MX2011010367A - Aislamiento de celulas germinales mesenquimales derivadas de la sangre de cordon umbilical humano. - Google Patents

Abstract

La sangre de cordón umbilical (UCB) contiene células germinales mesenquimales (MSC) que tienen una multipotencialidad más alta que las MSC derivadas de médula de adultos; sin embargo, ha sido difícil obtener estas células, debido a que la frecuencia de las MSC en la UCB es extremadamente rara (0.4 - 30 de 1 X 108 células mononucleares); hasta la fecha, el aislamiento de las MSC ha dependido de su capacidad de adhesión al plástico; algunas MSC "verdaderas" podrían perderse debido a que su capacidad para adherirse al plástico puede ser deficiente; los estudios previos demostraron que una matriz extracelular (ECM) hecha de células de médula ósea mejoraron la unión y proliferación de las MSC, y retuvieron sus propiedades de células germinales; la presente invención proporciona métodos para aislar las MSC de la sangre de cordón umbilical mediante la adherencia a una ECM y los usos para las células germinales aisladas.

Description

AISLAMIENTO DE CÉLULAS GERMINALES MESENQUIMALES DERIVADAS DE LA SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL HUMANO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente solicitud reclama el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de E.U.A. No. de Serie 61/165,193, presentada en Marzo 31 del 2009, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente como referencia.

Esta invención se hizo con el apoyo del gobierno bajo 5R21AG25466-2 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona generalmente con el campo de la biología. Más particularmente, se relaciona con métodos para aislar y cultivar células germinales mesenquimales de sangre de cordón umbilical (UCB).

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA Las células germinales son una de las áreas de la biomedicina más fascinantes actualmente. Las células germinales mesenquimales (MSC) son de un gran potencial terapéutico debido a su capacidad de autorrenovación y diferenciación en múltiples linajes.

Recientemente, la sangre de cordón umbilical (UCB) se ha propuesto como una fuente alterna de células germinales mesenquimales (MSC) para la terapia con células germinales en las áreas de artritis, enfermedad cardiaca, regeneración de nervios y tejidos. Las ventajas de utilizar las UCB-MSC con respecto a las MCS derivadas de médula ósea (BM-MSC) son 1 ) la UCB está disponible de manera abundante, y puede recolectarse sin daño a los donadores; y 2) las UCB-MSC tienen un potencial de expansión más alto y una mayor capacidad de diferenciación. Sin embargo, la mayor limitación en el uso de UCB-MSC para las aplicaciones de investigación y clínicas, es que la frecuencia de las MSC en la UCB es extremadamente baja (~0.4 a 30 de 1 X 108 células mononucleares, MNC) y la proporción de éxito del aislamiento de UCB-MSC es también baja (~ 30%). En cuanto a las células germinales, es difícil expandirlas en un cultivo a largo plazo sin la pérdida de sus propiedades de las células germinales. Hasta la fecha, las MSC se aislan de médula ósea o cualesquier otros tejidos mediante el método clásico de la adhesión a plástico, debido a una falta de marcadores específicos que puedan definir estas células. Wolfe et al., 2008; Soleímani y Nadri, 2009; Kern et a/., 2006. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells 24:1294-1301 .

Utilizando el mismo procedimiento, la mayoría de las MSC extremadamente inmaduras en la UCB se pierden probablemente debido a que su capacidad para adherirse al plástico es deficiente. Recientemente, se reportó que una matriz extracelular (ECM) hecha de células de médula ósea mejoraba la unión y proliferación de las MSC, y retenía sus propiedades de las células germinales. Chen er a/. , 2007, JBMR, 22:1943.

Aquí, la invención proporciona métodos para aislar, fomentar la proliferación de las MSC mediante la adherencia a las ECM. Utilizando este sistema, puede aislarse un gran número de hUCB-MSC, indicando que la frecuencia es al menos 1000 veces mayor que la reportada previamente por otros que aislaron las UCB-MSC con el método de clásico de adhesión al plástico prerrecubierto con fibronectina o FBS. De manera más importante, las MSC obtenidas por la ECM formaron cuerpos embriónicos in vitro, una característica única de las células germinales embriónicas, y generaron tejidos originados de 3 capas germinales embriónicas in vivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para aislar células germinales mesenquimales (MSC) de la sangre de cordón umbilical mediante la adherencia a una matriz extracelular (ECM) y usos para las MCS aisladas.

En un aspecto, la invención proporciona un método para aislar las células germinales mesenquimales (MSC), que comprende (a) recolectar una muestra; (b) sembrar la muestra en un plato de cultivo prerrecubierto con la matriz extracelular (ECM); y (c) aislar las MSC. En algunas modalidades, el método comprende además, centrifugar la muestra para recolectar las células mononucleares antes de la siembra.

En aún otras modalidades, el método comprende además, implantar las MSC aisladas para obtener un tejido diferenciado. En otras modalidades, el método comprende además, implantar las MSC aisladas para obtener un tejido diferenciado.

En otros aspectos, la invención proporciona un método para fomentar la proliferación de las MSC, que comprende (a) obtener una muestra de MSC aisladas; y (b) sembrar las MSC aisladas en una ECM para fomentar la proliferación de la muestra de MSC aisladas.

En aún otros aspectos, la invención proporciona un método para producir tejidos diferenciados, que comprende (a) obtener una muestra de MSC aisladas; y (b) implantar las MSC aisladas en un ratón ¡nmunocomprometido para obtener un tejido diferenciado.

La muestra puede ser de cualquier tejido o una muestra que contiene MSC. En algunas modalidades, la muestra es del periostio, hueso trabecular, tejido adiposo, sinovio, músculo esquelético, dientes no permanentes, páncreas, pulmón, hígado fetal, fluido amniótico, sangre de cordón umbilical y tejidos del cordón umbilical. En las modalidades particulares, la muestra es sangre de cordón umbilical (UCB). La muestra puede ser de cualquier mamífero, y en las modalidades particulares es de un humano. La muestra puede recolectarse en cualquier momento. En las modalidades particulares, la muestra se recolecta después del nacimiento. En otras modalidades, la muestra puede recolectarse antes del nacimiento.

La matriz extracelular puede derivarse de cualquier fuente adecuada. En algunas modalidades, la matriz extracelular se deriva de células de médula ósea humana. En las modalidades particulares, las ECM pueden comprender colágeno del tipo I, colágeno del tipo III, fibronectina, biglicano, decorin, perlecan y/o laminina.

El tejido diferenciado puede comprender varias capas. En las modalidades particulares, el tejido diferenciado comprende tres tejidos derivados de capas germinales embriónícas. En algunas modalidades, el tejido diferenciado comprende endodermo-glándula; mesodermo-hueso, músculo, grasa, vasos sanguíneos y/o ectodermo-fibra nerviosa.

Las modalidades en la sección de Ejemplos se entienden que son modalidades de la invención que son aplicables para todos los aspectos de la invención.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza para significar "y/°" a menos que se indique de manera explícita para referirse a alternativas únicamente o a las alternativas que son mutuamente excluyentes, aunque la descripción sustenta una definición que se refiere sólo a las alternativas e "y/o".

A través de esta solicitud, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la desviación estándar del error para el dispositivo o método que se emplea para determinar el valor.

Siguiendo una ley de patentes de hace bastante tiempo, las palabras "uno, una", cuando se utilizan en conjunto con la palabra "comprende" en las reivindicaciones o la especificación, denota uno o más, a menos que se indique de manera específica.

El término "terapéuticamente efectivo", como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad de células y/o una composición terapéutica (tal como un polinucleótido terapéutico y/o polipéptido terapéutico), que se emplea en los métodos de la presente invención, para lograr un efecto terapéutico, de manera que al menos un síntoma de una condición que se está tratando, al menos es aliviado.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención se volverán evidentes de la siguiente descripción detallada. Deberá entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican las modalidades específicas de la invención, se proporcionan a manera de ilustración únicamente, puesto que varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención, se volverán evidentes para aquellos con experiencia en la técnica, a partir de esta descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar además, ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor con referencia a uno o más de estos dibujos, en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas aquí.

Figuras 1A-1 D icrografias de exploración de los cultivos de células estromales humanas y su ECM. Micrografias SEM de las células estromales cultivadas antes (Figuras 1A, 1 B), y después de la eliminación de las células (Figuras 1 C, 1 D). La flecha en la figura 1 B denota una célula. Se utilizó un procedimiento estándar basado en los estudios previos del inventor. Las células estromales de los pasajes 1 o 2 se sembraron en plástico de cultivo del tejido a 1 x 104 células/cm2, y se cultivaron durante 15 días. El medio (a-MEM que contiene FBS al 15%) se cambió cada 3-4 días, y se agregó ácido ascórbico (50 µ?) durante los 8 días finales del cultivo. Después de un lavado extenso con PBS, las células se eliminaron mediante incubación con Tritón X-100 al 0.5% que contiene NH4OH 20 mM en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS 4 veces, se agregó a las placas PBS que contiene 50 pg/ml de gentamicina y 0.25 pg/ml de fungizona, que se almacenaron a 4°C hasta por 4 meses.

Figura 2 Imágenes confocales que muestran la ubicación del colágeno del tipo I, III, fibronectina, biglicano, decorin, perlecan y laminina en la ECM elaborada con células estromales de médula ósea humana. Las proteínas se detectaron utilizando anticuerpos contra los componentes indicados y los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia. La IgG de isotipo no específico se utilizó como un control negativo (Control Negativo). La tinción nuclear con DAPI se muestra en azul.

Figuras 3A-3D Las células no adherentes eliminadas de la placa 2D y de la ECM 4 horas y 72 horas después de la siembra primaria se volvieron a sembrar en placas de la ECM. 24 horas después de volver a sembrar, las células no adherentes de la placa 2D primaria mostraron 5 veces más células unidas (Figuras 3A, 3C; tinción con violeta de metilo) que de la placa de la ECM primaria (Figuras 3B, 3D).

Figura 4 La ECM facilita la unión y expansión de las MCS derivadas de UCB. La UCB humana se compró del Banco de Sangre de Cordón de Texas (San Antonio, TX). Las células mononucleares (MNC) aisladas de UCB se sembraron en la ECM o en plástico no recubierto a 1 x 106 MNC/cm2 y se incubaron para las varias veces indicadas a 37°C. A continuación, las células no adherentes se eliminaron mediante lavado con PBS. Amplificación original, x 100.

Figura 5 Formación de la colonia. Las UCB-MSC aisladas de la adhesión a la ECM formaron numerosas colonias (panel izquierdo, amplificación original, x 50, y panel medio, amplificación original, x 200), y algunas de éstas generaron cuerpos embriónicos (panel derecho, amplificación original, x 200).

Figuras 6A-6C Formación de la colonia. Las UCB-MSC se sembraron en la ECM (Figura 6A) o en plástico no recubierto (Figura 6B) a 1 x 106 MNC/cm2 y se incubaron durante 72 horas a 37°C (amplificación original, x 100). (Figura 6C) Cuerpos similares a los embriónicos se formaron en las placas recubiertas con la ECM (amplificación original, x 200).

Figuras 7A-7C Diferenciación celular. (Figura 7A) UCB-MSC no diferenciadas. (Figura 7B) Adipogénesis de las UCB-MSC, la tinción con aceite rojo mostró las gotitas de lípido. (Figura 7C) Miogénesis de las UCB-MSC, la tinción con hematoxilina mostró el miotubo con múltiples núcleos (flechas).

Figura 8 Análisis citométrico de flujo de las células aisladas mediante la adhesión a la ECM (ECM) vs. Las células aisladas por un método clásico de adhesión al plástico (Plástico). En los mismos experimentos previamente descritos en la Figura 4, se obtuvieron suspensiones de una sola célula de la incubación celular en la ECM o el plástico durante 72 horas después del tratamiento con tripsina, y se tiñeron con los varios anticuerpos primarios y los anticuerpos secundarios conjugados con FITC. Las células teñidas con el anticuerpo no específico primario (isotipo, IgG) funcionaron con el control negativo (picos grises). Las células teñidas se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACStarplus de Becton Dickinson con 10,000 eventos, recolectados para cada muestra.

Figuras 9A-9B Las UCB-MSC aisladas por la ECM generaron tejidos originados de 3 capas germinales embriónicas in vivo. Las UCB-MSC aisladas por la ECM y expandidas de manera continua en la ECM o las UCB-MSC aisladas por el plástico y expandidas de manera continua en el plástico, se cargaron en Gelfoam o hidroxiapatita/fosfato tricálcico (HA/TCP) que induce de manera favorable la esqueletogénesis, y se implantaron de manera subcutánea en la superficie dorsal de ratones beige inmunodeficientes de 10 semanas de edad. Cada vehículo se cargó con 0.5 x 106 células. Se realizaron tres implantes para cada condición. Los implantes se recolectaron después de 8 semanas de implante y se procesaron para el análisis histológico. Las secciones se tiñeron con H&E. Además, se utilizó la tinción con plata de Bieischowsky para identificar de manera especifica el nervio (véase el panel medio de las fibras Nerviosas). Para determinar el origen del tejido generado, una sección adyacente a la sección teñida con H&E se tiñó con un anticuerpo específicamente contra la ribonucleoproteína nuclear humana, comprado de Millipore (Billerica, MA). Los tejidos de ratón y de humano sirvieron como controles negativos y positivos, respectivamente. El tejido esquelético generado en los huesecillos se ha definido como de origen del donador (30). A, arteria; B, hueso; C, capilar; E, células endoteliales; F, grasa; G, glándula; M, músculo y N, nervio.

Figura 10 Perfiles de expresión del gen de las células de UCB aisladas mediante el método de adhesión a la ECM. El ARN se preparó de las células de UCB (paso 1 ) preaisladas y mantenidas en la ECM (UMSC/E) o en plástico (UMSC/P), de manera separada, de 4 donadores individuales. Los transcriptos de interés se determinaron mediante PCR en tiempo real utilizando TaqMan PCR Master Mix and Assay Demand (Applied Biosystems). El ARN aislado de las células ES humanas [(hES) línea celular H7] se proporcionó amablemente por el Dr. Christopher Navara de UTSA. El ARN de las MSC humanas (BMSC) se preparó de células de médula ósea humana compradas de ALLCELLS (Emeryville, CA) como se describe en el Método. *P < 0.01 (n = 4), hES vs. UMSC/E, o UMSC/P, o BMSC. †P< 0.01 (n = 4) UMSC/E vs. UMSC/P, o BMSC.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para aislar las MSC mediante adherencia a una ECM y usos de las MSC aisladas.

I. Células germinales mesenquimales (MSC) Las MSC son de un gran potencial terapéutico debido a su capacidad para autorrenovarse y de diferenciación en múltiples linajes. Las MSC son células germinales multipotentes que pueden diferenciarse en una variedad de tipos celulares. Los tipos de células en que las MSC han mostrado diferenciarse in vitro o in vivo incluyen osteoblastos, condrocitos, miocitos y adipositos. El término "células germinales" como se utiliza en la presente, se refiere a una célula que da lugar a uno o más linajes de células.

Se ha reportado que las MSC podrían aislarse de varios tejidos, incluyendo periostio, hueso trabecular, tejido adiposo, sinovio, músculo esquelético, dientes no permanentes, páncreas, pulmón, hígado fetal, fluido amniótico, sangre de cordón y tejidos de cordón umbilical. Entre éstos, la sangre de cordón puede ser la fuente ideal, debido a su accesibilidad, procedimientos indoloros para los donadores, fuentes promisorias de terapia con células autólogas y riesgo bajo de contaminación viral. Las células germinales de sangre de cordón umbilical pueden obtenerse del cordón umbilical inmediatamente después del nacimiento. Estas células germinales son menos maduras que aquéllas células germinales encontradas en la médula ósea de adultos o niños. Además, la sangre de cordón umbilical humano (hUCB) contiene células germinales mesenquimales MSC que tienen un potencial de expansión más alto y una mayor capacidad de diferenciación que las MCS derivadas de médula de adulto (BM-MSC). Sin embargo, estas células han sido difíciles de obtener con los métodos tradicionales debido a que la proporción de éxito del aislamiento de las UCB-MSC es bajo. Con los métodos tradicionales, para 10 muestras de UCB cualquiera, las UCB-MSC pueden aislarse de sólo 3 muestras (una proporción de éxito del 30%), y en esas muestras en las cuales pueden encontrarse UCB-MSC, el número absoluto de MSC en la UCB es extremadamente bajo (-5 a 30 de 1 x 108 células mononucleares, MNC).

II. Aislamiento de las MSC en la ECM Hasta la fecha, el aislamiento de las MSC ha dependido de su capacidad de adhesión al plástico. Así, algunas MSC verdaderas en la UCB se pierden probablemente debido a que su capacidad para adherirse al plástico es deficiente. Además, las células germinales requieren un microambiente especializado para mantener su función. La tecnología de cultivo de tejido actual no proporciona este ambiente, como se evidencia por una pérdida de las propiedades de las células germinales de las MSC. En su lugar, se someten a senescencia, "de manera espontánea" se asignan a un linaje celular particular o se vuelven células transformadas.

En algunos aspectos, la invención proporciona el aislamiento de las MSC mediante la adherencia a una ECM. Al utilizar el procedimiento de adhesión a la ECM, se logró el aislamiento de un número sorprendentemente grande de células germinales similares a las embriónicas de la sangre de cordón umbilical humano. Con el método descrito actualmente, una ECM nativa libre de células hecha de células de médula ósea humana (hBM) puede reconstituirse. La ECM comprende, al menos en parte, colágeno del tipo I y III, fibronectina, proteoglicanos pequeños ricos en leucina, tales como biglicano y decorin, y componentes mayores de la membrana basal, tales como perlecan y laminina. Todas estas proteínas de la matriz son muy importantes para regular la adhesión, migración, proliferación, diferenciación y supervivencia celular. Los componentes y la estructura única de las hBM-ECM imitan las características clave del microambiente in vivo que sustentan las MSC, y de manera notable, mejoran la unión y proliferación de las hUCB-MSC y retienen sus propiedades de células germinales.

La ECM hecha por las células de médula ósea mejoró la unión y proliferación de las UCB-MSC, y la retención de sus propiedades de las células germinales. Utilizando este sistema, se encontró que la UCB humana contiene un gran número de MSC que se adhieren a la ECM, pero no al plástico. Además, numerosas colonias se formaron cuando las células primarias se cultivaron en la ECM con una baja densidad de siembra (3 x 104 - 1 x 105 MNC/cm2). Estos datos indican que las UCB-MSC cultivadas en la EMC tienen una capacidad colonogénica mucho mayor que en el plástico. De acuerdo con la medición de las unidades de formación de la colonia (CFU), la frecuencia de las UCB-MSC es 22,800 - 37,000 de 1 x 108 MNC, al menos 1 ,000 veces (760 - 92,500) más que lo reportado previamente por otros (0.4 -30 de 1 x108 MNC).

De manera más importante, los estudios indicaron que sin ninguna inducción de la diferenciación específica, el implante de las MCS derivadas de la hUCB (hUCB-MSC) obtenidas por la ECM en ratones inmunocomprometidos, generaron tejidos derivados de 3 capas germinales embriónicas, incluyendo hueso, músculo, grasa, vaso sanguíneo, glándula y fibra nerviosa. Puesto que las hUCB-MSC aisladas por la ECM y cultivadas posteriormente en la ECM son nativas y pluripotenciales, que exhiben características de células hES, estas células son nombradas "células germinales similares a las embriónicas derivadas de la sangre de cordón umbilical humano (hUCB-ELSC).

Utilizando esta nueva tecnología, puede obtenerse un número sorprendentemente grande de UCB-ELSC de sólo una unidad de sangre de cordón. Sin ninguna inducción de la diferenciación específica, las hUCB-MSC cultivadas en la ECM, incluso en el paso 6-8, podrían diferenciarse de manera muy efectiva hacia varios tejidos originados de 3 capas germinales embriogénicas in vivo como hES. Basándose en estas características únicas, el método actualmente descrito es muy útil para: 1 . Investigación básica de diseño del tejido: Un gran número de hUCB-MSC altamente purificadas obtenidas por la adhesión a la ECM facilitará estudiar los mecanismos moleculares que controlan su comportamiento. 2. Descubrimiento del fármaco: Las hUCB-MSC altamente purificadas en la ECM pueden utilizarse para la selección de fármacos in vitro. 3. Usos clínicos de diseño del tejido: Un gran número de UCB-ELSC nativas y multipotenciales puede ser el sustituto de las células ES para las aplicaciones clínicas basadas en las células, en un futuro previsible.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Deberá apreciarse por aquellos con experiencia en el campo, que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan las técnicas descubiertas por el inventor, que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto, pueden considerarse como que constituyen los modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos con experiencia en la técnica deben, a la luz de la presente descripción, apreciar que muchos cambios pueden hacerse en las modalidades especificas que se describen y obtener todavía un resultado parecido o similar, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Preparación de la ECM libre de células de las células de médula ósea cultivadas (1 ) Comprar las células mononucleares de médula ósea humana aisladas recientemente (que contienen MSC, obtenidas de donadores de 20-30 años) de ALLCELLS (Emeryville, CA). (2) Emplacar las células en un matraz T175 a una densidad de 8.5-17 x 104 por cm2, y cultivar en a-MEM que contiene glutamina (4 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml), y suero bovino fetal preseleccionado al 15%. Después de 24 horas, eliminar las células no adherentes, agregar medio fresco y cultivar a una confluencia del 70% (2-3 semanas). (3) Lavar los cultivos con PBS. Desprender las células adherentes utilizando tripsina al 0.05%. Recolectar las células resuspendidas y volverlas a sembrar en plástico para el cultivo del tejido a 6 x 103 células/cm2, y cultivar durante 15 días. Cambiar la mitad del medio cada 3-4 días; se agregó ácido ascórbico (50 µ?) durante los 8 días finales del cultivo. Después de un lavado extenso con PBS, eliminar las células mediante incubación de Tritón X- 00 al 0.5% que contienen NH4OH 20 mM en PBS, pH 7.4, durante 5 minutos a 37°C. A continuación, lavar las placas con PBS 4 veces, y PBS que contiene 50 pg/ml de gentamicina y 0.25 g/ml de fungizona, y almacenar a 4°C hasta por 4 meses.

EJEMPLO 2 Aislamiento y cultivo de las MSC de HUCB (1 ) Aislamiento de las células mononucleares (MNC) de hUCB utilizando el Gradiente de densidad con Ficoll: Diluir la sangre de cordón anticoagulada (1 :1 ) con solución de sal Equilibrada (BSS). Colocar lentamente la sangre de cordón diluida en una capa de 10 mi de solución PREMIUM de Ficoll-Paque (GE Healthcare BioSciences Corp., Piscataway, NJ) (relación 4: 1 ) en un tubo de 50 mi. Centrifugar las muestras de sangre en capas a 480 g durante 30 minutos a 18-20°C. Recolectar la capa mononuclear/blanca en un nuevo tubo de 50 mi; agregar 3 volúmenes de BSS a las MNC; centrifugar la suspensión celular a 480 g durante 6 minutos a 18-20°C; resuspendidas en la pelotilla en 10 mi de aMEM que contiene FBS al 2%. Contar las células y verificar la viabilidad. (2) Sembrar a una densidad de 1 x 106 MNC/cm2 en placas o platos de cultivo prerrecubiertos con ECM derivada de células de médula ósea humana. Eliminar las células no adherentes 24 horas después del emplacado inicial. Lavar las células adherentes vigorosamente dos veces con PBS y agitar para eliminar cualesquier células no adherentes que contengan células hematopoyéticas, y agregar medio fresco. Cultivar las células adherentes fibroblastoides resultantes que contienen MSC (hUCB-MSC) a 37°C en una atmósfera humidificada que contiene CO2 al 5%. (3) Cambiar el medio una vez a la semana. El medio de expansión consiste de FBS al 20%. Mantener las MSC en el medio hasta que alcanzan 70% a 90% de confluencia. Las células pueden recolectarse a subconfluencia utilizando Tripsina al 0.05%. En el segundo paso, reemplacar las células a una densidad media de 6 x 03/cm2. (4) La generación de colonias fibroblastoides separadas únicas, denominadas unidades que forman colonias fibroblastoides (CFU-F) puede lograrse sembrando inicialmente las MNC a una baja densidad (1 x 103 a 1 x 105 células por cm2).

EJEMPLO 3 Comparación de la adherencia de las MSC a la ECM vs. plástico Métodos: Para comparar la capacidad de las MSC para adherirse a la ECM derivada de la médula versus el plástico, las células se sembraron a 1 x106 células/cm2 en plástico y se incubaron durante 4, 24 y 72 horas. Las células no adherentes se recolectaron del plástico y se volvieron a sembrar en la ECM y se incubaron durante 24 horas adicionales. Las células adherentes se tiñeron con violeta de metilo y se cuantificaron (FIGURA 8). La adipogénesis y la miogénesis se determinaron por las células mantenidas en medio adipogénico o miogénico, respectivamente.

Resultados: Las células más adherentes en la UCB fueron capaces de unirse a la ECM tan pronto como a las 4 horas de incubación. En contraste, menos células se unieron al plástico. Sin embargo, las células no adherentes recolectadas del plástico, contenían un número mayor de células que las unidas a la ECM. Las células adherentes en la ECM pueden diferenciarse en adipositos y en células musculares in vitro.

EJEMPLO 4 Implante y evaluación de la diferenciación (1 ) Implante: Cargar 0.5 x 106 hUCB-MSC precultivadas (Paso 6-8) en el polvo de cerámica del vehículo de transplante hidroxiapatita/fosfato tricálcico (HA/TCP) o Gelfoam e implantar de manera subcutánea en la superficie dorsal de ratones beige inmunodeficientes de 10 semanas de edad (NIH-bg-nu-xid). (2) Evaluación de la diferenciación: Recolectar y fijar los implantes con formaldehido al 4% a temperatura ambiente después del implante 2 - 4 meses. Examinar los implantes seriales incluidos en parafina de 4-µ?t? mediante H&E e inmunotinción. El tejido diferenciado de las hUCB-MSC del donador puede detectarse mediante inmunotinción con anticuerpo RNP especifico antihumano (1 :60; Millipore/Chemicon).

EJEMPLO 5 Resultados Un gran número de UCB-MSC se adhirió a la ECM, pero no al plástico. La matriz extracelular (ECM, FIGURAS 1A-1 D, 2) hecha por las células de médula ósea mejoraron la unión y proliferación de las hUCB-MSC, y retuvieron sus propiedades de células germinales. Utilizando este sistema, se encontró que la UCB humana contiene un gran número de MSC que se adhieren a la ECM, pero no al plástico. Numerosas colonias se formaron cuando las células primarias se cultivaron en la ECM, con una densidad de siembra de 3 x 104 - 1 x 105 MNC/cm2 (FIGURAS 3A-3D, 4). Estos datos indican que las hUCB-MSC cultivadas en la ECM tienen una capacidad colonogénica mucho mayor que en el plástico. De acuerdo con la medición de las unidades formadoras de colonias (CFU), la frecuencia de las hUCB-MSC es 22,800 - 37,000 de 1 x 108 MNC, al menos 1 ,000 (760 - 92,500) veces mayor que lo reportado previamente por otros (0.4 - 30 de 1 x 108 MNC).

Las células de UCB adheridas a la ECM expresaron a SSEA-4 y otros marcadores de las MSC, pero no los marcadores de las células hematopoyéticas. Los fenotipos de las células adheridas a la ECM se determinaron mediante análisis citométrico de flujo, sugiriendo que ~ 40% de estas células expresaron un marcador celular ES, SSEA-4 (15), y ~ 90% de las células también expresaron varios marcadores MSC, incluyendo CD29, CD105, CD166 y CD146, pero no la expresión de los marcadores celulares hematopoyéticos CD34 y CD45 (FIGURA 8). En contraste, las células adheridas al plástico contenían menos células SSEA-4+ y un número pequeño de células que expresan esos marcadores de MSC. Estos resultados sugieren que los fenotipos de las células adheridas a la ECM fueron muy diferentes de aquéllos adheridos al plástico. Las células aisladas por la adhesión a la ECM son únicas, que contienen una población relativamente homogénea de MSC. Estas células también pueden tener algunas características de las células ES.

Las hUCB- SC cultivadas en la ECM generaron tejidos originados de 3 capas germinales embriónicas in vivo. El sistema de la ECM enriquece las células similares a las embriónicas de la sangre de cordón umbilical humano. Las hUCB-MSC obtenidas por la ECM y cultivadas posteriormente en la ECM, formaron cuerpos embriónicos in vitro (FIGURAS 5 y 6A-6C), una característica única de las células germinales embriónicas. Sin ninguna inducción de la diferenciación específica, el implante de las hUCB-MSC en ratones inmunocomprometidos generó tejidos derivados de 3 capas germinales embriónicas, incluyendo: endodermo-glándula; mesodermo-hueso, músculo, grasa, vasos sanguíneos y ectodermo-fibra nerviosa. Estos tejidos se diferenciaron de las hUCB-MSC del donador detectadas mediante inmunotinción con anticuerpo RPN específico antihumano. La mayoría de los implantes contenían tejidos heterogéneos generados por las células como células hES, sin embargo, no ocurrió teratoma (FIGURAS 9A-9B).

El fenotipo de las células hUCB que se adhirieron a, y se cultivaron posteriormente en la ECM es diferentes de aquél de las hES y las hBM-MSC. Con el fin de definir y caracterizar además las hUCB-MSC, los inventores examinaron si las UCB-MSC aisladas por la adhesión a la ECM expresaban a NANOG, OCT4, TDGF1, DNMT3B, GABRB3 y Sox2, todos los cuales son expresados en gran medida por las células hES (Adewumi et al. , 2007). Se encontró que los niveles de estos genes expresados por las UCB-MSC aisladas por la adhesión a la ECM, fueron mucho menores que aquéllos expresados por las células hES, pero todavía mayores que los niveles expresados por las UCB-MSC aisladas por la adhesión al plástico, así como por las células germinales mesenquimales derivadas de la médula ósea humana (hBM-MSC) (FIGURA 10). Esto puede explicar por qué las UCB-MSC aisladas por la adhesión a la ECM no forman un teratoma, puesto que los estudios previos habían mostrado claramente que las células somáticas incorporadas con algunos de estos genes forman un teratoma. Parece que la UCB puede contener un gran número de células germinales similares a las embriónicas que se adhieren a la ECM derivada de BM, pero no al plástico y que las UCB-MSC obtenidas por el método de adhesión a la ECM pueden tener propiedades distintas de aquéllas aisladas por el método clásico de adhesión al plástico. La etapa de diferenciación de las UCB-MSC obtenidas mediante la adhesión a la ECM puede ser cercana a la las células ES, y más al inicio de la diferenciación, en comparación con el método de adhesión al plástico tradicional. Tomados juntos, estos datos sugieren que las hUCB-MSC aisladas por la adhesión a la ECM tienen propiedades suficientemente únicas en comparación con los tipos caracterizados previamente de células germinales (hESC, hBM-MSC, tejido adiposo-MSC, periostio-MSC, etc. e incluso las hUCB-MSC aisladas utilizando el método estándar de adhesión al plástico), para justificar la colocación de estas células en una clase diferente de células germinales.

Todas las composiciones y métodos descritos y reclamados en la presente pueden hacerse y ejecutarse sin experimentación indebida, a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de algunas modalidades, será evidente para aquellos con experiencia en la técnica, que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito en la presente, sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. De manera más específica, será evidente que ciertos agentes que están relacionados tanto química como fisiológicamente, pueden sustituirse por los agentes descritos en la presente, mientras que se obtengan los mismos o similares resultados. Todos de tales sustitutos y modificaciones similares, evidentes para aquellos con experiencia en la técnica, se consideran que están dentro del alcance, espíritu y concepto de la invención, como se define en las reivindicaciones anexas.

Referencias Las siguientes referencias, al grado en que proporcionan detalles ejemplares del procedimiento y otros detalles suplementarios a aquéllos expuestps en la presente, se incorporan de manera específica en la presente como referencia.

Ade umi, O et al. Nat. Biotechnol. 25:803-816, 2007. Chen et ai, J. Bone Miner. Res., 22:1943-1956, 2007 Kern er a/., Stem Cells, 24: 1294-1301 , 2006 Soleimani y Nadri, Nat. Protoc. 4:102-106, 2009 Wolfe et al., Methods Mol. Biol., 449:3-25, 2008

Claims (37)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para aislar células germinales mesenquimales ( SC), que comprende: (a) recolectar una muestra; (b) sembrar la muestra en un plato de cultivo prerrecubierto con la matriz extracelular matrix (ECM) y (c) aislar las MSC.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra es de periostio, hueso trabecular, tejido adiposo, sinovio, músculo esquelético, dientes no permanentes, páncreas, pulmón, hígado fetal, fluido amniótico, sangre de cordón umbilical and tejidos de cordón umbilical.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la muestra es sangre de cordón umbilical (UCB).

4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la sangre de cordón umbilical es UCB humano (hUCB).

5.- El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque la muestra se recolecta después del nacimiento.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizado además porque la muestra de hUCB se centrifuga para recolectar las células mononucleares antes de la siembra.

7. - El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque la ECM se deriva de células de médula ósea humana.

8 - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la ECM comprende colágeno del tipo I, colágeno del tipo III, fibronectina, biglicano, decorin, perlecan y/o laminina.

9.- El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque comprende implantar las MSC aisladas para obtener un tejido diferenciado.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el tejido diferenciado comprende tejidos derivados de tres capas germinales embriónicas.

1. - El método de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizado además porque el tejido diferenciado comprende endodermo-glándula; mesodermo-hueso, músculo, grasa, vasos sanguíneos y/o ectodermo-fibra nerviosa.

12.- Un método para fomentar la proliferación de las MSC, que comprende: (a) obtener una muestra de MSC aisladas; y (b) sembrar las MSC aisladas en una ECM para fomentar la proliferación de la muestra de MSC aisladas.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la muestra es de periostio, hueso trabecular, tejido adiposo, sinovio, músculo esquelético, dientes no permanentes, páncreas, pulmón, hígado fetal, fluido amniótico, sangre de cordón umbilical and tejidos de cordón umbilical.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la muestra es sangre de cordón umbilical (UCB).

15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la sangre de cordón umbilical es UCB humano (hUCB).

16. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado además porque la ECM se deriva de células de médula ósea humana.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además la ECM comprende colágeno del tipo I, colágeno del tipo III, fibronectina, biglicano, decorin, perlecan y/o laminina.

18.- Un método para producir tejidos diferenciados, que comprende: (a) obtener una muestra de MSC aisladas; y (b) implantar las MSC aisladas en un ratón inmunocomprometido para obtener un tejido diferenciado.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el tejido diferenciado comprende tejidos derivados de tres capas germinales embriónicas.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado además porque el tejido diferenciado comprende endodermo-glándula; mesodermo-hueso, músculo, grasa, vasos sanguíneos y/o ectodermo-fibra nerviosa.

21 - Un método para aislar células germinales mesenquimales (MSC), que comprende: (a) recolectar una muestra; (b) sembrar la muestra en un plato de cultivo prerrecubierto con la matriz extracelular (ECM) y (c) aislar las MSC.

22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la muestra es de periostio, hueso trabecular, tejido adiposo, sinovio, músculo esquelético, dientes no permanentes, páncreas, pulmón, hígado fetal, fluido amniótico, sangre de cordón umbilical and tejidos de cordón umbilical.

23. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la muestra es sangre de cordón umbilical (UCB).

24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la muestra se recolecta después del nacimiento.

25. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la sangre de cordón umbilical es UCB humano (hUCB).

26. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la muestra de hUCB es centrifugada para recolectar las células mononucleares antes de la siembra.

27. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la ECM se deriva de células de médula ósea humana.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la ECM comprende colágeno del tipo I, colágeno del tipo III, fibronectina, biglicano, decorin, perlecan y/o laminina.

29. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque comprende implantar las MSC aisladas para obtener un tejido diferenciado.

30. - El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el tejido diferenciado comprende tejidos derivados de tres capas germinales embriónicas.

31. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque el tejido diferenciado comprende endodermo-glándula; mesodermo-hueso, músculo, grasa, vasos sanguíneos y/o ectodermo-fibra nerviosa.

32.- Un método para fomentar la proliferación de las MSC, que comprende: (a) obtener una muestra de MSC aisladas; y (b) sembrar las MSC aisladas en una ECM para fomentar la proliferación de la muestra de MSC aisladas.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la muestra es de periostio, hueso trabecular, tejido adiposo, sinovio, músculo esquelético, dientes no permanentes, páncreas, pulmón, hígado fetal, fluido amniótico, sangre de cordón umbilical and tejidos de cordón umbilical.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque la muestra es sangre de cordón umbilical (UCB).

35. - El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque la sangre de cordón umbilical es UCB humano (hUCB).

36. - El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la ECM se deriva de células de médula ósea humana.

37. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la ECM comprende colágeno del tipo I, colágeno del tipo III, fibronectina, biglicano, decorin, perlecan y/o laminina.