JP7279212B2 - 免疫疾患の治療 - Google Patents

Description

本開示は、高レベルのアンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）を発現する幹細胞ならびにＴＮＦ－α及び／またはＩＬ－６の放出を阻害し、糖尿病などの炎症性疾患を治療する際におけるその使用に関する。

アンジオポエチンは、初期及び出生後の血管新生に関与する脈管増殖因子のファミリーの一部である。Ａｎｇ１は、内皮細胞及び平滑筋細胞などのいくつかの非内皮細胞の遊走を促進する。Ａｎｇ１はまた、尿細管内に内皮細胞の発芽や再編も誘導する。Ａｎｇ１は内皮細胞の強力な抗炎症効果を発揮し、Ｅ－セレクチン、ＩＣＡＭ－１及びＶＣＡＭ－１の上方制御を誘導する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を抑制し、ＶＥＧＦ及びＴＮＦ－αに反応して白血球の接着及び遊出を阻害する（Ｋｉｍら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．，８９（６），４７７－４７９，２００１）。

Ｉ型糖尿病患者の大部分に対する現在の治療法は、速効型と持続型のインスリン製剤の混合物の定期的な皮下注射に基づいている。より持続性のある作用プロファイルを有する中間型及び持続型成分を与える、サイズの異なる可溶性インスリン粒子の懸濁液を投与してホルモンの一定の基礎レベルを達成する（Ｈｅｉｎｅら、Ｂｒ Ｍｅｄ Ｊ（Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｅｄ）２９０：２０４－２０５，１９８５）。

この現在の治療法の欠点は、徐放性製剤が一般に滑らかなインスリンのバックグラウンドレベルを生じないことであり、結果として高血糖症または低血糖症のいずれかになる。高血糖は、糖尿病患者にて、更なる合併症につながり得るという点で問題である。たとえば、慢性高血糖は、重度の微小血管性（網膜症及び腎症）、大血管性（脳卒中、心筋梗塞）及び神経性合併症につながる。これらの激しい合併症は、血糖レベルの標準化によって防ぐことができる。

近年、糖尿病を治療できる可能性のあるアプローチとして、幹細胞に基づく技術が現れた。しかしながら、生涯にわたる免疫制御を要し得る、根本的な自己免疫疾患に関する問題に加えて、これらの技術は、実行可能な治療選択肢としていまだ明らかにされていない。

したがって、新しい治療選択肢を要する糖尿病及び／またはその関連状態もしくは症状を患う患者において、治療上の必要性は満たされていないままである。
本出願中のあらゆる文献の引用または特定は、当該文献が本開示の先行技術として利用可能であることを自認するものではない。

Ｋｉｍら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．，８９（６），４７７－４７９，２００１ Ｈｅｉｎｅら、Ｂｒ Ｍｅｄ Ｊ（Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｅｄ）２９０：２０４－２０５，１９８５

本発明者らは、Ａｎｇ１を高レベルで発現する遺伝的に変更されていない幹細胞を用いて、Ａｎｇ１を発現する核酸で細胞をトランスフェクションする必要なく、ヒト対象にて抗炎症性細胞の産生を増加させることができることを見出した。

また、本発明者らは、ヒト対象にて、ＴＮＦ－アルファレベルの減少、ＩＬ－６レベルの減少及び／またはＩＬ－１０レベルの増加が可能であることも見出した。これらの所見は、こうした高レベルのＡｎｇ１を発現する遺伝的に変更されていない幹細胞が、糖尿病ならびにその関連状態及び症状などの炎症性疾患を治療するのに適し得ることを示唆している。

事実、本発明者らは、Ａｎｇ１を高レベルで発現する遺伝的に変更されていない幹細胞を用いて、Ａｎｇ１を発現する核酸で細胞をトランスフェクションする必要なく、糖尿病を患うヒト対象にてＨｂＡ１ｃの減少、空腹時インスリンレベルの減少及び／またはアディポネクチンレベルの増加が可能であることを見出した。

他の実施例にて、本発明者らはまた、Ａｎｇ１を高レベルで発現する遺伝的に変更されていない幹細胞を用いて、Ａｎｇ１を発現する核酸で細胞をトランスフェクションする必要なく、ヒト対象にて関節リウマチ及び糖尿病性腎症の症状を改善することができることも示した。

したがって、１つの実施例では、本開示は、必要とする対象において、抗炎症性細胞の産生及び／または機能を増加させる方法を提供し、この方法は、遺伝的に変更されていない幹細胞を含む組成物を対象に投与することを含み、当該遺伝的に変更されていない幹細胞は、少なくとも０．１μｇ／１０^６細胞の量でアンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）を発現する。

１つの実施例では、抗炎症性細胞は、Ｔｈ２細胞、ＴＲｅｇ細胞またはＭ２型マクロファージである。

別の実施例では、方法は、対象において、Ｍ２型マクロファージの数を増加させる。

別の実施例では、方法は、対象において、Ｍ２型マクロファージの数を総単核細胞集団の少なくとも１０％まで増加させる。

別の実施例では、方法は、対象において、Ｍ２型マクロファージの数を総単核細胞集団の少なくとも２０％まで増加させる。

別の実施例では、方法は、対象において、Ｍ２型マクロファージの数を総単核細胞集団の少なくとも４０％まで増加させる。

別の実施例では、方法は、対象において、Ｍ２型マクロファージの数を総単核細胞集団の少なくとも８０％まで増加させる。

別の実施例では、方法は、対象において、Ｍ２型マクロファージの数を総単核細胞集団の少なくとも９０％まで増加させる。

別の実施例では、Ｍ２型マクロファージは、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋である。

別の実施例では、Ｍ２型マクロファージは、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋ＣＤ１６３＋である。

別の実施例では、Ｍ２型マクロファージは、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋ＣＤ２０６＋である。

別の実施例では、Ｍ２型マクロファージは、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋ＣＤ１６３＋ＣＤ２０６＋である。

別の実施例では、Ｍ２型マクロファージは、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋である。

別の実施例では、Ｍ２型マクロファージは、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋ＣＤ１６３＋である。

別の実施例では、Ｍ２型マクロファージは、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋ＣＤ２０６＋である。

別の実施例では、Ｍ２型マクロファージは、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋ＣＤ１６３＋ＣＤ２０６＋である。

別の実施例では、方法は、Ｍ１からＭ２表現型へのマクロファージの分極を促進する。

別の実施例では、方法は、炎症誘発性ヘルパーＴ細胞のＴｈ２細胞またはＴＲｅｇ細胞への分化を促進する。

１つの実施例では、炎症誘発性ヘルパーＴ細胞は、Ｔｈ１７細胞である。

一実施例では、対象における抗炎症性細胞の産生及び／または機能の増加が、
・対象おけるＩＬ－６レベルの減少；
・対象におけるＴＮＦ－アルファレベルの減少；及び／または
・対象おけるＩＬ－１０レベルの増加をもたらす。

一実施例では、方法は、対象において、抗炎症性サイトカインのレベルを増加させる。

一実施例では、方法は、対象において、ＩＬ－１０のレベルを増加させる。

一実施例では、方法は、対象において、炎症誘発性サイトカインのレベルを減少させる。

一実施例では、方法は、対象において、ＩＬ－６、ＴＮＦ－アルファ及び／またはＩＬ－１７のうちのいずれか１つのレベルを減少させる。

一実施例では、方法はまた、炎症誘発性細胞の産生及び／または機能を阻害する。

一実施例では、炎症誘発性細胞は、Ｔｈ１７細胞またはＭ１型マクロファージである。

別の実施例では、本開示は、Ｍ１型マクロファージ分極を阻害する方法を提供する。

別の実施例では、本開示は、Ｍ１からＭ２表現型へのマクロファージの分極を促進する方法を提供する。

別の実施例では、本開示は、Ｍ１型マクロファージに由来するサイトカイン放出を阻害する方法を提供する。

別の実施例では、本開示は、阻害されるＭ１型マクロファージ由来サイトカインがＴＮＦ－アルファ及び／またはＩＬ－６である方法を提供する。

別の実施例では、本開示は、炎症性疾患を治療する方法を提供し、この方法は、遺伝的に変更されていない幹細胞を含む組成物を対象に投与することを含み、当該遺伝的に変更されていない幹細胞は、少なくとも０．１μｇ／１０^６細胞の量でアンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）を発現する。

別の実施例では、炎症性疾患は、糖尿病であるか、または異常な創傷治癒、心臓発作の症状、脳卒中の症状、末梢血管疾患の症状、切断、腎臓疾患の症状、腎不全、失明、神経障害、腎症、網膜症、炎症、性交不能症もしくは非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）からなる群から選択される糖尿病に関連する状態もしくは症状である。

たとえば、本開示は、関節リウマチを治療する方法を提供する。

たとえば、本開示は、糖尿病性網膜症を治療する方法を提供する。

別の実施例では、本開示の方法は、遺伝的に変更されていない幹細胞を含む組成物を対象に投与することを含み、当該遺伝的に変更されていない幹細胞は、少なくとも０．１μｇ／１０^６細胞の量でアンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）を発現する。別の実施例では、幹細胞は、少なくとも０．５μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現する。別の実施例では、幹細胞は、少なくとも０．７μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現する。別の実施例では、幹細胞は、少なくとも１μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現する。

別の実施例では、幹細胞は、約０．１μｇ／１０^６細胞未満の量でＶＥＧＦを発現する。別の実施例では、幹細胞は、約０．０５μｇ／１０^６細胞未満の量でＶＥＧＦを発現する。別の実施例では、幹細胞は、約０．０４μｇ／１０^６細胞未満の量でＶＥＧＦを発現する。別の実施例では、幹細胞は、約０．０３μｇ／１０^６細胞未満の量でＶＥＧＦを発現する。別の実施例では、幹細胞は、約０．０２μｇ／１０^６細胞未満の量でＶＥＧＦを発現する。別の実施例では、幹細胞は、約０．０１μｇ／１０^６細胞未満の量でＶＥＧＦを発現する。

別の実施例では、幹細胞は、少なくとも約２：１の比率でＡｎｇ１：ＶＥＧＦを発現する。別の実施例では、幹細胞は、少なくとも約１０：１の比率でＡｎｇ１：ＶＥＧＦを発現する。別の実施例では、幹細胞は、少なくとも約２０：１の比率でＡｎｇ１：ＶＥＧＦを発現する。別の実施例では、幹細胞は、少なくとも約３０：１の比率でＡｎｇ１：ＶＥＧＦを発現する。別の実施例では、幹細胞は、少なくとも約５０：１の比率でＡｎｇ１：ＶＥＧＦを発現する。

別の実施例では、幹細胞は、間葉系幹細胞である。別の実施例では、幹細胞は、間葉系前駆細胞である。別の実施例では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である。

別の実施例では、組成物は、許容される医薬担体をさらに含む。

別の実施例では、組成物は、以下に記載されるインビトロ法に従って、遺伝的に変更されていない幹細胞を培養することによって製造される。

一実施例では、幹細胞は、任意の哺乳動物から得ることができる。たとえば、幹細胞は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、またはヤギに由来しても良い。別の実施例では、幹細胞はヒト幹細胞である。

別の実施例では、炎症性疾患はＩＩ型糖尿病である。

１つの実施例では、ＩＩ型糖尿病を治療する方法は、１ｋｇあたり約０．１×１０^６個～約３×１０^６個の幹細胞を対象に投与することを含み得る。

１つの実施例では、ＩＩ型糖尿病を治療する方法は、１ｋｇあたり約０．３×１０^６個～約２×１０^６個の幹細胞を対象に投与することを含み得る。

１つの実施例では、ＩＩ型糖尿病を治療する方法は、１ｋｇあたり約１×１０^６個～約２×１０^６個の幹細胞を対象に投与することを含み得る。

１つの実施例では、ＩＩ型糖尿病を治療する方法は、１ｋｇあたり約２×１０^６個の幹細胞を対象に投与することを含み得る。

１つの実施例では、糖尿病または糖尿病に関連する状態もしくは症状が対象にて治療されたことが次のうちのいずれか１つにより示される。
・ＨｂＡ１ｃ値（総ヘモグロビンのパーセンテージ）の減少；
・空腹時インスリンレベルの減少；
・ＩＬ－６レベルの減少；
・ＴＮＦ－αレベルの減少；及び／または
・アディポネクチンレベルの増加

１つの実施例では、対象は、ＩＩ型糖尿病を患っており、対象のブドウ糖レベルが十分にコントロールされていない。

１つの実施例では、対象のブドウ糖レベルが、メトホルミンにより十分にコントロールされていない。

１つの実施例では、対象は、７．５％を超えるベースラインのＨｂＡ１ｃ値を有する。

１つの実施例では、対象は、８％以上のベースラインのＨｂＡ１ｃ値を有する。

１つの実施例では、炎症性疾患は関節リウマチである。

１つの実施例では、関節リウマチを治療する方法は、１ｋｇあたり約０．５×１０^６個～約３．０×１０^６個の幹細胞を対象に投与することを含み得る。

１つの実施例では、関節リウマチを治療する方法は、１ｋｇあたり約１．０×１０^６個～約２．０×１０^６個の幹細胞を対象に投与することを含み得る。

１つの実施例では、関節リウマチが治療されたことが、次のうちのいずれか１つにより示される。
・ＡＣＲ２０；
・ＡＣＲ５０
・ＡＣＲ７０
・ＩＬ－６レベルの減少；及び／または
・疾患活動性スコアの減少

別の実施例では、炎症性疾患は糖尿病性神経障害である。

１つの実施例では、関節リウマチを治療する方法は、約１．０×１０^８個～約４．０×１０^８個の幹細胞を対象に投与することを含み得る。

１つの実施例では、関節リウマチを治療する方法は、約１．５×１０^８個～約３．０×１０^８個の幹細胞を対象に投与することを含み得る。

１つの実施例では、糖尿病性腎症が治療されたことが、次のうちのいずれか１つにより示される。
・ｅＧＦＲ及び／もしくはｍＧＦＲの減少の阻害；
・ｅＧＦＲ及び／もしくはｍＧＦＲの改善；ならびに／または
・ＩＬ－６レベルの減少

１つの実施例では、対象のベースラインのｅＧＦＲは、約３５ｍｌ／分／１．７３ｍ^２よりも大きい。

１つの実施例では、対象のベースラインのｅＧＦＲは、３０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２よりも大きい。

１つの実施例では、対象のベースラインのｅＧＦＲは、２８ｍｌ／分／１．７３ｍ^２よりも大きい。

１つの実施例では、対象のベースラインのｅＧＦＲは、２５ｍｌ／分／１．７３ｍ^２よりも大きい。

１つの実施例では、幹細胞は全身投与される。

１つの実施例では、幹細胞は静脈投与される。

別の実施例では、本開示は、炎症性疾患を治療するための薬剤の製造における、遺伝的に変更されていない幹細胞を含む組成物の使用に関し、当該遺伝的に変更されていない幹細胞は、高レベルのアンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）を発現する。

別の実施例では、本開示は、炎症性疾患の治療にて使用するための遺伝的に変更されていない幹細胞を含む組成物に関し、当該遺伝的に変更されていない幹細胞は、高レベルのアンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）を発現する。

別の実施例では、本開示は、遺伝的に変更されていない幹細胞を含む組成物に関し、当該遺伝的に変更されていない幹細胞は、炎症性疾患を治療するために使用すると、高レベルのアンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）を発現する。

現在培養培地（プロセスＡ）及び再配合培養培地（プロセスＢ）でのＭＰＣ増殖。Ｙ軸は細胞数を示し、Ｘ軸は日単位の時間である。対照培地はプロセスＡで用いた培養培地であり、再配合培地はプロセスＢで用いた培養培地である。 現在培地（プロセスＡ）及び再配合培地（プロセスＢ）でのＭＰＣ倍加時間。ＭＰＣを現在アルファＭＥＭ培養（プロセスＡ）または改変アルファＭＥＭの再配合培養（プロセスＢ）にて増殖させた。細胞は、Ｐ３からＰ５まで継代させた。 ＭＰＣの集団倍加時間（ＰＤＬ）。現在アルファＭＥＭ培養培地（プロセスＡ）と再配合アルファＭＥＭ（プロセスＢ）中で、ＭＰＣをＰ３からＰ５まで増殖させた。現在培地（プロセスＡ）で増殖させたＭＰＣは８ＰＤＬとなり、再配合培養培地（プロセスＢ）で増殖させたＭＰＣは７．３３ＰＤＬになった。 免疫選択したＣＤ１４＋単核細胞とＭＰＣとの共培養により、Ｍ２マクロファージの表現型特性を示すＣＤ１４＋１６＋マクロファージが生じる。 ＭＰＣとの共培養は、マクロファージによるＴＮＦαの炎症誘発性（ＬＰＳ）分泌を阻止する。 ＬＰＳ存在下におけるＭＰＣとの共培養によって、マクロファージによる抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の産生が向上した。 ＭＰＣは、マクロファージ分極を制御する役割を果たす。 ＰＧＥ２の分泌：ＩＬ－１βとＴＮＦαの相加作用。 ＭＰＣ投与後の炎症誘発性及び抗炎症性サイトカインのレベルの変化。 後期疾患（４２日）の確立時におけるＭＰＣ投与は、関節の炎症性サイトカインのレベル減少をもたらす。 後期疾患（４２日）の確立時におけるＭＰＣ投与は、関節の炎症性サイトカインのレベル減少をもたらす。 後期疾患（４２日）の確立時におけるＭＰＣ投与は、関節の炎症性サイトカインのレベル減少をもたらす。 コホート１～３に関するＭＰＣ用量。 １２週時のアディポネクチンレベル（ベースラインからの変化）。 １２週時のＴＮＦ－アルファレベル（ベースラインからの変化）。 １２週時のＩＬ－６レベル（ベースラインからの変化）。 ベースラインＨｂＡ１ｃのサブグループ＜８％または≧８％別のＨｂＡ１ｃ変化 ベースラインＨｂＡ１ｃのサブグループ＜８％または≧８％別のＨｂＡ１ｃ変化 １２週時に目標ＨｂＡ１ｃ（＜７．０％）に達した被験者 ＩＬ－６中央値の経時変化 ＩＬ－６中央値の経時変化 生物学的製剤不応性ＲＡのＡＣＲ２０応答：１ＭＭＰＣ／ｋｇ 生物学的製剤不応性ＲＡのＡＣＲ５０応答：１ＭＭＰＣ／ｋｇ 生物学的製剤不応性ＲＡのＡＣＲ７０応答：１ＭＭＰＣ／ｋｇ 構成要素別のＡＣＲの経時応答；週ごとの圧痛関節（ＴＪＣ；左）及び腫脹関節（ＳＪＣ；右）の数 構成要素別のＡＣＲの経時応答；週ごとの疾病活動性の主観的包括的評価（ＳＧＡＤＡ）（左）；週ごとの疾病活動性の医師による包括的評価（ＩＧＡＤＡ）（右） １２週時におけるＤＡＳＣＲＰレスポンダー分析 健康評価質問票の障害指数（ＨＡＱ－ＤＩ）：ＭＣＩＤ到達率（－０．２２） １２週のｍＧＦＲ［^９９Ｔｃ ＤＴＰＡ］及びｅＧＦＲ［ＭＤＲＤのベースラインからの変化（ｍｌ／分／１．７３ｍ^２） １２週時におけるＩＬ－６中央値のベースラインからの変化 ＭＰＣ治療患者における１２週時の血清クレアチニン改善との相関を示したベースラインＩＬ－６ １２週時におけるｍＧＦＲ及びｅＧＦＲのベースラインからの変化（ベースラインｅＧＦＲ＞３０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２を有する被験者）

一般的技術及び定義
本明細書を通じて、特に明記がないまたは文脈上必要とされない限り、単一の工程への参照、物質の組成物、工程の群または物質の組成物の群は、これらの工程、物質の組成物、工程の群または物質の組成物の群の複数（すなわち１つまたは複数）を包含すると解釈すべきである。

当業者は、本明細書に記載の開示が、特に記載した以外の変形及び修正に影響されやすいことを理解するであろう。本開示がそのようなすべての変形及び修正を含むことを理解すべきである。本開示は、本明細書に個々または集合的に参照または示された、工程、特徴、組成物及び化合物のすべて、及び任意の組み合わせ及びすべての組み合わせまたは任意の２つ以上の前記工程または特徴も含む。

本開示は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではなく、例示の目的だけが意図される。機能的に等価な生産物、組成物及び方法は、明らかに、本明細書に記載される本開示の範囲内である。

特に記載のない限り、本明細書に開示される、いかなる実施例も、他のいかなる実施例に準用するものと解釈すべきである。

特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、（たとえば、細胞培養、分子遺伝学、幹細胞分化、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学及び生化学の）当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものと解釈すべきである。

特に記載のない限り、本開示で利用される幹細胞、細胞培養、及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的な手順である。このような技術は、Ｊ． Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ（１９８４）、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）、Ｔ．Ａ． Ｂｒｏｗｎ（編）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１巻及び２巻、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ及びＢ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ（編）、及びＦ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ及びＷｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、 ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｌｌ ｕｐｄａｔｅｓ ｕｎｔｉｌ ｐｒｅｓｅｎｔ）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８８）、及びＪ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在に至るまで、すべての更新を含む）などの出典の文献を通じて記載及び説明される。

用語「ａｎｄ／ｏｒ」は、たとえば、「Ｘ ａｎｄ／ｏｒ Ｙ」は「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解され、両方の意味またはいずれかの意味を明示的にサポートするものと解釈すべきである。

本明細書で使用するとき、「約」という用語は、反対の記載がない限り、指定された値の＋／－１０％、より好ましくは＋／－５％を意味する。

体積％（ｖ／ｖ％）の定義は、［（溶質の体積）／（溶液の体積）］×１００％である。体積％は、溶液の体積に比例する。たとえば、細胞培養培地を、５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳで補充するとは、細胞培養培地の１００ｍｌごとに約５ｍｌ ＦＣＳがあることを意味する。

本明細書を通じて、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、既定された要素、整数または工程、または要素群、整数群または工程群を包含するが、いかなる他の要素、整数または工程、または要素群、整数群または工程群をも排除することを意味するものではないことを理解されるだろう。

幹細胞
本明細書で使用するとき、「幹細胞」の用語は、表現型的及び遺伝子型的に同一の娘及び少なくとも１つの他の最終的な細胞種（たとえば、最終的に分化した細胞）を生じさせ得る自己再生細胞を意味する。「幹細胞」の用語は、全能性、多能性及び多分化能の細胞ならびにそれらの分化由来の前駆細胞及び／または前駆体を含む。幹細胞は、成体または胚性幹細胞であっても良い。

本明細書で使用するとき、「全能性細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）」または「全能性細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ）」の用語は、完全な胚（たとえば、胞胚）を形成可能な細胞を意味する。

本明細書で使用するとき、「多能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）」または「多能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ）」の用語は、完全に分化した万能性、すなわち、哺乳類の身体のおおよそ２６０の細胞種のいずれかに成長する能力を有する細胞を意味する。多能性細胞は、自己再生することができ、組織内で休止または静止したままであることができる。

「多分化能細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ）」または「多分化能細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）」は、複数の成熟細胞種を生じ得る細胞を意味する。本明細書で使用するとき、この表現は、成体性前駆細胞及びこれらの細胞の多分化能子孫を包含する。多能性細胞と異なり、多分化能細胞は、細胞種のすべてを形成する能力を有していない。

本明細書で使用するとき、「間葉系統前駆または幹細胞」の用語は、間葉系細胞種に分化することができる細胞を意味する。たとえば、間葉系統前駆細胞及び間葉前駆細胞は、骨組織、軟骨組織、筋肉組織及び脂肪細胞、及び線維性結合組織に分化することができる。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ＳＴＲＯ－１＋間葉系前駆細胞である。

ＳＴＲＯ－１＋多分化細胞は、骨髄、血液、歯髄、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靱帯、腱、骨格筋、真皮、及び骨膜に見られる細胞である。したがって、ＳＴＲＯ－１＋多分化細胞は、これらに限定されないが、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織及び繊維性結合組織を含む多数の細胞種に分化することができる。特定の分化系列決定及びこれらの細胞が入る分化経路は、機械的影響及び／または内在的生体活性因子、たとえば、増殖因子、サイトカイン及び／または宿主組織により確立された局所微小環境条件からの種々の影響により決まる。一実施形態では、ＳＴＲＯ－１＋多分化細胞は、表現型細胞を生じさせるのに不可逆的に分化するであろうタイミングで、幹細胞または前駆細胞のいずれかである娘細胞を生じさせるのに分割される非造血前駆細胞である。

１つの実施例では、ＳＴＲＯ－１＋細胞は、対象、たとえば、処置する対象または関連する対象または無関係の対象（同じ種または異なる種かどうかを問わない）から取得された試料から濃縮される。「濃縮される（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」、「濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」の用語またはそれらの変形例は、本明細書において、細胞（たとえば、自身の生来の環境にある細胞）の未処置の集合と比較して、１つの特定の細胞種の比率または数多くの特定の細胞種の比率が増加する細胞集合を説明するのに使用される。１つの実施例では、ＳＴＲＯ－１＋細胞の濃縮された集団は、少なくとも約０．１％または０．５％または１％または２％または５％または１０％または１５％または２０％または２５％または３０％または５０％または７５％または８５％または９５％または９９％のＳＴＲＯ－１＋細胞を含む。これに関連して、「ＳＴＲＯ－１＋細胞の濃縮された集団」の用語は、「Ｘ％のＳＴＲＯ－１＋細胞を含む細胞の集団」（ここで、Ｘ％は本明細書で記載される百分率である）の用語を明示的にサポートするものと解釈されるだろう。ＳＴＲＯ－１＋細胞は、いくつかの例では、クローン原性コロニー、たとえば、ＣＦＵ－Ｆ（線維芽細胞）を形成することができ、またはそれらのサブセット（たとえば、５０％または６０％または７０％または８０％または９０％または９５％）はこの活性を有することができる。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、選択可能な形式でＳＴＲＯ－１＋細胞を含む細胞標品から濃縮される。これに関連して、「選択可能な形式」の用語は、細胞がＳＴＲＯ－１＋細胞の選択を可能にするマーカー（たとえば、細胞表面マーカー）を発現することを意味すると理解されるであろう。マーカーは、ＳＴＲＯ－１とすることができるが、する必要はない。たとえば、本明細書に記載及び／または例示されるように、ＳＴＲＯ－２及び／またはＳＴＲＯ－３（ＴＮＡＰ）及び／またはＳＴＲＯ－４及び／またはＶＣＡＭ－１及び／またはＣＤ１４６及び／または３Ｇ５を発現する細胞（たとえば、ＭＰＣ）は、ＳＴＲＯ－１も発現する（及びＳＴＲＯ－１^{ｂｒｉｇｈｔ}でも良い）。したがって、細胞がＳＴＲＯ－１＋であることを示すことは、細胞がＳＴＲＯ－１の発現により選択されていることを意味するものではない。１つの実施例では、細胞は、少なくともＳＴＲＯ－３の発現に基づいて選択される。たとえば、ＳＴＲＯ－３＋（ＴＮＡＰ＋）などである。１つの実施例では、細胞は、少なくともＳＴＲＯ－４の発現に基づいて選択される。たとえば、ＳＴＲＯ－４＋などである。

細胞またはその集合の選択の参照は、特定の組織源からの選択を必ずしも必要とはしない。本明細書に記載するようにＳＴＲＯ－１＋細胞は、多種多様なソースから選択するか、単離するか濃縮することができる。それによると、いくつかの例では、これらの用語は、ＳＴＲＯ－１＋細胞（たとえば、ＭＰＣ）を含む組織、または血管化した組織、または周皮細胞（たとえば、ＳＴＲＯ－１＋周皮細胞）を含む組織のいずれかから、または本明細書に記載される任意の１つ以上の組織から選択するためのサポートを提供する。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ＳＴＲＯ－１＋、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ－１＋、ＴＨＹ－１＋、ＳＴＲＯ－２＋、ＳＴＲＯ－４＋（ＨＳＰ－９０β）、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋、３Ｇ５＋、ＣＣ９またはそれらの任意の組み合わせから構成される群から個々にまたは集合的に選択される１つまたは複数のマーカーを発現する。

「個々に（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｌｙ）」とは、本開示が、列挙されたマーカーまたはマーカー群を個別に包含すること、及び個々のマーカーまたはマーカー群が本明細書に個別に列挙されていなくても良いにもかかわらず、添付の特許請求の範囲が、かかるマーカーまたはマーカー群を互いに個別かつ可分的に定義して良いことを意味する。

「集合的に（ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）」とは、本開示が、列挙されたマーカーまたはペプチド群の任意の数または組み合わせを包含すること、及びかかるマーカーまたはマーカー群の数または組み合わせが本明細書に具体的に列挙されていなくても良いにもかかわらず、添付の特許請求の範囲が、かかる組み合わせまたは部分的組み合わせ（ｓｕｂ－ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ）を、マーカーまたはマーカー群の任意の他の組み合わせから個別かつ可分的に定義して良いことを意味する。

１つの実施例では、ＳＴＲＯ－１＋細胞は、ＳＴＲＯ－１^{ｂｒｉｇｈｔ}（ｓｙｎ．ＳＴＲＯ－１^ｂｒｉ）である。１つの実施例では、ＳＴＲＯ－１^ｂｒｉ細胞は、ＳＴＲＯ－１^ｄｉｍまたはＳＴＲＯ－１^{ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ}細胞と比較して優先的に濃縮されている。

１つの実施例では、ＳＴＲＯ－１^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞は、さらに１つまたは複数のＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ－１＋、ＴＨＹ－１＋、ＳＴＲＯ－２＋、ＳＴＲＯ－４＋（ＨＳＰ－９０β）及び／またはＣＤ１４６＋である。たとえば、細胞は、前述のマーカーの１つまたは複数のために選択され、及び／またはこれらのマーカーの１つまたは複数の発現を示す。これに関して、マーカーを発現することが示された細胞は、特にテストする必要はなく、逆に、以前に濃縮または単離された細胞を試験し、その後、使用することができる。また、単離または濃縮された細胞は、合理的に、同じマーカーを発現すると仮定することもできる。

１つの実施例では、ＳＴＲＯ－１^{ｂｒｉｇｈｔ}は、免疫選択により単離される。１つの実施例では、ＳＴＲＯ－１^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞は、ＴＮＡＰを発現する細胞の免疫的選択によって単離される。本明細書で使用する用語「ＴＮＡＰ」は、組織非特異的アルカリホスファターゼのすべてのアイソフォームを包含することを意図する。たとえば、この用語は、肝臓アイソフォーム（ＬＡＰ）、骨アイソフォーム（ＢＡＰ）及び腎臓アイソフォーム（ＫＡＰ）を包含する。１つの実施例では、ＴＮＡＰはＢＡＰである。１つの実施例では、本明細書中で使用されるＴＮＡＰは、２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託された、ブダペスト条約の条項に基づいた寄託アクセッション番号ＰＴＡ－７２８２に基づく、ハイブリドーマ細胞系統により産生されるＳＴＲＯ－３抗体と結合し得る分子を意味する。

１つの実施例では、間葉系前駆細胞または幹細胞は、ＣＤ２９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０２＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６＋、ＣＤ１６６＋、ＭＨＣ１＋間葉系幹細胞（たとえば、ｒｅｍｅｓｔｅｍｃｅｌ－Ｌ）である。

１つの実施例では、間葉系前駆細胞は、ＷＯ２００４／８５６３０で定義される血管周囲間葉系前駆細胞である。たとえば、間葉系前駆細胞は、血管周囲細胞のマーカーを発現する細胞である。たとえば、ＳＴＲＯ－１＋またはＳＴＲＯ－１^{ｂｒｉｇｈｔ}及び／または３Ｇ５＋などである。１つの実施例では、細胞は、あるか以前にあったか、血管組織またはそれらの器官または部分から単離された細胞の子孫である。

所定のマーカーについて「陽性」である細胞を意味する場合、そのマーカーが細胞表面上に存在する度合いに応じて、そのマーカーの低い（ｌｏもしくはｄｉｍ）または高い（ｂｒｉｇｈｔ、ｂｒｉ）レベルのいずれかであり得、その用語は、細胞の選別プロセスに使用される蛍光強度またはその他のマーカーに関する。ｌｏ（またはｄｉｍもしくはｄｕｌｌ）及びｂｒｉの区別は、選別される特定の細胞集合に使用されるマーカーの関連において理解されるであろう。所定のマーカーについて「陰性」である細胞を意味する場合、マーカーがその細胞によって全く発現していないことを意味するわけではない。この用語は、マーカーがその細胞によって相対的に非常に低いレベルで発現されること、及び検出可能に標識された場合、非常に低い信号を生成すること、またはバックグラウンドレベルを超えて検出されないことを意味する。たとえば、レベルは、アイソタイプ対照抗体を用いて検出する。

本明細書で使用する用語「ｂｒｉｇｈｔ」は、検出可能に標識された場合の比較的高い信号を生成する細胞表面上のマーカーを意味する。理論によって限定されることは望まないが、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞は、試料中の他の細胞よりも標的マーカー タンパク質（たとえば、ＳＴＲＯ－１によって認識される抗原）を多く発現することが提案される。たとえば、ＳＴＲＯ－１^ｂｒｉ細胞は、非ｂｒｉｇｈｔ細胞（ＳＴＲＯ－１^{ｄｕｌｌ／ｄｉｍ}）より、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析によって測定されるようなＦＩＴＣコンジュゲートＳＴＲＯ－１抗体で標識されている場合、より大きな蛍光シグナルを生じる。１つの実施例では、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞は、出発試料に含まれる最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも約０．１％を構成する。他の実施例では、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞は、出発試料に含まれる最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、または少なくとも約２％を構成する。１つの実施例では、ＳＴＲＯ－１^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞は、「バックグラウンド」、すなわち、ＳＴＲＯ－１－である細胞と比較して、ＳＴＲＯ－１表面発現が２ログマグニチュード（２ｌｏｇ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）高い発現を有する。比較した場合、ＳＴＲＯ－１^ｄｉｍ及び／またはＳＴＲＯ－１^{ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ}細胞は、ＳＴＲＯ－１表面発現が２ログマグニチュード未満の発現を有し、典型的には約１ログ未満または「バックグラウンド」未満である。

１つの実施例では、ＳＴＲＯ－１＋多分化細胞のかなりの割合が、少なくとも２つの異なる生殖細胞系に分化することができる。多分化細胞が決定され得る系列の非限定的な例として、骨前駆細胞；胆管上皮細胞及び肝細胞に対して多能性である肝細胞前駆細胞；乏突起膠細胞及び星状膠細胞へと進行するグリア細胞前駆細胞を生じることができる神経限定細胞；ニューロンへと進行する神経前駆細胞；心筋及び心筋細胞の前駆細胞、グルコース応答性インスリン分泌膵β細胞株が挙げられる。他の系列として、象牙芽細胞、象牙質産生細胞及び軟骨細胞、ならびに以下の前駆細胞：網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトなどの皮膚細胞、樹状細胞、毛包細胞、腎管上皮細胞、平滑筋細胞及び骨格筋細胞、精巣前駆細胞、血管内皮細胞、腱、靱帯、軟骨、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄基質、心筋、平滑筋、骨格筋、周皮細胞、血管細胞、上皮細胞、グリア細胞、神経細胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施例では、ＳＴＲＯ－１＋細胞は、培養に際して、造血細胞を生じさせることができない。

１つの実施例では、本明細書に記載の幹細胞は、間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、均一な組成物であっても良いし、ＭＳＣが濃縮された混合細胞集団であっても良い。均一な間葉系幹細胞組成物は、接着性の骨髄または骨膜細胞を培養することによって得られても良いし、間葉系幹細胞は、固有のモノクローナル抗体を用いて同定される特定の細胞表面マーカーによって同定しても良い。間葉系幹細胞中で濃縮された細胞集団を得るための方法は、たとえば、米国特許第５，４８６，３５９号に記載されている。間葉系幹細胞の代替供給源としては、血液、皮膚、臍帯血、筋肉、脂肪、骨、及び軟骨膜が含まれるが、これに限定されるものではない。

上述の細胞表面マーカーを運んでいる幹細胞の認識、選択及び精製は、多数の異なる方法によって達成することができる。たとえば、関係するマーカーに結合剤を適用し、それに続いて、高レベル結合、または低レベル結合、または結合なしのいずれかの結合を示すこれらの細胞を分離する。

たとえば、結合剤は、モノクローナル抗体または抗体ベースの分子のような抗体を含むことができる。

抗体及びその他の結合分子は、特定の細胞表面マーカーを発現する幹細胞を選択し、精製するために様々な技術に用いることができる。

選択及び精製のための技術は、抗体コーティング磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティー クロマトグラフィー、及び固体マトリックスに結合した抗体での「パニング」、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含んでも良いが、これらに限定されない。

特定のマーカーを発現する、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、陽性免疫選択を介して、細胞集団から選択または精製されても良い。たとえば、間葉系前駆細胞は、ＳＴＲＯ－１抗体の細胞表面発現に基づいて細胞集団から単離及び濃縮することができる（たとえば、Ｇｒｏｎｔｈｏｓ及びＳｉｍｍｏｎｓ１９９５を参照）。

本開示によれば、単離された幹細胞を培養することによりインビトロで拡大することができる。当業者によって理解されるように、幹細胞は、凍結保存し解凍し、続いて培養することによりインビトロで拡大することができる。１つの実施例では、幹細胞は、増殖培地中に播種し、３７℃、２０％Ｏ_２で一晩培養容器に付着させる。その後、増殖培地を交換し、３７℃、５％Ｏ_２でさらに６８～７２時間、細胞を培養する。

一実施例では、単離された幹細胞は、血清を補充した増殖培地中に５０，０００細胞／ｃｍ^２で播種し、３７℃、２０％Ｏ_２で一晩培養容器に付着させる。その後、増殖培地を、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した軟骨基礎培地（ＣＢＭ；Ｌｏｎｚａ社、メリーランド州ウォーカーズビル）と交換し、３７℃、５％Ｏ_２でさらに６８～７２時間、細胞を培養する。

主要な幹細胞培養の様々なその他の方法は、当該分野で周知である。たとえば、主要な幹細胞培養は、Ｇｒｏｎｔｈｏｓ及びＳｉｍｍｏｎｓ １９９５に記載された方法を用いて行うことができる。

培養された幹細胞は、インビボでの細胞と表現型的に異なる。たとえば、これらは、ＣＤ４４を発現することができる。

一実施形態では、培養幹細胞は、インビボでの細胞と生物学的に異なり、より速い再生速度を有する。

培養幹細胞は、対象への投与前に凍結保存されても良い。たとえば、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、対象への投与前に凍結保存される。

遺伝的に変更されていない細胞
本明細書で使用される場合、「遺伝的に変更されていない」という用語は、Ａｎｇ１を発現またはコード化する核酸でトランスフェクションすることにより変更されていない細胞を指す。誤解を避けるために言及すると、本開示の文脈でのＡｎｇ１をコード化する核酸でトランスフェクションされた幹細胞は、遺伝的に変更されたと考えられる。本開示の文脈では、「遺伝的に変更されていない」細胞は、ある程度までＡｎｇ１を自然発現する。

Ａｎｇ１及び／またはＶＥＧＦの発現
高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、遺伝的に変更されておらず、少なくとも０．１μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現する。しかしながら、様々な実施形態では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．２μｇ／１０^６細胞、０．３μｇ／１０^６細胞、０．４μｇ／１０^６細胞、０．５μｇ／１０^６細胞、０．６μｇ／１０^６細胞、０．７μｇ／１０^６細胞、０．８μｇ／１０^６細胞、０．９μｇ／１０^６細胞、１μｇ／１０^６細胞、１．１μｇ／１０^６細胞、１．２μｇ／１０^６細胞、１．３μｇ／１０^６細胞、１．４μｇ／１０^６細胞、１．５μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現し得ることが想定される。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．２μｇ／１０^６細胞～約１．５μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現する。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．３μｇ／１０^６細胞～約１．４μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現する。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．４μｇ／１０^６細胞～約１．３μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現する。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．５μｇ／１０^６細胞～約１．２μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現する。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．５５μｇ／１０^６細胞～約１．１μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現する。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．６μｇ／１０^６細胞～約１．０μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現する。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．６５μｇ／１０^６細胞～約０．９μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現する。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．７μｇ／１０^６細胞～約０．８μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現する。

別の態様では、高レベルのＡｎｇ１を発現する遺伝的に変更されていない幹細胞は、約０．０１μｇ／１０^６細胞未満の量でＶＥＧＦを発現する。

別の態様では、高レベルのＡｎｇ１を発現する遺伝的に変更されていない幹細胞は、約０．０５μｇ／１０^６細胞未満の量でＶＥＧＦを発現する。しかしながら、様々な実施形態では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、約０．０５μｇ／１０^６細胞、０．０４μｇ／１０^６細胞、０．０３μｇ／１０^６細胞、０．０２μｇ／１０^６細胞、０．０１μｇ／１０^６細胞、０．００９μｇ／１０^６細胞、０．００８μｇ／１０^６細胞、０．００７μｇ／１０^６細胞、０．００６μｇ／１０^６細胞、０．００５μｇ／１０^６細胞、０．００４μｇ／１０^６細胞、０．００３μｇ／１０^６細胞、０．００２μｇ／１０^６細胞、０．００１μｇ／１０^６細胞未満の量でＶＥＧＦを発現し得ることが想定される。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．００１μｇ／１０^６細胞～約０．１μｇ／１０^６細胞の量でＶＥＧＦを発現する。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．００２５μｇ／１０^６細胞～約０．０９μｇ／１０^６細胞の量でＶＥＧＦを発現する。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．００７５μｇ／１０^６細胞～約０．０８μｇ／１０^６細胞の量でＶＥＧＦを発現する。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．０１μｇ／１０^６細胞～約０．０７μｇ／１０^６細胞の量でＶＥＧＦを発現する。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．０２μｇ／１０^６細胞～約０．０６μｇ／１０^６細胞の量でＶＥＧＦを発現する。

１つの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも０．０２μｇ／１０^６細胞～約０．０５μｇ／１０^６細胞の量でＶＥＧＦを発現する。

組成物または幹細胞の培養で発現する細胞のＡｎｇ１及び／またはＶＥＧＦの量は、当業者に周知の方法によって決定しても良い。このような方法には、たとえば、定量的ＥＬＩＳＡアッセイなどの定量的なアッセイが含まれるが、これらに限定されない。しかし、本開示の範囲が、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞で発現するＡｎｇ１またはＶＥＧＦの量またはレベルを決定するための任意の特定の方法に限定されるものではないことが理解されるべきである。

１つの実施例では、組成物または幹細胞の培養によって発現するＡｎｇ１またはＶＥＧＦのレベルは、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。このようなアッセイでは、幹細胞の培養からの細胞溶解物をＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加する。ウェルは、Ａｎｇ１またはＶＥＧＦに対して、モノクローナルまたはポリクローナル抗体（複数可）のいずれかの一次抗体で被覆されても良い。次いで、ウェルを洗浄した後、一次抗体に対して、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（複数可）のいずれかの二次抗体と接触させる。二次抗体は、たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの適切な酵素にコンジュゲートされる。次いで、ウェルをインキュベートしても良く、一定時間インキュベーションした後に洗浄する。次いで、ウェルを、１つまたは複数の色原体などの、二次抗体にコンジュゲートした酵素に適した基質と接触させる。使用することができる色原体は、過酸化水素及びテトラメチルベンジジンを含むが、これらに限定されない。基質（複数可）を添加した後、ウェルを適切な一定時間インキュベートする。インキュベーションが完了したら、基質（複数可）と酵素の反応を停止させるために「停止」溶液をウェルに添加する。次いで、試料の光学密度（ＯＤ）を測定する。試料の光学密度は、試験される幹細胞の培養によって発現するＡｎｇ１またはＶＥＧＦの量を決定するために、Ａｎｇ１またはＶＥＧＦの既知量を含む試料の光学密度と相関している。

別の態様では、高レベルのＡｎｇ１を発現する遺伝的に変更されていない幹細胞は、少なくとも約２：１の比率でＡｎｇ１：ＶＥＧＦを発現する。しかしながら、様々な実施形態では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、少なくとも約１０：１、１５：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、５０：１の比率でＡｎｇ１：ＶＥＧＦを発現し得ることが想定される。

Ａｎｇ１：ＶＥＧＦの発現比率を決定するための方法は、当業者には明らかであろう。Ａｎｇ１及びＶＥＧＦの発現の比率を決定する方法の実施例では、上述のようにＡｎｇ１及びＶＥＧＦの発現レベルは量的ＥＬＩＳＡを介して定量される。このような例では、Ａｎｇ１及びＶＥＧＦのレベルを定量した後、Ａｎｇ１及びＶＥＧＦの定量レベルに基づいた比率を次のように表すことができる。（Ａｎｇ１のレベル／ＶＥＧＦのレベル）＝Ａｎｇ１：ＶＥＧＦの比率。

細胞組成物
本開示の１つの実施例では、幹細胞は組成物の形態で投与される。１つの実施例では、そのような組成物は、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を含む。

用語「担体」及び「賦形剤」は、貯蔵、投与及び／または活性化合物の生物学的活性を促進にするために、当該技術分野で従来使用されている物質の組成物を指す（たとえば、レミントンの薬学、第１６版、Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）参照）。担体はまた、活性化合物のあらゆる望ましくない副作用を低下させ得る。適切な担体は、たとえば、安定であり、たとえば、担体中の他の成分と反応することができない。１つの実施例では、担体は、治療に使用される投与量及び濃度において、重大な局所的または全身的な有害作用をレシピエントにもたらさない。

本開示のための適切な担体には、従来使用されるものが含まれる。たとえば、水、生理食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンゲル液、緩衝液、ヒアルロン酸及びグリコールは、特に液剤用（等張の場合）に、例示的な液体担体である。適切な医薬担体及び賦形剤には、デンプン、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノール、などが挙げられる。

別の実施例では、担体は、たとえば、細胞が成長または懸濁している、培地組成物である。たとえば、培地組成は、それが投与される対象におけるいかなる有害な作用も誘発しない。

例示的な担体及び賦形剤は、代謝症候群及び／または肥満を減らす、防止または遅延させる細胞の生存能及び／または細胞の能力に悪影響を与えることはない。

１つの実施例では、担体または賦形剤は、たとえば、適切なｐＨで細胞及び／または可溶性因子を維持するための緩衝作用を提供し、それによって生物学的活性を発揮する。たとえば、担体または賦形剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＰＢＳは、魅力的な担体または賦形剤であるが、その理由は、本開示の組成物が、血流中、または組織中もしくは組織の周辺もしくは隣接する領域中へと直接適用（たえば、注入により）するための液体として製造されて良いような場合に、ＰＢＳは細胞及び因子と最小限しか相互作用せず、細胞及び因子の迅速な放出を可能とするからである。

幹細胞及び／またはその子孫細胞はまた、レシピエント適合性があり、レシピエントに対して有害ではない産物に分解される足場に組み込まれるか、または包埋され得る。これらの足場は、レシピエント対象に移植される細胞のための支持及び保護を提供する。天然及び／または合成の生分解性足場は、このような足場の例である。

様々な異なる足場が、本発明の実施において首尾良く使用されても良い。例示的な足場として、生物学的な、分解性の足場が挙げられるが、これに限定されない。天然の生分解性足場として、コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンの足場が挙げられる。細胞移植の足場のための適切な合成材料は、広範な細胞増殖及び細胞機能をサポートできるべきである。そのような足場は吸収性であっても良い。適切な足場として、ポリグリコール酸足場、たとえば、Ｖａｃａｎｔｉら Ｊ．Ｐ版 Ｓｕｒｇ．２３：３－９ １９８８；Ｃｉｍａら Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３８：１４５ １９９１；Ｖａｃａｎｔｉら Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８８：７５３－９ １９９１に記載されるようなもの、または、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの合成ポリマーが挙げられる。

別の実施例では、細胞は（Ｕｐｊｏｈｎ ＣｏｍｐａｎｙのＧｅｌｆｏａｍなどの）ゲル状足場中で投与されても良い。

本明細書に記載の細胞組成物は、単独で、または他の細胞との混合物として投与されても良い。異なるタイプの細胞を、本開示の組成物と、投与の直前または投与の少し前に混合しても良く、または投与前にある一定期間、一緒に共培養しても良い。

１つの実施例では、組成物は、有効量、または治療上もしくは予防上有効量の細胞を含む。たとえば、組成物は、高いＡｎｇ１レベルを伴う約１×１０^５個の幹細胞胞／ｋｇ～高いＡｎｇ１レベルを伴う約１×１０^７個の幹細胞／ｋｇ、または高いＡｎｇ１レベルを伴う約１×１０^６個の幹細胞／ｋｇ～高いＡｎｇ１レベルを伴う約５×１０^６個の幹細胞／ｋｇを含む。

投与されるべき幹細胞の正確な用量は、限定されないが、患者の年齢、体重及び性別、治療される疾患または障害、ならびにその程度及び重症度を含む様々な因子に応じて決定される。

１つの実施例では、低用量の細胞が対象に投与される。例示的な投与量は、１ｋｇあたり約０．１×１０^４～約０．５×１０^６個の間の細胞、たとえば、１ｋｇあたり約０．１×１０^５～約０．５×１０^６個の間の細胞、たとえば、１ｋｇあたり約０．５×１０^５～約０．５×１０^６個の間の細胞、たとえば、１ｋｇあたり約０．１×１０^６～約０．５×１０^６個の間の細胞、たとえば、１ｋｇあたり約０．２×１０^６個または０．３×１０^６個または０．４×１０^６個の細胞を含む。

たとえば、１ｋｇあたり約０．１×１０^６、約０．２×１０^６、約０．３×１０^６、約０．４×１０^６、約０．５×１０^６個の細胞を対象に投与することができる。

他の実施例では、１ｋｇあたり約０．６×１０^６、約０．７×１０^６、約０．８×１０^６、約０．９×１０^６、約１．０×１０^６、約１．１×１０^６、約１．２×１０^６、約１．３×１０^６、約１．４×１０^６個の細胞を対象に投与することができる。

１つの実施例では、高用量の細胞が対象に投与される。例示的な投与量は、少なくとも約１．５×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。たとえば、高用量は、約１．５×１０^６～約６×１０^６個の間の細胞／ｋｇ、たとえば約１．５×１０^６～約５×１０^６個の間の細胞／ｋｇ、たとえば、約１．５×１０^６～約４×１０^６個の間の細胞／ｋｇ、たとえば、約１．５×１０^６～約３×１０^６個の間の細胞／ｋｇを含む。たとえば、高用量は、約１．５×１０^６個または約２×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。たとえば、高用量は、約１．５×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。たとえば、高用量は、約２×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。たとえば、高用量は、約３×１０^６個の細胞／ｋｇを含む。

他の実施例では、１ｋｇあたり約１．５×１０^６、約１．６×１０^６、約１．７×１０^６、約１．８×１０^６、約１．９×１０^６、約２．０×１０^６、約２．１×１０^６、約２．２×１０^６、約２．３×１０^６、約２．４×１０^６、約２．５×１０^６、約２．６×１０^６、約２．７×１０^６、約２．８×１０^６、約２．９×１０^６、約３．０×１０^６、約３．１×１０^６、約３．２×１０^６、約３．３×１０^６、約３．４×１０^６、約３．５×１０^６、約３．６×１０^６、約３．７×１０^６、約３．８×１０^６、約３．９×１０^６、約４．０×１０^６個の細胞が対象に投与される。

他の実施例では、約１．０×１０^８、約１．１×１０^８、約１．２×１０^８、約１．３×１０^８、約１．４×１０^８、約１．５×１０^８、約１．６×１０^８、約１．７×１０^８、約１．８×１０^８、約１．９×１０^８、約２．０×１０^８、約２．１×１０^８、約２．２×１０^８、約２．３×１０^８、約２．４×１０^８、約２．５×１０^８、約２．６×１０^８、約２．７×１０^８、約２．８×１０^８、約２．９×１０^８個の細胞、約３．０×１０^８、約３．１×１０^８、約３．２×１０^８、約３．３×１０^８、約３．４×１０^８、約３．５×１０^８、約３．６×１０^８、約３．７×１０^８、約３．８×１０^８、約３．９×１０^８、約４．０×１０^８個の細胞が対象に投与される。

間葉系統前駆または幹細胞は、組成物の細胞集団の少なくとも約５％を占め得る。他の実施例では、間葉系統前駆または幹細胞は、組成物の細胞集団の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％を占め得る。

ＣＤ４４を発現する幹細胞は、組成物の細胞集団の少なくとも約５％を占め得る。他の実施例では、ＣＤ４４を発現する幹細胞は、組成物の細胞集団の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％を占め得る。

いくつかの実施例では、細胞は、該細胞が対象の循環中に出て行くことは不可能であるが、細胞により分泌される因子が循環に進入することは可能であるチャンバー内に含まれる。このような方法では、可溶性因子は、細胞が対象の循環中に因子を分泌することを可能とすることにより、対象に投与されても良い。このようなチャンバーは、対象のある部位に同時に埋め込まれて、可溶性因子の局所レベルを増加させても良い。

幹細胞は、たとえば、静脈内、動脈内、または腹腔内投与などにより、全身投与されることができる。

間葉系統前駆または幹細胞はまた、経鼻、筋肉内、関節内または心内投与により投与されることができる。

たとえば、間葉系統前駆または幹細胞は、痛みのあるまたは腫脹した関節に直接投与されることができる。

別の実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、冠動脈内注入により投与される。たとえば、間葉系統前駆または幹細胞は、左前下行枝（ＬＡＤ）動脈に投与され得る。

別の実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、腎内注入により投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、単回投与で投与され得る。

いくつかの実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、多用量で投与され得る。たとえば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回の用量である。

高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を含む組成物は、凍結保存されても良い。幹細胞の凍結保存は、当技術分野で周知の低速の冷却方法または「高速」凍結手順を使用して行うことができる。一実施例では、凍結保存の方法は、凍結していない細胞と比較して、凍結保存した細胞の類似した表現型、細胞表面マーカー及び成長率を維持する。

凍結保存した組成物は、凍結保存溶液を含んでも良い。凍結保存液のｐＨは、典型的には約６．５～８である。

一実施例では、凍結保存液のｐＨは、約７．４である。

凍結保存液は、たとえば、無菌、非発熱性等張液のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ（登録商標）を含んでも良い。Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ（登録商標）の１００ｍＬは、５２６ｍｇの塩化ナトリウム、ＵＳＰ（ＮａＣｌ）、５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ_６Ｈ_１１ＮａＯ_７）、３６８ｍｇの酢酸ナトリウム三水和物、ＵＳＰ（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２・３Ｈ_２Ｏ）、３７ｍｇの塩化カリウム、ＵＳＰ（ＫＣＩ）、及び３０ｍｇの塩化マグネシウム、ＵＳＰ（ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）を含む。抗菌剤は含まれていない。ｐＨは、水酸化ナトリウムで調整される。ｐＨは、７．４（６．５～８．０）である。

凍結を促進するために、たとえば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの凍結防止剤が通常、凍結保存溶液に添加される。理想的には、凍結防止剤は、細胞及び患者のために非毒性であり、化学的に不活性であり、非抗原性であり、解凍した後の高い生存率を提供し、洗浄することなく移植を可能にする必要がある。しかし、最も一般的に使用される凍結防止剤であるＤＭＳＯは、いくつかの細胞毒性を示す。ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、凍結保存溶液の細胞毒性を減少させるために、代替としてまたはＤＭＳＯと組み合わせて使用することができる。

凍結保存溶液は、１つまたは複数のＤＭＳＯ、ヒドロキシエチルデンプン、ヒト血清成分及びその他のタンパク質の増量剤を含むことができる。１つの実施例では、凍結保存溶液は、約５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及び約１０％のＤＭＳＯを含む。凍結保存溶液は、１つまたは複数のメチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、及びトレハロースをさらに含んでも良い。

凍結保存した組成物を解凍し、対象に直接投与することもできる。また、凍結保存された組成物を解凍し、間葉系統前駆体または幹細胞を投与前に代替溶液に再懸濁しても良い。

高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、動物の疾患または障害を治療するのに有効な量で動物に投与される。動物は哺乳動物でも良く、哺乳動物は、ヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類であっても良い。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ヒトに投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ヒトに投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、糖尿病を患う対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ＩＩ型糖尿病を患う対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ＩＩ型糖尿病を患っている、ベースラインのＨｂＡ１ｃ値が約７％を超える対象に投与される。たとえば、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ＩＩ型糖尿病を患っている、ベースラインのＨｂＡ１ｃ値が約７．１％、約７．２％、約７．３％、約７．４％、約７．５％、約７．６％、約７．７％、約７．８％、約７．９％、約８．０％、約８．１％、約８．２％、約８．３％、約８．４％、約８．５％、約８．６％、約８．７％、約８．８％、約８．９％、約９．０％を超える対象に投与することができる。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ＩＩ型糖尿病を患っている、ベースラインのＨｂＡ１ｃ値が約８．０％以上の対象に投与することができる。

ＨｂＡ１ｃ値（総ヘモグロビンのパーセンテージ）を決定するための方法は、当業者には明らかであろう。ＨｂＡ１ｃ値（総ヘモグロビンのパーセンテージ）を決定するために使用される方法の例には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはイムノアッセイが挙げられる。当業者はまた、ＨｂＡ１ｃ値を他の値、たとえば、ｍｍｏｌ／ｍｏｌで表すことができることも認識するであろう。

一実施例では、対象のＨｂＡ１ｃ値は、ＨＰＬＣにより決定される。

一実施例では、対象のＨｂＡ１ｃ値は、イムノアッセイにより決定される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ＩＩ型糖尿病を患う患者に投与され、対象のブドウ糖レベルは、十分にコントロールされていない。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ＩＩ型糖尿病を患う対象に投与され、対象のブドウ糖レベルは、メトホルミンまたはメトホルミンともう１つの他の経口治療薬により十分にコントロールされていない。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、慢性腎臓病を患う対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、糖尿病性腎症を患う対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ＩＩ型糖尿病及び慢性腎臓病を患う対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ＩＩ型糖尿病及び糖尿病性腎症を患う対象に投与される。

初期の腎臓損傷を検査及び検出し、腎臓状態をモニターするには、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）が使用される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ベースラインのｅＧＦＲが約３５ｍｌ／分／１．７３ｍ^２、約３４ｍｌ／分／１．７３ｍ^２、約４４ｍｌ／分／１．７３ｍ^２、約３２ｍｌ／分／１．７３ｍ^２、約３１ｍｌ／分／１．７３ｍ^２、約３０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２、約２９ｍｌ／分／１．７３ｍ^２、約２８ｍｌ／分／１．７３ｍ^２、約２７ｍｌ／分／１．７３ｍ^２、約２６ｍｌ／分／１．７３ｍ^２、約２５ｍｌ／分／１．７３ｍ^２を超える対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、腎機能ステージが３Ａ、３Ｂ、４または５である対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、腎臓機能ステージが３Ｂである対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、ベースラインのｅＧＦＲが３０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２以上である対象に投与される。

ＧＦＲを推算するための方法は、当業者には明らかであろうが、以下に例を示す。ｅＧＦＲは、クレアチニン及び／またはシスタチンＣレベルを用いて算出することができる。

たとえば、次のＭＤＲＤ式を用いてｅＧＦＲを算出することができる。
ＧＦＲ（ｍＬ／分／１．７３ｍ^２）＝１７５×（Ｓ_ｃｒ）^{－１．１５４}×（年齢）^{－０．２０３}×（女性の場合０．７４２）×（アフリカンアメリカンの場合１．２１２）

他の実施例では、ＣＫＤ－ＥＰＩ式（Ｌｅｖｅｙら、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１５０（９），６０４－１２，２００９）を用いてｅＧＦＲを算出しても良い。
ＧＦＲ＝１４１×ｍｉｎ（Ｓ_ｃｒ／κ、１）^α×ｍａｘ（Ｓ_ｃｒ／κ、１）^{－１．２０９}×０．９９３^年齢×１．０１８［女性の場合］×１．１５９［黒人の場合］
式中、
Ｓ_ｃｒは、血清クレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）であり、
κは、女性で０．７、男性で０．９であり、
αは、女性で－０．３２９、男性で－０．４１１であり、
ｍｉｎは、Ｓ_ｃｒ／κの最小値または１を示し、
ｍａｘは、Ｓ_ｃｒ／κの最大値または１を示す。

また、ｅＧＦＲを連続して算出し、経時的にモニターして、ｅＧＦＲが減少しているか、または改善しているかどうかを決定することができる。ｅＧＦＲを対照群と治療群とを比較して、ｅＧＦＲの減少が治療群にて阻害されるかどうかを特定することができる。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、関節炎を患う対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、関節リウマチを患う対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、不十分な抗ＴＮＦαレスポンダーに分類される関節リウマチを患っている対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、関節リウマチの生物学的療法が奏功しなかった、関節リウマチを患っている対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、関節リウマチの２つの生物学的療法が奏功しなかった、関節リウマチを患っている対象に投与される。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、関節リウマチの３つの生物学的療法が奏功しなかった、関節リウマチを患っている対象に投与される。

ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－６、ＩＬ－１７の阻害
ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－６及びＩＬ－１７は、サイトカインとして知られている化学的メッセンジャーである。これらの分子は、種々のシグナルに応答して細胞から放出される。本発明の文脈では、「阻害する」または「阻害すること」という用語は、タンパク質（たとえば、サイトカイン）などの物質またはプロセス（たとえば、細胞分化または細胞分極）の測定可能なレベルの低減または抑制を指す。

したがって、一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を含む細胞組成物の投与は、対象において、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７及び／またはＩＬ－６の測定可能なレベルを減少させることが想定される。本実施例では、細胞からのＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７及び／またはＩＬ－６放出が阻害される。

１つの実施例では、本開示は、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞の投与に対する対象の応答をモニターする方法に関する。本実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞の投与後、そのレベルまたはサイトカインなどの炎症誘発性及び／もしくは抗炎症性マーカーを一定期間にわたってモニターすることができる。

一実施例では、本開示は、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞の投与後の対象の応答をモニターする方法に関し、この方法は、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を投与した対象から得た全血試料などの試料中の炎症マーカー及び／または抗炎症マーカーレベルを評価することと、その対象が高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞の投与に対して応答したかどうかを炎症誘発性及び／または抗炎症マーカーレベルに基づいて決定することを含む。

一実施例では、抗炎症マーカーレベルの増加及び／または炎症マーカーの減少は、その対象が幹細胞の投与に応答したことを示す。

一実施例では、炎症マーカー及び／または抗炎症マーカーは、細胞または細胞集団である。

一実施例では、抗炎症性細胞の数の増加及び／または炎症性細胞の数の減少は、その対象が幹細胞の投与に応答したことを示す。

一実施例では、抗炎症性細胞は、Ｔｈ２細胞、Ｔｒｅｇ細胞及び／またはＭ２型マクロファージである。

一実施例では、炎症性細胞は、Ｔｈ１７細胞及び／またはＭ１型マクロファージである。

炎症性細胞の数が減少したか、及び／または抗炎症性細胞の数が増加したかどうかを判定するために用いることができる種々のアッセイは、当業者に利用可能である。

たとえば、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリーに基づく技術を用いて、細胞表面マーカーの発現について、全血試料から単離した細胞集団を評価することができる。

１つの実施例では、ＣＤ１４＋単核細胞は、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を投与した対象から得た全血試料から精製することができる。単核細胞をＣＤ１６、ＣＤ１６３及びＣＤ２０６発現について評価して、Ｍ１型とＭ２型マクロファージの比率を特定することができる。複数の試料を経時的に評価して、Ｍ１型マクロファージ数が減少したか、もしくは減少しているか、及び／またはＭ２型マクロファージレベルが増加したか、もしくは増加しているかどうかを判定することができる。一実施例では、Ｍ１及び／またはＭ２型マクロファージ数は、幹細胞の投与前に対象から得た試料（たとえば、ベースラインまたは処置前の参照試料）中のＭ１及び／またはＭ２型マクロファージ数と比較して評価される。

別の実施例では、評価される炎症マーカー及び／または抗炎症マーカーは、サイトカインである。

一実施例では、炎症マーカーは、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７及び／またはＩＬ－６である。

一実施例では、抗炎症マーカーは、ＩＬ－１０である。

ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７及び／もしくはＩＬ－６レベルが減少したか、またはＩＬ－１０レベルが増加したかどうかを判定することができる種々のアッセイは、当業者に利用可能である。１つの実施例では、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７、ＩＬ－１０及び／またはＩＬ－６の濃縮レベルは、Ｉｍｍｕｌｉｔｅ化学発光免疫測定法などの分光光度技術を用いて特定することができる。別の実施例では、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７、ＩＬ－１０及び／またはＩＬ－６の濃縮レベルは、市販のキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したＬｕｍｉｎｅｘプラットフォームを使用して測定することができる。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を含む細胞組成物の投与は、マクロファージによるＴＮＦ－アルファ及び／またはＩＬ－６の放出を阻害する。ＴＮＦ－アルファ及び／またはＩＬ－６のマクロファージからの放出が減少したかどうかを判定することができる種々のアッセイは、当業者に利用可能である。たとえば、マクロファージをインビトロで培養し、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を含む組成物または好適な対照のいずれかに曝露する。一定時間後、次いで、上記の例示的方法を用いて、ＴＮＦ－アルファ及び／またはＩＬ－６放出を評価することができる。次いで、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を含む細胞組成物に曝された細胞中のＴＮＦ－アルファ及び／またはＩＬ－６レベルを、対照細胞中のＴＮＦ－α及び／またはＩＬ－６レベルと比較して、ＴＮＦ－アルファ及び／またはＩＬ－６レベルが減少するかどうかを決定することができる。

マクロファージについては、古典的活性化（Ｍ１）マクロファージ表現型（すなわち「Ｍ１型マクロファージ」）及び選択的活性化（Ｍ２）マクロファージ表現型（すなわち「Ｍ２型マクロファージ」）の２つの異なる分極状態が特定されている（Ｇｏｒｄｏｎ及びＴａｙｌｏｒ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：９５３－９６４，２００５；Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：５４９－５５５，２００２）。Ｍ１型マクロファージは、「炎症誘発性」サイトカインプロファイル（たとえば、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－６、ＩＬ－１－ベータ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３）を有する。これに対して、Ｍ２型マクロファージは、「抗炎症性」サイトカインプロファイル（たとえば、ＩＬ－１０）を有する。一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を含む細胞組成物の投与は、Ｍ１型マクロファージによるサイトカインの放出を阻害することが想定される。別の実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を含む細胞組成物の投与は、Ｍ１型マクロファージによるＴＮＦ－アルファ及び／またはＩＬ－６の放出を阻害することが想定される。Ｍ１型マクロファージによるＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－６及び／または他のサイトカインの放出が減少したかどうかを判定することができる種々のアッセイは、当業者に利用可能である。たとえば、上述したインビトロアッセイにてＭ１型マクロファージを用いる。本実施例では、免疫選択により全血試料からＣＤ１４＋単核細胞を精製することができる。

抗炎症性細胞の産生及び／または機能の増加
１つの実施例では、本開示は、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を投与することによって、対象において、抗炎症性細胞の産生及び／または機能を増加させる方法に関する。

「抗炎症性細胞」という用語は、対象にて抗炎症反応を誘発または媒介する細胞を指すために、本開示の文脈にて用いられる。「抗炎症性細胞」は、細胞集団または標的に直接作用して抗炎症反応を誘導し得る。あるいは、本開示によって包含される抗炎症性細胞は、特定の細胞集団または標的に作用して抗炎症反応を誘導するサイトカインなどの因子を発現または分泌し得る。

抗炎症性細胞の例には、Ｔｈ２細胞、Ｔｒｅｇ細胞及びＭ２型マクロファージが挙げられる。

１つの実施例では、本開示は、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を投与することによって、対象において、Ｔｈ２細胞、Ｔｒｅｇ及び／またはＭ２型マクロファージの数を増加させる方法に関する。

１つの実施例では、本開示は、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を投与することによって、対象において、Ｍ２型マクロファージの数を増加させる方法に関する。

１つの実施例では、本開示の方法は、対象において、Ｍ２型マクロファージの数を総単核細胞集団の少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％まで増加させる。

１つの実施例では、本開示の方法は、対象において、Ｍ２型マクロファージの数を総単核細胞集団の少なくとも約１０％まで増加させる。

１つの実施例では、本開示の方法は、対象において、Ｍ２型マクロファージの数を総単核細胞集団の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％まで増加させる。

当業者であれば、当該技術分野において知られている種々の方法を用いて、対象の総単核細胞集団に対するＭ２マクロファージのパーセンテージを容易に特定することができるであろう。たとえば、Ｍ２マクロファージは、ＣＤ１４及びＣＤ１６ならびにＣＤ１６３及びＣＤ２０６などの他のマーカーの発現に基づいて特定することができる。

本実施例では、全血試料を対象から得て、ＣＤ１４の発現に基づいてＦＡＣＳにより細胞を免疫選択することができる。次いで、ＣＤ１４＋細胞をＣＤ１６、ＣＤ１６３及びＣＤ２０６の発現について評価することができる。ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋ＣＤ１６３＋ＣＤ２０６＋の比率は、試料中の総ＣＤ１４＋細胞集団を基準として算出することができる。

１つの実施例では、対象における抗炎症性細胞の産生及び／または機能の増加が、
・対象おけるＩＬ－６レベルの減少；
・対象におけるＴＮＦ－アルファレベルの減少；及び／または
・対象おけるＩＬ－１０レベルの増加をもたらす。

別の実施例では、本開示の方法は、Ｍ１からＭ２表現型へのマクロファージの分極を促進する方法である。

たとえば、本開示は、必要とする対象において、Ｍ１型マクロファージのＭ２型マクロファージへの分極を促進する方法を提供し、この方法は、遺伝的に変更されていない幹細胞を含む組成物を対象に投与することを含み、当該遺伝的に変更されていない幹細胞は、少なくとも０．１μｇ／１０^６細胞の量でアンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）を発現する。

本実施例では、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋細胞、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋細胞、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋ＣＤ１６３＋細胞、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋ＣＤ１６３＋細胞、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋ＣＤ２０６＋細胞、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋ＣＤ２０６＋細胞、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋ＣＤ１６３＋ＣＤ２０６＋細胞、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋ＣＤ１６３＋ＣＤ２０６＋細胞、ＣＤ１４＋ＣＤ１６３＋細胞、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６３＋細胞、ＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋細胞、ＣＤ１４＋＋ＣＤ２０６＋細胞、ＣＤ１４＋ＣＤ１６３＋２０６＋細胞、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６３＋ＣＤ２０６＋細胞の産生もしくは数の増加、ＩＬ－６レベルの減少、ＴＮＦ－アルファレベルの減少及び／またはＩＬ－１０レベルの増加は、Ｍ１型マクロファージのＭ２型マクロファージへの分極が促進されたことを示し得る。

逆に、別の実施例では、本開示は、Ｍ２型マクロファージのＭ１型マクロファージへの分極を阻害する方法を提供する。

別の実施例では、本開示は、必要とする対象において、Ｍ１型マクロファージの産生及び／または機能を阻害する方法を提供し、この方法は、遺伝的に変更されていない幹細胞を含む組成物を対象に投与することを含み、当該遺伝的に変更されていない幹細胞は、高レベルのアンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）を発現する。

治療方法
本開示は、炎症性疾患を治療する方法に関する。

本明細書で使用するとき、「炎症性疾患」という用語は、限定するものではないが、そう痒症、皮膚炎症、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、変形性関節症、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、糖尿病Ｉ型またはＩＩ型、糖尿病性腎症、喘息、炎症性肺損傷、炎症性肝損傷、炎症性糸球体傷害、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、シェーグレン症候群、角結膜炎、ぶどう膜炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節、皮膚または筋肉の炎症性疾患、急性または慢性特発性炎症性関節炎、筋炎、脱髄疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、間質性腎炎及び慢性活動性肝炎を含む、疾患を包含するとみなすべきである。

一実施例では、本開示の方法によって治療される炎症性疾患は、糖尿病である。別の実施例では、炎症性疾患は、糖尿病に関連する状態または症状である。本実施例では、治療することができる症状には、異常な創傷治癒、胸痛などの心臓発作に関連する症状、脳卒中に関連する症状、末梢血管疾患、切断、腎臓疾患、腎不全、失明、神経障害、炎症、性交不能症または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）が挙げられる。

たとえば、本開示の方法によって治療される炎症性疾患は、関節リウマチである。

たとえば、本開示の方法によって治療される炎症性疾患は、糖尿病性網膜症である。

一実施例では、本開示は、糖尿病を治療する方法に関する。

一実施例では、本開示は、ＩＩ型糖尿病を治療する方法に関する。

一実施例では、本開示は、糖尿病性腎症を治療する方法に関する。

一実施例では、本開示は、関節リウマチを治療する方法に関する。

本明細書で使用するとき、「治療する」または「治療」または「治療すること」という用語は、治療上有効な量の細胞を投与することを意味するものと理解されたい。本開示の文脈では、「治療上有効な量の細胞」という用語は、炎症性疾患または障害を予防、改善または治療するのに有効である量の細胞を指す。このような有効量は、一般に、炎症性疾患または障害の徴候、症状及び／または他の指標に改善をもたらすであろう。たとえば、糖尿病の場合、有効量の細胞は、ＨｂＡ１ｃ値の減少、ＩＬ－６及び／またはＴＮＦ－αなどのサイトカインレベルの減少、空腹時インスリンの減少及び／またはアディポネクチンレベルの増加をもたらすことができる。

たとえば、関節リウマチの場合、有効量の細胞は、ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０及び／もしくはＡＣＲ７０の達成、ＩＬ－６などのサイトカインレベルの減少ならびに／または疾患活動性スコアの減少をもたらすことができる。

たとえば、糖尿病性腎症の場合、有効量の細胞は、ｅＧＦＲもしくはｍＧＦＲの減少の阻害、ｅＧＦＲもしくはｍＧＦＲの改善及び／またはＩＬ－６などのサイトカインレベルの減少をもたらすことができる。

糖尿病またはその関連状態もしくは症状の文脈にて、ＨｂＡ１ｃ値の減少、空腹時インスリンの減少及び／またはアディポネクチンレベルの増加を特定するために使用することができる種々の慣用的臨床分析は、当業者に利用可能である。たとえば、一般に、血液試料を対象から得た後、イムノアッセイにかけてＨｂＡ１ｃ、インスリン及びアディポネクチンレベルを検出する。

細胞培養方法
一実施形態では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を作製する方法は、幹細胞の集団を細胞培養培地で培養することを含み、当該細胞培養培地は、短時間作用型Ｌ－アスコルビン酸誘導体を含むが、長時間作用型Ｌ－アスコルビン酸誘導体の相当量を含まず、及び／または１０％（ｖ／ｖ）未満のウシ胎児血清で補充される。

細胞培養に関連して使用される用語「培地（ｍｅｄｉａ）」または「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」は、細胞を取り巻く環境の構成要素を含む。培地は、Ａｎｇ１発現の発現を誘導するのに十分な条件に寄与する及び／または条件を提供することが想定される。培地は、固体、液体、気体、または相及び物質の混合物であっても良い。培地には、液体増殖培地、及び細胞増殖を維持しない液体培地を含むことができる。培地はまた、寒天、アガロース、ゼラチン及びコラーゲン基質などのゼラチン質の培地も含む。例示的な気体培地は、ペトリ皿または他の固体もしくは半固体の支持体上で増殖する細胞が暴露される気相を含む。用語「培地」とはまた、それが未だ細胞と接触していない場合であっても、細胞培養での使用を目的とした物質を指す。

高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を作製する方法に使用される培養培地は、基礎培地として、幹細胞の培養に使用される培地を使用して調製することができる。基礎培地は、たとえば、イーグル最小必須（ＭＥＭ）培地、α改変ＭＥＭ培地、及びその混合培養培地を含み、幹細胞の培養のために使用することができるならば、特に制限されるものではない。

さらに、培養培地は、脂肪酸または脂質、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、緩衝剤、無機塩などの成分を含むことができる。

細胞培養培地は、すべての必須アミノ酸を含むことができ、非必須アミノ酸を含んでも良い。一般に、アミノ酸は、必須アミノ酸（トレオニン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、ヒスチジン）及び非必須アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、システイン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、プロリン）に分類される。

アスコルビン酸は、培養中の様々な細胞の増殖及び分化に必須のサプリメントである。特定のアスコルビン酸誘導体は、特に、中性ｐＨ及び３７℃の通常の細胞培養条件下で、溶液中で安定していないため、「短時間作用型」であることが現在では理解されている。これらの短時間作用型誘導体は、急速にシュウ酸またはトレオン酸に酸化する。３７℃の培養培地（ｐＨ７）では、酸化により、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体のレベルは、２４時間後に約８０～９０％低下する。したがって、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体は、様々な細胞型の従来の細胞培養で、より安定した「長時間作用型」アスコルビン酸誘導体に置き換えられる。

本開示の文脈では、用語「短時間作用性」とは、中性ｐＨ及び３７℃の培養条件下の細胞培養が、２４時間後に約８０～９０％酸化されるアスコルビン酸誘導体を含む。１つの実施例では、短時間作用型のＬ－アスコルビン酸誘導体は、Ｌ－アスコルビン酸塩である。たとえば、本開示の文脈では、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム塩は、「短時間作用型」アスコルビン酸誘導体である。

対照的に、用語「長時間作用性」とは、中性ｐＨ及び３７℃の培養条件下の細胞培養が、２４時間後に約８０～９０％酸化されないアスコルビン酸誘導体を含む。１つの実施例では、本開示の文脈では、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸は、「長時間作用型」アスコルビン酸誘導体である。長時間作用型のアスコルビン酸誘導体のその他の例には、アスコルビン酸テトラヘキシルデシル、リン酸アスコルビルマグネシウム及び２－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸が挙げられる。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を作製する方法に使用される培養培地は、短時間作用型アスコルビン酸誘導体で補充される。たとえば、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体の少なくとも約０．００５ｇ／Ｌを含んでも良い。別の実施例では、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体の少なくとも約０．０１ｇ／Ｌを含んでも良い。たとえば、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体の少なくとも約０．０２ｇ／Ｌを含んでも良い。別の実施例では、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体の少なくとも約０．０３ｇ／Ｌを含んでも良い。たとえば、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体の少なくとも約０．０４ｇ／Ｌを含んでも良い。別の実施例では、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体の少なくとも約０．０５ｇ／Ｌを含んでも良い。別の実施例では、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体の少なくとも約０．０６ｇ／Ｌを含んでも良い。この実施形態の１つの実施例では、細胞培養培地は、Ｌ－アスコルビン酸のナトリウム塩で補充される。

別の実施例では、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体を含むが、長時間作用型のアスコルビン酸誘導体の相当量を含まない。たとえば、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体を含んでも良いが、長時間作用型のアスコルビン酸誘導体の０．０４ｇ／Ｌ以下である。別の実施例では、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体を含んでも良いが、長時間作用型のアスコルビン酸誘導体の０．０３ｇ／Ｌ以下である。別の実施例では、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体を含んでも良いが、長時間作用型のアスコルビン酸誘導体の０．０２ｇ／Ｌ以下である。別の実施例では、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体を含んでも良いが、長時間作用型のアスコルビン酸誘導体の０．０１ｇ／Ｌ以下である。別の実施例では、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体を含んでも良いが、長時間作用型のアスコルビン酸誘導体の０．００５ｇ／Ｌ以下である。別の実施例では、細胞培養培地は、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体を含んでも良いが、長時間作用型のアスコルビン酸誘導体は含み得ない。

別の実施例では、細胞培養培地は、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム塩を含むが、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸の相当量は含まない。

高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を作製する方法に使用される細胞培養培地は、血清含有培地または無血清培地であり得る。

培養培地は、血清代替を含んでも良いし含まなくても良い。血清代替物は、たとえば、アルブミン（たとえば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノールまたは３’－チオールグリセロール、またはそれらを適切に含む血清同等物とすることができる。そのような血清代替物は、たとえば、国際特許出願第９３／３０６７９号に記載された方法で調製することができるし、市販品を使用することもできる。

一実施例では、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を作製する方法に使用される細胞培養培地は、少なくとも約９％（ｖ／ｖ）、少なくとも約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも約１％（ｖ／ｖ）のＦＣＳで補充される。また、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）の用語は、本発明の文脈では、同じ意味で使用し得ることが想定される。

一実施形態では、細胞培養培地は、非胎児血清で補充される。培地は、少なくとも約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％（ｖ／ｖ）の非胎児血清で補充しても良いことが想定される。

たとえば、培養培地は、哺乳動物の非胎児血清で補充することができる。

たとえば、培養培地は、ヒトの非胎児血清で補充することができる。

たとえば、培養培地は、新生児血清で補充することができる。培地は、少なくとも約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％（ｖ／ｖ）の新生児血清で補充しても良いことが想定される。

一実施形態では、細胞培養培地は、哺乳動物の新生児血清を補充される。

たとえば、培養培地は、新生仔ウシ血清（ＮＢＣＳ）で補充することができる。培地は、少なくとも約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％（ｖ／ｖ）のＮＢＣＳで補充しても良いことが想定される。

一実施形態では、細胞培養培地は、ヒトの新生児血清を補充される。

たとえば、細胞培養培地は、少なくとも約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも約９％（ｖ／ｖ）のヒト新生児血清で補充することができる。たとえば、ヒト新生児血清は、「臍帯血」から得られる。

一実施形態では、培養培地は、成人血清で補充される。培地は、少なくとも約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％（ｖ／ｖ）の成人血清で補充しても良いことが想定される。

一実施形態では、細胞培養培地は、哺乳動物の成体血清で補充される。

たとえば、細胞培養培地は、少なくとも約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％（ｖ／ｖ）の哺乳動物の成体血清で補充することができる。

たとえば、細胞培養培地は、少なくとも約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％（ｖ／ｖ）の成体ウシ血清で補充することができる。

一実施形態では、細胞培養培地は、ヒトの成体血清で補充される。

たとえば、細胞培養培地は、少なくとも約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも約９％（ｖ／ｖ）のヒト成人血清で補充することができる。

たとえば、細胞培養培地は、少なくとも約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも約９％（ｖ／ｖ）のヒトＡＢ血清で補充することができる。

１つの実施例では、細胞培養培地は、少なくとも約３％のヒトＡＢ血清で補充される。

一実施形態では、培養培地は、ＦＣＳ及びＮＢＣＳの混合物で補充される。

たとえば、培養培地は、ＦＣＳ：ＮＢＣＳの比率が、少なくとも約０．４：１、少なくとも約０．５：１、少なくとも約０．６：１、少なくとも約０．７：１、少なくとも約０．８：１、少なくとも約０．９：１、少なくとも約１：１、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１になるようなＦＣＳ及びＮＢＣＳの混合物で補充することができる。

たとえば、ＦＣＳとＮＢＣＳの混合物は、少なくとも約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％（ｖ／ｖ）の細胞培養培地を含み得ることが想定される。しかし、この実施例では、細胞培養培地は、少なくとも約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも約９％（ｖ／ｖ）、１０％（ｖ／ｖ）未満のＦＣＳで補充される。

一実施形態では、細胞培養培地は、無ＦＣＳ血清である。

一実施形態では、細胞培養培地は、無胎児血清である。

一実施形態では、細胞培養培地は、非胎児血清で補充される。

一実施形態では、細胞培養培地は無胎児血清であり、非胎児血清で補充される。

別の実施例では、細胞培養培地は、ｌα，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５Ｄ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インターロイキンキン－１β（ＩＬ－１β）及び間質由来因子ｌα（ＳＤＦ－ｌα）で構成されるグループから選択される１つまたは複数の刺激因子で補充される。別の実施形態では、細胞は、細胞の増殖を支持するのに十分な量の少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養することができる。

別の実施形態では、細胞は、細胞の増殖を支持するのに十分な量の血小板細胞溶解物の存在下で培養される。たとえば、細胞は、細胞の増殖を支持するのに十分な量のヒト血小板の細胞溶解物で培養することができる。

１つの実施例では、細胞は、細胞の増殖を支持するのに十分な量のヒトＡＢ血清及びヒト血小板の細胞溶解物で培養される。

また、当業者であれば、以下に例示する方法を用いて、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を作製することができる。

細胞の治療的／予防的可能性を分析する
疾患の発症または進行を処置し、予防し、または遅延させる、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞の能力を決定するための方法は、当業者には明らかであろう。たとえば、幹細胞は、Ａｎｇ１のレベルを増加させるその能力について評価することができる。

１つの実施例では、少なくとも０．１μｇ／１０^６細胞の量でＡｎｇ１を発現する遺伝的に変更されていない幹細胞は、インビトロ及び／またはインビボでのＡｎｇ１発現を増加させる能力について試験される。これらの実施例では、細胞または組織は、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞の投与後に、Ａｎｇ１の発現の展開について評価する。

本開示はまた、疾患の治療、予防または遅延するための細胞を同定または単離するための以下の方法を提供することも、上記のことから当業者には明らかであろう。
（ｉ）関連疾患に罹患している試験対象に高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を投与し、対象の疾患の症状を評価する。
（ｉｉ）（ｉ）の対象の障害の症状と、疾患を罹患しているが幹細胞を投与していない対照被験体の疾患の症状または活性とを比較し、対照被験体と比較した試験対象の症状の改善が、幹細胞が疾患を治療することを示す。細胞は、任意の実施例による、本開示に記載の任意の細胞であっても良い。

実施例１：ＳＴＲＯ－３^＋細胞の選択によるＭＰＣの免疫選択
骨髄（ＢＭ）を、健康な正常成人ボランティア（２０～３５歳）から採取する。簡潔には、４０ｍｌのＢＭを、後腸骨稜から、リチウム－ヘパリン抗凝固剤含有チューブに吸引する。

骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を、先に記載されているように（Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏら、Ｂｌｏｏｄ，９２：２６１３－２６２８，１９９８）、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて、密度勾配分離によって調製する。４００×ｇ、４℃、３０分間の遠心分離後、淡黄色の層をホールピペットで除去し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）からなる「ＨＨＦ」中で３回洗浄する。

続いて、ＳＴＲＯ－３^＋（またはＴＮＡＰ^＋）細胞を、以前に記載されるように（Ｇｒｏｎｔｈｏｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１６：１８２７－１８３５，２００３；Ｇｒｏｎｔｈｏｓ ａｎｄ Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｂｌｏｏｄ，８５，９２９－９４０，１９９５）、磁気活性化細胞選別により単離した。簡潔には、およそ１～３×１０^８個のＢＭＭＮＣを、ＨＨＦ中１０％（ｖ／ｖ）正常ウサギ血清からなるブロッキングバッファー中で、２０分間、氷上でインキュベートする。細胞を、ブロッキングバッファー中１０μｇ／ｍｌのＳＴＲＯ－３ ｍＡｂ溶液（２００μｌ）とともに、氷上で１時間インキュベートする。続いて、細胞を４００×ｇでの遠心分離によってＨＨＦ中で２回洗浄する。ＨＨＦバッファー中１／５０希釈のヤギ抗マウスγ－ビオチン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を加え、細胞を氷上で１時間インキュベートする。細胞を、上記と同様に、ＭＡＣＳバッファー（１％ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０１％アジ化ナトリウムを補充したＣａ^２＋及びＭｎ^２＋を含まないＰＢＳ）中で２回洗浄し、最終体積０．９ｍｌのＭＡＣＳバッファー中に再懸濁する。

１００μｌのストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を細胞懸濁液に添加し、氷上で１５分間インキュベートする。細胞懸濁液を０．５ｍｌのＭＡＣＳバッファーで２回洗浄し、再懸濁した後、ミニＭＡＣＳカラム（ｍｉｎｉ ＭＡＣＳ ｃｏｌｕｍｎ）（ＭＳ Ｃｏｌｕｍｎｓ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）上にロードし、０．５ｍｌのＭＡＣＳバッファーで３回洗浄して、ＳＴＲＯ－３ｍＡｂ（２００５年１２月１９日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にＰＴＡ－７２８２の受託番号で寄託；国際特許出願第２００６／１０８２２９号を参照）と結合しなかった細胞を回収する。さらに１ｍｌのＭＡＣＳバッファーを加えた後、カラムを磁石から取り除き、ＴＮＡＰ^＋細胞を陽圧で単離する。各画分からの細胞アリコートをストレプトアビジン－ＦＩＴＣで染色し、純度をフローサイトメトリーで評価することができる。

このようにして単離されたＭＰＣは、ＳＴＲＯ－１^{ｂｒｉｇｈｔ}ＭＰＣである。

実施例２：開始培地－プロセスＡ
一般にイーグルαＭＥＭと称される、アール平衡塩を有するイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）のアルファ改変は、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及び添付されたビタミンを含む。これらの改変は、マウスとハムスターのハイブリッド細胞（Ｓｔａｎｎｅｒｓら、Ｎａｔ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．，２３０，５２－５４，１９７１）を増殖させる際に使用するために最初に記載された。

主要な幹細胞を培養するのに適したイーグルαＭＥＭ培地は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ及びＳｉｇｍａなどの様々な供給源から得ることができる。

例示のプロセスで使用される必要な増殖因子を含む主要な幹細胞培養物を確立する詳細な方法は、Ｇｒｏｎｔｈｏｓ ａｎｄ Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｂｌｏｏｄ，８５，９２９－９４０，１９９５に記載されている。
プロセスＡでは、１０％ウシ胎児血清、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸（１００μＭ）、デキサメタゾン（１０－７Ｍ）、及び／または無機リン酸塩（３ｍＭ）で補充されたイーグルαＭＥＭ培地が、幹細胞を培養するために使用された。

実施例３：改変培養培地－プロセスＢ
プロセスＢでは、プロセスＡで使用したイーグルαＭＥＭ培地は、以下によって改変（改変αＭＥＭ）された。
・長時間作用型のアスコルビン酸誘導体Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸を短期作用型のアスコルビン酸誘導体Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム（５０ｍｇ／Ｌ）で置換する。
・ＦＣＳを１０％（ｖ／ｖ）から５％（ｖ／ｖ）まで低減する。
・－非胎児血清（５％ｖ／ｖ）で補充する。

実施例４：細胞培養
間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）を単一のドナーから得て、以下の凍結保存法で保存した。

一般に、細胞培養は、以下の工程を含んだ。

凍結保存されたＭＰＣを解凍し、１０，０００個の細胞／ｃｍ^２で播種し、開始培地（プロセスＡ、ｎ＝３）または改変培養培地（プロセスＢ、ｎ＝３）のいずれかで９０％のコンフルエンスまで２０％のＯ_２、３７℃で増殖させた。

馴化培地を生成するために、増殖培地を２００μｌの培地／ｃｍ^２の量でＦＣＳを補充したＥＢＭ－２基本培地（Ｌｏｎｚａ）と交換した。細胞はさらに３日間培養し、その後、培地を回収し、任意の細胞を除去するために遠心分離し、生じた上清を回収し、－８０℃で保存した。

増殖因子の濃度は、市販キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したＬｕｍｉｎｅｘプラットフォームを使用して測定した。

細胞培養に続いて、ＭＰＣ増殖ダイナミクスを評価した（図１～図３参照）。細胞増殖、ＭＰＣ倍加時間または集団倍加時間の有意な変化は、細胞培養プロセスＡ及びＢの後、観察されなかった。

ＭＰＣはまた、ＳＴＲＯ－１、ＣＣ９及びＳＴＲＯ－４だけでなく、プロ血管新生増殖因子Ａｎｇ１及びＶＥＧＦの細胞マーカーの発現レベルの点で特徴付けられる。

ＳＴＲＯ－１、ＣＣ９及びＳＴＲＯ－４のレベルは、細胞培養プロセスＡ及びＢ後のＭＰＣと同等だった。
しかし、培養プロセスＢは、
・Ａｎｇ１レベルを増加させ、
・ＶＥＧＦレベルを減少させ、
・以前に血管新生を増強する上で特に効果があることを示したＡｎｇ１：ＶＥＧＦ比率と一致するＡｎｇ１：ＶＥＧＦの比率を提供する。
プロセスＡまたはＢで培養したＭＰＣの馴化培地のＡｎｇ１及びＶＥＧＦのレベル（μｇ／１０^６細胞）の測定値を表２に示す。

実施例５：改変培養条件－プロセスＣ及びＤ
長時間作用アスコルビン酸誘導体、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸の短時間作用型のアスコルビン酸誘導体Ｌ－アスコルビン酸ナトリウムとの交換を制御するために、３つの異なるドナーからのＭＰＣは、α－ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋５０ｍｇ／ＬのＬ－アスコルビン酸ナトリウム（プロセスＣ）またはα－ＭＥＭ＋３％ヒトＡＢ血清＋５０ｍｇ／ＬのＬ－アスコルビン酸ナトリウム（プロセスＤ）とＰＤＧＦ及びＥＧＦなどの増殖因子で連続的に伝播された。

Ａｎｇ１及びＶＥＧＦのレベルは、プロセスＣ及びＤの細胞培養の後に評価した。プロセスＣまたはＤで培養したＭＰＣの馴化培地のＡｎｇ１及びＶＥＧＦのレベル（uｇ／１０^６細胞）を表３に示す。

プロセスＣと比較して、培養プロセスＤは、
・Ａｎｇ１レベルを増加させ、
・ＶＥＧＦレベルを減少させ、
・ＶＥＧＦ：Ａｎｇ１の比率を増加させる。
プロセスＡと比較して、プロセスＣ及びＤは、Ａｎｇ１の発現レベルの進行性増加をもたらす。これは、短時間作用型のアスコルビン酸誘導体及び非胎児血清の存在が、それぞれ独立してＡｎｇ１の発現の増加をもたらすと共にＡｎｇ１の発現をさらに増加させる相乗効果を発揮することを示唆している。

実施例６：炎症誘発性Ｍ１単核細胞のＭ２表現型への分極
ＣＤ１４＋単核細胞を全血から免疫選択した。単核細胞集団をＣＤ１６発現に基づいて特性評価した。５．２％の細胞がＭ２型マクロファージの表現型特性（ＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋）を示した（図４）。

ＣＤ１４＋単核細胞と、高レベルのＡｎｇ１を発現するＭＰＣとを７日間共培養した。ＭＰＣは、２名の異なるドナーから得た（＃０２３及び＃００９）。

共培養の３日後、細胞を以下に関して評価した。
・ＣＤ１４、ＣＤ１６発現；及び
・リポ多糖体（ＬＰＳ）に反応したＴＮＦ－αの分泌。ＬＰＳは、１ｎｇ／ｍｌを２４時間添加した（最後の５時間は＋伝達阻害薬）。

共培養により、以下が生じた。
・Ｍ２型マクロファージの表現型特性（ＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋ＣＤ１６３^＋ＣＤ２０６^＋）を示すマクロファージの生成（図４）
・マクロファージによるＴＮＦαの炎症誘発性（ＬＰＳ）分泌の阻止（図５）

共培養の７日後、ＬＰＳに応答したＩＬ－１０の分泌について、細胞を評価した。ＬＰＳは、１ｎｇ／ｍｌを２４時間添加した（最後の５時間は＋伝達阻害薬）。細胞内フローサイトメトリーによりＩＬ－１０発現を分析した。マクロファージによるＩＬ－１０産生は、ＬＰＳの存在下におけるＭＰＣとの共培養によって向上した（図６）。

これらのデータは、高レベルのＡｎｇ１を発現するＭＰＣがＭ２型マクロファージの産生を促進することを示している（図７）。

高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を漸増量のＩＬ－１βのみまたはＴＮＦ－αと組み合わせて培養し、ＰＧＥ２分泌に対するこれらのサイトカインの影響を評価した。

ＰＧＥ２発現に対するＩＬ－１βとＴＮＦ－αの相加作用が観察された（図８）。

ＰＧＥ２は、Ｔｈ１７細胞のＴｈ２細胞及びＴＲｅｇ細胞への分化だけでなく、Ｍ１型マクロファージのＭ２型マクロファージへの分極も促進する（図７）。ＩＩ型糖尿病などの炎症性疾患を患う対象にて、高いＩＬ－１及びＴＮＦ－αレベルが観察されている。

したがって、ＴＮＦα及びＩＬ１βに応じた、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞からのＰＧＥ２の分泌増加は、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞が、炎症性疾患を患う対象において、抗炎症性細胞の産生を増加させ得ることを示唆している。特に、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞は、
・Ｍ１型マクロファージのＭ２型マクロファージへの分極を促進することによって、Ｍ２型マクロファージ産生を増加させ得；及び／または
・Ｔｈ１７細胞の分化を促進することによって、Ｔｈ２及びＴｒｅｇの産生を増加させ得る。

実施例７：コラーゲン誘発性関節炎のヒツジモデル
高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を関節リウマチのヒツジモデルに投与した（Ｔｈｏｒｐｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，１０：１４３－１５０（１９９２）。このモデルは、全身及び関節の両方の関節リウマチの炎症性発現を特徴とする。

１億５０００万個の凍結保存ヒツジＭＰＣを頸静脈から静脈投与した。

ＩＬ－１７及びＩＬ－１０レベルを２週にわたって評価した。炎症誘発性及び抗炎症性サイトカインのレベル変化を（図９）に示す。

後期疾患の確立時（４２日目）にも、高レベルのＡｎｇ１を発現する幹細胞を投与した。幹細胞の投与は、関節における炎症性サイトカインのレベル減少をもたらした（図１０）。

実施例８：糖尿病における幹細胞投与
メトホルミンまたはメトホルミンともう１つの経口治療薬により十分にコントロールされていない２型糖尿病であるヒト被験者に、３つの用量の間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）の単回静脈内注射を注入して、プラセボ対照と比較した。ＨｂＡ１ｃ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－アルファ、空腹時インスリン、アディポネクチン、オステオカルシン及びｈｓＣＲＰのベースラインの変化を１２週にわたって評価した。

被験者を３つのコホートに分けた（図１１）。
コホート１：ＭＰＣ１用量（３０万細胞／ｋｇ）［ｎ＝１５］またはプラセボ［ｎ＝５］
コホート２：ＭＰＣ１用量（１００万細胞／ｋｇ）［ｎ＝１５］またはプラセボ［ｎ＝５］
コホート３：ＭＰＣ１用量（２００万細胞／ｋｇ）［ｎ＝１５］またはプラセボ［ｎ＝５］

ＭＰＣで治療した被験者では、わずかな増加があったプラセボ対照被験者と比較して、ＨｂＡ１ｃのわずかな減少が観察された（表４）。８週のコホート２対プラセボでは、ＨｂＡ１ｃのより大きな減少が観察された（表４）。ＨｂＡ１ｃの大きな減少傾向は、ベースラインＨｂＡ１ｃ値が８％以上である被験者で観察された（図１５）。４５名中８名（１７．８％）の被験者が１２週で目標ＨｂＡ１ｃ（＜７．０％）を達成した（図１６）。
プラセボ対照被験者と比較して、ＭＰＣ治療被験者において、空腹時インスリン及びアディポネクチンレベルの改善傾向（図１２）が観察された。プラセボ対照被験者と比較して、ＭＰＣ治療被験者にてＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－６レベルの減少があり、最も顕著な減少はコホート３で観察された（図１３）。コホート３において、ＴＮＦ－アルファ（図１３）及びＩＬ－６（図１４）のベースラインからの変化は、それぞれ－０．２６ｐｇ／ｍｌ及び－０．４７ｐｇ／ｍｌであった（図１３）。

実施例９：関節リウマチにおける幹細胞投与
不十分な抗ＴＮＦαレスポンダーに分類される関節リウマチを患うヒト被験者または最大２つの別の生物学的製剤が奏功しなかったヒト被験者に、２つの用量の間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）の単回静脈内注射を注入して、プラセボ対照と比較した。

試験に含めた４８名の被験者は、＋ＲＦ／抗ＣＣＰ；＞４腫脹／圧痛関節；ＥＳＲ／ＣＲＰ＞ＵＬＮであった。

被験者を２つのコホートに分けた。
コホート１：ＭＰＣ用量（１００万細胞／ｋｇ）［ｎ＝１６］またはプラセボ［ｎ＝８］
コホート２：ＭＰＣ用量（２００万細胞／ｋｇ）［ｎ＝１６］またはプラセボ［ｎ＝８］

注入後３ヶ月の評価エンドポイントには、以下を含めた。
・ＴＮＦα；ＩＬ－６（図１７）、ＩＬ－１７；ＲＡＮＫＬ；ＭＭＰ－１、３、９；ＴＩＭＰ－１、２、４及びオステオカルシンの各レベル。０、１、２、４、６、８及び１０週にもレベルを評価した。
・ＡＣＲ２０（図１８）／５０（図１９）／７０（図２０）；
・ＡＣＲ個アセット（図２１；図２２）；
・寛解（疾患活動性スコア（ＤＡＳ２８（ＣＲＰ））＜２．６）（図２３）；
・疾患活動性スコア（ＤＡＳ２８）；ＥＳＲ／ＣＲＰ；ＨＡＱ－ＤＩ（図２４）；ＳＦ－３６（寛解ＤＡＳ２８（ＣＲＰ）＜２．６）；応答ＤＡＳ２８（ＣＲＰ）＜３．２（図２３）のベースラインからの変化；
・６ヶ月及び１２ヶ月時の手／手首のＸ線

コホート１と関係した治療に関連する重篤な有害事象（ＳＡＥ）はなかった。早期かつ持続した有効性が３ヶ月にわたって認められた。

１～１２週にわたって、プラセボと比較してコホート１にて、ＩＬ－６レベルがベースラインから減少した（図１７）。

データにより、他の生物学的製剤よりも高いと思われる約２０％の潜在的寛解率の示唆が裏付けられている（図２３）。

コホート１に関する１２週での主要エンドポイントでは、プラセボに勝る応答改善の一貫した傾向が明らかである。

追跡中間分析は、経時的なレスポンダー効果の持続性を示している。

コホート２は、より多い単回用量での試験が進行中である。

実施例１０：糖尿病性腎症における幹細胞投与
２型糖尿病及び中程度～重度慢性腎臓疾患であり、糖尿病性腎症向けのＡＣＥｉまたはＡＲＢ療法の安定レジメン中であるヒト被験者に、２つの用量の間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）の単回静脈内注射を注入して、プラセボ対照と比較した。

被験者を２つのコホートに分けた。
コホート１：ＭＰＣ１用量（１億５０００万細胞／ｋｇ）［ｎ＝１０］またはプラセボ［ｎ＝５］
コホート２：ＭＰＣ１用量（３億細胞／ｋｇ）［ｎ＝１０］またはプラセボ［ｎ＝５］

注入後３ヶ月及び６ヶ月の評価エンドポイント：
・測定ＧＦＲ（ｍＧＦＲ［９９Ｔｃ ＤＴＰＡ］）（図２５）、推算ＧＦＲ（ｅＧＦＲ［ＭＤＲＤ］）（図２５）、ＩＬ－６（図２６）；及び血清クレアチニンの各レベル；
・ＩＬ－６と血清クレアチニンレベルとの間の相関関係（図２７）

最初の２４週間の調査期間中に、プラセボに対し、ＭＰＣ治療被験者にて、測定ＧＦＲと推算ＧＦＲの両方による腎機能の予防または改善の傾向が観察された。
・治療効果は、両方のＭＰＣ用量で類似した。
・ベースラインｅＧＦＲ＞３０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２の被験者において、ＭＰＣでの治療効果がより顕著であった（図２８）。
・ベースラインＩＬ－６レベルが中央値を超える被験者でのより顕著なＭＰＣでの治療効果；
・ベースラインＩＬ－６レベルと血清クレアチニンのＭＰＣ関連改善との間の優位な相関関係（図２７）；
・ＭＰＣ群対プラセボでは、１２週時の血清ＩＬ－６レベルに用量依存変化があった（図２６）。

多数の変形及び／または修正を、広く記載された本開示の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示すように、本開示になされ得ることが当業者によって理解されるであろう。したがって、本実施形態は、すべての点において例示としてみなされるべきであり、限定的とみなされるべきではない。

本出願は、２０１４年６月１０日出願のＡＵ２０１４９０２１９４及び２０１４年６月１３日出願のＡＵ２０１４９０２２５７の優先権を主張するものであり、これらの開示を参照により本明細書に援用する。

本明細書で考察及び／または参照したすべての刊行物は、その全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に含まれている、文書、行為、材料、装置、物品などの考察は、いずれも本発明についての状況を提供することを目的とするのみである。これらの事柄のいずれかまたは全部が、本出願の各特許請求の範囲の優先日前に存在していたので、本発明の関連分野において、先行技術基盤の一部を形成する、またはありふれた一般的な知識であるということの承認として理解すべきではない。

Claims (17)

1. 遺伝的に変更されていない間葉系統前駆細胞を含む、対象の炎症性疾患を治療するための組成物であって、前記遺伝的に変更されていない間葉系統前駆細胞が、２：１から３０：１の間の［アンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）］比で、アンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現し、前記炎症性疾患が炎症性肺疾患である、組成物。
2. 対象において抗炎症性細胞の産生及び／又は機能を増加させる、請求項１に記載の組成物。
3. Ｔｈ２細胞、ＴＲｅｇ細胞又はＭ２型マクロファージの産生及び／又は機能を増加させる、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
4. 対象においてＭ２型マクロファージの数を増加させる、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. ・前記対象において、Ｍ２型マクロファージの数を総単核細胞集団の１０％から８０％の間まで増加させる；
   ・Ｍ１からＭ２表現型へのマクロファージの分極を促進する；
   ・炎症誘発性ヘルパーＴ細胞のＴｈ２細胞若しくはＴＲｅｇ細胞への分化を促進する；
   ・前記対象において、抗炎症性サイトカインのレベルを増加させる；
   ・前記対象において、ＩＬ－１０のレベルを増加させる；
   ・前記対象において、炎症誘発性サイトカインのレベルを減少させる；
   ・前記対象において、ＩＬ－６、ＴＮＦ－アルファ及び／若しくはＩＬ－１７のうちのいずれか１つのレベルを減少させる；
   ・前記対象において、炎症誘発性細胞の産生及び／若しくは機能を阻害する；又は
   ・前記対象において、Ｔｈ１７細胞若しくはＭ１型マクロファージの産生及び／若しくは機能を阻害する、
   請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
6. ・前記Ｍ２型マクロファージが、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋である；又は
   ・前記炎症誘発性ヘルパーＴ細胞が、Ｔｈ１７細胞である、
   請求項３～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記対象における抗炎症性細胞の産生及び／又は機能を増加させることが、
   ・前記対象におけるＩＬ－６レベルの減少；
   ・前記対象におけるＴＮＦ－アルファレベルの減少；及び／又は
   ・前記対象におけるＩＬ－１０レベルの増加
   をもたらす、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記炎症性肺疾患が、炎症性肺損傷又は間質性肺疾患である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記炎症性肺疾患が、間質性肺疾患である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記遺伝的に変更されていない間葉系統前駆細胞が、少なくとも約２０：１の比率のＡｎｇ１：ＶＥＧＦを発現する、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. ・１ｋｇあたり約１．５×１０^６個～約６×１０^６個の間葉系統前駆細胞が前記対象に投与される；又は
    ・１ｋｇあたり約４×１０^６個の間葉系統前駆細胞が前記対象に投与される
    請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記間葉系統前駆細胞が、少なくとも２回、投与される、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記間葉系統前駆細胞が、静脈内に投与される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 前記遺伝的に変更されていない間葉系統前駆細胞が、５：１から２０：１の間の［Ａｎｇ１：ＶＥＧＦ］比で、Ａｎｇ１とＶＥＧＦを発現する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. 前記遺伝的に変更されていない間葉系統前駆細胞が、間葉系前駆細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. 炎症性肺疾患を治療するための医薬の製造における遺伝的に変更されていない間葉系統前駆細胞を含む組成物の使用であって、前記遺伝的に変更されていない間葉系統前駆細胞が、２：１から３０：１の間の［アンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）］比で、アンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現し、前記医薬が、対象において抗炎症性細胞の産生及び／又は機能を増加させる、使用。
17. 前記炎症性肺疾患が、炎症性肺損傷又は間質性肺疾患である、請求項１６に記載の使用。

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