JP4859078B1 - 新規間葉系幹細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】抜歯窩より採取した肉芽組織由来の細胞から選別された新規間葉系幹細胞による。新規間葉系幹細胞は、抜歯窩より採取した肉芽組織を培養し、形成された細胞コロニーを収集することにより選別される。従来の方法に比べて、容易に細胞を採取することができ、提供者にとって負担が少ない。また、本発明の抜歯窩より採取した肉芽組織由来の細胞は、骨髄由来の細胞に比べてコロニー形成能が高く、より効率的に間葉系幹細胞又は前駆細胞が採取可能である。さらに、一度採取した抜歯窩から何度も同じ特性を有する細胞を採取することができる。
【選択図】図8
Description
1.抜歯窩より採取した肉芽組織由来の新規間葉系幹細胞。
2.抜歯窩より採取した肉芽組織が、抜歯後10日までに形成された肉芽組織である前項1に記載の新規間葉系幹細胞。
3.抜歯窩より採取した肉芽組織を培養し、形成された細胞コロニーを収集することを特徴とする、新規間葉系幹細胞の選別方法。
4.抜歯窩より採取した肉芽組織が、抜歯後10日までに形成された肉芽組織である前項3に記載の新規間葉系幹細胞の選別方法。
5.前項3又は4に記載の選別方法により選別された新規間葉系幹細胞。
6.前項1、2又は5に記載の新規間葉系幹細胞を含む再生医療用組成物。
7.再生医療用組成物が、骨形成用再生医療用組成物である前項6に記載の再生医療用組成物。
8.再生医療用組成物が、脂肪細胞形成用再生医療用組成物である前項6に記載の再生医療用組成物。
イヌの抜歯を行い、抜歯後3日目、7日目、10日目、14日目、2ヶ月目の抜歯窩周辺の組織をHE(ヘマトキシリン・エオジン)染色することにより、抜歯窩の治癒過程の組織学的評価を行った。図1〜6に示すように、抜歯後3日目より骨芽細胞が観察され、その後新生骨梁が形成されることを観察した。
以下、本実施例及び各実験例で使用する細胞について、肉芽組織由来のものを「DSSC: Dental Socket Stem Cells」といい、対照として、骨髄由来のものを「BMSC: Bone marrow stromal cell」という。イヌの抜歯窩肉芽組織由来の細胞を以下のa)〜c)に示し、対照として、イヌの上顎骨骨髄及び長管骨骨髄由来の細胞を以下のd)〜e)に示した(図7参照)。
b)ステップa)の後、3日目の、a)と同じ抜歯窩由来肉芽組織から採取した細胞(DSSC 3days again)
c)抜歯後10日目の抜歯窩由来肉芽組織から採取した細胞(DSSC 10days)
d)上顎骨(maxilla)由来骨髄から採取した細胞(BMSC maxilla)
e)長管骨(long bone)由来細胞から採取した細胞(BMSC LB)
実施例1で作製された各間葉系幹細胞のうち、特にDSSC 3days、DSSC 3days again、BMSC maxilla又はBMSC LBについて、細胞分裂能の指標の一つとして、テロメラーゼ活性を測定した。テロメラーゼ活性は、市販のキット(TeloExpress Quantitative Telomerase Detection Kit, Express Biotech International, Thurmount, USA)を用い、リアルタイムRT-PCRにて定量した。その結果、図10に示すように、DSSC 3daysは他のBMSCと比べ同等以上のテロメア活性を有することが確認された。
実施例1で作製された各間葉系幹細胞のうち、特にDSSC 3days、DSSC 3days again、BMSC maxilla又はBMSC LBについて、骨芽細胞分化誘導前の細胞と、骨芽細胞誘導培地で3日間培養した細胞について、骨芽細胞分化マーカーであるALPの発現量を、GAPDHを標準として定量した。各細胞がコンフルエントになった状態で、以下の骨芽細胞誘導培地に交換して培養し、3日後に培養上清をサンプルとして回収した。
ALP センスプライマー: AGATGTGGAGTATGAGATGGA(配列番号1)
ALP アンチセンスプライマー: CGTAGTGAGAGTGCTTGTG(配列番号2)
GAPDH センスプライマー: GCTGAGTATGTTGTGGAGTC(配列番号3)
GAPDH アンチセンスプライマー: AGAAGGAGCAGAGATGATGA(配列番号4)
実施例1で作製された各間葉系幹細胞のうち、特にDSSC 3days、DSSC 3days again、BMSC maxilla又はBMSC LBについて、細胞表面マーカータンパク質の解析をフローサイトメトリー法により行った。細胞表面各マーカーに対する各モノクローナル抗体を用いたゲート設定法にて解析を行った。それぞれの細胞をタンパク質分解酵素及びコラーゲン分解酵素を含む細胞剥離用溶液(Accutase(R))を用い培養皿から剥がし、抗CD34(MA1-81639,Thermo)、抗CD45 (MA1-80304)、抗CD29(555443, BD Pharmigen)、抗CD44(555478, BD Pharmigen)、抗CD90(559869, BD Pharmigen)、抗CD271(130-091-917, Miltenyi Biotec)の各抗体存在下で4℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、1% FBSを含むPBSバッファーで洗浄し、フローサイトメーター(MACSQuantTM Analyzer, Miltenyi Biotec)を用いて解析を行った。
実施例1で作製された各間葉系幹細胞のうち、特にDSSC 3days、DSSC 3days again、BMSC maxilla又はBMSC LBの異所性骨形成能を動物モデルを用いて評価した。
2〜3×106個の各細胞と40mgの骨補填材であるβ-リン酸三カルシウム(β-TCP)(OSferion、オリンパステルモバイオマテリアル株式会社)を37℃で一時間半混和後、1200rpmで一分間遠心し、上清を除去し、各細胞とβ-TCPの各複合体を作製した。その後、作製した各複合体を、SCID (severe combined immunodeficiency disease)マウスの背皮下に移植した。8週後にサンプルを回収し、常法に従い脱灰パラフィン切片を作製した。切片をHE染色にて染色し、光学顕微鏡下で観察した結果、図12〜15に示すように、DSSC 3days及びDSSC 3days againについて、対照のBMSC maxilla及びBMSC LBと同様に骨芽細胞への分化が認められた。
実施例1で作製された各間葉系幹細胞のうち、特にDSSC 3days、DSSC 3days again、BMSC maxilla又はBMSC LBを培養皿に播種し、脂肪細胞誘導培地に交換し、1週間に2度の培地交換を行い、28日間培養した。脂肪細胞誘導培地として、市販のイヌ脂肪細胞分化培地(Canine Adipocyte Differentiation Medium; CELL Applications,INC)を用いた。脂肪誘導培地で培養した細胞をオイルレッド 0染色した結果、図16に示すように、DSSC 3days及びDSSC 3days againについて、対照のBMSC maxilla及びBMSC LBと同様に脂肪細胞に誘導されたことが確認された。
Claims (6)
- 抜歯窩より採取された肉芽組織であって、抜歯後10日までに形成された肉芽組織を単一細胞とし、15%血清含有αMEM培地を含む細胞コロニー形成用培地で培養し、形成した細胞コロニーを収集する工程を含む再生医療用間葉系幹細胞の調製方法。
- 抜歯後3日までに形成された肉芽組織を単一細胞とし、15%血清含有αMEM培地を含む細胞コロニー形成用培地で培養し、形成した細胞コロニーを収集する工程を含む、請求項1に記載の再生医療用間葉系幹細胞の調製方法。
- 抜歯窩より採取された肉芽組織を単一細胞とし、15%血清含有αMEM培地を含む細胞コロニー形成用培地で7〜21日間培養し、形成した細胞コロニーを収集する工程を含む、請求項1又は2に記載の再生医療用間葉系幹細胞の調製方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の再生医療用間葉系幹細胞の調製方法により調製した再生医療用間葉系幹細胞を、骨補填材と混合し又は足場材に播種する工程を含む、骨形成用再生医療用組成物の調製方法。
- 骨補填材が、β-リン酸三カルシウムである、請求項4に記載の骨形成用再生医療用組成物の調製方法。
- 足場材が、セラミックス、金属材料、生体吸収性又は非吸収性ポリマーから選択されるいずれかである請求項4に記載の骨形成用再生医療用組成物の調製方法。
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