade®), 라파티니브(lapatinib)(Tykerb®), 수니티니브(sunitinib)(Sutent®), 소라페니브(sorafenib)(Nevaxar®), 닐로티니브(nilotinib)(Tasigna®), 잘루투무맙(zalutumumab), 달로투주맙(dalotuzumab), 피지투무맙(figitumumab), 라무시루맙(ramucirumab), 갈릭시맙(galiximab), 파를레투주맙(farletuzumab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오파투무맙(Arzerra®), 토시투무맙, 2F2(HuMax-CD20), 7D8, IgM2C6, IgG1 2C6, 11B8, B1, 2H7, LT20, 1F5 또는 AT80 다클리주맙(Zenapax®), 및 항-LHRH 수용체 항체이다. 세포 성장 인자, 세포 생존 인자, 세포 분화 인자, 사이토카인 및 케모카인의 비제한적인 예는 IL-2, IL-1α, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-7, 과립구-대식세포-집락 자극 인자(GMCSF), IFN-γ, IL-12, TNF-α, TNFβ, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, SDF-1, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, 에오탁신(eotaxin), 에오탁신-2, I-309/TCA3, ATAC, HCC-1, HCC-2, HCC-3, LARC/MIP-3α, PARC, TARC, CKβ, CKβ6, CKβ7, CKβ8, CKβ9, CKβ11, CKβ12, C10, IL-8, GROα, GROβ, ENA-78, GCP-2, PBP/CTAPIII-TG/NAP-2, Mig, PBSF/SDF-1 및 림포탁틴(lymphotactin)을 포함한다.
추가의 비제한적인 예는 세포 기반 요법을 포함하는 면역-증강 치료 및 요법을 포함한다. 특히, 면역-증강 치료 및 요법은 림프구, 형질 세포, 대식세포, 수지상 세포, NK 세포 및 B-세포를 투여하는 것을 포함한다.
전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 치료하는 방법, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 갖거나 가질 위험이 있기 때문에 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법, 및 항-증식성, 항-종양, 항-암, 항-신생물 또는 항-악성종양 요법의 효과를 증가시키거나 개선시키는 방법이 제공된다. 각각의 구체예에서, 상기 방법은 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 갖거나 그러한 위험이 있는 대상체에게 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 치료하는데 충분한 양의 융합 작제물을 투여하고; 대상체에게 대상체를 치료하는데 충분한 융합 작제물의 양을 투여하고; 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 요법을 받고 있거나 받았던 대상체에게 항-증식, 항-종양, 항-암, 항-신생물 또는 항-악성종양 요법의 효과를 증가시키기에 충분한 양의 융합 작제물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과증식 장애, 질병 또는 질환이 존재한다는 증거(예를 들어, 하나 이상의 증상)가 시작되기 전에(즉, 예방), 이와 동시에 또는 이후에 실시될 수 있다. 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과증식 장애의 증상이 발생하기 전에, 동시에 또는 직후에 융합 작제물을 투여하는 것은 대상체에서 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과증식 장애, 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간을 감소시킬 수 있다. 또한, 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과증식 장애, 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상의 발생 이전에, 동시에 또는 직후에 융합 작제물을 투여하는 것은 대상체의 다른 부위, 영역, 조직 또는 기관으로의 과증식하는 세포의 확산 또는 전이(예를 들어, 전이), 또는 대상체의 다른 부위, 영역, 조직 또는 기관에서의 과증식하는 세포의 확립(예를 들어, 전이)을 억제하거나, 감소시키거나, 예방할 수 있다.
본 발명의 융합 작제물 및 방법, 예를 들어, 치료 방법은 대상체에게 검출될 수 있거나 측정가능한 치료적 이익 또는 개선을 제공할 수 있다. 치료적 이익 또는 개선은 대상체에게 임의의 측정가능하거나 검출될 수 있는 객관적이거나 주관적, 일시적, 임시적 또는 보다 긴-기간의 이익이 되거나, 대상체의 조직, 기관, 세포 또는 세포 집단에서 질환, 장애 또는 질병에서의 어느 정도의 유해한 증상, 결과 또는 근원적인 원인의 개선이다. 치료적 이익 및 개선은 장애, 질병 또는 질환과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간을 감소시키거나 저하시키거나, 장애, 질병 또는 질환의 근원적인 원인 또는 수반하는 효과를 감소시키거나 저하시키는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본 발명의 융합 작제물 및 방법은 대상체에게 치료적 이익 또는 개선을 제공하는 것을 포함한다.
치료적 이익 또는 개선이 요망되는 결과인 본 발명의 방법에서, 본 발명의 융합 작제물은 치료가 필요한 대상체에게 충분하거나 효과적인 양으로 투여될 수 있다. "충분한 양" 또는 "효과적인 양"은 단일 또는 다중 용량으로, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 조성물(치료제, 예를 들어, 화학요법제 또는 면역 자극 약물), 치료, 프로토콜 또는 치료적 섭생제와 함께, 임의의 기간(장기 또는 단기)의 검출가능한 반응, 대상체에서 임의의 측정가능하거나 검출가능한 정도의 또는 임의의 기간 동안(예를 들어, 수시간, 수일, 수개월, 수년 또는 치료됨) 요망되는 결과 또는 이익을 제공하는 양을 나타낸다. 장애, 질병 또는 질환 또는 증상의 진행 또는 악화를 감소시키거나 억제하는 것이 만족스러운 결과로 고려되나, 치료를 위한 용량 또는 "충분한 양" 또는 "효과적인 양"(예를 들어, 치료적 이익 또는 개선을 제공함)은 통상적으로 장애, 질병 또는 질환, 또는 장애, 질병 또는 질환의 하나, 다수 또는 모든 유해 증상, 결과 또는 합병증을 측정가능한 정도로 개선하는데 효과적이다.
용어 "개선시키다"는 대상체 상태의 검출가능한 객관적이거나 주관적인 개선을 의미한다. 검출가능한 개선은 장애, 질병 또는 질환에 의해 야기되거나 이와 관련된 증상의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간의 주관적이거나 객관적인 감소, 장애, 질병 또는 질환의 근원적인 원인 또는 결과의 개선, 또는 장애, 질병 또는 질환의 역전을 포함한다.
따라서, 치료는 장애, 질병 또는 질환, 또는 관련 증상 또는 결과, 또는 근원적인 원인의 억제, 감소 또는 예방; 장애, 질병, 질환, 증상 또는 결과, 또는 근원적인 원인의 진행 또는 악화의 억제, 감소 또는 예방; 또는 장애, 질병, 질환 또는 증상의 하나 이상의 추가 증상의 추가적인 악화 또는 발생의 억제, 감소 또는 예방을 발생시킬 수 있다. 따라서, 성공적인 치료 결과는 "치료적 효과" 또는 "이익"을 발생시키거나, 하나 이상의 증상의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간 또는 대상체의 질환, 장애, 질병 또는 증상의 근원적인 원인 또는 결과의 억제, 감소 또는 예방을 발생시킨다. 따라서, 질환, 장애, 질병 또는 증상의 하나 이상의 근원적인 원인에 영향을 미치는 치료 방법이 이로운 것으로 간주된다. 장애 또는 질환의 진행 또는 악화를 안정화 또는 억제시키는 것이 또한 성공적인 치료 결과이다.
따라서, 치료적 이익 또는 개선은 질환, 장애 또는 질병과 관련된 임의의 하나, 대부분 또는 모든 증상, 합병증, 결과 또는 근원적인 원인의 완전한 제거일 필요는 없다. 따라서, 만족스러운 종점은 대상체의 상태가 점진적으로 개선되거나, 짧거나 긴 기간(수시간, 수일, 수주, 수개월 등)에 걸쳐 장애 또는 질병의 생리학적, 생화학적 또는 세포 소견 또는 특징 중 하나 이상의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간의 부분적인 감소, 또는 하나 이상의 관련 유해 증상 또는 합병증 또는 결과 또는 근원적인 원인, 악화 또는 진행(예를 들어, 질환, 장애 또는 질병의 하나 이상의 증상 또는 합병증의 안정화)의 억제 또는 역전시에 달성된다.
특정 구체예에서, 치료 방법은 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 세포 덩어리, 부피, 크기 또는 세포 수의 부분적이거나 완전한 파괴를 발생시키거나; 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 세포 괴사, 용해 또는 아폽토시스를 자극하거나, 유도하거나, 증가시키거나; 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 부피, 크기, 세포 덩어리를 감소시키거나; 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 부피, 덩어리, 크기 또는 세포 수의 증가 또는 진행을 억제하거나, 예방하거나; 과증식하는 세포의 대상체의 다른(이차) 부위, 영역, 조직 또는 기관으로의 확산 또는 전이(예를 들어, 전이), 또는 대상체의 다른(이차) 부위, 영역, 조직 또는 기관에서 과증식하는 세포의 확립(예를 들어, 전이)을 억제하거나, 감소시키거나; 대상체의 수명을 연장시킨다. 추가의 특정 구체예에서, 치료 방법은 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물과 관련되거나 이에 의해 야기된 유해 증상 또는 합병증의 중증도, 기간 또는 빈도를 감소시키거나, 저하시킨다.
충분한 양 또는 효과적인 양이 단일 투여로 제공될 필요는 없을 수 있고, 단독으로 또는 다른 조성물(예를 들어, 화학요법제 또는 면역 증강제 또는 자극제), 치료, 프로토콜 또는 치료 섭생과 함께 제공될 필요도 없을 수 있다. 예를 들어, 상기 양은 대상체의 필요, 치료하려는 장애, 질병 또는 질환의 상태 또는 치료 부작용에 의해 지정된 대로 비례적으로 증가될 수 있다. 또한, 충분한 양 또는 효과적인 양이 제 2 조성물(예를 들어, 화학요법제 또는 면역자극제), 치료, 프로토콜 또는 치료 섭생 없이 단일 또는 다중 용량으로 제공되는 경우 충분하거나 효과적일 필요가 없는데, 그 이유는 상기 용량 이상 및 이를 초과하는 추가의 용량, 양 또는 기간 또는 추가의 조성물(예를 들어, 화학요법제 또는 면역자극제), 치료, 프로토콜 또는 치료 섭생이 제공된 대상체에서 효과적이거나 충분하게 고려되도록 포함될 수 있기 때문이다. 충분하게 고려되는 양은 또한 또 다른 치료, 치료 섭생 또는 프로토콜의 사용 감소를 초래하는 양을 포함한다.
충분한 양 또는 효과적인 양이 치료하려는 각각 및 모든 대상체에서 또는 제공된 그룹 또는 집단에 있는 치료되는 대상체의 대부분에서 예방적 또는 치료적으로 효과적일 필요는 없다. 치료 또는 치료 방법에서 통상적인 대로, 일부 대상체는 제공된 치료, 치료 섭생 또는 프로토콜에 크거나 작은 반응을 나타낼 것이다. 충분한 양 또는 효과적인 양은 그룹 또는 일반적인 집단이 아닌 특정 대상체에서의 충분함 또는 효과를 나타낸다. 상기 양은 치료하려는 상태, 예를 들어, 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과증식 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)의 유형 또는 단계, 요망되는 치료 효과 뿐만 아니라 개별적 대상체(예를 들어, 대상체 내에서의 생체이용률, 성별, 연령 등)에 부분적으로 의존적일 것이다.
요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식, 예를 들어, 과증식 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)에 대한 치료 이익 또는 개선의 특정한 비제한적인 예는 세포 크기, 덩어리 또는 부피의 감소, 세포 크기, 덩어리 또는 부피의 증가 억제, 악화 또는 진행의 지연 또는 억제, 세포 괴사, 용해 또는 아폽토시스의 자극, 신생물 또는 악성종양 또는 전이의 감소 또는 억제, 사망률 감소 및 대상체의 수명 연장을 포함한다. 따라서, 세포 크기, 덩어리, 부피 또는 전이(안정화) 증가의 억제 또는 지연은, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물의 완전한 제거가 발생하지 않더라도 비록 수일, 수주 또는 수개월에 불과할지라도 수명을 증가시킬 수 있다(사망률 감소). 감소되거나 저하될 수 있는 과증식 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)과 관련된 유해 증상 및 합병증은, 예를 들어, 동통, 구역, 불쾌, 식욕 부족, 기면 및 쇠약을 포함한다. 따라서, 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식, 예를 들어, 과증식 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)의 증상의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간의 감소, 예를 들어, 주관적인 느낌의 개선(예를 들어, 증가된 에너지, 식욕, 감소된 구역, 개선된 운동성 또는 정신적 웰빙 등)이 치료 이익 또는 개선의 모든 예이다.
예를 들어, 융합 작제물의 충분하거나 효과적인 양은, 그 투여가 더 적은 양의 화학요법 약물, 방사선 또는 면역요법이 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식, 예를 들어, 과증식 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)의 치료에 요구되도록 하는 경우에 치료 효과를 갖는 것으로 간주된다.
용어 "대상체"는 동물, 통상적으로 포유동물, 예를 들어, 인간, 비인간 영장류(유인원, 긴팔원숭이, 침팬지, 오랑우탄, 짧은꼬리원숭이), 애완 동물(개 및 고양이), 농장 동물(말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험 동물(마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그)을 나타낸다. 대상체는 동물 질병 모델, 예를 들어, 생체내 융합 작제물의 분석을 위한 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식, 예를 들어, 과증식 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)의 동물 모델을 포함한다.
치료에 적절한 대상체는 종양이 완화된 대상체를 포함하여, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 세포를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체, 진행하고 있는 대상체 뿐만 아니라 항-증식(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물) 요법을 받고 있거나 받았던 대상체를 포함한다. "위험이 있는" 대상체는 통상적으로 과다형성의 발생(예를 들어, 종양)인 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식과 관련된 위험 요인을 갖는다.
위험이 있거나 후보가 되는 대상체의 특정 예는 융합 작제물이 결합할 수 있는 수용체, 리간드, 항원 또는 항체를 발현시키는 세포를 갖는 대상체를 포함하며, 특히 괴사, 용해, 사멸 또는 파괴를 위해 표적화된 세포는 비-표적 세포보다 더 많은 수 또는 더 많은 양의 수용체, 리간드, 항원 또는 항체를 발현시킨다. 상기 세포는 괴사, 용해 또는 사멸을 위해 선택적으로 또는 우선적으로 표적화될 수 있다.
위험이 있는 대상체는 또한 외과적 절제, 화학요법, 면역요법, 이온화 또는 화학적 방사선요법, 국소 또는 국부 열(고열) 요법, 또는 예방접종에 대한 후보인 대상체, 및 외과적 절제, 화학요법, 면역요법, 이온화 또는 화학적 방사선요법, 국소 또는 국부 열(고열) 요법, 또는 예방접종을 받은 대상체를 포함한다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어, 안정 또는 완화의 기간 이후에 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 재발 또는 재성장으로 인한 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물, 또는 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물과 관련된 합병증의 위험이 있는 대상체를 치료하는데 적용될 수 있다.
위험 인자는 성별, 생활 방식(식이, 흡연), 직업(의학 및 임상 직원, 농업 및 축산업 종사자), 환경 인자(발암원 노출), 가족력(자가면역 장애, 당뇨병 등), 유전적 소인 등을 포함한다. 예를 들어, 흑색종이 발생할 위험이 있는 대상체는 과도한 일광 노출(자외선 조사), 창백한 피부(fair skin), 많은 수의 반점(형성이상 반점), 환자 표현형, 가족력, 또는 이전 흑색종 병력을 포함한다. 따라서, 암이 발생할 위험이 있는 대상체는 생활 방식, 직업, 환경 인자, 가족력, 및 종양 관련 유전자, 유전자 결실 또는 유전자 변이에 대한 유전적 스크린에 의해 확인될 수 있다. 유방암이 발생할 위험이 있는 대상체는, 예를 들어, Brca1이 결핍되어 있다. 결장암이 발생할 위험이 있는 대상체는 이른 연령 또는 고 빈도의 폴립 형성, 또는 결실되거나 변이된 종양 억제 유전자, 예를 들어, 선종성 결장폴립증(APC)을 갖는다.
대상체는 또한 다른 치료에서 제외된 대상체를 포함한다. 예를 들어, 특정 대상체는 외과적 절제, 화학요법, 면역요법, 이온화 또는 화학적 방사선요법, 국소 또는 국부 열(고열) 요법, 또는 예방접종에 대해 양호한 후보가 아닐 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 치료를 위한 후보 대상체는 외과적 절제, 화학요법, 면역요법, 이온화 또는 화학적 방사선요법, 국소 또는 국부 열(고열) 요법, 또는 예방접종에 대한 후보가 아닌 대상체를 포함한다.
융합 작제물은 단위 용량 또는 단위 투여량 형태로 제형화될 수 있다. 특정 구체예에서, 융합 작제물은 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과증식 장애를 갖는 대상체를 치료하는데 효과적인 양으로 존재한다. 추가의 특정 구체예에서, 융합 작제물은 전이성 또는 비전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 갖는 대상체를 치료하는데 효과적인 양으로 존재한다. 추가의 특정 구체예에서, 융합 작제물은 대상체의 생식력을 감소시키는데 효과적인 양으로 존재한다. 예시적인 단위 용량은 약 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 또는 2500-5000, 5000-25,000, 5000-50,000 ng; 및 약 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 또는 2500-5000, 5000-25,000, 5000-50,000 ㎍ 및 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 또는 2500-5000 mg의 범위이다.
본 발명의 조성물 및 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 접촉되거나 제공될 수 있다. 조성물을 투여하여, 예를 들어, 효과적이거나 충분한 양으로, 단일 또는 다중 투여량으로서 의도된 효과를 제공할 수 있다. 예시적 용량은 연속하는 날, 또는 격일이나 간헐적으로 약 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 또는 2500-5000, 5000-25,000, 5000-50,000 pg/kg; 약 50-500, 500-5000, 5000-25,000 또는 25,000-50,000 ng/kg; 및 약 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 또는 2500-5000, 5000-25,000, 5000-50,000 ㎍/kg, 또는 약 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 또는 2500-5000, 5000-25,000 mg/kg의 범위이다. 단일 또는 다중 용량은 연속하는 날, 또는 격일이나 간헐적으로 투여될 수 있다.
조성물은 전신, 국부 또는 국소 투여를 통해 임의의 경로로 투여될 수 있고, 방법 또한 그렇게 실시될 수 있다. 예를 들어, 융합 작제물은 전신, 국부 또는 국소, 정맥내, 경구(예를 들어, 섭취 또는 흡입), 근내, 복막내, 피내, 피하, 공동내, 두개내, 경피(국소), 비경구, 예를 들어, 경점막 또는 직장으로 투여될 수 있다. 약학적 제형을 포함하는 본 발명의 조성물 및 방법은 (미세)캡슐화된 전달 시스템을 통해 투여되거나, 투여용 임플란트로 패키징될 수 있다.
본 발명은 융합 작제물, 및 융합 작제물이 약학적 조성물에 포함되는 방법을 추가로 제공한다. 약학적 조성물은 "약학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는" 담체, 희석제 또는 부형제를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는"은 담체, 희석제 또는 부형제를 언급할 때 약학적 투여 및 제형의 다른 성분과 상용되는 용매(수성 또는 비수성), 세제, 용액, 에멀젼, 분산 매질, 코팅, 등장화제 및 흡수 촉진제 또는 지연제를 포함한다. 상기 제형은 정제(코팅되거나 비코팅됨), 캡슐(경질 또는 연질), 마이크로비드, 에멀젼, 분말, 과립, 결정, 현탁액, 시럽 또는 엘릭서(elixir)에 함유될 수 있다.
약학적 조성물은 특정 투여 경로와 상용되도록 제형화될 수 있다. 비경구, 피내, 또는 피하 투여용 조성물은 멸균 희석제, 예를 들어, 물, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매를 포함할 수 있다. 제조물은 미생물 성장을 예방하기 위한 하나 이상의 보존제를 함유할 수 있다(예를 들어, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트화제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스토로스와 같은 긴장성 조정제).
주사용 약학적 조성물은 주사가능한 멸균 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리학적 염수, 정균수, 크레모포르(Cremophor) EL™(BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용하거나, 계면활성제를 이용하여 유지될 수 있다. 항균제 및 항진균제는, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살을 포함한다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 주사가능한 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
추가의 약학적 제형 및 전달 시스템이 당 분야에 공지되어 있고, 본 발명의 방법에 적용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993); 및 Poznansky, et al., Drug Delivery Systems, R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980), pp. 253-315] 참조).
본 발명은 적합한 패키징 재료에 패키징된 본 발명의 융합 작제물, 조합 조성물 및 이의 약학적 제형을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 성분들의 설명 또는 그 안에 있는 성분들의 시험관내, 생체내 또는 생체외 사용을 위한 설명서를 포함하는 라벨 또는 패키징 삽입물을 임의로 포함한다. 예시적인 설명서는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하거나, 요망되지 않거나 비정상적인 세포, 예를 들어, 과증식하는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하거나, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 세포의 증식을 감소시키거나 억제하거나, 과증식 장애를 갖는 대상체를 치료하거나, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 갖는 대상체를 치료하거나, 동물의 생식능력을 감소시키기 위한 설명서를 포함한다.
키트는 이러한 성분들의 수집물, 예를 들어, 둘 이상의 융합 작제물을 단독으로 또는 치료적으로 유용한 또 다른 조성물과 함께(예를 들어, 항-증식 또는 면역-증강 약물) 함유할 수 있다.
용어 "패키징 재료"는 키트의 성분들을 담고 있는 물리적 구조를 나타낸다. 패키징 재료는 성분들을 멸균상태로 유지할 수 있고, 상기 목적에 일반적으로 이용되는 재료로 이루어질 수 있다(예를 들어, 종이, 파형 섬유, 유리, 플라스틱, 호일, 앰풀, 바이얼, 튜브 등).
본 발명의 키트는 라벨 또는 삽입물을 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 "인쇄된 물질", 예를 들어, 종이 또는 카드보드를 포함하거나, 분리되거나, 성분, 키트 또는 패키징 재료(예를 들어, 박스)에 고정되거나, 키트 성분을 함유하는 앰풀, 튜브 또는 바이알에 부착된다. 라벨 또는 삽입물은 컴퓨터 판독가능한 매체, 예를 들어, 디스크(예를 들어, 플로피 디스켓, 하드 디스크, ZIP 디스크), 광학 디스크, 예를 들어, CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자기 테이프, 또는 전기 저장 매체, 예를 들어, RAM 및 ROM 또는 이들의 하이브리드, 예를 들어, 자기/광학 저장 매체, FLASH 매체 또는 기억 유형 카드를 추가로 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 그 안에 있는 하나 이상의 성분들의 정보, 용량, 작용 메카니즘을 포함하는 활성 성분(들)의 임상적 약리학, 약동학 및 약역학을 규명하는 것을 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체 정보, 로트 번호, 제조업체 위치 및 날짜를 확인하는 정보를 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 키트 성분이 사용될 수 있는 질환, 장애, 질병 또는 증상에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 방법, 치료 프로토콜 또는 치료 섭생에 키트 성분 중 하나 이상을 임상의 또는 대상체가 사용하도록 하는 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 투여량, 빈도 또는 기간, 및 본원에 기재된 임의의 방법, 치료 프로토콜 또는 치료 섭생을 실시하기 위한 설명들을 포함할 수 있다. 예시적인 설명서는 요망되지 않거나 비정상적인 세포 증식, 과증식하는 세포 및 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)을 치료하기 위한 설명서를 포함한다. 따라서, 본 발명의 키트는 치료 방법을 포함하는 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법을 실시하기 위한 라벨 또는 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 성분이 제공할 수 있는 임의의 이익, 예를 들어, 예방적 또는 치료적 이익에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 특정 조성물을 사용하는 것이 적절하지 않을 상황들과 관련하여 대상체 또는 임상의에 대한 경고와 같은 잠재적인 유해한 부작용에 대한 정보를 포함할 수 있다. 유해한 부작용은 또한 대상체가 조성물과 상용되지 않을 수 있는 하나 이상의 다른 약물을 지니거나, 섭취할 것이거나 현재 섭취하고 있는 경우, 또는 대상체가 조성물과 상용되지 않을 또 다른 치료 프로토콜 또는 치료 섭생을 받고 있거나, 받을 것이거나 현재 받고 있는 경우에 발생할 수 있으므로, 따라서 설명서는 그러한 비상용성에 대한 정보를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 다른 성분을 추가로 포함할 수 있다. 키트의 각각의 성분은 개별적 컨테이너에 동봉될 수 있거나, 다양한 컨테이너가 모두 단일 패키지 내에 있을 수 있다. 본 발명의 키트는 냉장 저장을 위해 설계될 수 있다. 본 발명의 키트는 본 발명의 융합 작제물을 발현시키는 숙주 세포를 함유하거나, 융합 작제물을 인코딩하는 핵산을 함유하도록 추가로 설계될 수 있다. 키트의 세포는 세포가 사용 준비가 될 때까지 적합한 저장 조건하에 유지될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 세포를 포함하는 키트는 세포가 해동 및 성장할 수 있도록 적절한 세포 저장 매질을 함유할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 개시된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질들이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질은 본원에 기재되어 있다.
본원에 인용된 모든 출원, 공개, 특허 및 기타 참조문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 그 전체내용이 본원에 참조로서 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
본원에서 사용된 단수 형태는 문맥에서 명확히 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "융합 작제물" 또는 "용해 도메인"에 대한 언급은 복수의 그러한 융합 작제물 또는 용해 도메인 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 모든 숫자 값 또는 숫자 범위는 문맥에서 명확히 달리 지시되지 않는 한 상기 범위 내의 정수 및 범위 내의 값 또는 정수의 분획을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 90-100%의 범위에 대한 언급은 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97% 등, 뿐만 아니라 91.1%, 91.2%, 91.3%, 91.4%, 91.5% 등, 92.1%, 92.2%, 92.3%, 92.4%, 92.5% 등을 포함한다.
본 발명은 다수의 구체예를 기재하기 위해 단정적인 언어를 이용하여 본원에 일반적으로 개시되었다. 본 발명은 또한 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜, 절차, 검정 또는 분석과 같이 특정 대상 물질이 완전히 또는 부분적으로 제외된 구체예를 특별히 포함한다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 본 발명이 포함하지 않는 것과 관련하여 본원에서 표현되지 않지만, 그럼에도 불구하고 본 발명에서 명백하게 포함되지 않은 양태가 본원에 개시된다.
본 발명의 다수의 구체예가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으며 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 하기 실시예는 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 설명하기 위한 것이며 이를 제한하지 않는다.
실시예
실시예
1
최초 연구는 용해 펩티드 모이어티와 리간드 사이에 다양한 힌지 서열을 함유하고, 30%의 D 아미노산(D-거울상 이성질체)를 함유하고, 용해 펩티드 모이어티에 대해 18 및 15개 아미노산 길이이고, 힌지 서열 또는 D-거울상 이성질체를 함유한 28개의 용해 도메인 펩티드의 시험관내 스크리닝을 포함하였다. 21, 18 및 15개의 아미노산의 Phor21 유사체 상에 스페이서로서 α-아미노카프로산의 도입을 연구하였다. 연구를 위해 선택된 리간드는 융모생식샘자극호르몬으로부터의 베타 사슬의 결합 모이어티의 15개의 아미노산 단편인 βCG-ala, 및 완전 기능성 리간드인 데카펩티드 LHRH를 포함하였다.
실시예
2
본 실시예는 인간 유방암 세포주를 이용한 세포 독성(IC50) 및 용혈 활성에 대한 스크리닝을 기재한다.
18개의 βCG-ala 및 8개의 LHRH 컨쥬게이션된 융합 작제물을 연구하고, Phor21-βCG-ala 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor21 및 Phor18(338913) = CLIP71 펩티드와 비교하였다. 융모막 생식샘자극호르몬(CG) 및 황체형성호르몬-분비 호르몬(LHRH) 수용체를 과발현하는 인간 유방암 세포주 MDA-MB-435S.luc를 계대 번호 248-252에서 스크리닝하기 위해 사용하였다. MDA-MB-435S.luc 세포주를 리포펙션에 의해 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시페라제 유전자 및 항체 내성 유전자를 함유하는 플라스미드 PRC/CMV-luc를 이용한 안정적 트랜스펙션에 의해 미국 미생물보존센터(American Type Cell Culture Collection)로부터 수득된 MDA-MB-435S 세포주로부터 작제하였다. 안정적으로 트랜스펙션된 세포주를 G418을 이용하여 선택하였고, 루시페라제 유전자에 대해 가장 높은 발현을 갖는 클론을 이들의 LH 및 LHRH 수용체 발현에 대해 시험하였다.
MDA-MB-435S.luc 세포를 레보비츠(Leibovitz) L 15 배지, 10% 소 태아 혈청, 0.01 mg/ml 소 인슐린, 100 IU/ml 페니실린, 100 microg/ml 스트렙토마이신에서 성장시켰다. 세포를 빈틈없이 밀폐된 플라스크에서 배양하였다. 인큐베이션을 웰 당 10,000개 세포로 96 웰 플레이트를 이용하여 수행하였다. 세포를 통상적으로 96웰 플레이트로 시딩하고, 배지를 인큐베이션 48시간 후에 교체하였다. 각각의 검정을 0, 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10 및 100 마이크로몰 용량의 증가하는 농도의 용해 펩티드-결합 도메인 컨쥬게이트로 수행하였다. 동결건조된 형태로 제공된 각각의 용해 펩티드-결합 도메인 컨쥬게이트를 염수에 새로이 용해시키고, 세포에 첨가하였다. 인큐베이션 기간은 통상적으로 24시간이었고, 세포 생활력 검정을 포르마잔 전환 검정(MTT 검정)을 이용하여 수행하였다. 대조군은 0 및 100% 세포 사멸에 대한 참조로서 염수 또는 0.1% 트리톤을 각각 함유하였다.
데이터를 Graph Pad Prizm 4™ 소프트웨어(Graph Pad Prizm, Inc)를 이용하여 처리하고, 분석하였다. 유의성에 대한 통계적 분석을 양측 스튜던츠 T-검정(two-tailed Student's T-test)에 의해 결정하였다. 각각의 연구를 수행하여 적어도 8의 N을 달성하였다.
융합 작제물의 길이를 증가시키는 것의 효과를 확인하였다(Javadpour et al., J Med Chem 39:3107 (1996); Javadpour and Barkeley, Biochemistry 36:9540 (1997); Leuschner and Hansel, Current Pharmaceutical Design, 10:2299 (2004); 및 Leuschner and Hansel, Biol Reprod 73:255 (2005)). βCG-ala에 대해 C-말단에서 컨쥬게이션된 용해 펩티드는 작제물의 길이가 증가함에 따라 증가하는 독성을 나타내었다. 다양한 길이의 펩티드에 대한 IC50은 다음과 같다: 14개 아미노산(Phor14) 5.74, 15개 아미노산(Phor15) 1.92, 18개 아미노산(Phor18 = CLIP71) 1.09, 21개 아미노산(Phor21) 2.31 및 28개 아미노산(Phor28) 1.36 μM(표 3).
결합 모이어티의 위치(N-말단 또는 C-말단)의 효과를 확인하였다. 요컨대, Phor21-βCG-ala(C-말단), βCG-ala Phor21(N-말단), LHRH-Phor21(N-말단) 및 Phor21-LHRH(C-말단) 융합 작제물을 연구하였다. 펩티드의 IC50은 다음과 같다: Phor21-βCG-ala에 대해 2.3 μM, βCG-ala-Phor21에 대해 4.7 μM, LHRH-Phor21에 대해 2.65 μM, Phor21-LHRH에 대해 1.71 μM. 상기 데이터는 βCG-ala 및 LHRH 결합 모이어티의 C-말단 위치결정이 결합 모이어티가 N-말단에 위치된 경우보다 더 큰 독성을 나타낸 것을 입증한다.
LHRH-수용체는 많은 인간 암에 존재한다(표 1 참조). 결합 모이어티로서의 LHRH의 활성을 결합 모이어티로서의 βCG-ala와 비교하였다.
LHRH-Phor21 및 Phor21-βCG-ala의 독성을 2 또는 24시간 인큐베이션에서 시험관내 인간 MDA-MB-435S.luc 유방암 세포에서 비교하였다. 데이터는 LHRH-Phor21이 Phor21-βCG-ala보다 신속하게 세포를 사멸시키고, LHRH-Phor21이 2시간 이내에 세포 사멸을 유도하는 것을 나타낸다(도 1).
표 1: 인간 암에서의 LH 및 LHRH 수용체
용해 도메인과 결합 모이어티 사이의 힌지, 스페이서 또는 링커 서열의 도입은 세포 사멸에 있어서 Phor21-βCG-ala보다 큰 효능을 갖는 펩티드를 발생시켰다(도 2, 표 2). Phor21-βCG-ala 융합 작제물 내의 힌지 서열 또는 스페이서의 도입이 세포 사멸 활성을 유의하게 변화시키지 않은 반면, 힌지 서열로서의 ASAAS의 효과는 βCG-컨쥬게이트에 대한 15개의 아미노산을 갖는 용해 펩티드의 독성을 유의하게 증가시켰고; 이러한 효과는 시험관내에서 동등하게 효과적이었던 βCG 및 LHRH 컨쥬게이션된 펩티드 Phor18-LHRH 및 Phor18-ASAAS-LHRH의 경우에 부재하였다(표 2, 도 4). 힌지 서열이 6개의 탄소 스페이서인 알파 아미노 카프로산으로 치환된 경우 유사한 효과가 관찰되었다(표 2). 제 2 힌지 서열(GSGGS)에서의 글리신에 의한 알라닌의 치환은 유의하게 더 낮은 활성을 발생시켰고, 이는 글리신이 헬릭스 불안정 효과를 가질 수 있음을 암시한다(도 2, 표 2).
표 2: βCG-ala 컨쥬게이션된 펩티드의 펩티드 길이의 효과
D-아미노산 치환의 효과를 확인하기 위해, 융합 작제물 Phor21-βCG-ala를 D 거울상 이성질체로 합성하였다(이후, D-ala-Phor21-βCG-ala로 언급함). 이러한 융합 작제물은 시험관 내에서 MDA-MB-435S.luc 유방암 세포에 대해 동등한 독성(Phor21-βCG-ala 2.31 μM, D-ala-Phor21-βCG-ala 2.15 μM(표 3)을 나타내었고; D-ala-Phor18-βCG-ala는 Phor21-βCG-ala보다 1.4배 더 효능이 있었고(IC50 1.6 μM), LHRH 대응물은 0.75 μM의 IC50을 갖는 D-ala-Phor21-LHRH, 1.42 μM의 IC50을 갖는 D-Phor18-LHRH 및 1.95 μM의 IC50을 갖는 Phor18-Lupron에 비해 D-거울상 이성질체로서 유의하게 더 효능이 있었다(Phor21-LHRH (1.31 μM의 IC50)).
MDA-MB-435S.luc 유방암 세포에서의 βCG-ala 및 LHRH-컨쥬게이션된 용해 펩티드에 대한 IC50 값이 표 3 및 도 3에 요약되어 있다. 요컨대, Phor21-βCG-ala(2.31±0.16)보다 유의하게 낮은 IC50을 갖는 펩티드는 다음과 같다: Phor28-βCG-ala(1.36±0.09 μM; p<0.0001), Phor15-ASAAS-βCG-ala(1.48±0.24 μM; p<0.005), Phor15-C6-βCG-ala(1.31±0.17 μM; p<0.004) (C6 = 6 아미노카프로산), Phor18-βCG-ala(1.09±0.17 μM; p< 0.0001), Phor21-LHRH(1.31±0.1 μM; p < 0.0001), D-ala-Phor21-LHRH(0.75±0.1 μM; p < 0.0001), Phor18-ASAAS-LHRH(0.88±0.12 μM; p < 0.0001), Phor18-LHRH(0.87±0.11 μM; p < 0.0001), (KKKFAFA)3-LHRH(0.78±0.21 μM; p < 0.0004), 및 D-ala-Phor18-LHRH(1.42±0.08 μM; p < 0.004).
LHRH 융합 작제물은 일반적으로 βCG-ala 융합 작제물보다 더욱 효능이 있었다(더욱 독성이고 신속히 작용함, 도 1). 요컨대, Phor21-LHRH, D-ala-Phor21-LHRH, Phor18-ASAAS-LHRH, Phor18-LHRH 및 펩티드 대조군 338614((KKKFAFA)3 = 비활성 펩티드)는 Phor21-βCG-ala에 비해 인간 유방암 세포에 대해 유의하게 더 독성이었다(p<0.003). 결합 모이어티가 용해 부분에 비해 C 말단에 위치되는 경우에 유의하게 덜 효능이 있었던 LHRH-Phor21을 제외하고는 모든 LHRH 융합 작제물은 대략 동등하게 효과적이었다. D-ala-Phor18-LHRH는 Phor21-LHRH에 비해 동등하게 효과적이었고; Phor18-Lupron은 독성이 덜했으나, Phor21-βCG-ala와 동등하였다(도 4, 표 3; Lupron은 QHWSY(D-Leu)LRPNEt임).
Phor21-LHRH(1.34±0.1 μM)보다 유의하게 낮은 IC50 값을 갖는 융합 작제물은 다음과 같다: D-ala-Phor21-LHRH(0.75±0.12 μM; p < 0.002), Phor18-ASAAS-LHRH(0.88±0.11 μM; p < 0.0001), Phor18-LHRH(0.87±0.12 μM; p < 0.004), 및 (KKKFAFA)3-LHRH(0.78±0.21 μM; p < 0.04). 동일한 융합 작제물을 βCG-ala 및 LHRH 결합 모이어티 사이에서 비교한 경우, 모든 경우에서 LHRH 융합 작제물이 이들의 βCG-ala 대응물에 비해 유의하게 더 독성이었다.
표 3: 세포독성 펩티드 및 펩티드 컨쥬게이트 - MDA-MB-435S.luc 세포에서의 IC50 및 HA50 특징의 요약
Phor21-βCG-ala (323033)에 비한 유의성 *** p < 0.0005, ** p < 0.005, * p < 0.05
Phor18-Lupron 및 D-ala-Phor18-LHRH를 포함하는 21개의 융합 작제물에 대한 급성 용혈 활성을 연구하였다. 결과는 도 5 및 6, 및 표 3에 요약되어 있다.
용혈 활성을 0.5% 인간 RBC에 노출된 펩티드의 연속 희석액을 이용하여 96 웰 플레이트에서 결정하였다. 대조군은 염수(RBC 사멸 없음) 또는 0.1% Triton X 100(100% RBC 용해)이었다. 펩티드 농도는 0 내지 100 μM 범위였다. 인큐베이션을 2시간 동안 수행하였다.
시스플라티넘(cisplatinum)에 비한 다양한 인간 암 세포주에 대한 다양한 융합 작제물의 IC50을 확인하기 위해, 융합 작제물의 IC50을 표 3에서와 같이 평가하였다. 결과는 하기 제시된다:
시스플라티넘에
비한 인간 암 세포주에서의 IC
50
[
μM
] 값
유방암 세포주: MDA-MB-435S.luc, MDA-MB-231
난소암 세포주: OVCAR-3, SKOV-3
전립선암 세포주: LNCaP
자궁내막암 세포주: AN3-CA
데이터는 일반적으로 Phor21-LHRH, LHRH-Phor21 및 Phor18-Lupron을 제외하고는 연구된 융합 작제물에 대해 매우 낮은 용혈 활성을 나타낸다. 유사한 조건하에서, 다음과 같은 융합 작제물은 어떠한 용혈 활성도 나타내지 않았다(도 5 참조): Phor15-아미노카프로산-β-CG-ala(337474), D-ala-Phor21 β-CG-ala(337481) > 150,000 μM, Phor21, 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 = CLIP71, (KKKFAFA)3-βCG-ala, Phor21(338982), Phor18 = CLIP71(338983), D-ala-Phor18-LHRH(339385) 및 (KKKFAFA)3-LHRH (338984). D-아미노산 거울상 이성질체는 측정가능한 용혈 활성을 갖지 않았다.
50 μM 미만의 용혈 활성을 갖는 융합 작제물은 다음과 같다: Phor21-LHRH(25 μM), LHRH-Phor21(33 μM) 및 Phor18-Lupron(21 μM).
100 μM 초과의 용혈 활성을 갖는 융합 작제물은 다음과 같다: Phor18-β-CG-ala(337476), 및 Phor18-LHRH(338613).
50-100 μM의 용혈 활성을 갖는 융합 작제물은 다음과 같다: (KKKFAFA)3-LHRH(95 μM), Phor21-βCG-ala 및 Phor21-ASAAS-βCG-ala는 70 μM의 유사한 HA50를 갖는다.
400-1300 μM의 용혈 활성을 갖는 융합 작제물은 다음과 같다: Phor14-βCG-ala(337464), Phor18 GSGGS β-CG-ala(337467), Phor18 ASAAS β-CG-ala(337470), Phor15 ASAAS β-CG-ala(337471), D-ala-Phor21-LHRH(338611), 및 Phor18-ASAAS-LHRH(338612).
임상적으로 유의한 기준은 세포 독성(IC50) 및 용혈 활성(HA50)의 비, 또는 IC50/HA50이다(도 6, 표 3). 대부분의 융합 작제물에 대해 측정된 HA50 값 아래의 여러 인자인 10 μM의 융합 작제물의 최대 농도를 이용하여 생체내 연구를 수행하였다.
D-ala-Phor21, Phor18-ASAAS, D-ala-Phor18 및 Phor18을 갖는 LHRH-컨쥬게이트는 0.001-0.006의 매우 낮은 IC50/HA50 비를 갖는다(0.03의 Phor21-βCG-ala와 비교함). MDA-MB-435S.luc 세포에 대한 독성은 Phor21-βCG-ala에 비해 유의하게 더 높고, D-ala) Phor21-LHRH는 Phor21-βCG-ala보다 3배 더 독성이고, Phor18-LHRH 및 Phor18-ASAAS-LHRH는 2배 더 효능이 있고, D-ala-Phor18-LHRH는 1.5배 더 효능이 있다(도 6).
요컨대, 증가된 독성 및 덜한 용혈 활성의 기준(IC50/HA50 비)에 의해 평가된 융합 작제물은 다음과 같다: Phor18-βCG-ala, Phor18-ASAAS-βCG-ala, Phor15-ASAAS-βCG-ala, Phor15-C6-βCG-ala, D-ala-Phor21-LHRH, Phor18-LHRH, Phor18-ASAAS-LHRH, 및 D-ala-Phor18-LHRH.
실시예
3
본 실시예는 다양한 유형 및 용량의 βCG-융합 작제물 및 LHRH-융합 작제물을 이용한 유방암의 마우스 이종이식 모델에서의 생체내 연구를 기재한다.
암컷 Nu/Nu 마우스에 MDA-MB-435S.luc/마트리겔 HC 현탁액(1x106 세포)을 피하 주사하였다. 처리 스케줄은 도 7에 제시되어 있다. 요컨대, 처리를 종양 세포 주사 13일 후에 시작하였고, 19 및 25일에 지속시켰다. 처리는 다음과 같다: 염수 대조군, Phor21(5 mg/kg), Phor18(5 mg/kg), (KKKFAFA)3 펩티드 - βCG-ala(5 mg/kg), Phor21-βCG-ala(0.01, 1 및 5 mg/kg), Phor18-βCG-ala(0.01, 1 및 5 mg/kg), D-ala-Phor21-βCG-ala(0.01, 1 및 5 mg/kg), 기준선 그룹 당 8-12마리 마우스, 14 그룹. 매주 1회 주사에 대한 용량은 5, 1 및 0.01 mg/kg 체중이었고, 볼루스 단일 주사로 제공되었다.
모든 그룹의 마우스는 주사에 잘 견뎠다. 5 mg/kg 용량의 337476을 이용한 각각의 주사에서 단지 한마리의 마우스가 사망하였다. 사망은 갑작스러운 사건이었다. 다른 처리 그룹의 모든 마우스는 생존하였다. 주사후 10분 이후에 주사의 결과로서 마우스는 사망하지 않았다.
원발성 종양에 대한 세포용해 펩티드 주사의 효과는 도 8에 예시되어 있다. 요컨대, 도 8A-8C는 각각의 개별적 펩티드에 대한 연구 과정 동안의 종양 부피를 도시한다. 도 8D-8G는 부검시의 종양 특징인 종양 부피(D), 종양 중량(E), 살아있는 종양 세포(F), 종양 상태(G)를 도시한다.
처리 효능을 연구 종료시의 측정에 비한 처리 시작시의 측정 사이의 차이로 계산하였다(도 8H-8I). 도 8J는 부검시의 마우스의 체중을 도시한다. 종양을 루시페라제 활성에 대해 측정한 경우, 종양에서의 세포의 생활력을 연구 종료시에 결정하였다.
0.01 mg/kg의 기준선(323033 제외) 및 (KKKFAFA)3-βCG-ala, Phor21 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 = CLIP71 대조군과 비교하여 리간드(II, A)로서 βCG를 함유하는 펩티드로 처리된 모든 동물에서 종양 부피가 유의하게 감소되었다, p<0.05. 이종이식 부피를 감소시키는데 있어서 효과가 없었던 (KKKFAFA)3-βCG-ala, Phor21 및 Phor18을 제외하고 모든 처리 그룹에서 염수 대조군에 비해 종양 부피가 유의하게 감소되었다.
종양 중량은 또한 염수 또는 (KKKFAFA)3 펩티드로 처리된 동물과 비교하는 경우 βCG 컨쥬게이션된 펩티드를 이용한 모든 처리 그룹에서 유의하게 감소되었다(p<0.001). 루시페라제 활성에 의해 측정되는 바와 같은 종양 세포 생활력은 종양 중량 및 종양 부피에서의 관찰된 변화와 충분히 서로 관련되었다.
기준선 값에 비한 종양 중량 또는 살아있는 종양 세포의 감소로서 측정된 처리 효능은 323033 및 337476에 대해 농도 의존성 처리 반응을 나타내었다. 337481은 0.01, 1 및 5 mg/kg 투여량에서 종양 부하 및 살아있는 종양 세포의 일관성 있는 감소를 나타내었다. 323033은 5 mg/kg에 비해 1 mg/kg 용량에서 가장 효과적이었으나(본 발명자는 이미 이전 실험에서 이를 관찰함), 적용된 가장 적은 용량에서는 염수 대조군에 대해서만 유의하게 상이하였다. 융합 작제물 337476 및 337481은 기준선 값 아래로 종양 부하 및 살아있는 종양 세포를 감소시키는데 있어서 323033(p<0.0001)에 비해 5 및 0.01 mg/kg에서 유의하게 더욱 효과적이었다(p<0.004). 융합 작제물 337481은 농도 의존성을 나타내지 않았고, 모든 시험된 작제물에서 가장 효과적이었다.
융합 작제물 337476 및 337481로 처리된 마우스에서 낭성 종양이 발견되었고, 이는 80-90%에서 발생하였으나, 1 mg/kg 323033 처리 그룹에서는 단지 30%였다(낭성 형성은 상기 이종이식 모델에서는 관찰되지 않았다. 낭성은 액체 충전된 캡슐로 이루어진다). 명백하지 않지만, 세포가 신속히 성장하는 종양에서 신속히 사멸되는 경우에 낭성 종양이 발생하는 것으로 가정되었다. 낭종은 Phor21로 처리된 전립선 종양 이종이식편에 존재하였다.
처리 그룹에 대한 혈액 화학 및 완전 혈액 수 결과는 어떠한 환자에서도 처리가 간, 신장, 심장 기능에 영향을 미치지 않은 것을 나타내었다. 혈소판 수, WBC 및 RBC 수는 정상 범위 내였고, 이는 처리가 종양 세포를 특이적으로 사멸시키고, 제공된 농도에서 빈혈을 야기시키지 않거나, 임의의 다른 관찰가능한 중추 신체 기능에 영향을 미치지 않은 것을 나타낸다. 융합 작제물은 장기간 부작용 없이 잘 용인되었다.
상기 생체내 종양 효능 데이터를 기초로 하여, Phor18-βCG-ala(337476) 및 D-ala-Phor21-βCG-ala(337481)는 기준선 값에 비해 종양 중량 감소(p<0.0001) 및 살아있는 종양 세포의 파괴(p<0.004)와 관련하여 참조 Phor21-βCG-ala(323033)보다 유의하게 더욱 효능이 있었다. 둘 모두의 융합 작제물은 생체내에서 용혈을 야기시키지 않았고, 사용된 가장 높은 용량(5 mg/kg)에서 지속적인 부작용을 나타내지 않았다. Phor18-βCG-ala의 종양 효능이 가장 적은 용량에서도 다수의 주사를 이용하여 더 커질 수 있는 것이 가능하다.
LHRH 융합 작제물에 대해, 유방암에 대한 마우스 이종이식 모델을 이용하였다. 요컨대, 무작위교배계 계통의 5주령의 Nu/Nu 암컷 마우스(Charles River)에 MDA-MB-435S.luc/마트리겔 현탁액(1x106 세포)를 피하 주사하였다. 종양 세포 주사 21일 후에 처리를 시작하였고, 26 및 29일에 지속시켰다. 매주 1회 융합 작제물 주사를 위한 용량은 2, 0.2 및 0.02 mg/kg 체중이었고, 볼루스 단일 주사로 제공하였다. 모든 마우스를 종양 세포 주사 34일 후에 부검하였고, 종양 중량에 대한 기준선 값을 처리 시작시에 8마리의 마우스를 희생시킴으로써 수득하였다. 원발성 종양, 간, 신장, 췌장, 심장, 폐, 및 비장을 수거하고, 조직학적 평가를 위해 포르말린 중에 준비하였다. 종양 중량을 부검시에 기록하였고, 종양의 일부를 루시페라제 검정 결정을 위해 -80℃에서 동결시켰다.
처리 그룹은 염수 대조군, Phor21-βCG-ala-323033(0.02, 0.2 및 2 mg/kg), D-ala-Phor21-LHRH-338611(0.02, 0.2 및 2 mg/kg), (KKKFAFA)3 LHRH-338614(5 mg/kg), Phor18-LHRH-338613(0.02, 0.2 및 2 mg/kg), Phor18-ASAAS-LHRH-338612(0.02, 0.2 및 2 mg/kg), D-ala-Phor18-LHRH-339385(0.02, 0.2 및 2 mg/kg), 및 Phor18-Lupron-339347(0.02, 0.2 and 2 mg/kg), 기준선 그룹 당 12마리 마우스를 포함하였다.
모든 그룹은 주사에 잘 견뎠다. 2 mg/kg 용량의 Phor18-ASAAS-LHRH를 이용한 두번째 및 세번째 주사 동안 단지 2마리의 마우스가 사망하였다(이들 마우스는 동일 우리로부터의 마우스였다). 사망은 갑작스러운 사건이었다. 다른 처리 그룹의 모든 마우스는 생존하였다. 주사후 10분 이후에 주사의 결과로서 마우스는 사망하지 않았다.
도 9에는 각각의 개별적 작제물에 대한 연구 과정 동안의 부피 측정으로서의 원발성 종양에 대한 융합 작제물 주사의 효과가 요약되어 있다. 모든 그룹에서, 지수적 종양 성장이 관찰된 (KKKFAFA)3-LHRH 컨쥬게이트로 처리된 마우스 또는 염수 대조군을 제외하고는 처리 동안 종양 부피가 감소하였다. 처리 30일 후에 기록된 종양 부피는 모든 융합 작제물에 대해 기준선에 비한 감소(p < 0.01)를 나타내며, Phor18-ASAAS-LHRH 및 Phor18-LHRH를 이용한 처리 그룹에서 가장 작은 종양 부피가 기록되었다.
부검시의 종양의 특징이 도 10에 요약되어 있다: (A) 종양 중량, (B) 기준선에 비한 종양 중량의 변화, (C) 살아있는 종양 세포의 전체 수, (D) 기준선에 비한 전체 살아있는 종양 세포의 변화, 및 (E) 기준선 및 부검시의 체중. 종양을 루시페라제 활성에 대해 측정한 경우, 종양 세포의 생활력을 연구 종료시에 결정하였다. 처리 효능을 연구 종료시의 측정에 비한 처리 시작시의 측정 사이의 차이로 계산하였다(도 10B 및 10D).
염수 대조군 및 (KKKFAFA)3-LHRH 컨쥬게이션된 펩티드에 비해 LHRH 컨쥬게이트가 제공된 경우 0.02 mg/kg의 가장 적은 용량에서도 모든 처리 그룹 내의 모든 동물에서 종양 중량 및 살아있는 종양 세포의 전체 수가 유의하게 감소하였다(p<0.0001). LHRH를 함유하는 2 mg/kg의 펩티드 및 D-ala-Phor18-LHRH(A)에 대해 0.02, 0.2 및 2 mg/kg으로 처리된 모든 동물에서 전체 종양 중량은 기준선에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05).
하기 농도는 기준선과 유사한 종양 중량을 발생시켰다: 0.02 mg/kg(p<0.07) 및 0.2(p<0.06)의 Phor21-βCG-ala-323033; 0.2 및 0.02 mg/kg 투여량의 Phor18-Lupron, 0.2 mg/kg의 Phor18-LHRH, 및 0.2 mg/kg의 D-ala-Phor21-LHRH. 전체 종양 중량을 0.02 mg/kg 용량의 Phor21-βCG-ala와 비교하는 경우, Phor18-ASAAS-LHRH 및 D-ala Phor18-LHRH는 0.02 mg/kg 투여량에서 우수하였다(p<0.05).
살아있는 종양 세포의 수를 결정하였고, 도 10C에서 살아있는 종양 세포의 전체 수로 작도하고, 도 10D에서 기준선에 비한 살아있는 종양 세포에서의 변화로 작도하였다. 루시페라제 활성에 의해 측정되는 바와 같은 세포 생활력은 살아있는 종양 세포의 감소가 관찰된 Phor18-ASAAS-LHRH 및 Phor18-LHRH를 제외하고는 종양 중량 및 종양 부피에서 관찰된 변화와 서로 관련이 있었다. D-ala-Phor18-LHRH(339385) 및 Phor18-ASAAS-LHRH(338612)를 이용한 처리는 2 mg/kg 용량에서 Phor21-βCG-ala에 비해 우수하였다(p<0.04).
기준선 값에 비한 종양 중량 또는 살아있는 종양 세포의 감소로서 측정된 처리 효능은 종양 중량 및 살아있는 종양 세포와 관련하여 D-ala-Phor21-LHRH를 제외하고는 모든 융합 작제물에 대해 농도 의존성 처리 반응을 나타내었다. D-ala-Phor18-LHRH는 0.02, 2 및 2 mg/kg 투여량에서 종양 중량 및 살아있는 종양 세포의 일관성 있는 감소를 나타내었다. 2 mg/kg에서 살아있는 종양 세포의 수 및 종양 중량을 감소시키는데 있어서 상기 실험에서 가장 효과적인 융합 작제물은 Phor18-ASAAS-LHRH(338612), 및 D-ala-Phor18-LHRH(339385)였다. Phor18-ASAAS-LHRH 및 D-ala-Phor18-LHRH는 2 및 0.02 mg/kg 용량의 Phor21-βCG-ala에 비해 우수하였다(p<0.05). Phor18-Lupron은 종양 중량 및 살아있는 종양 세포를 감소시키는데 있어서 가장 효과가 적었다.
처리 그룹에 대한 혈액 화학 및 완전 혈액 수 결과는 어떠한 환자에서도 처리가 간, 신장, 심장 기능에 영향을 미치지 않은 것을 나타내었다. 혈소판 수, WBC 및 RBC 수는 정상 범위 내였고, 이는 처리가 종양을 특이적으로 파괴하고, 제공된 농도에서 빈혈을 야기시키지 않고, 임의의 다른 관찰가능한 중추 신체 기능에 영향을 미치지 않은 것을 암시한다. Phor18-Lupron, Phor18-LHRH 및 D-ala-Phor21-LHRH로 주사된 마우스에서 염수 대조군에 비해 1.5배의 상승된 포타슘 수준이 관찰되었다. 융합 작제물은 장기간 부작용 없이 잘 용인되었다.
상기 생체내 종양 효능 데이터를 기초로 하여, Phor18-ASAAS-L HRH(338612), 및 D-ala-Phor18-LHRH(339385)는 종양 중량 감소(p<0.05) 및 살아있는 종양 세포의 파괴(p<0.04)와 관련하여 참조 Phor21-βCG-ala보다 유의하게 더욱 효능이 있었다. Phor21-βCG-ala는 D-ala-Phor21-LHRH 및 Phor18-LHRH와 동등하게 효과적이었다. 둘 모두의 융합 작제물은 생체내에서 용혈 및 다른 부작용을 야기시키지 않았다. Phor18-ASAAS-LHRH(338612), 및 D-ala-Phor18-LHRH(339385)의 효능이 가장 적은 용량에서도 다수의 주사를 이용하여 더 커질 수 있는 것이 가능하다.
실시예
4
본 실시예는 시험관내 및 생체내 수용체 발현 및 특이성 연구를 기재한다.
처리 전 및 처리 후 둘 모두의 LH 수용체 발현 밀도는 처리가 수용체 발현의 하향 조절을 발생시키는지 결정하기 위해 분석될 것이다. 정량을 위해 면역세포화학을 웨스턴 블롯 검정 및 RIA와 비교하였다. 챔버 슬라이드를 갖는 IHC, 및 웨스턴 블롯 기술을 이용한 MDA-MB-435S.luc 세포, CHO 및 TM4 세포에서의 LH 및 LHRH 수용체 결정. 각각의 세포주의 동일 계대 번호가 용해 펩티드 CG 및 용해 펩티드 LHRH에 대한 민감성에 대해 시험될 것이다.
LH 수용체 융합 작제물의 특이성을 MDA-MB-435S.luc(LHRH 및 CG 수용체 둘 모두), TM4(LHRH 수용체 아님) 및 CHO(CG 수용체 아님) 세포에서 분석하였다. IC50 데이터는 LHRH-Phor21에 대해 TM4 세포에서 민감성의 유의한 감소를 나타낸 반면(10.9 μM), CHO 세포는 MDA-MD-435S.luc 세포(2.3 μM)와 비교하는 경우 Phor21-βCG-ala에 대한 낮은 민감성을 나타낸다(24.6 μM)(도 12).
생체내 수용체 발현이 융합 작제물 처리와 관련하여 측정된다. 생체내 수용체 발현이 융합 작제물 처리 시작 및 종료시에 측정된다.
실시예
5
본 실시예는 융합 작제물 및 화학요법제를 이용한 조합 치료를 기재한다.
Phor21-βCG-ala 및 독소루비신을 이용하여 48시간 동안 인큐베이션된 난소암 세포주(OVCAR-3 세포, 다약제 내성)의 예비 연구를 수행하였다. 세포 생활력을 포르마잔 환원으로 결정하였다. Phor21-βCG-ala와의 동시 인큐베이션에서 독소루비신 처리 증가에 따라 IC50이 감소하였다. 상기 감소는 0, 0.5, 2 및 10 ㎍/ml의 독소루비신 농도에서 10 μM로부터 0.9, 0.3 및 0.05 μM로의 감소이다(도 11). Phor21-βCG-ala를 이용한 처리는 독소루비신에 대한 반응을 강화시켰다. 데이터는 세포가 독소루비신과 공동인큐베이션되는 경우 Phor21-βCG-ala가 더 효과적(13배)인 것을 나타내었다.
독소루비신 또는 시스플라티넘을 이용한 암세포의 전처리, 및 이후 LH 또는 LHRH의 존재 및 부재하에서의 LH 또는 LHRH 융합 작제물을 이용한 처리는 작제물에 대한 세포의 세포독성이 변경되는지의 여부를 나타낼 것이다.
조합 처리의 생체내 효능을 이종이식 종양 모델(MDA-MB-435S)에서 시험하였다. 마우스를 융합 작제물 및 화학요법 약물의 조합물로 처리하고, 적절한 대조군과 비교하였다. 마우스를 약물에 대해 이용된 표준 스케줄에 따라 처리하고, 융합 작제물을 이용하여 3주 동안 매주 1회 처리하였다.
융합 컨쥬게이트는 용혈 활성, 및 항-종양 유효 용량(0.02 또는 0.01 mg/kg)과 비교한 최대 허용 용량(MTD)(16-25 mg/kg 이하)과 같은 파라미터를 고려하여 높은 안전 마진(safety margin)을 갖는다. Phor21-βCG-ala에 대한 안전 마진은 16인 반면, Phor18-βCG-ala 및 Phor18-LHRH에 대해서는 800의 값이 도달될 수 있다. 비교를 위해, Phor18-Lupron에 대한 안전 마진은 단지 8이다.
하기 표 6은 다양한 기준에 따른 컨쥬게이트의 요약이다.
평가 코드:
할당된 포인트: 1 2 3
시험관내 활성 1x 2x 3x
HA50 < 50 50-100 > 100
IC50/HA50 <0.03 <0.006 <0.004
생체내 효능
33과 비교하여 동등하거나 더 나음(Compared to 33 equal better)
MTD과 비교함
33에 대해 동등하거나 더 나음(To 33 equal better)
1)
33의 IC50은 2.31 μM이었고, 값은 33의 IC50/IC50 펩티드로 표현된다.
2)
HA50 [μM]으로 표현된 용혈 활성.
3)
생체내 성능은 펩티드 33의 동일 파라미터와 비교한 기준선 값에 비한 종양 중량 감소 및 살아있는 종양 세포 감소에서의 유의성을 나타낸다.
4)
66.6% 생존을 발생시키는 주사된 용량(급성 및 주사 8-14일 후).
펩티드 코드:
33 = Phor21βCG-ala
76 = Phor18-βCG-ala
81 = D ala Phor21-βCG-ala
85 = D ala Phor18-LHRH
47 = Phor18-Lupron
13 = Phor18-LHRH
11 = D ala Phor21-LHRH
12 = Phor18-ASAAS-LHRH
71 = Phor15-βCG-ala
74 = Phor15-C6-βCG-ala
실시예
6
본 실시예는 다양한 암 세포주에서의 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH (338613)) 시험관내 동역학 연구를 기재한다.
표준 화학요법 약물은 DNA 삽입, 미세관 상호작용을 통해 상호작용하거나, 이는 신호전달 경로의 억제제이다. 그러므로, 이들의 작용 메커니즘은 표적 세포를 파괴하는데 필요한 기간을 결정한다. MDA-MB-435S과 같은 인간 유방암 세포를 파괴하는 시험관내 독소루비신에 대한 동역학은 4시간만큼 신속한 것으로 보고되었으며, 의료 처리의 다른 표준은 더 오래 걸릴 수 있다. 암세포를 파괴하는데 있어서 가장 일반적인 작용 메커니즘은 아폽토시스이다. 가역적 과정에 따라 그리고 다약제 내성(MDR)의 발생으로 인해, 표준 의료 처리인 MDR 암세포에서 약물 분자를 배출하는 Pgp 펌프의 작용이 효과가 없을 수 있다.
화학요법 약물과 대조적으로, 직접적 막 작용은 수분 이내에 암세포를 파괴할 수 있다. 막 활성 화합물, 예를 들어, 양이온성 용해 펩티드는 Phor18-LHRH(338613)(KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG)를 포함한다.
세포독성의 동역학을 결정하기 위해, LHRH 표적 수용체를 다양한 수준으로 발현하는 다양한 세포주에서 표적화되지 않은 용해 펩티드 모이어티 Phor18 = CLIP71(338983)과 비교하여 Phor18-LHRH(338613)를 이용하여 상세한 시간 경과 연구를 수행하였다. 비-암성 세포주의 막은 중성이며, 외막에 높은 포스파티드산 함량을 갖는 암 세포주와 대조적으로 세포용해 펩티드에 내성이다.
연구된 유방암 세포주는 MDA-MB-435S(에스트로겐 수용체 알파 음성), MCF-7 및 T47D(에스트로겐 수용체 알파 양성), 난소암 세포주(OVCAR-3 및 SKOV-3), 전립선암(LNCaP), 비-악성종양 유방 상피세포주 MCF-10A 및 마우스 섬유모세포 세포주 NIH:3T3였다. Phor18-LHRH(338613)의 효능에서의 LHRH 수용체 표적화의 역할을 또한 평가하였다.
세포를 10,000 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 50 및 100 μM의 농도로 Phor18-LHRH(338613)(APC 338613, Lot # P080401) 또는 Phor18 = CLIP71(APC 338983, Lot # W08033C1)을 첨가함으로써 48시간 후에 처리를 개시하였다. 대조군은 0 및 100% 세포 사멸에 대한 참조로서 USP 염수 또는 0.1% TritonX-100™을 각각 함유하였다. 2분, 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 6시간, 24시간 및 48시간 후에 배양 배지를 제거함으로써 인큐베이션을 종료시켰다. 세포 생활력을 포르마잔 전환 검정(MTT 검정, (CellTiter 96 Aqueous One, Promega # G3582). 포르마잔 전환은 실온에서 490/630 nm에서 BioRad Benchmark Plus 마이크로플레이트 분광광도계 이중 파장을 이용하여 결정되었다)을 통해 평가하였다.
데이터를 염수 함유 웰 중 0% 세포 사멸에 비한 100% 세포 사멸을 나타내는 TritonX-100™ 함유 웰에서의 흡수의 분획으로 계산하였다. 세포독성을 0 및 100%의 제한 값(constraint values)을 이용하여 다양한 기울기를 갖는 S자형 용량 반응에 대해 윈도우용 GraphPad Prism version 5.01(GraphPad Software, San Diego California USA according to the program)을 이용하여 IC50으로 결정하였다. 2개의 96웰 플레이트의 각각의 개별적 세트의 4개의 웰을 비교하고 분석하였다. 유의성에 대한 통계 분석을 양측 스튜던츠 T-검정에 의해 결정하였다.
MDA-MB 435S 세포(p250)에서, Phor18-LHRH(338613)는 인큐베이션 1시간 후에 이의 최대 효능을 나타낸 반면, CLIP71 인큐베이션은 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 100, 109, 171, 145, 148, 86, 54.5, 55.1(24시간), 및 3 [μM](48시간)의 IC50 값을 발생시켰다(p<0.005). Phor18-LHRH(338613)는 컨쥬게이션되지 않은 용해 펩티드 CLIP71(> 100 μM)에 비해 신속히 작용하는 작용제(0.5시간 후 1.2 μM 및 1시간 후 0.6 μM)이다.
MCF-7 세포(p152)에서, Phor18-LHRH(338613)는 인큐베이션 1시간 후에 이의 최대 효능을 나타낸 반면, CLIP71 인큐베이션은 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 92, 95, 50 및 22 [μM]의 IC50 값을 발생시켰다(p<0.005). Phor18-LHRH(338613)는 컨쥬게이션되지 않은 CLIP71에 비해 신속히 작용하는 작용제(3.4-1.8 μM)이다.
OVCAR-3 세포(p47)에서, Phor18-LHRH(338613)는 인큐베이션 1시간 후에 이의 최대 효능을 나타낸 반면, 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 = CLIP71(33 인큐베이션은 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 337, 126, 85.5, 52.5, 22.9 및 23.1 [μM]의 IC50 값을 발생시켰다(p<0.005). Phor18-LHRH(338613)는 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 6.7, 5.6, 5.3, 1.6, 1.5, 0.5 및 0.5 [μM]의 IC50 값을 갖는 신속히 작용하는 작용제이다(p<0.005). 신속한 동역학 데이터는 Phor18-LHRH(338613) 및 Phor18이 다양한 작용 메커니즘에 의해 세포를 사멸시키고, 약물의 효능을 증가시키는 것을 암시한다.
SKOV-3 세포(p40)에서, Phor18-LHRH(338613)는 인큐베이션 24시간 후에 이의 최대 효능(11.5 μM)을 나타낸 반면, Phor18 인큐베이션은 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 86, 96, 53 및 50 [μM]의 IC50 값을 발생시켰다(p<0.005). Phor18-LHRH(338613)는 SKOV-3 세포에 대해 적절한 표적이 아닌데, 이는 이들 세포에는 기능성 LHRH 수용체가 존재하지 않기 때문이다.
Phor18-LHRH(338613)로 처리된 기능성 LHRH 수용체가 존재하는 모든 세포주, 예를 들어, 유방암 세포(MDA-MB-435 및 MCF-7) 및 OVCAR-3는 인큐베이션 0.5-1시간 내에 최대 효과(μM 단위의 IC50)를 나타내었다. 대조적으로, Phor18의 최대 효과를 위해서는 24시간 인큐베이션이 필요하였다. 기능성 LHRH 수용체, 예를 들어, T47D, LNCaP가 존재하는 세포주에 대해서 유사한 결과가 수득되었다. 기능성 LHRH 수용체가 존재하지 않는 세포주(SKOV-3 및 HEK 1A)에서, Phor18-LHRH(338613) 및 Phor18은 24시간 인큐베이션 후에 10.3 및 11.8 μM의 IC50 값으로 유사한 독성을 나타내었다. 비암성 세포주 3T3은 Phor18에 대해 > 40 μM 및 Phor18-LHRH(338613)에 대해 >10 μM의 IC50 값으로 Phor18-LHRH(338613) 및 Phor18에 대해 매우 내성이었다.
이들 결과는 LHRH 표적화가 Phor18의 효능을 향상시키고, 비-암성 세포주가 세포용해 양이온성 펩티드에 의한 파괴에 내성이 있는 것을 나타낸다. Phor18-LHRH(338613)는 1시간 미만 이내에 수용체 표적화된 메커니즘을 통해 암세포를 파괴하는데 있어서 현저한 효능을 나타낸다. Phor18-LHRH(338613)는 수분 이내에 효과적이며, 효능을 위해 세포내 흡수 및 대사 경로 및 증식 기구의 방해에 의존하는 표준 화학요법에 비해 장점을 갖는다. 또한, Phor18-LHRH(338613)는 다약제 내성 암세포에 대해 작용할 수 있다.
실시예
7
본 실시예는 시험관내에서 유방암 세포에 대한 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))의 가능한 작용 메커니즘을 나타내는 데이터를 포함한다.
시험관 내에서 가능한 작용 메커니즘을 입증하기 위해, LHRH 수용체를 과발현하는 인간 유방암 세포주 MDA-MB-435에서 형광 현미경검사 연구를 수행하였다. 요컨대, 인간 유방암 세포(MDA-MB-435, 계대 # 252)를 배양 접시에 시딩하였다. EP100을 첨가하기 전에 다음과 같은 마커를 도입시켰다: 핵의 염색을 위해 DRAQ5™(Alexis Corporation)(청색)을 이용하였고, 온전한 미토콘드리아를 시각화시키기 위해 MitoTracker® Red CMXRos(M7512)(Molecular Probes, Inc. OR)를 적용시켰다. 세포막을 맥아 알렉사 플루오르 그린(alexa fluor green) 컨쥬게이트(Molecular Probes, Inc. OR)를 이용하여 염색하였다.
세포에 먼저 제조업체의 권고에 따라 Mitotracker 염료를 로딩시켰다. 염수에 재구성된 Phor18-LHRH(338613)를 10 μM의 최종 농도로 첨가하고, 5-10분 동안 인큐베이션하였다. 염수만을 갖는 배양 접시를 대조군으로 제공하였다. 상층액을 제거하고, 남아있는 세포를 형광 현미경검사 영상화를 위해 준비하였다.
Phor18-LHRH(338613)에 대한 노출 후 시험관 내에서 기능성 LHRH 수용체가 존재하는 MDA-MB-435 유방암 세포의 형광 현미경검사 평가는 Phor18-LHRH(338613)(10 μM)에 대한 5분 노출 후 형질막의 붕괴를 나타내었다. 이들 관찰은 Phor18-LHRH(338613)가 형질막을 파괴시켜, 수분 이내에 세포의 사멸을 야기시키는 것을 암시하였다.
2 μM Phor18-LHRH(338613) FITC와 함께 30분 동안 인큐베이션된 배양물 중에서의 SKOV-3(p 41) 및 MDA-MB-435S(p 250) 세포의 형광 현미경검사 평가는 SKOV-3 세포에서 세포내 흡수가 부재하고, 막 블레빙(membrane blebbing)이 발생하지 않았고, 미토콘드리아 염료가 유지된 것을 나타내었다. 대조적으로, MDA-MB-435S 세포에서 Phor18-LHRH(338613) FITC의 세포내 흡수가 30분 이내에 관찰될 뿐만 아니라 외막의 소포 형성을 야기시키는 광범위한 막 블레빙 및 미토콘드리아 염료의 퇴색이 관찰되었다. 이들 관찰은 수분 이내에 발생된 세포 사멸을 암시한다.
수분 이내에, Phor18-LHRH(338613)는 기능성 LHRH 수용체가 존재하는 세포를 파괴하였다. Phor18-LHRH(338613)는 괴사를 야기시키는 외부 형질막의 붕괴를 통해 암세포를 파괴하였다. 상기 작용 메커니즘은 Phor18-LHRH(338613)와 기능성 표적이 존재하는 세포의 형질막의 신속한 상호작용을 강하게 암시한다. LHRH 수용체에 대해 음성인 세포는 표적이 아니었고, 온전하게 유지되었다.
이들 데이터는 항암 약물로서의 Phor18-LHRH(338613)의 높은 특이성 및 효능을 나타내었다. Phor18-LHRH(338613)는 수분 이내에 효과적이었고, 효능을 위해 세포내 흡수 및 대사 경로 및 증식 기구의 방해를 필요로 하는 표준 화학요법에 비해 주요한 장점을 갖는다. 또한, Phor18-LHRH(338613)는 다약제 내성 암세포에 작용할 수 있다.
실시예
8
본 실시예는 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))가 이종이식 모델에서 암에 대해 효과적인 것을 입증하는 연구를 포함한다.
인간 유방암 이종이식편: MDA-MB-435S.luc(s.c.), MCF-7(에스트로겐 수용체 알파 양성), 인간 난소암 이종이식편: OVCAR-3(s.c.), 인간 전립선암 이종이식편: PC-3(안드로겐 수용체 음성)을 갖는 누드 마우스에서 생체내 효능 연구를 단일요법 또는 표준 의료 처리와의 조합 요법으로 수행하였다. 염수에 용해된 Phor18-LHRH(338613)(0.02, 0.2 및 2 mg/kg)를 가쪽 꼬리 정맥으로의 단일 볼루스 주사로서 3주 동안 매주 1 또는 2회 주사하였다.
Phor18-LHRH(338613) 조합 요법을 MCF-7 유방암 이종이식 모델에서 수행하였다.
마우스를 마지막 주사 1주일 후에 희생시키고, 화학 평가를 위해 혈액을 수거하고, 종양 중량 및 체중을 기록하였다. 종양의 일부를 조직학적 평가를 위해 PBS 완충된 10% 포르말린에 고정시켰다. 다양한 생체내 이종이식 연구가 표 7에 요약되어 있다.
표 7: 이종이식 연구
단일 용량 요법에서 MDA-MB-435S 이종이식편 중량을 감소시키는데 필요한 최소 유효 용량을 결정하기 위해, 무작위교배계 계통의 5주령의 Nu/Nu 암컷 마우스(Charles River)에 MDA-MB-435S(계대 # 249)/마트리겔 현탁액(2.4x106 세포/마우스)[Leuschner 2006]을 어깨사이 부위에 주사(s.c.)하였다. Phor18-LHRH(338613)(ID: 338613 lot# P080401)(0.00002, 0.0002, 0.002, 0.02, 0.2 및 1 mg/kg) 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 = CLIP71(APC 338983, Lot # W08033C1) + LHRH(0.2/0.122 mg/kg, ([D-Trp6]-LHRH; Sigma L9761, lot # 037K1103)를 투여 전에 USP 염수에 재구성시켰다. 상기 용량을 3주 동안 매주 1회로 가쪽 꼬리 정맥을 통한 단일 볼루스 정맥내 주사로 제공하였다.
각각의 그룹은 3주 동안 매주 1회 주사되는 16마리의 마우스로 구성되었다. 16마리의 마우스의 한 그룹을 기준선으로 제공하기 위해 처리 시작시에 희생시켰다. 염수 주사를 대조군으로 제공하였다. 전체 연구 동안, 종양 부피를 매주 2회 기록하였다.
종양이 확립된 경우 종양 세포 주사 16일 후에 처리를 시작하였고, 23 및 30일에 지속시켰다. 모든 남아있는 마우스를 종양 세포 주사 37일 후에 부검하였다.
처리 반응을 염수 대조군 및 표적화되지 않은 Phor18 처리에 비한 부검시의 종양 중량 및 종양 중량 변화에 의해 결정하였다. 원발성 종양을 수거하고, 칭량하고, 10% PBS 완충 포르말린을 이용한 포르말린 고정으로 조직학적 평가를 위해 준비하였다. 데이터 세트의 통계적 평가를 GraphPad Prizm 4에서 수행하고, 유의성을 윌콕슨 부호 순위 검정(Wilcoxon signed-rank test)에 의해 계산하였다.
종양 부피 및 종양 중량은 염수 대조군 및 clip71 + LHRH로 처리된 마우스에서 증가되었다. 종양 부피 및 종양 중량은 0.0002 mg/kg의 Phor18-LHRH(338613)로 처리된 마우스에서 염수 대조군에 비해 유의하게 감소되었다. 0.002 mg/kg만큼 적은 용량의 Phor18-LHRH(338613)를 이용한 처리는 기준선에 비해 종양 부피 및 종양 중량을 유의하게 감소시켰다(p<0.0002).
처리된 마우스로부터의 헤마톡실린/에오신으로 염색된 MDA-MB-435S 이종이식된 마우스로부터의 종양 절편의 조직학적 평가는 염수 대조군 및 Phor18/LHRH로 처리된 마우스에서 가시적인 종양 세포를 나타낸다. 대조적으로 0.0002 mg/kg만큼 적은 용량의 Phor18-LHRH(338613)로 처리된 마우스로부터의 종양에서 유의한 괴사가 명백했다. 표적화되지 않은 양이온성 용해 펩티드 Phor18은 종양 중량을 감소시키지 않았거나, 종양 조직을 파괴하지 않았다.
0.002 mg/kg만큼 적은 Phor18-LHRH(338613)가 MDA-MB-435S 이종이식편의 종양 중량을 감소시키는데 매우 효과적이었고, 처리된 종양 조직에서 괴사를 발생시켰다. 세포용해 펩티드를 이용한 표적화되지 않은 처리는 효과적이지 않았다.
다중 용량 요법에서 MDA-MB-435S 이종이식편 중량을 감소시키는데 필요한 최소 유효 용량을 결정하기 위해, 무작위교배계 계통의 8주령의 Nu/Nu 암컷 마우스(Charles River)에 상기 기재된 바와 같이 MDA-MB-435S(계대 # 253)/마트리겔 현탁액(2x106 세포/마우스)을 어깨사이 부위로 주사(s.c.)하였다. Phor18-LHRH(338613)(ID: 338613 lot# P080401)(0.002, 및 0.2 mg/kg)를 투여 전에 USP 염수에 재구성시켰다. 상기 용량을 종양 세포 접종 15, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42일 후에 가쪽 꼬리 정맥을 통해 단일 볼루스 정맥내 주사로 제공하였다. 염수 주사를 대조군으로 제공하였다.
각각의 처리 그룹은 16마리의 마우스로 구성되었다. 전체 연구 동안, 종양 부피를 매주 2회 기록하였다. 종양 세포 주사 45일 후에 최종 부검을 수행하였다. 주사는 대부분의 마우스에서 꼬리 정맥의 폐색으로 인해 다시 시작하였다. 연구 종점에서, 체중, 종양 중량을 결정하고, 인산염 완충된 10% 포르말린에 고정시켰다.
다수의 정맥내 주사를 이용한 Phor18-LHRH(338613)를 이용한 처리는 둘 모두의 용량 수준에서 종양 퇴행을 발생시켰다. 0.002 mg/kg이 투여된 그룹에서 6/23 및 0.2 mg/kg이 투여된 그룹에서 1/20로 둘 모두의 처리 그룹에서 종양을 갖지 않는 마우스가 관찰되었다. 잔여 덩어리는 통상적으로 마트리겔(Matrigel)로 구성되었다. 0.2 mg/kg 그룹에서 한 마리의 마우스가 처리에 반응하지 않았다.
꼬리에서 괴사가 관찰되지 않았고, 꼬리의 발적이 존재하지 않았다. 체중은 전체 연구 기간에 걸쳐 처리에 의해 영향을 받지 않았다.
생존은 처리된 마우스에서 100%였다. 대조적으로, 염수 대조군의 8마리의 마우스는 종양 세포 주사 30일 후(연구 종점 전)에 희생되었는데, 이는 종양 부피가 2,500 mm3를 초과했기 때문이다.
다중 주사 요법으로 0.002 및 0.2 mg/kg의 Phor18-LHRH(338613)로 처리된 마우스로부터의 H&E 염색된 종양의 조직학적 검사는 처리된 마우스에서의 종양 세포의 근절을 나타내었다. 대조적으로, 염수 대조군에서 가시적인 종양 세포가 존재하였다.
Phor18-LHRH(338613)는 종양을 파괴하고, 종양 중량을 유의하게 감소시키고, 처리된 마우스의 수명을 연장시켰다. 상기 처리는 체중 또는 기관 검사에서 임의의 가시적인 효과가 없었다.
실시예
9
본 실시예는 유방암, 난소암 및 전립선암 이종이식 모델에서의 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH (338613)) 효능 연구의 설명을 포함한다.
본원에 기재된 시험관내 연구는 Phor18-LHRH(338613)가 신속히 작용하는 작용제이며, 접촉 수분 이내에 암세포를 사멸시키는 것을 입증하였다. 표적화된 처리의 최초 단계에서 유방암 이종이식편에 대한 Phor18-LHRH(338613)의 효능을 결정하기 위해, Phor18-LHRH(338613)의 단일 주사 후 유방암 이종이식 모델에서의 Phor18-LHRH(338613)를 통한 세포 파괴의 동역학을 연구하였다.
요컨대, 무작위교배계 계통의 5주령의 Nu/Nu 암컷 마우스(Charles River)에 실시예 10에 기재되는 바와 같은 MDA-MB-435S(계대 # 249)/마트리겔 현탁액(2.4x106 세포/마우스)을 어깨사이 부위로 주사(s.c.)하였다. Phor18-LHRH(338613)(ID: 338613 lot# P080401)(0.2, 및 2 mg/kg)을 투여 전에 USP 염수에 재구성시켰다. 용량을 가쪽 꼬리 정맥을 통해 단일 볼루스 정맥내 주사로 제공하였다.
마우스를 Phor18-LHRH(338613) 또는 염수를 이용한 처리 1, 2 및 16시간 후에 희생시켰다. 연구 종점에서, 체중, 종양 중량을 결정하고, 종양을 인산염 완충된 10% 포르말린에 고정시켰다.
종양으로부터의 H&E 염색된 절편으로부터의 조직학적 평가는 염수 처리된 마우스에서 다수의 유사분열 그림으로 가시적인 종양 세포를 나타내었다. 0.2 및 2 mg/kg 용량 둘 모두의 Phor18-LHRH(338613)를 이용한 처리는 주사 1시간 후만큼 신속하게 MDA-MB-435S 이종이식편으로부터의 종양의 파괴를 나타내었다.
Phor18-LHRH(338613)는 투여 1시간후 만큼 초기에 종양을 파괴하였고, 이는 괴사를 통한 세포 사멸을 야기시키는 신속 작용 메커니즘을 암시한다. 이들 데이터는 Phor18-LHRH(338613)가 종양 세포에 존재하는 LHRH 수용체에 대한 이의 막접촉을 통해 작용하는 것을 입증한다.
인간 질병과 유사한 난소암 이종이식편에 대한 Phor18-LHRH(338613)의 효능을 결정하기 위해, 단일 및 다중 용량 연구를 수행하였다. 기능성 LHRH 수용체가 존재하는 OVCAR-3 인간 난소암 세포주의 이종이식 모델을 본 연구에서 사용하였다. OVCAR-3는 느리게 성장하는 이종이식 모델이며, 종양 마커(암 항원 125, 또는 CA125)를 분비한다. 이의 분비는 처리 반응으로 이용될 수 있으며, 약물 활성의 척도이다.
상기 이종이식 연구의 목적은 난소암 모델에서 Phor18-LHRH(338613)를 시험하고, Phor18-LHRH(338613)가 매주 1회 주사로서 다약제 내성의 느리게 성장하는 종양 모델에서 생체내에서 효과적인지의 여부를 결정하는 것이었다. 요컨대, 순계교배 계통의 5주령의 Nu/Nu 암컷 마우스(Harlan-Sprague Dawley)에 NIH:OVCAR-3 세포/마트리겔 현탁액(4.6x106 세포/마우스)를 피하 주사하였다. 종양이 확립된 경우 처리를 종양 세포 주사 33일 후에 시작하였고, 41 및 47일에 지속시켰다. 3회의 매주 주사를 위한 용량은 0.02, 0.2 및 2 mg/kg 체중이었고, 33, 41 및 47일에서의 3주 동안의 매주 1회 투여되는 가쪽 꼬리 정맥을 통한 단일한 볼루스 정맥내 주사로 제공하였다. 부검을 52일에 수행하였다. 데이터는 평균 SEM으로 제공된다. 화살표는 투여를 나타낸다.
처리 그룹은 염수 대조군(N=10), Phor18-LHRH(338613)(338613, V09108X1)(0.02 (N=10), 0.2(N=10), 및 2 mg/kg (N=9),), 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 = CLIP71(APC 338983, Lot # V04004X1)(2 mg/kg (N=10)), 염수 중 시스플라티넘/CP(Calbiochem, Cat 232120, D0005495,)(10 mg/kg, 3qd (N=10),), 기준선(N=9)을 포함하였다.
9마리의 종양을 갖는 마우스의 한 그룹을 33일에 희생시키고, 기준선 그룹으로 제공하였다. 모든 마우스를 종양 세포 주사 51-52일 후에 부검하였다. 종양 부피 및 체중을 연구 동안 매주 2회 기록했을 뿐만 아니라 마우스의 종합적인 수의사 검사를 수행하였다.
원발성 종양, 간, 신장, 췌장, 심장, 폐, 및 비장을 수거하고, 포르말린에 고정시키고, 조직학적 평가를 위해 준비하였다. 종양 중량을 부검시에 측정하였고, 종양의 일부를 LH/CG 및 LHRH 수용체 검정 결정을 위해 -80℃에서 동결시켰다.
약물 활성을 위한 바이오마커로서, 난소암 항원 CA125의 정량적 결정을 위한 효소 결합 면역분석법(Assay kit Genway, Biotech, Inc. San Diego, CA, Catalog # 40-052-115009, # BC-1013 according to the manufacturer)을 이용하여 부검시에 각각의 개별적 마우스로부터 수거된 혈청에서 CA125를 결정하였다.
LHRH 수용체 수준을 포르말린 고정 종양으로부터 평가하였다. 쌍방향 현미경(Axio Imager)에 기능적으로 연결된 Ventana Image Analysis System(VIAS) 부속 컴퓨터 보조 이미지 분석 시스템을 이용하여 정량적 면역과산화효소 이미지 분석을 수행하였다. 정량적 분석을 형태계측 및 비색 분석을 포함하는 Her2/neu 수용체의 정량을 위한 프로그램을 이용하여 수행하였다. 수용체 상태 결과를 다음과 같은 기준 하에서 LHRH 수용체의 양성 염색을 나타내는 세포의 백분율로 보고하였다: 0: 비-면역반응성, 1+: 1-25% 양성, 2+: 26-50% 양성, 3+: 51-75% 양성 세포.
모든 마우스 그룹은 주사에 잘 견뎠다. 2 mg/kg 용량의 Phor18-LHRH(338613)를 이용한 첫번째 주사 동안 한마리의 마우스가 사망하였다. 사망은 갑작스러운 사건이었고, 절차적인 것이었으며, 처리와 관련이 없었다. 다른 처리 그룹의 모든 마우스는 생존하였다. 주사후 10분 이후에 주사의 결과로서 마우스는 사망하지 않았다.
종양 부피는 Phor18-LHRH(338613)를 이용한 처리 동안 감소하였다. 대조적으로, Phor18, 시스플라티넘 또는 염수 대조군으로 처리된 마우스에 대해 종양 성장이 관찰되었다. 종양 세포 주사 42일 후에 기록된 종양 부피는 0.2 mg/kg 체중만큼 적은 Phor18-LHRH(338613)의 농도에서 기준선에 비한 감소를 나타내었다(p<0.001).
부검시의 종양의 특징(중간 종양 중량 및 기준선에 비한 중간 종양 중량의 변화)을 결정하였다. 염수 대조군 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 = CLIP71에 비한 감소된 종양 중량(p<0.05)이 2 및 0.2mg/kg 투여량의 Phor18-LHRH(338613)에 대한 그룹에서 수득되었다. 종양이 없는 마우스가 0.2 및 2 mg/kg의 Phor18-LHRH(338613) 그룹에서 발견되었다. 처리 시작에 비한 종양 퇴행으로 측정된 처리 반응은 0.2 mg/kg의 Phor18-LHRH(338613)로 처리된 마우스에서 가장 컸다(기준선에 비해 p<0.03). 시스플라티넘 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 = CLIP 71은 종양 중량을 감소시키는데 있어서 효과적이지 않았다.
염수 대조군, CLIP71 및 시스플라티넘 처리된 마우스는 안정된 종양 성장을 나타내었다. CA125에 대한 혈청 수준은 종양 중량에 상응하였다(r2 = 0.66). CA125 분비는 Phor18-LHRH(338613) 처리된 마우스에서 감소되었고, 염수 대조군과 비교되었으며, 0.2 및 2 mg/kg의 Phor18-LHRH(338613)로 처리된 마우스에서 가장 컸다(p<0.0002).
0.02 mg/kg의 Phor18-LHRH(338613)를 이용한 처리 후 OVCAR-3 이종이식편 함유 마우스로부터 절제된 종양의 크기는 염수 대조군에 비해 감소되었고 괴사되었다. 처리된 종양은 1-2 스코어 포인트까지의 LHRH 수용체 수준의 감소를 나타내었다. 헤마톡실린/에오신으로 염색된 종양 절편은 0.02 mg/kg의 Phor18-LHRH(338613)로 처리된 그룹에서 유의한 괴사를 나타내었다. 시스플라티넘 또는 CLIP71로 처리된 이종이식편 함유 마우스는 종양 부피, LHRH 수용체 수준이 감소하지 않았고, 조직학적 평가 후에 살아있는 종양 세포를 나타내었다.
Phor18-LHRH(338613)를 이용한 처리는 난소 이종이식 모델에서 종양 퇴행, 혈장에서의 CA125 종양 마커의 감소, LHRH 수용체 수준의 감소 및 괴사를 야기시켰다. 따라서, Phor18-LHRH(338613)는 다약제 내성 난소암 이종이식편을 파괴하는데 있어서 효과적이다.
전립선암 이종이식편에 대한 Phor18-LHRH(338613)의 효능을 결정하기 위해, 신속히 공격적으로 성장하는 이종이식 모델에서 생체내 Phor18-LHRH(338613)의 효과를 연구하였다. 처리되지 않은 PC-3 이종이식편은 마우스에서 유의한 체중 감소를 야기시켰다.
요컨대, 무작위교배계 계통의 6주령의 Nu/Nu 수컷 마우스(Charles River)에 PC-3 세포/마트리겔 현탁액(1x106 세포/마우스)를 피하 주사하였다. 종양이 확립된 경우에 종양 세포 주사 15일 후에 처리를 시작하였고, 22 및 29일에 지속시켰다. 3회의 매주 주사를 위한 용량은 2, 0.2 및 0.02 mg/kg 체중이었고, 가쪽 꼬리 정맥을 통한 단일한 볼루스 정맥내 주사로 제공하였다. 처리 그룹은 염수 대조군(N=12), Phor18-LHRH(338613)(APC 338613 Lot # V09108X1)(0.002 (N=12), 0.02(N=12), 0.2(N=12) 및 2 mg/kg (N=12),), 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 = CLIP71(338983, Lot # V04004X1)(5 mg/kg (N=12), 기준선(N=12)을 포함하였다.
12마리의 종양을 갖는 마우스의 한 그룹을 15일에 희생시켰고, 기준선 그룹으로 제공하였다. 모든 마우스를 종양 세포 주사 35 및 36일 후에 부검하였다. 종양 부피 및 체중을 연구 동안 매주 2회 기록했을 뿐만 아니라 마우스의 종합적인 수의사 검사를 수행하였다.
원발성 종양, 간, 신장, 췌장, 심장, 폐, 및 비장을 수거하고, 포르말린에 고정시키고, 조직학적 평가를 위해 준비하였다. 종양 중량을 부검시에 측정하였고, 종양의 일부를 LH/CG 및 LHRH 수용체 검정 결정을 위해 -80℃에서 동결시켰다.
모든 그룹은 주사에 잘 견뎠고, 처리 그룹 내의 모든 마우스는 생존하였다. 주사의 결과로서 마우스는 사망하지 않았다.
종양 부피는 0.002, 0.02, 0.2 및 2 mg/kg 용량의 PHor18-LHRH(338613)를 이용한 처리 동안 감소되었다. Phor18 또는 염수 대조군으로 처리된 마우스에 대해, 종양 성장이 관찰되었다. 종양 세포 주사 22일 후에 기록된 종양 부피는 0.002 mg/kg 체중만큼 적은 Phor18-LHRH(338613)의 농도에서 염수 대조군 및 CLIP71에 비해 감소를 나타내었다(p < 0.001). 종양 중량은 염수 대조군 및 CLIP-71 처리 그룹에 비해 유의하게 감소되었다(모든 Phor18-LHRH(338613) 처리된 그룹에서 0.001).
PC-3 이종이식편은 누드 마우스에서 체중 감소를 야기시키는 것으로 공지되어 있다. Phor18-LHRH(338613) 처리된 마우스에서, 종양 부피는 염수 대조군 및 Phor18 주사에 비해 0.002, 0.02, 0.2 및 2 mg/kg의 Phor18-LHRH(338613)로 처리된 그룹에서 감소되었다. 부검시의 중간 종양 중량은 염수 대조군 및 Phor18에 비해 유의하게 감소되었다(p<0.001). 대조군의 마우스는 악액질이었고, 처리된 마우스에 비해 10 g 초과의 체중 감소로 고통받았다.
Phor18-LHRH(338613)는 PC-3 이종이식편에서 종양 성장을 억제하고, 종양 부하로 인한 심각한 체중 감소를 예방하는데 효과적이다. 컨쥬게이션되지 않은 Phor18-LHRH(338613)는 효과적이지 않았다.
요컨대, 상기 연구는 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))가 유방암, 난소암 및 전립선암 이종이식편을 파괴하는데 있어서 생체내에서 효과적인 것을 나타낸다. Phor18-LHRH(338613)는 처리된 마우스에서 종양 괴사를 야기시키며, 괴사는 주사 1시간 후만큼 초기에 명백하다. Phor18-LHRH(338613)는 효과적이다. Phor18-LHRH(338613)는 표적 세포 파괴와 일치하게 처리 후 LHRH 수용체 수준에 있어서 감소를 야기시킨다.
실시예
10
본 실시예는 베타 사슬 FSH 단편/용해 펩티드 융합 작제물/컨쥬게이트의 설명을 포함한다.
전립선암, 유방암, 결장암, 췌장암, 방광암, 신장암, 폐암, 간암, 위암, 고환암 및 난소암에 혈액을 공급하는 혈관을 라이닝하는 내피 세포는 모두 난포 자극 호르몬(FSH)에 대한 수용체를 발현한다(Radu et al. N Engl J Med, 363:1621 (2010)). FSH 수용체는 관강 내피 표면 상에 노출되어 있으며, 여기서 이들은 순환 리간드에 결합할 수 있다. FSH 서열 및 용해 펩티드(Phor18)의 컨쥬게이트는 종양 혈관구조를 라이닝하는 내피 세포를 표적화하고 파괴할 수 있어, 이에 따라 이의 혈액 공급을 파괴하고, 종양 퇴행을 야기시킬 수 있다.
생체내 스크리닝을 위해, 인간 난포 자극 호르몬의 베타 사슬의 단편으로 구성된 3개의 용해 펩티드 컨쥬게이트를 이용하였다. 서열은 다음과 같이 FSH 수용체에 결합하는 단편으로부터 선택하였다: hFSH-β-33-53, hFSH-β-81-95 및 hFSH-β-90-95(Santa-Coloma TA et al J Biol Chem 265:5037 (1990); Grasso P et al Endocrinology 128:2745 (1991); 및 Agris PF J Protein Chem 11:495 (1992)).
베타 사슬의 FSH 단편의 아미노산 서열은 다음과 같다:
hFSH-β-33-53: CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT;
hFSH-β-81-95: QCHCGKCDSDSTDCT; 및
hFSH-β-90-95: DSTDCT.
이들 펩티드 서열을 Fmoc [Nα-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)]을 이용한 표준 고상 화학 방법을 이용하여 C-말단에서 서열 KFAKFAK KFAKFAK KFAK를 갖는 Phor18로 공지된 용해 펩티드 도메인에 컨쥬게이션시키고, 표준 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제하였다. 티올 함유 아미노산이 펩티드 내에 존재하였고, 95% 트리플루오로아세트산, 2.5% 물, 2.5% 에탄디티올, 및 1% 트리이소프로필실란을 포함하도록 분해 칵테일을 변형시켰다. 합성된 펩티드 컨쥬게이트의 순도는 95% 초과였다.
실시예
11
본 실시예는 3개 유형 및 용량의 β-FSH-Phor18-융합 작제물(hFSH-β-33-53; hFSH-β-81-95 및 hFSH-β-90-95)을 이용한 인간 전립선 암의 마우스 이종이식 모델(PC-3)에서의 생체내 연구를 기재한다.
수컷 Nu/Nu 마우스에 PC-3/마트리겔 현탁액(1x106 세포)을 피하 주사하였다. 마우스를 종양 세포 주사 21일 후에 그룹 당 8마리의 마우스의 처리 그룹으로 할당하였다. 처리를 1일에 시작하였고, 5, 8, 12, 15 및 19일에 지속시켰다. 동결건조된 펩티드 및 펩티드-컨쥬게이트를 염수에 용해시켰다. 처리는 다음과 같다: 염수 대조군, hFSH-β-90-95(1 mg/kg), hFSH-β-81-95(1 mg/kg), hFSH-β-33-53(1 mg/kg), Phor18 hFSH-β-90-95(0.1, 1 및 2 mg/kg), Phor18 hFSH-β-81-95(0.1, 1 및 2 mg/kg), 및 Phor18 hFSH-β-33-53(0.1, 1 및 2 mg/kg). 매주 2회 주사를 위한 용량은 단일 볼루스 주사로 제공하였다.
모든 그룹의 마우스는 주사에 잘 견뎠다. 처리 그룹 내의 모든 마우스는 생존하였다.
원발성 종양에 대한 펩티드 컨쥬게이트 주사 및 컨쥬게이션되지 않은 hFSH-β 서열의 효과가 도 13에 예시되어 있다. 종양 부피에서의 시간-관련 증가가 모든 대조군 그룹 및 컨쥬게이션되지 않은 FSH-단편으로 주사된 그룹에서 관찰되었다. 비히클 및 컨쥬게이션되지 않은 리간드 펩티드 처리 그룹과 비교하는 경우 Phor18 hFSH-β-90-95(P=0.027), Phor18 hFSH-β-81-95(P=0.029) 및 Phor18 hFSH-β-33-53(P=0.134)으로 처리된 마우스에서 종양 부피가 유의하게 낮은 수준으로 유지되었다.
Phor18 hFSH-β-90-95, Phor18 hFSH-β-81-95 및 Phor18 hFSH-β-33-53의 투여는 종양 부피에 의해 측정시 전립선 암세포 성장을 억제하였다(도 14). 부검시의 종양 중량은 Phor18 hFSH-β-90-95 및 Phor18 hFSH-β-81-95 처리된 군에서 감소되었다(p<0.05). Phor18 hFSH-β-33-53은 유의성 없이 1 mg/kg 체중의 용량에서 종양 부피를 감소시켰다(도 15). Phor18 hFSH-β-90-95에 대한 최소 유효 용량은 1 mg/kg 체중인 한편, Phor18 hFSH-β-81-95에 대한 최소 유효 용량은 0.1 mg/kg이었다(도 15). 컨쥬게이션되지 않은 hFSH-β-90-95, hFSH-β-81-95 또는 hFSH-β-33-53은 종양 부피 또는 종양 중량에 영향을 미치지 않았다.
체중은 상기 처리 중 임의의 처리에 의해 영향을 받지 않았다(도 16).
완전한 혈액 수 또는 혈액 화학의 결과에서 차이가 없었으며, 이는 간 및 신장 기능 시험이 대조군과 처리된 동물 사이에 변경되지 않은 것을 나타낸다.
FSHR 항체 323(Nicolae Ghinea, Inserm, FR)을 이용한 종양의 면역조직화학 분석은 FSH-수용체 양성 내피 세포가 대조군 마우스의 종양에 혈액을 공급하는 많은 혈관에서 발견되었으나, 소수의 FSH 수용체 양성 내피 세포가 임의의 FSH-베타-단편 Phor18 컨쥬게이트로 처리된 마우스의 종양에 존재한 것을 나타내었다. 시험된 이들 컨쥬게이트 중에서, Phor18 hFSH-β-81-95가 FSH 수용체 함유 내피 세포를 파괴하고, 누드 마우스에서 PC-3 이종이식편의 종양 성장을 억제하는데 있어서 가장 효과적이었다.
실시예
12
본 실시예는 FSH 수용체 발현 암 세포주에 대한 FSH 표적화 Phor18 컨쥬게이트의 활성을 기재한다.
FSH에 대한 수용체는 특히 정상 전립선, 양성 전립선 비대증(BPH), 전립선암(Dirnhofer et al Prostae 35:212 (1998); Ben-Josef et al J. Urol . 161:970 (1999); Mariani et al J. Urol. 175:2072 (2006) 및 난소암(Li et al Mol . Cell Endocrinol. 267:26 (2007); Mertens-Walker et al Cancer Lett . 324:152 (2012))에서 검출되었다.
FSH-β 단편 및 용해 펩티드(Phor18)의 컨쥬게이트를 시스테인을 제거하도록 추가로 변형시키고, 시험관내에서 전립선암 및 자궁 육종 세포주를 표적화하고 파괴하는지 시험하였다.
시험관내 연구는 인간 난포 자극 호르몬의 베타 사슬의 단편으로 구성된 3개의 용해 펩티드 컨쥬게이트의 스크리닝을 포함하였다. 상기 서열을 hFSH-β-81-95 서열로부터 변형시켰다(Santa-Coloma T et al J Biol Chem 265:5037 (1990)).
hFSH-β-81-95의 아미노산 서열 중 4개의 시스테인(Q C H C GK C DSDSTD C T)을 합성의 용이성, 용액 중에서의 펩티드 컨쥬게이트의 균질성, 비-환원 조건하에서의 이황화물 기 형성을 통한 다합체 대신의 단량체를 위해 알라닌으로 치환시켰다.
81-89개의 아미노산 서열로의 hFSH-베타 사슬의 트렁케이션은 Phor18 컨쥬게이트의 전하를 7+(Phor18-hFSH-β 81-95a)로부터 9+(Phor18-hFSH-β 81-89 및 Phor18-hFSH-β 81-89a)로 증가시켰다. 각각의 컨쥬게이트는 FSH 수용체로의 결합에 필요한 리간드 도메인 내의 아미노산 및 용해 펩티드 컨쥬게이트의 본래의 헬릭스 길이(1-20)를 보유하였다.
베타 사슬의 FSH 단편의 아미노산 서열은 다음과 같다:
hFSH-β 81-95a: QAHAGKADSDSTDAT;
hFSH-β 81-89: QCHCGKCDS; 및
hFSH-β 81-89a: QAHAGKADS.
이들 펩티드 서열을 Fmoc [Nα-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)]을 이용한 표준 고상 화학 방법을 이용하여 C-말단에서 서열 KFAKFAK KFAKFAK KFAK를 갖는 용해 펩티드 도메인 Phor18에 컨쥬게이션시키고, 표준 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제하였다.
실시예
13
본 실시예는 시험관 내에서의 3개의 전립선 및 1개의 자궁 육종 세포주에 대한 3개의 FSH-베타-Phor18 컨쥬게이트의 활성의 시험을 기재한다.
인간 전립선암 세포주(PC-3(p 35), LNCaP(p 22) 및 DU145(p 64)) 및 인간 자궁 육종 세포주 MES-SA-Dx5(p 58)(다약제 내성클론)를 ATCC 권장 배지, 10% 소 태아 혈청, 0.01 mg/ml 소 인슐린, 100 IU/ml 페니실린, 100 microg/ml 스트렙토마이신에서 성장시켰다. 세포를 통상적으로 96 웰 플레이트에 시딩(웰 당 2,000개 세포)하고, 배지를 인큐베이션 48시간 후에 교체하였다. 각각의 검정을 0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 5, 10 및 25 마이크로몰 용량의 증가하는 농도의 용해 펩티드-결합 도메인 컨쥬게이트(N=6)로 수행하였다. 동결건조된 형태로 제공된 각각의 용해 펩티드-결합 FSH 컨쥬게이트를 염수에 용해시키고, 세포에 첨가하였다. 인큐베이션 기간은 37℃에서 2 및 24시간이었다. 막 온전성을 파열된 세포로부터 방출된 죽은 세포 프로테아제를 결정하는 발광 검정(Promega Cytotox Glo G 607 A, lot # 29753501)을 이용하여 2시간 후에 결정하였다. 발광 검정(Promega, CellTiter Glo, G755B, lot #31511202)을 이용하여 24시간 후에 세포 생활력을 평가하였다. 대조군은 0 및 100% 세포 사멸에 대한 참조로서 염수 또는 0.1% 트리톤을 각각 함유하였다.
윈도우용 GraphPad Prism version 5.00(GraphPad Software, San Diego California)을 이용하여 데이터를 처리하고 분석하였다. 유의성에 대한 통계적 분석을 양측 스튜던츠 T-검정에 의해 결정하였다. 각각의 연구를 수행하여 적어도 6의 N을 달성하였다.
시험관내 활성을 힐 방정식(Hill equation)(Graph Pad Prizm 소프트웨어)을 이용하여 계산된 각각의 세포주, 시험된 시점 및 화합물에 대한 IC50 값으로 표현하였다.
FSH 수용체 수준을 흐름세포측정법을 통해 결정하였다. 백그라운드 및 신호 수준을 비교함으로써 상대 염색 수준을 수득하였다. PC-3 전립선 암세포(p 35)는 FSH-수용체에 대해 음성이었고, MES-SA-Dx5(p 58)는 9의 가장 높은 염색 값을 가졌고, DU145는 5.6이었고, LNCaP 세포는 3.3의 염색 수준을 가졌다. 더 높은 염색 수준은 낮은 마이크로몰 범위 내의 IC50 값을 갖는 FSH Phor18 컨쥬게이트 각각에 대한 더 큰 민감성과 서로 관련이 있었다(상관계수는 Phor-18-hFSH-β-81-95a에 대해 r2=0.9250, Phor-18-hFSH-β-81-89에 대해 r2=0.8685, Phor-18-hFSH-β-81-89a에 대해 r2=0.9335였다).
IC50 값으로 측정된 시험관내 활성은 FSH 수용체를 발현하는 전립선암 세포주에 대해 중간 내지 낮은 마이크로몰 범위였고(Phor-18-hFSH-β 81-95a; Phor-18-hFSH-β 81-89; Phor-18-hFSH-β 81-89a): LNCaP 세포주는 2시간 후에 14.6±1.8, 7.4±0.6 및 7.9±0.4 μM 및 24시간 후에 10.5±0.5 (p<0.0001), 3.9±0.4 (p<0.0004 vs Phor-18-hFSH-β 81-89a) 및 6.3±0.1 μM의 IC50 값을 가졌고; DU145 세포는 2시간 후에 14.8±0.8, 9.7±0.7 및 11.3±0.3 μM의 민감성 및 24시간 후에 10.1±0.3(p<0.0001), 2.7±0.5(p<0.0002 vs Phor-18-hFSH-β 81-89a) 및 6.2±0.3 μM의 IC50 값의 증가된 민감성을 나타내었다. 가장 높은 민감성이 가장 높은 수준의 FSH 수용체를 갖는 자궁 육종 세포주(MES-SA-Dx5)에서 측정되었다: 2시간 후에 2.5±0.6, 1.1±0.3 및 2.0±0.4 μM 및 24시간 후에 2.7±0.3(p<0.0001), 0.47±0.04(p<0.016 vs Phor-18-hFSH-β 81-89a) 및 0.76±0.05 μM의 IC50 값(표 8).
전하의 증가는 Phor-18-hFSH-β 81-95a와 비교하여 Phor-18-hFSH-β 81-89 및 Phor-18-hFSH-β 81-89a에 대해 전립선암 세포주 DU145 및 LNCaP 및 자궁 육종 세포주 MES-SA-Dx5에 대한 FSH 수용체 양성 세포주에서의 독성을 증가시켰다(p< 0.0001; p< 0.0001 및 p<0.0001). LNCaP, DU145 및 MES-SA-Dx5 세포주에서, Phor-18-hFSH-β 81-89는 Phor-18-hFSH-β 81-89a보다 더 활성이었다(p<0.0004, p<0.0002 및 p<0.016). 막 붕괴가 DU145, LNCaP 및 MES-SA-Dx5 세포주에서 2시간만큼 초기에 관찰되었다.
이들 데이터는 트렁케이션된 컨쥬게이트가 FSH 수용체 양성 암세포를 특이적으로 사멸시키는 것을 나타낸다. 알라닌 치환은 시스테인 대응물에 비해 낮은 효능을 발생시켰으나, 낮은 마이크로몰 범위에서 적절한 활성을 나타내었다.
표 8:
FSH
-
Phor18
컨쥬게이트의
시험관내
활성
실시예
14
본 실시예는 2개의 트렁케이션된 FSH-Phor18 컨쥬게이트(Phor-18-hFSH-β 81-89 및 Phor-18-hFSH-β 81-89a)에 대한 FSH 수용체에 대한 세포 사멸의 특이성을 제시한다. 둘 모두의 FSH-Phor18 컨쥬게이트를 FSH 수용체 양성 자궁 육종 세포주(MES-SA-Dx5)에서 증가하는 농도의 FSH를 이용하여 일정한 용량으로 시험하였다.
MES-SA-Dx5(p 59) 세포로부터의 세포 배양물을 2,000 세포/웰을 이용하여 96 웰 불투명 플레이트에서 효소 비함유 세포 방출을 통해 지수적으로 성장하는 배양물로부터 제조하였다. 세포 배양물을 48시간 동안 부착시켰다. 염수에 용해된 증가하는 농도의 FSH(Sigma F 4021, 인간 뇌하수체, 090M1336)를 0, 1, 10, 25 및 50 μM의 용량으로 첨가하였다. 동결건조된 형태의 Phor-18-hFSH-β 81-89 및 Phor-18-hFSH-β 81-89a를 염수에 새로이 용해시키고, 1 μM의 최종 농도로 다중-웰 플레이트에 첨가하였다. 세포 생활력을 발광 검정 키트(CellTiter Glo G755, Promega lot 31699601)를 이용하여 37℃에서 6시간 인큐베이션 후에 결정하였다. 대조군은 0 및 100% 세포 사멸에 대한 참조로서 USP 염수 또는 0.1% TritonX-100™을 각각 함유하였다. 데이터를 윈도우용 GraphPad Prism version 5.00(GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com)을 이용하여 처리하고 분석하였다. 유의성에 대한 통계 분석을 양측 스튜던츠 T-검정에 의해 결정하였다. 각각의 연구를 수행하여 적어도 6의 N을 달성하였다.
시험관내 활성을 100%로서 염수 대조군 수준과 비교하여 표현하였다.
단독이거나 FSH의 존재하에서의 1 μM Phor18-FSH-81-89 및 Phor18-FSH-81-89a의 상대 활성은 활성의 상실을 나타내었고, 이는 10 μM의 농도에서 유의하였다(p<0.05). Phor18-FSH-81-89 및 Phor18-FSH-81-89a는 MES-SA-Dx5 자궁 육종 세포 상의 FSH 수용체를 특이적으로 표적화한다.
Phor18-FSH-81-89 및 Phor18-FSH-81-89a는 유사한 시험관내 활성으로 MES-SA-Dx5 자궁 육종 세포 상의 FSH 수용체를 특이적으로 표적화한다. 10 μM의 FSH의 존재는 활성을 유의하게 억제하였고, 25 μM에서 완전히 비활성화시켰다. 이들 데이터는 Phor18-FSH-81-89 및 Phor18-FSH-81-89a 둘 모두가 FSH 수용체에 결합함으로써 FSH 수용체 발현 세포를 특이적으로 표적화하는 것을 나타낸다(도 17).
실시예
15
본 실시예는 시험관 내에서의 컨쥬게이션되지 않은 Phor18과 비교한 2개의 난소암 세포주, 하나의 췌장암 세포주 및 하나의 유방암 세포주에 대한 3개의 FSH-베타-Phor18 컨쥬게이트의 활성을 기재한다.
인간 난소암 세포주 OVCAR-3(p 41), SKOV-3(p 35) 및 인간 자궁 육종 세포주 MES-SA-Dx5(p 61)(다약제 내성 클론), 인간 췌장암 세포주 Panc-1(계대 번호 18), 및 인간 삼중 음성 유방암 세포주 MDA-MB-231(계대 번호 47)을 ATCC 권장 배지, 10% 소 태아 혈청, 100 IU/ml 페니실린, 100 microg/ml 스트렙토마이신에서 성장시켰다. 세포를 통상적으로 96웰 플레이트에 시딩(웰 당 2,000개 세포)하고, 배지를 인큐베이션 48시간 후에 교체하였다. 각각의 검정을 0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 5, 10 및 25 마이크로몰 용량의 증가하는 농도의 용해 펩티드-결합 도메인 컨쥬게이트 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor18(N=6)로 수행하였다. 동결건조된 형태로 제공된 각각의 Phor-18-hFSH-β 81-89 컨쥬게이트를 염수에 용해시키고, 세포에 첨가하였다. 인큐베이션 기간은 37℃에서 4시간이었다. 발광 검정(Promega, Cell Titer Glo, G755B, lot #00000031421)을 이용하여 4시간 후에 세포 생활력을 평가하였다. 대조군은 0 및 100% 세포 사멸에 대한 참조로서 염수 또는 0.1% 트리톤을 각각 함유하였다.
윈도우용 GraphPad Prism version 5.00(GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com)을 이용하여 데이터를 처리하고 분석하였다. 유의성에 대한 통계적 분석을 양측 스튜던츠 T-검정에 의해 결정하였다. 각각의 연구를 수행하여 적어도 6의 N을 달성하였다.
시험관내 활성을 힐 방정식(Graph Pad Prizm 소프트웨어)을 이용하여 계산된 각각의 세포주, 시험된 시점 및 화합물에 대한 IC50 값으로 표현하였다.
IC50 값으로 측정된 시험관내 활성은 난소암 세포주 OVCAR-3, Panc-1 및 인간 삼중 음성 유방암 세포주 MDA-MB-231에 대해 중간 내지 낮은 마이크로몰 범위 내였고, Phor-18-hFSH-β 81-89에 대해 MES-SA-Dx5 세포에서 활성이 가장 높았고, Phor-18-hFSH-β 81-89a가 그 뒤였다. Phor18-hFSH-81-89는 Phor18-hFSH-81-89a에 비해 유의하게 더 효능이 있었다(p<0.003). Phor-18-hFSH-β 81-95a에 대해 가장 낮은 활성이 시종일관 발견되었다(p<0.0001).
4개의 상이한 세포주에서, 4시간 후의 시험관내 활성은 Phor-18-hFSH-β 81-95a에 비해 Phor-18-hFSH-β 81-89 및 Phor-18-hFSH-β 81-89a에 대해 유의하게 더 높았다(표 9). Phor-18-hFSH-β 81-89는 컨쥬게이션되지 않은 Phor18보다 3 내지 93배 더 활성이 있었다.
이들 데이터는 Phor-18-hFSH-β 81-89 컨쥬게이트가 FSH 수용체 양성 암세포를 특이적으로 사멸시키는 것을 나타낸다. 알라닌 치환(Phor-18-hFSH-β 81-89a)은 시스테인 대응물(Phor-18-hFSH-β 81-89)에 비해 낮은 효능을 발생시켰으나, Phor-18-hFSH-β 81-95a에 비해 우수한 활성을 나타내었다.
표 9:
컨쥬게이션되지
않은
Phor18에
비한
FSH
-
Phor18
컨쥬게이트의
시험관내
활성
유의성 수준: * Phor-18-hFSH-β 81-95a에 비함, # Phor-18-hFSH-β 81-89a에 비함
Claims (79)
- 난포 자극 호르몬(FSH) 수용체에 결합하는 FSH 단편 및 용해 도메인을 포함하는 융합 작제물로서, 상기 FSH 단편이 용해 도메인에 컨쥬게이션되어 있고, 상기 용해 도메인이 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA로부터 선택된 펩티드 서열, 또는 K 잔기 중 하나 이상이 F 또는 L 잔기 중 임의의 것으로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 K, A 또는 L 잔기 중 임의의 것으로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 K, F 또는 L 잔기 중 임의의 것으로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA로부터 선택된 펩티드 서열로 구성되는, 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편이 FSH 베타-사슬의 단편인 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편이 포유동물 FSH 서열의 단편인 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편이 인간 FSH 서열의 단편인 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편이 Asn - Ser - Cys - Glu - Leu - Thr - Asn - Ile - Thr - Ile - Ala - Ile - Glu - Lys - Glu - Glu - Cys - Arg - Phe - Cys - Ile - Ser - Ile - Asn - Thr - Thr - Trp - Cys - Ala - Gly - Tyr - Cys - Tyr - Thr - Arg - Asp - Leu - Val - Tyr - Lys - Asp - Pro - Ala - Arg - Pro - Lys - Ile - Gln - Lys - Thr - Cys - Thr - Phe - Lys - Glu - Leu - Val - Tyr - Glu - Thr - Val - Arg - Val - Pro - Gly - Cys - Ala - His - His - Ala - Asp - Ser - Leu - Tyr - Thr - Tyr - Pro - Val - Ala - Thr - Gln - Cys - His - Cys - Gly - Lys - Cys - Asp - Ser - Asp - Ser - Thr - Asp - Cys - Thr - Val - Arg - Gly - Leu - Gly - Pro - Ser - Tyr - Cys - Ser - Phe - Gly - Glu - Met - Lys - Glu로 기재되는 인간 FSH 베타 사슬 서열의 단편인 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편이 FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 33-53; FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 81-95; FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 81-89; FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 90-95; 또는 FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 33-53; FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 81-95; FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 81-89; 또는 적어도 하나의 C 잔기가 A 잔기로 치환된 FSH 베타 사슬 아미노산 잔기 90-95를 포함하거나 이들로 구성되는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편이 CYTRDLVYKDPARPKIQKTCT; QAHAGKADSDSTDAT; QCHCGKCDSDSTDCT; QAHAGKADS; QCHCGKCDS 또는 DSTDCT, 또는 적어도 하나의 C 잔기가 A 잔기로 치환된 상기 서열 중 임의의 서열을 포함하거나, 이들로 구성되는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편이 FSH 베타 사슬의 약 1 내지 10, 10 내지 20, 15 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100개 또는 그 초과의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편이 선형 또는 고리형 구조를 갖는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 수용체가 세포에서 발현되는 융합 작제물.
- 제 10항에 있어서, 상기 세포가 과증식 세포인 융합 작제물.
- 제 10항에 있어서, 상기 세포가 유방, 난소, 자궁, 자궁경부, 전립선, 고환, 부신, 뇌하수체 또는 자궁내막 세포인 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 용해 도메인 또는 FSH 단편이 L-아미노산, D-아미노산 또는 L-아미노산과 D-아미노산의 혼합물로 구성되거나 이들을 포함하는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 용해 도메인이 약 1 내지 10, 10 내지 20, 15 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100개 또는 그 초과의 아미노산의 아미노산 서열로 구성되거나 이들을 포함하는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 용해 도메인이 약 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산의 아미노산 서열로 구성되거나 이들을 포함하는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 용해 도메인이 상기 FSH 단편과 관련하여 NH2-말단에 위치되는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편이 상기 용해 도메인과 관련하여 NH2-말단에 위치되는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 용해 도메인 또는 상기 FSH 단편이 하나 이상의 D-아미노산을 갖는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 용해 도메인이 임의의 K, F 또는 A 잔기에서 D-아미노산을 갖는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 용해 도메인이 양친매성 알파-헬릭스를 형성하는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 용해 도메인이 연속적 또는 불연속 PNNPNNP 반복 모티프를 형성하고, 여기서 P가 양성으로 하전된 아미노산이고, N이 중성 아미노산인 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6 또는 제 7의 용해 도메인을 추가로 포함하는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편 및 상기 용해 도메인이 공유 결합에 의해 연결되는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편 및 상기 용해 도메인이 펩티드 링커에 의해 연결되는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편 및 상기 용해 도메인이 1 내지 25개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 링커 서열에 의해 연결되는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편 및 상기 용해 도메인이 하나 이상의 A, S 또는 G 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 링커 서열에 의해 연결되는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편 및 상기 용해 도메인이 GSGGS 또는 ASAAS를 포함하거나 이들로 구성된 펩티드 서열에 의해 연결되는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편 및 상기 용해 도메인이 비-펩티드 링커에 의해 연결되는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 FSH 단편 및 상기 용해 도메인이 선형 탄소 사슬에 의해 연결되는 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 융합 작제물이 분리되거나 정제된 것인 융합 작제물.
- 제 1항에 있어서, 상기 융합 작제물이 혼합물을 포함하는 융합 작제물.
- 제 1항의 융합 작제물을 포함하는 조성물.
- 제 1항의 융합 작제물을 포함하는 약학적 조성물.
- 요망되지 않는 세포 증식 또는 세포 증식 장애를 갖는 대상체를 치료하는데 효과적인 양의 제 1항의 융합 작제물을 포함하는 단위 투여 형태(unit dosage).
- 신생물, 종양 또는 암을 갖는 대상체를 치료하는데 효과적인 양의 제 1항의 융합 작제물을 포함하는 단위 투여 형태.
- 대상체의 생식력을 감소시키는데 효과적인 양의 제 1항의 융합 작제물을 포함하는 단위 투여 형태.
- 세포의 증식을 감소시키거나 억제하거나, 과증식하는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하거나, 신생물, 종양 또는 암 세포의 증식을 감소시키거나 억제하거나, 세포 증식 장애를 갖는 대상체를 치료하거나, 신생물, 종양 또는 암을 갖는 대상체를 치료하거나, 동물의 생식력을 감소시키기 위한 제 1항의 융합 작제물 및 설명서를 포함하는 키트.
- 제 1항의 융합 작제물, 및 세포 증식 억제제(anti-cell proliferative agent) 또는 면역자극제를 포함하는 조성물.
- 제 1항의 융합 작제물을 인코딩하는 핵산 분자.
- 제 39항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
- 제 40항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 제 1항의 융합 작제물을 발현하는 세포.
- 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 제 1항의 융합 작제물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, FSH 수용체를 발현하는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법.
- 과증식하는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 제 1항의 융합 작제물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, FSH 수용체를 발현하는 과증식하는 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법.
- 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 제 1항의 융합 작제물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법.
- 제 45항에 있어서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포가 FSH 수용체를 발현하거나, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 혈관구조가 FSH 수용체를 발현하는 방법.
- 세포 증식 장애를 치료하는데 충분한 양의 제 1항의 융합 작제물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 세포 증식 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법.
- 제 47항에 있어서, 세포 증식 장애가 FSH 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 방법.
- 제 47항에 있어서, 세포 증식 장애가 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 또는 이들의 신생혈관구조(neovasculature)를 포함하는 방법.
- 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 다른 부위로의 전이, 또는 원발성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양으로부터 원위에 있는 다른 부위에서의 전이성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 제 1항의 융합 작제물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 다른 부위로의 전이, 또는 원발성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양으로부터 원위에 있는 다른 부위에서의 전이성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하는 방법.
- 제 50항에 있어서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 FSH 수용체를 발현하는 세포를 포함하거나, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 혈관구조가 FSH 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 전이성, 비-전이성 또는 양성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양인 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 신생물, 종양, 암, 또는 악성종양이 고형 세포 덩어리를 포함하는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 조혈 세포를 포함하는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 샘종, 샘암종, 흑색종, 신경아교종, 아교모세포종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 별아교세포종, 핍지세포종, 중피종, 그물내피, 림프 또는 조혈 신생물, 종양, 암 또는 악성종양을 포함하는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 육종이 림프육종, 지방육종, 뼈육종, 연골육종, 평활근육종, 횡문근육종 또는 섬유육종을 포함하는 방법.
- 제 56항에 있어서, 조혈 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 골수종, 림프종 또는 백혈병을 포함하는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 폐, 갑상샘, 두경부, 코인두, 인후, 코 또는 굴, 뇌, 척추, 유방, 부신, 뇌하수체, 갑상샘, 림프, 위장(구강, 식도, 위, 십이지장, 회장, 공장(소장), 결장, 직장), 비뇨생식관(자궁, 난소, 자궁경부, 자궁내막, 방광, 고환, 음경, 전립선), 신장, 췌장, 간, 뼈, 골수, 림프, 혈액, 근육, 또는 피부 신생물, 종양, 또는 암을 포함하는 방법.
- 제 58항에 있어서, 폐 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 소세포폐암 또는 비소세포폐암을 포함하는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 줄기 세포 신생물, 종양, 암 또는 악성종양을 포함하는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 상기 방법이 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 재발 또는 진행을 억제하거나 감소시키는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항-암 또는 면역-증강 치료 또는 요법을 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제 62항에 있어서, 치료 또는 요법이 외과적 절제, 방사선요법, 이온화 또는 화학적 방사선 요법, 화학요법, 면역요법, 국소 또는 국부 열(고열) 요법, 또는 예방접종을 포함하는 방법.
- 제 62항에 있어서, 치료 또는 요법이 알킬화제, 항-대사물, 식물 추출물, 식물 알칼로이드, 니트로소우레아, 호르몬, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제 62항에 있어서, 치료 또는 요법이 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 사이클로스포린 A, 프레드니솔론, 멜팔란, 클로람부실, 메클로르에타민, 부술판, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 티오구아닌, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드, AZT, 5-아자시티딘(5-AZC) 및 5-아자시티딘 관련 화합물, 블레오마이신, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 미토마이신 C, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조토신, 하이드록시우레아, 시스플라틴, 미토탄, 프로카르바진, 데카르바진, 탁산, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 독소루비신 또는 디브로모만니톨을 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제 62항에 있어서, 치료 또는 요법이 림프구, 형질 세포, 대식세포, 수지상 세포, NK 세포 또는 B-세포를 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제 62항에 있어서, 치료 또는 요법이 항체, 호르몬, 세포 성장 인자, 세포 생존 인자, 세포 분화 인자, 사이토카인 또는 케모카인을 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제 62항에 있어서, 치료 또는 요법이 특히 본 발명에 따른 융합 작제물과 조합하여 사용될 수 있는 IL-2, IL-1α, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-7, 과립구-대식세포-집락 자극 인자(GMCSF), IFN-γ, IL-12, TNF-α, TNFβ, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, SDF-1, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, 에오탁신(eotaxin), 에오탁신-2, I-309/TCA3, ATAC, HCC-1, HCC-2, HCC-3, LARC/MIP-3α, PARC, TARC, CKβ, CKβ6, CKβ7, CKβ8, CKβ9, CKβ11, CKβ12, C10, IL-8, GROα, GROβ, ENA-78, GCP-2, PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2, Mig, PBSF/SDF-1, 림포탁틴(lymphotactin), 리툭시맙(rituximab)(Rituxan®), 트라스투주맙(trastuzumab)(Herceptin®), 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin®), 라니비주맙(ranibizumab)(Lucentis®), 세툭시맙(cetuximab)(Erbitux®), 알렘투주맙(alemtuzumab)(Campath®), 파니투무맙(panitumumab)(Vectibix®), 퍼투주맙(pertuzumab)(Perjeta®), 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin®), 이필리무맙(ipilimumab)(Yervoy®), 토시투모맙(tositumomab)(Bexxar®) 등, 융합 작제물과 함께 적용가능한 다른 표적화된 약물, 예를 들어, 이마티니브(imatinib)(Gleevec®), 제피티니브(gefitinib)(Iressa®), 보르트조미브(bortzomib)(Velcade®), 라파티니브(lapatinib)(Tykerb®), 수니티니브(sunitinib)(Sutent®), 소라페니브(sorafenib)(Nevaxar®), 닐로티니브(nilotinib)(Tasigna®), 잘루투무맙(zalutumumab), 달로투주맙(dalotuzumab), 피지투무맙(figitumumab), 라무시루맙(ramucirumab), 갈릭시맙(galiximab), 파를레투주맙(farletuzumab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오파투무맙(ofatumumab)(Arzerra®), 토시투무맙(tositumumab), 2F2(HuMax-CD20), 7D8, IgM2C6, IgG1 2C6, 11B8, B1, 2H7, LT20, 1F5 또는 AT80 다클리주맙(daclizumab)(Zenapax®), 또는 항-LHRH 수용체 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제 62항에 있어서, 융합 작제물이 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항-암 또는 면역-증강 치료 또는 요법의 제공 전, 실질적으로 이들의 제공과 동시에 또는 이들의 제공 후에 투여되는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 대상체가 외과적 절제, 화학요법, 면역요법, 이온화 또는 화학적 방사선요법, 국소 또는 국부 열(고열) 요법, 또는 예방접종을 받은 적이 있는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 대상체가 외과적 절제, 화학요법, 면역요법, 이온화 또는 화학적 방사선요법, 국소 또는 국부 열(고열) 요법, 또는 예방접종에 대한 후보인 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 대상체가 외과적 절제, 화학요법, 면역요법, 이온화 또는 화학적 방사선요법, 국소 또는 국부 열(고열) 요법, 또는 예방접종에 대한 후보가 아닌 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 치료가 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포 덩어리, 부피, 크기 또는 세포의 수의 부분적 또는 완전한 파괴를 발생시키거나, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 세포 괴사, 용해 또는 아폽토시스를 자극하거나, 유도하거나, 증가시키거나, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 부피 크기, 세포 덩어리를 감소시키거나, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 부피, 덩어리, 크기 또는 세포 수의 진행 또는 증가를 억제하거나 예방하거나, 수명을 연장시키는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 치료가 신생물, 종양, 암 또는 악성종양과 관련되거나 이에 의해 야기된 유해 증상 또는 합병증의 중증도, 기간 또는 빈도를 감소시키거나 저하시키는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 치료가 동통, 불쾌, 구역, 쇠약 또는 기면을 감소시키거나 저하시키는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 치료가 증가된 에너지, 식욕, 개선된 움직임 또는 심리적 웰빙(well being)을 발생시키는 방법.
- 생식력을 감소시키기에 충분한 양의 제 1항의 융합 작제물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물의 생식력을 감소시키는 방법.
- 제 49항 또는 제 50항 또는 제 77항에 있어서, 대상체 또는 동물이 포유동물인 방법.
- 제 49항 또는 제 50항 또는 제 77항에 있어서, 대상체 또는 동물이 인간인 방법.
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