CN111269942A - Tgfbi作为调控间充质干细胞成骨分化的标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了TGFBI在制备调控间充质干细胞成骨分化的产品中的应用。本发明人通过实验发现人脐带来源的间充质干细胞分泌的TGFBI基因可以调节间充质干细胞成骨分化；具体地，利用慢病毒转染技术将合成的TGFBI慢病毒导入传代培养后的人脐带来源的间充质干细胞，通过敲低TGFBI基因使得成骨细胞分化成熟的早期标志物碱性磷酸酶(ALP)和成骨细胞分化成熟的晚期标志物骨桥蛋白(OPN)的表达显著上调，从而促进huMSC成骨分化能力。

Description

TGFBI作为调控间充质干细胞成骨分化的标志物的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及TGFBI作为调控间充质干细胞成骨分化的标志物的应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一种存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)、具有多向分化潜力的非造血干细胞，是一种能够分化为包括脂肪和骨骼在内等多个间质组织的多源细胞。
MSC作为脂肪细胞和成骨细胞的祖细胞，能够维持其良好的平衡分化。大量体外试验证实脂肪诱导因子抑制了成骨细胞的形成，反之，成骨诱导因子抑制了成脂细胞的形成。一些化学、物理和生物因素可以调控MSC的微环境，促进成脂细胞及成骨细胞之间的平衡分化。这些因素触发了不同的信号通路，激活转录因子，调控MSC的分化。脂肪成骨平衡的失调与一些病理生理过程有关，如衰老、肥胖、骨质疏松、骨化病和骨质疏松症。近年来对MSC分化的调控越来越受到人们的关注。对其外界影响的因素及其调控的信号通路展开了研究，从而调控了MSC向成脂细胞的分化能力，维持成脂及成骨细胞的分化平衡。TGFBI基因(transforming growth factor-βinduced gene,TGFβi)也称为big-H3，首次发现是在A549肺腺癌细胞形成的基因克隆。TGFBI基因所表达的产物被称为角膜上皮蛋白(keratoepithelin,KE蛋白)，由683个氨基酸组成。TGFBI基因蛋白是由N-末端分泌信号，四个FAS1同源内部区域及C端RGD区域组成。TGFBI广泛分布于细胞质及细胞核，是TGF-β诱导的一种分泌蛋白。它与胶原蛋白结合，形成细胞外基质的一部分，并与细胞表面的整合素相互作用。TGFBI作为一种双功能蛋白，能够在一些功能紊乱的细胞中，调控细胞外基质与细胞间的粘连与迁移，通过调控细胞微管组织影响细胞周期，从而发挥作用。TGF-β调控TGFBI的表达，在高糖及TGF-β刺激下，TGFBI可以在平滑肌细胞、角质细胞、星形细胞、近端小管上皮细胞等几类细胞中产生。我们通过基因转录测序发现，TGFBI在MSC中高表达，已有研究证明，骨髓来源的MSC可以诱导小鼠体内造血干细胞及祖细胞(hematopoietic stemandprogenitor cell,HSPC)中TGFBI的表达，影响HSPC的迁移及分化能力。HSPC细胞中TGFBI的表达降低，将影响该细胞的稳定与迁移分化能力。
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)，是反应骨组织中分解代谢水平的一种标志酶，在钙化中起着关键作用。钙离子在ALP作用下沉积于胶原上，完成基质矿化过程，骨组织是通过骨基质钙化而形成，而骨基质由成骨细胞合成、分泌；在基质开始钙化时，成骨细胞的ALP活性最高，在钙化接近结束时活性则最低，其活力在一定程度上反映成骨细胞的分化程度和功能状态。ALP活性增强是成骨细胞分化成熟的重要标志。ALP是成熟成骨细胞的标志酶之一，其主要作用为水解有机磷酸酶，启动钙化。其活性的增加反映了成骨细胞成熟的程度增高。
骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种磷酸纤维化的糖蛋白，又被称为骨基质蛋白，含有丰富的天冬氨酸和丝氨酸残基，经对比分析发现人OPN与不同种属动物之间具有中度同源性，都具有特异性保守序列(包括7～10个连续的ASP序列、信号肽序列、RGD序列、酪氨酸激酶磷酸化识别序列等)，通过这些基序OPN与不同分子相互作用介导多种多样的生物学功能，如骨的矿化、吸收和形成、癌症的发生和进展等。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种调控间充质干细胞成骨分化的靶点及其间充质干细胞成骨分化的产品中的应用。
本发明目的之二在于提供TGFBI抑制剂或促进剂及其通过调节间充质干细胞成骨分化在间充质干细胞成骨诱导分化中的应用以及在调控脂肪成骨平衡的失调相关疾病中的应用。
本发明的上述目的通过如下技术方案实现：
本发明人利用成熟的干细胞分离培养技术和间充质干细胞体外诱导培养体系，经实验发现TGFBI基因可以调节间充质干细胞成骨分化的特性；具体地，利用慢病毒稳定敲除转染技术将慢病毒LV-TGFBI导入传代培养后的人脐间充质干细胞(huMSC)，通过稳定敲除TGFBI基因，使得成骨细胞分化成熟的早期标志物ALP和成骨细胞分化成熟的晚期标志物OPN的表达明显上调，从而促进huMSC成骨分化能力。
首先，本发明提供TGFBI在制备调控间充质干细胞成骨分化的产品中的应用。
优选地，所述TGFBI基因调节间充质干细胞成骨分化是通过敲低TGFBI基因使得成骨细胞分化成熟的早期标志物ALP和成骨细胞分化成熟的晚期标志物OPN的表达明显上调，从而促进MSC成骨分化能力。
优选地，所述TGFBI基因是通过TGFBI抑制剂或促进剂影响间充质干细胞的成骨分化能力。
在本发明的一些实施方案中，所述调控间充质干细胞成骨分化的产品为生物制剂、生物药剂等。
优选地，所述间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞。
进一步地，本发明提供了TGFBI基因表达抑制剂在制备间充质干细胞成骨诱导分化剂中的应用。
在本发明的一些实施方案中，所述TGFBI抑制剂为能降低TGFBI表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸；或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。
优选地，所述TGFBI基因表达抑制剂为TGFBI shRNA，其具有SEQ ID NO:1和/或SEQID NO:2所示的核苷酸序列。
进一步地，本发明提供了一种调控间充质干细胞成骨分化的制剂，所述制剂以TGFBI抑制剂或者具有TGFBI生物活性的模拟物或类似物为活性成分。
更进一步地，本发明提供了间充质干细胞成骨分化的制剂通过调节间充质干细胞成骨分化在制备调控与脂肪成骨平衡失调相关疾病的产品中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述脂肪成骨平衡的失调相关疾病包括(但不限于)衰老、肥胖、骨质疏松、骨化病或骨质疏松症。
进一步地，本发明还提供了一种促进间充质干细胞成骨分化的方法，包括如下步骤：
1)从人脐带组织分离获取间充质干细胞，然后进行原代培养和传代培养；
2)利用慢病毒转染技术将合成的TGFBI慢病毒导入传代培养后的间充质干细胞，然后培养。
优选的，所述慢病毒转染的转染体系为：转染病毒滴度为MOI＝10，转染病毒量为1×107/ml，转染时间为24h。
有益效果
本发明人通过实验发现TGFBI基因可以调节间充质干细胞成骨分化的能力，为脐带间充质干细胞生物学特性的研究及临床、医用应用提供了理论基础；因此，可将TGFBI用于制备调控间充质干细胞成骨分化的产品，如MSC成骨分化的抑制剂或促进剂，并提供MSC成骨分化的抑制剂或促进剂在脂肪成骨平衡失调相关疾病中的应用。本发明采用成熟的人脐带来源的分离培养技术，结合特定的成骨诱导化学体系及特定的接种细胞数，稳定的基因转染敲低技术，可操作性强，方便实用；本发明针对人脐带来源间充质干细胞(huMSC)成功并快速建立了稳定的TGFBI基因敲低效率，通过成骨诱导分化证实了诱导后所述huMSC碱性磷酸酶活性和骨桥蛋白的活性的明显差异。
附图说明
图1所示为倒置显微镜下观察的P1代huMSC形态；其中图1A为P1代huMSC(4×)，图1B为P1代huMSC(10×)；
图2为TGFBI基因的转染效率，图2A为q-PCR检测TGFBI基因的敲除效率；图2B为荧光显微镜下观察TGFBI基因的转染效率；图2C为流式检测TGFBI基因的转染效率；
图3为碱磷酶染色检测正常huMSC和进行LV-TGFBI慢病毒转染的TGFBI基因敲低huMSC(TGFBI-/-huMSC)成骨诱导结果，碱磷酶活性出现的差异。其中图3A为huMSC成骨诱导分化的自分化组；图3B为huMSC成骨诱导分化的诱导组；图3C为TGFBI-/-huMSC成骨诱导分化的自分化组；图3D为TGFBI-/-huMSC成骨诱导分化的诱导组；图3E为q-PCR检测huMSC成骨诱导后成骨细胞标志物ALP表达；图3F为q-PCR检测TGFBI-/-huMSC成骨诱导后成骨细胞标志物OPN表达；
图4为成骨诱导后，huMSC与TGFBI-/-huMSC表达的成骨分化标志物ALP和OPN表达差异结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，本发明所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。
实施例1：间充质干细胞TGFBI基因敲低培养
首先按照常规方法从人脐带组织分离获取原代人脐带间充质干细胞(huMSC)培养后，接种到完全培养基中培养P1代huMSC。图1所示为倒置显微镜下观察的P1代huMSC形态；图1A为P1代huMSC(4×)，图1B为P1代huMSC(10×)；也可多次传代培养扩增，再用冻存液调整细胞悬液的细胞密度后分装于冻存管中，在液氮中冻存备用。
复苏P1代huMSC，于15mlα-MEM+10％胎牛血清(FBS)的完全培养基的T75瓶中培养，细胞融合度达80％-90％后，经0.125％胰酶消化传至P2代，待细胞融合度达70％左右，用于转染的慢病毒TGFBI基因序列为：SEQ ID NO:1(正向序列，5’-GCGCTTGAGATCTTCAAACAA-3’)和/或SEQ ID NO:2(反向序列，5’-TTGTTTGAAGATCTCAAGCGC-3’)，转染前进行细胞换液。慢病毒转染的转染体系为：转染病毒滴度为MOI＝10，转染病毒量为1×107/ml，转染时间达24h后进行细胞换液，加入嘌呤霉素2uM浓度进行药物筛选48h。将存活细胞经胰酶消化，进行细胞计数，按规定细胞个数接种至六孔板进行成骨诱导培养，留取5×105个细胞放置1.5ml EP管中，加1ml TRIZOL提取RNA进行转染效果检测。
通过q-PCR检测上述未转染的正常huMSC和进行LV-TGFBI慢病毒转染的TGFBI基因敲低huMSC(TGFBI-/-huMSC)中的TGFBI基因表达情况，图2A所示为与正常huMSC相比，TGFBI基因敲低后的huMSC中TGFBI基因表达明显降低，差异显著；荧光显微镜(Olympus，CKX53)下观察TGFBI基因的转染效率如图2B所示LV-TGFBI慢病毒转染huMSC后出现大量绿色荧光结果；流式细胞仪(BD，FACSCalibur)检测TGFBI基因的转染效率如图2C所示LV-TGFBI慢病毒转染huMSC检测转染效率为86.9％。
实施例2：间充质干细胞成骨分化诱导
1)将实施例1中获得的huMSC和TGFBI-/-huMSC这两种细胞接种至六孔板，分别设为自分化组和诱导组，每组3个复孔；
2)向诱导组加入成骨诱导培养基(90％α-MEM培养基+10％FBS+维生素C+地塞米松+β-磷酸甘油)，自分化组则仅加入完全培养基(90％α-MEM培养基+10％FBS)，每2-3天全量换液，共诱导9天；
3)将培养基弃除后，加入60％丙酮固定1min；
4)PBS清洗1遍，经碱性磷酸酶染色，室温避光30min；
5)PBS清洗1遍，每孔各加入1ml PBS，倒置显微镜下观察染色细胞的数量及分布密度；如图3所示，碱性磷酸酶染色检测huMSC与TGFBI-/-huMSC成骨诱导结果表明，huMSC诱导组出现的红色细胞数量明显少于TGFBI-/-huMSC组。其中图3A为huMSC成骨诱导分化的自分化组(control)；图3B为huMSC成骨诱导分化的诱导组(induced)。图3C为TGFBI-/-huMSC成骨诱导分化的自分化组(control)；图3D为TGFBI-/-huMSC成骨诱导分化的诱导组(induced)。可见，两种MSC自分化组几乎无碱性磷酸酶染色的细胞(图3A、图3C)，而诱导组可见大量的红色细胞(图3B、图3D，图中阴影的部分)。
实施例3：体外成骨诱导分化后，检测正常MSC和TGFBI基因敲低的MSC中成骨分化标志物的表达差异
分别收集自以上实施例2的步骤2)培养的分化组及诱导组的细胞，1000rpm离心10min后，弃去上清，用1ml TRIZOL重悬离心管中的细胞沉淀，转移至1.5ml的EP管中，提取总RNA。进行实时荧光定量PCR(q-PCR)，检测成骨分化的早期标志物碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)和晚期成骨分化基因骨桥蛋白(osteopontin，OPN)的表达差异。具体实验操作步骤如下：
1.总RNA的提取
1)从-80℃冰箱中取出细胞样本，放置于涡旋震荡器中，震荡30min，期间可用移液枪吹散细胞团块，使之充分裂解；
2)室温静置10min后，置于低温离心机中，12000rpm，4℃，10min离心；
3)收集上清到新的EP管中，加入氯仿(按1ml上清加入200μl氯仿的比例)，涡旋震荡，充分混匀，室温静置10min；
4)4℃，低温离心，12000rpm，15min；
5)小心吸取上清500μl，转移到新的EP管中(注意不要吸到白膜层)；
6)每管加入等体积的异丙醇(约500μl)，混匀，室温静置10min；
7)4℃，低温离心，12000rpm，10min；
8)弃上清，在EP管底部可见白色沉淀，每管再加入1ml 75％的乙醇(DEPC水配制，预冷)洗涤沉淀2次，放置冰上，待其自然晾干；
9)15-20min后，每管加入14μl的无RNA酶水溶解RNA，同时再加入1μl RNaseInhibit以防止RNA降解。
2.RNA浓度的测定
1)配制工作液(1μl
Figure BDA0002395634400000084
RNA HS Regent+199μl
Figure BDA0002395634400000085
RNA HS Buffer)，静置2-5min；
2)将RNA原液先稀释50倍后，再取出1μl加入工作液中，稀释200倍，静置2min；
3)选择
Figure BDA0002395634400000083
2.0荧光定量仪中High Sensitivity RNA检测，读取每组样本浓度。
3.RNA逆转录
1)在PCR管内按照以下表1配制逆转录体系A
表1：逆转录体系A
Figure BDA0002395634400000081
2)混匀后，置于PCR仪内70℃处理10min，后立即转到冰上放置2min；
3)离心数秒，使模板RNA+引物发生变性，溶液聚集于PCR管底部；
4)按照以下表2配制逆转录体系B
表2：逆转录体系B
Figure BDA0002395634400000082
5)混匀B体系，加入A体系，离心，放于PCR仪中(程序设置为42℃，60min，70℃，15min)，结束后立即置于冰上冷却；
6)得到cDNA溶液，用于实时荧光定量PCR操作。
4.实时荧光定量PCR(q-PCR)检测成骨分化的标志物ALP和OPN的表达
1)按照以下表3配制体系
表3：q-PCR反应体系
Figure BDA0002395634400000091
2)将GAPDH基因作为对照，把混合体系加入到MicroTM Optical 8-Tube Strip，每组4个复孔，用MicroTM Optical 8-Cap Strip密封反应孔，放入7500real time system系统的机器中，按照以下表4的反应程序进行反应，并且反应所用的引物序列如表5所示。
表4：反应程序
Figure BDA0002395634400000092
表5：引物序列
Figure BDA0002395634400000093
Figure BDA0002395634400000101
图3E和F为q-PCR结果显示TGFBI-/-huMSC成骨诱导后成骨分化标志物ALP和OPN发生显著变化，诱导组显著高于对照组。综合图1-3结果提示分离培养的TGFBI-/-huMSC符合MSCs判定标准。
图4所示为成骨诱导后,TGFβI-/-huMSC的诱导组(induced)的成骨基因ALP和OPN表达显著高于huMSC的诱导组(induced)，提示TGFβI-/-huMSC成骨分化能力增强。
实验表明，TGFBI基因敲低后成骨基因ALP及OPN表达上调，在成骨诱导体系中这种促进效果一直存在。本发明首次证实了TGFBI调控间充质干细胞成骨分化能力。
以上结果表明，本发明可快速建立稳定的TGFBI基因敲低效率，并成功地进行人脐带来源间充质干细胞的成骨诱导分化。本发明方法具有稳定的敲低效率，成骨诱导分化率高，细胞死亡数少，成骨诱导成功后，显示出明显的成骨基因表达差异。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军军事医学科学院
<120> TGFBI作为调控间充质干细胞成骨分化的标志物的应用
<130> P200140
<141> 2020-02-28
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gcgcttgaga tcttcaaaca a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ttgtttgaag atctcaagcg c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tcaagatcat cagcaatgcc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cgataccaaa gttgtcatgg a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
cagaagaagg acaaactggg 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
attgtatgtc ttggacagag c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ccataccagt taaacaggct g 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
tcagggttta gccatgtgg 19
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
cagaaggtta ttggcactaa tagg 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ctgatgactg ttgatttgcc a 21

Claims (10)

1.TGFBI在制备调控间充质干细胞成骨分化的产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述TGFBI基因调节间充质干细胞成骨分化是通过敲低TGFBI基因使得成骨细胞分化成熟的早期标志物ALP和成骨细胞分化成熟的晚期标志物OPN的表达明显上调，从而促进MSC成骨分化能力。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述TGFBI基因是通过TGFBI抑制剂或促进剂影响间充质干细胞的成骨分化能力。
4.TGFBI基因表达抑制剂在制备间充质干细胞成骨诱导分化剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述TGFBI基因表达抑制剂为TGFBI shRNA，其具有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
6.一种调控间充质干细胞成骨分化的制剂，其特征在于，所述制剂以TGFBI抑制剂或者具有TGFBI生物活性的模拟物或类似物为活性成分。
7.权利要求6所述的间充质干细胞成骨分化的制剂通过调节间充质干细胞成骨分化在制备调控与脂肪成骨平衡失调相关疾病的产品中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述脂肪成骨平衡的失调相关疾病包括衰老、肥胖、骨质疏松、骨化病或骨质疏松症。
9.一种促进间充质干细胞成骨分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)从人脐带组织分离获取间充质干细胞，然后进行原代培养和传代培养；
2)利用慢病毒转染技术将合成的TGFBI慢病毒导入传代培养后的间充质干细胞，然后培养。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，慢病毒转染的转染体系为：转染病毒滴度为MOI＝10，转染病毒量为1×107/ml，转染时间为24h。
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