MXPA04004309A

MXPA04004309A - Celulas estromales derivadas de tejido adiposo para la reparacion de defectos corneales e intraorbitales y usos de las mismas.

Info

Publication number: MXPA04004309A
Application number: MXPA04004309A
Authority: MX
Inventors: M Gimble Jeffrey
Original assignee: Artecel Sciences Inc
Priority date: 2001-11-09
Filing date: 2002-11-08
Publication date: 2005-03-31
Also published as: EP1456354A2; KR20100018089A; KR20100131011A; WO2003039481A2; HUP0401945A3; CN100516200C; US20030125293A1; EP1892289A3; PL370261A1; HUP0401945A2; WO2003039481A3; JP2005508174A; AU2002360362A1; EP1892289A2; CZ2004694A3; RU2331668C2; BR0214021A; CA2465908A1; RU2004117533A; KR20050044392A

Abstract

La invencion proporciona composiciones y metodos para el uso de celulas estromales derivadas de tejido adiposo para el tratamiento y reparacion de cualquier defecto de tejido asociado con los ojos, que incluye pero que no se limita a los secundarios a traumatismo, enfermedades metabolicas, errores congenito o de cirugia. Las celulas estromales derivadas de tejido adiposo se cultivan en estado no diferenciado, diferenciado o como adipositos ya sea solas o en presencia de material biocompatible. Los materiales resultantes se utilizan quirurgicamente para corregir diversos defectos intraoculares corregibles.

Description

CÉLULAS ESTROMALES DERIVADAS DE TEJIDO ADIPOSO PARA LA REPARACIÓN DE DEFECTOS CORNEALES E INTRAORBITALES Y USOS DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona células estromalés derivadas de tejido adiposo, aisladas, inducidas para expresar por lo menos una característica de una célula estromal intraocular. También se proporcionan métodos para la reparación de defectos corneales e intraorbitales del ojo con células estromalés derivadas de adiposos, diferenciadas o no diferenciadas . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El ojo es un órgano complejo constituido de una multitud de tipos de tejidos. Existen tres recubrimientos diferentes que comprenden al ojo: desde la parte exterior al interior: la esclerótica y córnea, la coroides y la retina. Dentro de los tres recubrimientos se encuentra un medio refractario: el humor acuoso, el cristalino y el humor vitreo. Las células estromalés son un componente integral de cada capa del ojo y comparten relaciones reguladoras importantes dentro de las células vecinas epiteliales, endoteliales , neuronales e inflamatorias. Existen muchas condiciones que afectan al ojo y su funcionamiento. Por ejemplo, los desórdenes de la córnea incluyen las denominadas Ref: 155809 enfermedades primarias y secundarias (Kruse & Volcker, 1997, Curr. Opin. Ophthalmol. 8(4):46-54). Las enfermedades primarias del ojo incluyen, pero no se limitan a: aniridia o ausencia del iris: eitroqueratodermia o enrojecimiento e hipergueratosis de la piel; y queratitis con deficiencias endocrinas múltiples. Las enfermedades secundarias del ojo incluyen, pero no se limitan a: daños químicos; daños térmicos, queratopatia por lentes de contacto; cirugías límbicas repetitivas y queratopatia en banda, una condición degenerativa en la cual se desarrolla una banda gris desde el limbo hacia el interior de la córnea. Muchos de estos desórdenes involucran embriocitos indiferenciados autorrenovantes de la córnea, los cuales se encuentran en la capa basal del limbo, que se encuentra entre la córnea y la conjuntiva (Kruse & Volcker, 1997, Curr. Opin. Opthamol . 8(4):46-54). La insuficiencia límbica o disfunción de los embriocitos resulta en síntomas que incluyen visión disminuida, fotofobia, inflamación, edema y espasmo de los músculos que controlan el párpado. En algunos casos esto se puede corregir por transplante de tejido lxmbico sano a áreas dañadas de la córnea, como en los casos de una quemadura química localizada de manera definida. Existe mucha evidencia que indica que la interacción entre los embriocitos córneos y su estroma subyacente es crítico para una función normal . Los dos tipos de células adyacentes muestran vías específicas autocrinas y paracrinas. Estas vías son mediadas por citocinas liberadas por célula estromales que incluyen pero que no se limitan a factor de crecimiento transformante ß? y P(TGFP, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento similar a insulina (IGF, por sus siglas en inglés) , factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, por sus siglas en inglés) , factor de crecimiento hepático (HGF, por sus siglas en inglés) , y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF, por sus siglas en inglés) . Los receptores de cada uno de estos se sintetizan por células epiteliales de la córnea. De igual manera, las células epiteliales de la córnea sintetizan GFi y ß2, IGF, bFGF y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) . Excepto para el receptor VEGF, las células estromales expresan receptores para la totalidad de estas citocinas así como factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por sus siglas en inglés) y factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) (Kruse & Volcker, 1997, Curr. Opin. Opthalmol . 8 (4):46-54). La córnea juega un papel crítico en el mantenimiento de visión normal al refractar luz sobre el cristalino y la retina. Esto requiere autorrenovación continua de las células epiteliales para proteger de la infección las capas más profundas del tejido (Lu et al 2001, Exp. Biol Med 226 (7) -.653-64) . Los procedimientos quirúrgicos tales como queratectomía fotorrefractaria o queratomileusis in situ con láser involucra la remoción de una porción de la córnea. Estos procedimientos se realizan para tratar formas de miopía o ceguera a lo que está cerca (Wilson et al 2001, Aren Ophthalmol : 119 (6) : 889-96) . La reparación después de estos procedimientos requiere contracción estromal acompañada por estratificación epitelial (Taliana et al 2001, Invest Ophthalmol Vis Sci; 42(l):81-9). Durante el proceso de sanado muchos pacientes experimentan una "opacidad estromal" anterior postquirúrgica caracterizada en modelos animales por la aparición de células miofibroblásticas que expresan actina de músculo liso (a-SMA) (Nakamura et al 2001, Br J Ophthalmol; 85 (2) :209-13) . Estas células miofibroblásticas son inducidas en cultivo por GF$ y se bloquean in vivo por anticuerpos contra TGFP (Jester et al 1997, Cornea; 16 (2) : 177-87 ; Jester et al 1999, Prog Retin Eye Res; 18- (3) : 311-56) . De igual manera, existe evidencia de que las interacciones directas entre las células epiteliales y el estroma adyacente pueden inducir diferenciación estromal en miofibroblastos . Esto es alterado adicionalmente por la presencia de membranas amnióticas (Choi & Tseng 2001, Cornea; 20 (2) : 197-204) . El grado de "opacidad estromal" en modelos animales corresponde a la profundidad de daño del estroma de la córnea durante la queratectomia fotorrefractaria (Moller-Pedersen et al 1998, Cornea; 17 (6) : 627-39) . En los pacientes, el grado de opacidad córnea es el mismo, independientemente de la técnica para remoción de células epiteliales (mecánica o basada en láser) (Lee et al 2001, Ophthalmology; 108 (1) : 112-20) . Se han utilizado diversos biomateriales para tratar y reparar defectos y daños corneales y oculares. La matriz extracelular córnea es rica en colágeno y glucosaminoglucanos (Robert et al 2001, Pathol Biol (PariS) ; 49 (4) : 353 -63 ) . Se ha encontrado que el glucosaminoglucano, hialuronano mejora el sanado de heridas epiteliales corneales en modelos de rata y conejo, determinado por evaluación de las capas estromales y endoteliales (Nakamura et al 1997, Exp Eye Res; 64(6):1043-50; Chung et al 1999, Ophthalmic Res; 31 (6) : 432-9) . Tseng y otros han sido los primeros en utilizar membrana amniótica en el tratamiento de diversos desórdenes oculares (patente de E.U.A. número 6,152,142). La membrana amniótica es polarizada con un lado "estromal" y un lado de "membrana basamental" . El lado estromal contiene colágenos I y III y fibronectina con una distribución de lamina basal de colágeno tipo IV, laminina y proteoglucano de sulfato de heparina. El lado de la membrana basamental de la membrana amniótica soporta el crecimiento de células epiteliales, mientras que el lado estromal soporta el crecimiento de fibroblastos de una manera similar a colágeno. La membrana amniótica se aisla de la placenta humana, se crioconserva y después se utiliza para la reparación quirúrgica de desórdenes intraoculares .

Aún no se comprende por completo el mecanismo de acción de la membrana amniótica. No obstante, existe evidencia in vitro de que la presencia de membrana amniótica en cultivo suprime la expresión de TGFp por fibroblastos (Lee et al 2000, Curr Eye Res; 20 (4) :325-334) e interleucina la e interleucina 1ß por células epiteliales (Solomon et al 2001, Br J Ophthalmol; 85(4) :444-449) . Se ha encontrado con éxito que la membrana amniótica trata una amplia gama de defectos corneales y oculares. Por ejemplo, las úlceras corneales profundas y las úlceras esclerales se han tratado mediante el uso de capas múltiples de la membrana amniótica para llenar la capa estromal, membranas basamentales y cubierta de heridas (Hanada et al 2001,, Am J Opthamol; 131 (3) : 324-31) . Se ha encontrado que la membrana amniótica reduce la inflamación y ulceración estromal en queratitis por VIH-1, una enfermedad mediada por el sistema inmunológico (Heiligenhaus et al 2001, InvestS Ophtlamol Vis Sci; 42 (9) : 1969-1974) . Las úlceras corneales neurotróficas graves también se han tratado con membranas amnióticas (Chen et al 2000, Br J Ophthalmol; 84 (8) : 826-833) . La membrana amniótica restaura las superficies corneal y conjuntival y reduce la inflamación estromal límbica que resulta de quemaduras agudas por sustancias químicas o térmicas (Meller et al 2000, Ophthalmology: 107 (5) : 980-989) . Se utiliza la membrana amniótica como una alternativa al autoinjerto límbico o al aloinjerto en pacientes con una deficiencia en embriocitos límbicos parciales (Anderson et al 2001, Br J. Ophthalmol ; 85(5) :567-575) . Las membranas amnioticas también se han utilizado en el tratamiento quirúrgico de terigion, un plegamxento similar a la de la membrana que se extiende desde la conjuntiva a la córnea, con uniones hacia la esclera (Solomon et al 2001, Ophthalmology: 108 (3) :449-460) . Las membranas amnioticas se utilizan para tratar un inicio tardío de glaucoma, filtrando las fugas de lecho como una alternativa para la conjuntiva con éxito (Budenz et al 2000, Am J Ophthalmol; 130 (5) : 580-588 ; Barton et al 2001, Invest Ophthalmol Vis Sci; 42 (8) :1762-1768) , así como mejoramiento de la recuperación de un epitelio córneo estable y reducir el dolor ocular cuando se utiliza en el tratamiento quirúrgico de queratopatía de banda, la deposición de calcio en la membrana basamental córnea, secundaria a sarcoidosis, uveitis crónica y otras causas (Anderson et al 2001, Cornea; 20 (4) :354-361) . Debido a las dificultades asociadas con el procuramiento de materiales amnióticos, los investigadores han buscado fuentes alternativas de material estromal para la reparación de defectos oculares o corneales . El documento EP 93830229.6 para Cancedda et al., describen métodos para cultivar células epiteliales oculares diferenciadas de antemano in vitro, para ser utilizadas para transplante subsecuente para el tratamiento de defectos en la córnea. La fuente de las células epiteliales es material de biopsia autólogo del ojo sano. Por lo tanto, un paciente sirve como donador y como receptor. La patente de E.U.A. número 6,117,675 para van der Kooy et al describe embriocitos aislados de la retina de mamíferos que se diferencian in vitro a células epiteliales de pigmento retinal que se transplantan en un individuo que padece de enfermedades de la retina. La fuente de las células retínales de vastago es embriónico o tejido postnatal temprano . La patente de E.U.A. número 5,912,178 para Wille, Jr. describe medios y métodos para la formación in vivo de varios tipos de epitelio humano histológicamente completo que incluyen epidermis, córnea, y tejidos gingivales y de uréter. El epitelio resultante se hace crecer in vitro a partir de células epiteliales animales aisladas sobre embriocitos b sales aislados de tejido epitelial. La patente de E.U.A. número 5,942,487 para Ogawa et al describe una composición que comprende un factor de embriocitos que se pueden aplicar a tejido de córnea enfermo para estimular el crecimiento de la córnea. Los inventores establecen la hipótesis de que los embriocitos corneales sean estimulados para migrar y crecer.

La patente de E.U.A. número 5,863,531 para Advanced Tissue Sciences, Inc. describe un tejido estromal vivo tubular preparado in vitro, que comprende células estromales y proteínas de tejido conectivo secretadas naturalmente por las células estromales unidas a, y que sustancialmente envuelven una infraestructura tubular tridimensional compuesta de un material no vivo biocompatible que tiene espacios intersticiales unidos por las células estromales. Un objetivo de la invención es proporcionar una célula, material y método para ayudar en la reparación de defectos oculares, incluyendo corneales. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona células estromales o embriocitos derivados de tej ido adiposo que se han diferenciado para poseer por lo menos una característica genotípica o fenotípica de una célula estromal intraocular u ocular. Esta célula se puede utilizar para el tratamiento terapéutico de enfermedades degenerativas y otras enfermedades del ojo. La presente invención también proporciona métodos y composiciones para el uso y cultivo de células estromales derivadas de tejido adiposo para tratar defectos intraoculares y oculares de cualquier etiología. En otro aspecto de la invención, se describen métodos y se proporcionan composiciones para inducción consistente, cualitativa y cuantitativa, de células estromales derivadas de tejido adiposo subcutáneo, mamario, gonadal, epiploico o cualquier otro sitio de tejido adiposo que exprese por lo menos una característica genotípica o fenotípica de células estromales intraoculares u oculares. En otro aspecto de la invención, las células derivadas de tejido adiposo aisladas se inducen para que se diferencian en una célula que exprese por lo menos una característica de una célula estromal intraocular que comprende la etapa de: poner en contacto una célula estromal aislada, derivada de tejido adiposo, con una sustancia inductora ocular. Esta sustancia está en un medio de cultivo celular definido químicamente e incluye factores de crecimiento, citocinas, agentes químicos y hormonas a concentraciones suficientes para inducir a las células estromales aisladas derivadas de tej ido adiposo para que expresen por lo menos un marcador de célula ocular. En otro aspecto de la presente invención, las células estromales derivadas de tejido adiposo se someten a ingeniería genética para expresar proteínas que pueden modificar el fenotipo celular e inducir vías que faciliten la recuperación y reparación de cualquier defecto intraocular. Esto se lleva a cabo al exponer a la célula a un vector de transferencia de genes que comprende un ácido nucleico que incluye un transgen bajo condiciones adecuadas de manera que se introduce dentro de la célula el ácido nucleico deseado. Alternativamente, la célula se trata con, y se permite que incorpore un ácido nucleico desnudo. La invención proporciona adicionalmente un método para tratar una condición ocular degenerativa en un hospedador, que incluye la administración de células estromales derivadas de tejido adiposo que se han inducido para expresar una característica de una célula ocular deseada. Una ventaja distinta de la invención es que las células estromales derivadas de tejido adiposo se pueden aislar directamente del hospedador (transplante autólogo) o se pueden donar por otro hospedador (transplante alogénico) . En otro aspecto de la invención, se cultivan células estromales derivadas de tejido adiposo en su estado no diferenciado o diferenciado dentro o sobre una matriz tridimensional constituida de un material biocompatible natural o sintético para ser utilizado para reparar quirúrgicamente sitios de ulceración estromal intraoculares. En otro aspecto de la invención, las células estromales derivadas de tejido adiposo se utilizan directamente sin diferenciación para transplante autólogo y alogeneico de células para promover cirugías exitosas de glaucoma al corregir fugas de vesículas. En esta modalidad, las células estromales derivadas de tejido adiposo se administran al ojo, preferiblemente en el lugar deseado, y se permite que se diferencian ya sea (i) a través de coadministración de citocinas apropiadas y otros factores biológicos, o (ii) a través de factores in vivo que están presentes de antemano o que son inducidos en el hospedador. En otro aspecto adicional de la presente invención, las células estromales derivadas de tejido adiposo se utilizan para transplante autólogo y alogeneico de células para el tratamiento de condiciones humanas que incluyen pero que no se limitan a opacidad de la córnea inducida por queratectomia fotorrefractaria/terapéutica, reparación durante la extirpación de la "esclerótica desnuda" del terigión, tratamiento quirúrgico de la queratopatía en banda, extirpación quirúrgica de tumores, lesiones o tejido cicatrizado de la superficie de la conjuntiva o la córnea, entre otros. En otro aspecto adicional de la invención, las células estromales derivadas de tejido adiposo se transplantan combinadas con tejido de membrana amniótica en un ojo enfermo. En otro aspecto de la invención, las células estromales derivadas de tejido adiposo se diferencian en células de la linea de adipoblastos antes de transplante en el ojo enfermo. En otro aspecto de la invención, las células estromales derivadas de tej ido adiposo se diferencian en células de la línea de adipoblastos y se transplantan junto con tejido de membrana amniótica en el ojo enfermo.

Las células de la invención se utilizan ya sea como una población de células homogénea o como parte de una población celular en las cuales las demás células secretan sustancias para soportar el crecimiento o diferenciación de células similares a oculares. La invención también contempla un equipo para aislar embriocitos o células estromales de tejido adiposo que incluye un medio para aislar tejido adiposo de un paciente y un medio para separar embriocitos del resto del tejido adiposo. El equipo también incluye un medio para diferenciar los embriocitos, en donde el medio provoca que la célula exprese por lo menos una característica genotípica o fenotípica de una célula ocular, o que sea de manera general ocularogénica. La invención incluye adicionalmente composiciones y métodos para someter a ingeniería tejido de células derivadas del tejido adiposo de la invención. Tales composiciones incluyen una célula derivada de tej ido adiposo combinada con una estructura de retícula compatible biológicamente para permitir que el tejido se diferencie y se expanda. Así, de esta manera, se fabrican tejido similar a ojo u órganos completos. La retícula compatible biológicamente puede ser en si misma derivada de tejido adiposo e incluir cualquier proteína humana, proteoglucano, glucoproteína, hialuronina, molécula de fibronectina, una hormona, citocinas y factores de crecimiento. La retícula también puede incluir o estar preparada de polímeros de monómeros que se seleccionan del grupo que consiste de ácido glicólico, ácido láctico, fumarato de propilo, caprolactona, hialuronano, ácido hilaurónico o combinaciones de los mismos. Alternativamente, el ' material polimerico puede ser una proteína, polisacárido, polihidroxiácido, poliortoéster, polianhídrido, polifosfazano, polímero sintético o una combinación de los mismos. El material polimérico también puede ser un hidrogel formado por reticulación de una suspensión de polímero que tiene las células dispersas en el mismo. Otros objetivos y características de la invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción y reivindicaciones anexas . DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 es un análisis de citometría de flujo de células estromales derivadas de tejido adiposo humano. Se muestran los análisis de citometría de flujo representativos para CD9, CD29 (ß?-integrina) , CD44 (receptor de hialuronato) , CD49d (a 4 integrina) , CD55 (factor acelerador de extinción) , y HLA-ABC (antígeno de histocompatibilidad clase 1) . Las células estromales no diferenciadas aisladas de un solo donador se tiñen con anticuerpos monoclonales contra antígenos indicados (línea continua, derecha de cada panel) ; el anticuerpo de control monoclonal de isotipo (línea discontinua, parte izquierda de cada panel) . Representativo n = 5 donadores. Las barras indican intensidad fluorescente >99% control. La figura 2 muestra esquemáticamente progenitores linfoides en un cocultivo de 12 dias . Un porcentaje significativo de células tanto CD34+ como CD34" expresadas en antígeno CD7 o CD10 (n = 4 donadores estromales, n = 2 donadores UCB) . Los fenotipos individuales representan los siguientes porcentajes de la población hematopoyética total: progenitores linfoides tempranos, 20.2% (CD34+ CD7+) y 9.5% (CD34+, CD10+, respectivamente; progenitores de NK/linfocitos T (CD34+ CD7+) , 31.4%; y progenitores de linfocitos B (CD34~, CD10+) , 7.7%. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención es una célula estromal o un embriocito, derivado de tejido adiposo que se induce para que exprese por lo menos una característica genotípica o fenotípica de una célula de origen ocular. De manera más preferible, la célula posee por lo menos una característica genotípica o fenotípica de una célula epitelial corneal. Alternativamente, la célula posee por lo menos una característica genotípica o fenotípica de una célula estromal ocular. Las células producidas por los métodos de la invención proporcionan una fuente de células parcial o completamente diferenciadas o no diferenciadas funcionales que tienen características genotípicas o fenotípicas de células oculares maduras para investigación, transplante y desarrollo " de productos terapéuticos celulares para el tratamiento de enfermedades animales, preferiblemente enfermedades humanas, reparación o mejoramiento de tejido y la corrección de enfermedades degenerativas del ojo, preferiblemente del epitelio de la córnea. También se incluyen métodos para producir y utilizar dichas células. I . Definiciones "Conjuntiva" se refiere a la membrana que delinea el párpado y cubre la superficie expuesta de la esclerótica. "Córnea" se refiere a la estructura transparente que forma la parte anterior de la túnica fibrosa del ojo. Consiste de cinco capas específicas: 1) el epitelio corneal anterior, continuo con la conjuntiva; 2) la capa limitante anterior (membrana de Bowman) ; 3) sustancia propia o capa estromal; 4) capa limitante posterior (membrana de Descemet) y 5) endotelio de la cámara anterior o queratoderma. "Retina" se refiere a la más interior de las tres túnicas del globo ocular, que rodea al cuerpo vitreo y que continua posteriormente con el nervio óptico. Se divide en el par óptico, el cual se apoya sobre la coroides, el par ciliar, el cual se apoya sobre el cuerpo ciliar y el par del iris, que se apoya sobre la superficie posterior de iris. En general, la retina está constituida de una capa pigmentada exterior (par pigmentosa) y una capa de transplante interior (par nerviosa) , las cuales juntas constituyen la par óptica) . La parte óptica del ojo consiste de 9 capas denominadas desde el interior hacia el exterior como: 1) membrana limitante interna; 2) capa de fibra nerviosa; 3) capa de células del ganglio; 4) capa plexiforme interior; 5) capa nuclear interior; 6) capa plexiforme exterior; 7) capa nuclear exterior; 8) membrana limitante externa; y 9) una capa de bastones y conos . El "factor de crecimiento transformante ß" (TGFP, por sus siglas en inglés) es una prepropproteina de 391 aminoácidos (aa) de 55 kDa que consiste de una secuencia de señal de 23 aa, una prorregion de 255 aa y un segmento maduro de 112 aa. Antes de su secreción, la prorregion se separa en un sitio RxxR con una proteasa similar a furina. Esto genera un dímero maduro unido por disulfuro de 25 kDa no glucosilado que se asocia de manera no covalente con las prorregiones unidas por disulfuro que se han unido previamente para formar un "complejo latente". Este complejo es secretado. La activación se produce extracelularmente bajo diversas condiciones, más probablemente vía una serinatreonina cinasa transmembranal para iniciar una cáscada de señales intracelulares mediadas por la familia de factores de transcripción Smad. El "factor de crecimiento de fibroblastos básico" (bFGF, por sus siglas en inglés) , también conocido como FGF-2, es un polipéptido no glucosilado de 18 kDa que muestra actividad intracelular y extracelular. bFGF es secretado como un monómero. Después de su secreción, bFGF es captado sobre el sulfato de heparina de la superficie de células (HS) o los glucosaminoglucanos de matriz. Aunque bFGF es secretado como un monómero, HS en la superficie celular parece dimerizar al bFGF rnonomérico en una configuración no covalente lado a lado que posteriormente es capaz de dimerizar y activar los receptores de FGF . "Factor de crecimiento derivado de plaquetas" (PDGF, por sus siglas en inglés) es una combinación homodimérica o heterodimérica de 30 kDa de dos cadenas polipeptídicas genéticamente distintas pero relacionadas estructuralmente, denominadas A y B. Originalmente se identificó como un mitógeno de fibroblastos derivado de plaquetas en suero. Estudios posteriores han demostrado que muchos tipos de células secretan PDGF y que la citocina es un mitógeno para células de la línea mesodérmica (músculo, hueso, tejido conectivo) . El "factor de crecimiento endotelial vascular" (VEGF, por sus siglas en inglés) , se identificó por primera vez como un factor de crecimiento y supervivencia para células endoteliales . Incluye proliferación de células endoteliales y regula la angiogénesis y la vasculogénesis . VEGF es una glucoproteína que une heparina que se secreta como un homodímero de 45 kDa. Muchos tipos de células, pero habitualmente no las células endoteliales mismas, secretan VEGF. El "factor de crecimiento de hepatocitos" (HGF, por sus siglas en inglés) , también conocido como factor de dispersión es una citocina multifuncional que promueve la mitogénesis, migración, invasión y morfogénesis. La señalización dependiente de HGF modula la función de integrina al promover la agregación y la adhesión celular. Los efectos inducidos por HGF/SF se presentan vía señalización del receptor MET tirosina cinasa, posterior a unión de ligando. El "factor de crecimiento de queratinocitos" (KGF, por sus siglas en inglés), o FGF-7, es una glucoproteína secretada, de cadena única, de 28 kDa que tiene un objetivo relativamente limitado al epitelio. La molécula se sintetiza como un precursor de 194 aa que contiene una secuencia de señal de 31 aa y un segmento maduro de 163 aa. El factor de crecimiento maduro une heparina y su receptor (KGFR) a través de regiones definidas de la molécula. Las células adultas que expresan FGF-7 incluyen fibroblastos, linfocitos T, células de músculo liso y células de la teca del ovario. En el embrión, se ha encontrado KGF en muchas etapas de desarrollo a través del mesenquima. "Los "factores de crecimiento similares a insulina" (IGF, por sus siglas en inglés) , , IGF-I e IGF-II comparten homología estructural en 50% con insulina. Los IGF actúan como estimuladores mitogénicos de la proliferación celular así como supresores de las vías apoptósicas celulares. Bajo el control de la hormona del crecimiento (GH, por sus siglas en inglés) , el hígado es el sitio principal de producción de IGF. Las concentraciones de IGF-I también son alteradas por la nutrición y los estados de desarrollo. La producción de los IgF en tejido autocrino y paracrino contribuye a las concentraciones de IGF disponibles para regulación del crecimiento . "Fenotipo de desarrollo" es el potencial de una célula para adquirir un fenotipo físico particular a través del procedimiento de diferenciación. "Hormona" es cualquier sustancia que ' es secretada por una célula y que provoca un cambio fenotípico en la misma célula o en otra, al contacto. "Genotipo" es la expresión de por lo menos un transcrito de ARN mensajero de un gen relacionado con una vía de diferenciación. El término "transgénico" se utiliza para describir cualquier animal o cualquier parte del mismo que incluye, pero que no se limita a células, cultivos o tejidos los cuales incluyen material genético exógeno dentro de sus células . Las células de la invención pueden tener el ADN agregado al mismo y estas células después se pueden utilizar para transplante o para producción in vitro de hormonas, células o tejidos. "Transgen" significa cualquier pieza de ADN insertada de manera artificial en una célula que se vuelve parte del genoma de la célula, la línea celular, el tejido u organismo (ya sea integrado de manera estable o como un elemento extracromosómico estable) el cual se desarrolla desde dicha célula. Tal transgen puede incluir un gen el cual es parcial o completamente heterólogo o extraño a la célula u organismo al cual se introduce el gen heterólogo, o puede representar un gen homólogo para un gen endógeno del organismo. Se incluyen dentro de la definición los transgenes creados al suministrar una secuencia de ARN que es transcrita en ADN y que después se incorpora en el genoma. Adicionalmente, el término "transgénico" incluye cualquier organismo o parte del mismo que incluye, pero que no se limita a células, líneas celulares, cultivos celulares o tejidos cuyo genoma ha sido alterado por manipulación in vitro o por cualquier tecnología transgenica.

II. Embriocitos o células estromales derivadas de tejido adiposo Los embriocitos derivados de tejido adiposo o "células estromales derivadas de tejido adiposo" se refieren a células que se originan del tejido adiposo. Por "adiposo" se quiere significar cualquier tejido graso. El tejido adiposo puede ser el tej ido adiposo pardo o blanco derivado de los sitios de tejido adiposo subcutáneo, epiploico/visceral , mamario, gonadal u otro sitio de tejido adiposo. Preferiblemente, el tejido adiposo es tejido adiposo blanco subcutáneo. Tales células pueden comprender un cultivo de células primarias o una línea de células inmortalizadas. El tej ido adiposo puede estar formando parte de cualquier organismo que tenga tejido graso. Preferiblemente, el tejido adiposo es de mamífero, de manera más preferible el tejido adiposo es humano. Una fuente conveniente de tejido adiposo es de cirugía de liposucción, no obstante, la fuente de tejido adiposo o el método de aislamiento de tejido adiposo no es crítico para la invención. Las células estromales derivadas de tejido adiposo extramedular humano adulto representan una fuente de células de embriocitos estromales que pueden ser cosechadas de manera sistemática con riesgo mínimo o con un mínimo de incomodidad para el paciente . La evidencia patológica sugiere que las células estromales derivadas de tejido adiposo son capaces de diferenciación a lo largo de vías de líneas múltiples. El tejido adiposo es accesible con facilidad y abundante en muchos individuos . La obesidad es una condición de proporciones epidémicas en los Estados Unidos, en donde más de 50% de los adultos exceden el BMI recomendado en base en su altura.

Se ha documentado bien que los adipocitos son una población de células reabastecible . Incluso después de remoción quirúrgica por liposucción u otros procedimientos, es común observar una recurrencia de adipocitos en un individuo con respecto al tiempo. Esto sugiere que el tejido adiposo contiene embriocitos estromales que son capaces de autorrenovación. El tejido adiposo proporciona muchas ventajas prácticas para aplicaciones de ingeniería de tejidos. En primer lugar es abundante. En segundo lugar es accesible para los métodos de recolección con riesgo mínimo para el paciente. En tercer lugar es reabastecible. Aunque las células estromales representan menos de 0.01% de la población de células nucleadas de médula ósea, constituyen hasta 8.6 x 104 células estromales por gramo de tejido adiposo (Sen et al 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319) . La expansión ex vivo durante 2 a 4 semanas proporciona hasta 500 millones de células estromales a partir de 0.5 kg de tejido adiposo. Estas células se pueden utilizar de inmediato o se pueden conservar criogénicamente para aplicaciones futuras autólogas o alogeneicas . Las células estromales derivadas de tejido adiposo también expresan una gran cantidad de proteínas de adhesión y de superficie . Estas incluyen marcadores de super icie celular tal como CD9 ,- CD29 (integrina ß?) ; CD44 (receptor de hialuronato) ; CD49 d,e (integrina a4, 5); CD54 (ICAM1) ; CD55 (factor acelerador de la extinción) ; CD105 (endoglina) ; CD106 (VAM-1) , CD166 (ALCAM) y HLA-ABC (antígeno de histocompatibilidad clase I) ; y citocinas tales como interleucinas 6, 7, 8, 11, factor estimulador de colonia de macrófagos; factor estimulador de colonias de GM; factor estimulador de colonia de granulocitos , factor inhibidor de leucemia; factor de embriocitos y proteína morfogenética ósea. Muchas de estas proteínas tienen el potencial para servir como una función de soporte hematopoyético y todas ellas comparten en común las células estromales de médula ósea . Se han reportado métodos para el aislamiento, expansión y diferenciación de células derivadas de tejido adiposo humano. Véase, por ejemplo, Burris et al 1999, Mol Endocrinol 13:410-7; Erickson et al 2002, Biochem Biophys Res Commun, 18 de enero del 2002 ,-290 (2) : 763-9; Gronthos et al, 2001, Journal of Cellular Physiology, 189:54-63; Halvorsen et al 2001, Metabolism 50407-413; Halvorsen et al 2001, Tissue Eng. 7(6) : 729-41; Harp et al 2001, Biochem Biophys Res Commun 281:907-912; Saladin et al 1999, Cell Growth & Diff 10:43-48; Sen et al 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319; Zhou et al 1999 Biotechnol . Techniques 13: 513-517. Las células estromales derivadas de tejido adiposo se obtienen de tejido adiposo humano picado, por digestión con colagenasa y centrifugación diferencial [Halvorsen et al 2001, Metabolism 50:407-413; Hauner et al 1989, J Clin Invest 84:1663-1670; Rodbell et al 1966,. J Biol Chem 241:130-139]. Otros investigadores han demostrado que las células estromales derivadas de tejido adiposo humano se pueden diferenciar en las vias de las líneas de adipocitos, condrocitos y osteoblastos [Erickson et al 2002, Biochem Biophys Res Commun. 18 de enero del 2002; 290 (2) : 763-9; Gronthos et al 2001, Journal of Cellular Physiology, 189:54-63; Halvorsen et al 2001, Metabolism 50:407-413; Halvorsen et al, 2001, Tissue Eng. 2001 Dec; 7(6):729-41; Harp et al 2001, Biochem Biophys Res Commun 281:907-912; Saladin et al 1999, Cell Growth & Diff 10:43-48; Sen et al 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319; Zhou et al 1999, Biotechnol . Technigues 13:513-517; Zuk et al 2001, Tissue Eng. 7:211-228. Las células estromales de adulto derivadas de tejido adiposo humano representan la fuente de embriocitos adultos que se pueden cosechar de manera sistemática con riesgo o incomodidad mínimos para el paciente . Se pueden expandir ex vivo, se pueden diferenciar a lo largo de vías de líneas únicas, se pueden someter a ingeniería genética y se puede volver a introducir en individuos ya sea como transplante autólogo o alogeneico. El documento WO 00/53795 de la University of Pittsburg and The Regents of the University of California y la Solicitud de patente de E.U.A. número 2002/0076400 asignada a la University of Pittsburg describen embriocitos derivados de tejido adiposo y reticular sustancialmente libres de adipocitos y eritrocitos así como poblaciones clónales de embriocitos de tejido conectivo. Las células se pueden utilizar solas o dentro de composiciones biológicamente compatibles para generar tej idos y estructuras diferenciadas in vivo e in vitro . Adicionalmente las células se pueden expandir y cultivar para promover hormonas y para proporcionar medio de cultivo acondicionado para sostener el crecimiento y expansión de otras poblaciones de células. En otro aspecto, estas publicaciones describen una retícula lipo derivada sustancialmente carente de células la cual incluye un material de matriz extracelular a partir de tejido adiposo. La retícula se puede utilizar como un sustrato para facilitar el crecimiento y diferenciación de las células, in vivo o in vitro, en tejido o estructuras en construcción o maduras . Ninguna publicación describe células estromales derivadas de tejido adiposo que se hayan inducido para expresar por lo menos una característica fenotípica o genotípica de una célula estromal intraocular. La patente de E.U.A. número 6,391,297 cedida a Artecel Sciences describe una composición de una célula estromal derivada de tejido adiposo humano aislada que se ha diferenciado para mostrar por lo menos una característica de un osteoblasto que se puede utilizar in vivo para reparar hueso y para tratar osteopatías. Estas célula similar a osteoblasto derivada de tejido adiposo opcionalmente puede ser modificada genéticamente o combinada con una matriz. La patente de E.U.A. número 6,426,222 cedida a BioHoldings describe métodos para inducir diferenciación de osteoblastos a partir de tejido adiposo extramedular humano al incubar las células de tejido adiposo en un medio nutriente liquido que debe contener un glucocorticoide . El documento O 00/44882 y la patente de E.U.A. número 6,153,432 que menciona a Halvorsen et al., como inventores, describe métodos y composiciones para la diferenciación de preadipocitos humanos aislados de tejido adiposo, en adipocitos que presentan características bioquímicas, genéticas y fisiológicas similares a las observadas en adipocitos primarios aislados. El documento WO 01/62901 y publicado como solicitud de Patente de E.U.A. número 2001/0033834 para Artecel Sciences describen células estromales derivadas de tejido adiposo aisladas que se han inducido para expresar por lo menos una característica fenotípica de una célula progenitora o hepática neuronal, de astroglia o hepatopoyética. Además, también se ha descrito una célula estromal derivada de tej ido adiposo aislado que se ha diferenciado de manera que hay una ausencia de marcadores fenotípicos de adipocito.

La patente de E.U.A. número 6,429,013 cedida a Artecel Sciences describe composiciones dirigidas a células estromales derivadas de tejido adiposo aisladas que se han inducido para expresar por lo menos una característica de un condrocito . También se describen métodos para diferenciar estas células . La patente de E.U.A. número 6,200,606 para Peterson et al . , describen que las células precursoras las cuales tienen el potencial para generar hueso o cartílago se pueden aislar de una variedad de tejidos hematopoyéticos y no hematopoyéticos que incluyen sangre periférica, médula ósea y tejido adiposo. Las células estromales derivadas de tejido adiposo útiles en los métodos de la invención se aislan por diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica tal como los descritos en WO 00/53795 para la University of Pittsburgh et al. En un método preferido, el tejido adiposo se aisla de un sujeto mamífero, preferiblemente un sujeto humano. Una fuente preferida de tejido adiposo es el tejido adiposo epiploico. En humanos, el tejido adiposo, típicamente se aisla por liposucción. Si las células de la invención van a ser transplantadas a un sujeto humano, es preferible que el tejido adiposo se aisle del mismo sujeto de manera que proporcione un transplante autólogo. Alternativamente, las células transplantadas son alogeneicas .

Como un ejemplo no limitante, un método para aislar tejido adiposo derivado de células estromales, el tejido adiposo se trata con colagenasa a concentraciones entre 0.01 a 0.5%, preferiblemente 0.04 a 0.2%, y de manera más preferible 0.1% de tripsina a concentraciones entre 0.01 a 0.5%, preferiblemente 0.04 a 0.04%, y de manera más preferible 0.2% a temperaturas entre 25° y 50°C, preferiblemente entre 33° y 40°C, y de manera más preferible a 37°C, por periodos entre 10 minutos a 3 horas, preferiblemente entre 30 minutos a 1 hora, y de manera más preferible 45 minutos. Las células se hacen pasar a través de un filtro de malla de nylon o de gasa de entre 20 micrómetros y 800 micrómetros, de manera más preferible entre 40 y 400 micrómetros, de manera más preferible de 70 micrómetros. Las células después se someten a centrifugación diferencial directamente en medio sobre Ficoll o Percoll u otro gradiente particulado. Las células se pueden centrifugar a velocidades entre 100 y 3000X g, de manera más preferible 200 a 1500X g, y de manera mucho más preferible a 500X g por períodos de entre 1 minuto a 1 hora, de manera más preferible 2 a 15 minutos, y de manera mucho más preferible 5 minutos a temperaturas de entre 4o y 50°C, de manera preferible entre 20° a 40°C, y de manera mucho más preferible a 25°C. En otro método adicional de aislamiento de células estromales derivadas de tejido adiposo se utiliza un sistema mecánico tal como el descrito en el documento de E.U.A. 5,786,207 para Katz et al. Se utiliza un sistema para introducir una muestra de tejido adiposo en un dispositivo automatizado, someterlo a fase de lavado y una fase de disociación, en donde el tejido es agitado y se hace girar de manera que la suspensión celular resultante se recolecta y un receptáculo listo para centrifugar. De esta manera, las células derivadas de tej ido adiposo se aislan de una muestra de tejido, conservando la integridad celular de las células deseadas. III . Inducción de células estromales derivadas de tejido adiposo para que muestren por lo menos una característica de una célula ocular. La invención incluye el tratamiento de una célula estromal derivada de tejido adiposo para inducirla para que forme una célula que exprese por lo menos una característica genotípica o fenotípica de una célula ocular. Los ejemplos no limitantes de la manera para inducir la diferenciación de células estromales derivadas de te ido adiposo incluyen: 1) el uso de medio celular; 2) el uso de células de soporte; 3) implantación directa de las células no diferenciadas en el tejido de un paciente; y 4) técnicas de ingeniería celular. A) Inducción de Medio Celular Aunque la invención no se une a teoría alguna de operación, se considera que el tratamiento de las células estromales derivadas de tejido adiposo con un medio que contiene una combinación de suero, extractos embriónicos, te ido/fluidos amnióticos, factores de crecimiento purificados o recombinantes , citocinas, hormonas o agentes químicos en un microambiente bidimensional o tridimensional, inducirán la diferenciación deseada. De manera más específica, la invención proporciona un método para diferenciar una célula derivada de tejido adiposo en una célula que tiene una propiedad genotípica o fenotípica de una célula ocular que comprende: sembrar en placa embriocitos adultos derivados de tejido adiposo aislados, a una densidad deseada, que incluye pero que no se limita a una densidad de aproximadamente 1000 a aproximadamente 500,000 células/cm2; incubar las células en un medio de cultivo definido químicamente que comprende por lo menos un compuesto que se selecciona del grupo que consiste de: factor de crecimiento, hormona, citocina, factor sérico, ligando receptor de hormona nuclear o cualquier otro agente químico definido. En otro aspecto adicional de la invención, las células diferenciadas de la invención se hacen crecer en cultivos hasta que se observa evidencia de formación de epitelio corneal. El medio que contiene el epitelio después se analiza por técnicas analíticas bioquímicas estándar conocidas por los expertos en la técnica para determinar la presencia de marcadores que pueden ser indicativos de la función epitelial corneal. Las capas de epitelio corneal después se injertan en tejido hospedador para propósitos de generación o regeneración de tejido. El medio base útil en los métodos de la invención incluye, pero no se limita a Neurobasal" (suplementado con o sin, suero bovino fetal o factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF, por sus siglas en inglés)), N2 , B27, medio esencial mínimo de Eagle, ADC-1, LPM (suero bovino sin albúmina), FIO (???) , F12 (HAM) , DCCM1, DCCM2 , RPMI 1640, medio BGJ, (con o sin la modificación de Fitton-Jackson) , medio de Eagle basal (BME, por' sus siglas en inglés, con la adición de la base de sal de Earle) , medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés, sin suero), Yamane, IMEM-20, medio de Eagle de modificación de Glasgow (GMEM, por sus siglas en inglés) , medio Leibovitz L-15, medio McCoy 5A, medio M199 (M199E con base de sal de Earle) , medio M199 (M199H con base de sal de Hank) , medio esencial mínimo de Eagle (MEM-E con base de sal de Earle) , medio esencial mínimo de Eagle (MEM-H con base de sal de Hank) y medio esencial mínimo de Eagle (MEM-NAA-sin aminoácidos esenciales) entre muchos otros, que incluyen al medio 1999, CMRL 1415, CMRL 1969, C RL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams', G. Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, DBC 153. Un medio preferido para uso en la presente invención es DMEM. Estos medios y otros medios útiles están disponibles de GIBCO, Grand Island, M.Y., USA y Biological Industries, Bet HaEmek, Israel, entre otros. Muchos de estos medios se resumen en Methods in Enzymology, Volumen LVIII, "Cell Culture", pp. 62-72, editado por illiam B. Jakoby and Ira H. Pastan, publicado por Academic Press, Inc. Los medios preferidos para cultivo de células epiteliales de la córnea se conocen en la técnica e incluyen medios descritos en la Patente de E.U.A. número 5,912,175 para Wille, Jr. Generalmente, los medios útiles en los métodos de la invención contendrán suero fetal de bovino u originario de otra especie en una concentración de por lo menos 1% a aproximadamente 30%, de manera preferible por lo menos aproximadamente 5% a 15%, y de manera más preferible a aproximadamente 10%. El extracto embriónico de pollo o de origen de otra especie está presente en una concentración de aproximadamente 1% a 30%, de manera preferible por lo menos aproximadamente 5% a 15%, y de manera más preferible a aproximadamente 10%. Los factores de crecimiento, citocinas, hormonas y otros factores específicos útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a hormonas del crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, interleucina-3 , interleucina-6, interleucina-7 , factor estimulador de colonia de macrófagos, ligando c-kit/factor de embriocitos, ligando de osteoprotegerina, insulina, factores de crecimientos similares a insulina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento de nervios, factor neurotrófico ciliar, factor de crecimiento derivado de plaquetas y proteína morfogenética ósea en concentraciones entre niveles de picogramos/ml a miligramos/mi . Por ejemplo, a tales concentraciones, los factores de crecimiento, citocinas y hormonas útiles en los métodos de la invención son capaces de inducir hasta 100% de células sanguíneas (de las líneas linfoide, eritroide, mieloide o plaquetaria) en ensayos de unidades formadoras de colonias (UFC) . (Moore et al. (1973) J. Nati. Cáncer Inst . 50:603-623; Lee et al. (1989) J. Immunol . 142:3875-3883; Medina et al. (2993) J. Exp. Med. 178:1507-1515. Se reconoce además que se pueden agregar al medio de cultivo componentes adicionales. Tales componentes incluyen antibióticos, albúmina, aminoácidos y otros componentes conocidos en la técnica para el cultivo de células. Adicionalmente, se pueden agregar componentes para mejorar el procedimiento de diferenciación. Por "agentes químicos" se quieren significar esteroides, retinoides y otros compuestos químicos o agentes que inducen la diferenciación de células estromales derivadas de tejido adiposo en por lo menos 25-50% en relación a un control positivo . Se reconoce que la condición de medio celular descrito en lo anterior proporciona una célula la cual exprese por lo menos una característica genotípica o fenotípica de un tipo único de célula ocular. Los tipos de células particulares se separan por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica. Son particularmente útiles medios que aprovechan las características genotípicas o fenotípicas expresadas por las células diferenciadas . Los marcadores fenotípicos de las células deseadas se incluyen en lo siguiente -y son bien conocidos por los habitualmente expertos en la técnica y se han publicado ampliamente en la literatura. Los marcadores fenotípicos adicionales continúan por ser descritos o se pueden identificar sin experimentación indebida. Cualquiera de estos marcadores se utiliza para confirmar que los embriocitos adultos derivados de tejido adiposo se han inducido hasta un estado diferenciado. Las características fenotípicas específicas de línea incluyen, pero no se limitan a proteínas de superficie celular, proteínas de citoesqueleto, morfología celular o productos secretores. Por ejemplo, las células epiteliales corneales diferenciadas sintetizan receptores para factor de crecimiento transformante ß? y ß2 (??Gß, por sus siglas en inglés) , factor de crecimiento similar a insulina (IGF, por sus siglas en inglés) , factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF, por sus siglas en inglés) , factor de crecimiento hepático (HGF, por sus siglas en inglés) y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF, por sus siglas en inglés) (Kruse & Volcker, 1997, Curr Opin Ophthalmol; 8 (4) :46-54) . Una persona habitualmente experta en la técnica reconocerá que los métodos conocidos calorimétricos, fluorescentes, inmunoquímic'os , de reacción en cadena de polimerasa, químicos o radioquímicos , determinarán con facilidad la presencia o ausencia de un marcador específico de una línea. En otra modalidad, la invención proporciona un embriocito derivado de tejido adiposo, no diferenciado y aislado capaz de ser inducido para expresar por lo menos una característica genotípica o fenotípica de una célula ocular dentro de un medio de cultivo capaz de tal diferenciación. Un embriocito adulto derivado de tejido adiposo no diferenciado se identifica por la ausencia de marcadores de los adipocitos maduros .

B. Uso de células de soporte para promover la diferenciación de las células estromales derivadas de tejido adiposo . Por lo tanto, las células derivadas de tejido adiposo de la invención se aislan y cultivan dentro de una población de células, de manera más preferible la población es una población definida. La población de células es heterogénea e incluye células de soporte para suministrar factores a las células de la invención. Las células de soporte incluyen otros tipos de células las cuales promoverán la diferenciación, crecimiento y mantenimiento de las células deseadas. Como un ejemplo no limitante, si se desea una célula estromal derivada de tejido adiposo que exprese por lo menos una característica genotípica o fenotípica de una célula epitelial corneal, las células estromales derivadas de tejido adiposo primero se aislan por cualquiera de los medios descritos en lo anterior, y se hacen crecer en cultivo en presencia de otras células de soporte oculares o no oculares. En otra modalidad, las células de soporte se derivan de cultivos primarios de estos tipos de células tomados a partir de tejido corneal cultivado. En otra modalidad adicional, las células de soporte se derivan de líneas de células inmortalizadas. En algunas modalidades, las células de soporte se obtienen de manera autóloga. En otras modalidades, las células de soporte se obtiene alogeneicamente . También se contempla por la presente invención que las células utilizadas para soporte de la diferenciación de la célula deseada se pueden someter a ingeniería genética para que sea una célula de soporte. Las células son modificadas genéticamente para que expresen genes exógenos o para que representen la expresión de genes endógenos por cualquier método descrito en lo anterior o conocido por los expertos en la técnica. Un método para la modificación genética de células de la presente invención involucra exponer la célula a fragmentos desnudos de ácido nucleico (es decir, ADN o ARN) de manera que los ácidos nucleicos se incorporen en el genoma de una célula de manera que los ácidos nucleicos se expresan dentro de la célula. Alternativamente, las células de la invención se exponen a un vector de transferencia de genes que comprende un ácido nucleico que incluye un transgen, de manera que el ácido nucleico se introduce en la célula bajo condiciones apropiadas para que el transgen se exprese dentro de la célula.

C . Implantación En otro aspecto, la invención proporciona células estromales derivadas de tejido adiposo y células diferenciadas que expresan por lo menos una característica genotípica o fenotípica de una célula ocular que es útil en transplantes autólogos y alogeneicos. Preferiblemente, el sujeto es mamífero, de manera más preferible el sujeto es humano . De esta manera, en otro aspecto adicional, la invención describe un método para proporcionar células diferenciadas capaces de expresar por lo menos una característica genotípica o fenotxpica de una célula ocular a un suj eto, que comprende : a) aislar células estromales derivadas de tejido adiposo; b) sembrar en placa e incubar las células en un medio apropiado para la diferenciación de las células; c) introducir las células diferenciadas en el sujeto. En otra modalidad de la invención, se describe un método para proporcionar células estromales derivadas de tejido adiposo no diferenciadas a un sujeto, que comprende: a) aislar células estromales derivadas de tejido adiposo; b) introducir las células no diferenciadas en el sujeto. Se contempla en la invención que cuando se introducen en el sujeto las células estromales derivadas de tejido adiposo no diferenciadas, en una modalidad particular, se introduce directamente en el ojo enfermo. En otro aspecto de la invención, las células estromales derivadas de tejido adiposo no diferenciadas se introducen junto con cualquiera de las células de soporte o medios o factores de diferenciación como se describe en la presente que proporcionarán un ambiente adecuado para la diferenciación in vivo de las células estromales. Por ejemplo, estas células de soporte en una modalidad particular son células amnióticas . En otra modalidad, las células de soporte se derivan de cultivos primarios de estas células tomados de tejido corneal cultivado. En otra modalidad adicional, las células de soporte se derivan de líneas de células inmortalizadas. En algunas modalidades, las células de soporte se obtienen de manera autóloga. En otras modalidades, las células de soporte se obtienen alogeneicamente . En otra modalidad, las células derivadas de tej ido adiposo no diferenciadas se proporcionan combinadas con un portador farmacéuticamente aceptable para una aplicación terapéutica que incluye, pero que no se limita a reparación de tejido, regeneración, reconstrucción o mejoramiento. Las células derivadas de tejido adiposo se pueden cultivar por los métodos descritos en la patente de E.U.A. número 6,153,432 (incorporado en la presente como referencia) para no diferenciar las células de manera que los embriocitos adultos no diferenciados después se inducen para que expresen características genotípicas o fenotípicas de las células diferentes a las de células derivadas de tejido adiposo. Las células derivadas de tejido adiposo no diferenciadas se pueden modificar para incluir una secuencia de un gen no endógeno para producción de una proteína o péptido deseado. En una modalidad alternativa, las células derivadas de tejido adiposo no diferenciadas se pueden administrar a un hospedador en una matriz bidimensional o tridimensional con un propósito terapéutico deseado. En una modalidad, las células no diferenciadas se obtienen de manera autóloga de las células propias de un paciente. De manera alternativa, la célula de diferenciada se obtiene alogeneicamente .

D) Manipulación genética de células derivadas de tejido adiposo de la invención Los embriocitos y su progenie son objetivos importantes para la terapia de genes, en donde los genes insertados promueven la salud del individuo y en quien se transplantan los embriocitos . En otra modalidad adicional, las células derivadas de tej ido adiposo que expresan por lo menos una característica genotípica o fenotípica de una célula ocular se modifican genéticamente para expresar genes exógenos o para reprimir la expresión de los genes endógenos . La invención proporciona un método de modificación genética de tales células y poblaciones. Un método de modificación genética de las células de la presente invención involucra exponer las células a fragmentos desnudos de ácido nucleico (es decir, ADN o ARN) de manera que los ácidos nucleicos se incorporan en el genoma de la célula de manera que los ácidos nucleicos se expresan dentro de la célula. Alternativamente, las células de la invención se exponen a un vector de transferencia de genes que comprende un ácido nucleico que incluye un transgen, de manera que el ácido nucleico se introduce en la célula bajo condiciones apropiadas para que el transgen se exprese dentro de la célula. El transgen puede ser un cásete de expresión, que incluye un polinucleótido codificante unido operablemente a un promotor adecuado. El polinucleótido codificante puede codificar para una proteína o puede codificar para ARN biológicamente activo (por ejemplo ARN antisentido o una ribozima) . Asi, por ejemplo, el polinucleótido codificante puede codificar para un gen que confiera resistencia a una toxina, una hormona, una citocina, una porción de señalización intracelular unido a superficie celular (por ejemplo moléculas de adhesión celular, receptores, etc.), un factor que promueve crecimiento o secreción de una hormona endógena, péptido u otro factor, o cualquier otro producto celular. Cuando se desee utilizar tecnología de transferencia de genes para suministrar un transgen dado, su secuencia será conocida . Dentro del cásete de expresión, el polipéptido codificante se une operablemente a un promotor adecuado. Los ejemplos de promotores adecuados incluyen promotores procarióticos y promotores virales (por ejemplo promotores retrovirales , promotores de herpes virus, promotores de citomegalovirus) . Otros promotores adecuados son promotores eucarióticos tales como mejoradores, promotores activos de manera constitutiva, promotores específicos de señal y promotores específicos de tejido. Se conocerá por los expertos en la técnica la selección del promotor apropiado adecuado para activar la expresión del gen en un contexto celular predefinido. El cásete de expresión puede incluir más de un polinucleótido codificante y puede incluir otros elementos (por ejemplo secuencias poli-A, elementos reguladores transcripcxonales y similares), según se desee. El cásete de expresión que contiene al transgen se puede incorporar en un vector genético adecuado para suministrar el transgen a las células . Dependiendo de la aplicación final deseada, cualquiera de tales vectores puede ser utxlizado para modificar genéticamente las células tales como plásmidos, ADN desnudo o virus. Se puede utilizar cualquier método de construcción del cásete de expresión deseado dentro de los vectores utilizados. Estos métodos son bien conocidos en la técnica e incluye métodos tales como clonación directa, recombinaci n homologa y similares. Aquellos expertos en la técnica comprenderán que la elección del vector determinará en gran medida el método utilizado ara introducir el vector en las células . Las células alteradas genéticamente después se pueden introducir en el organismo por diversos métodos bajo condiciones para que el transgen se exprese in vivo. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la invención, el transgen puede codificar para factores de crecimiento tales como ??Gß. Después, las células que contienen el transgen para TGF se pueden introducir en el ojo de un humano enfermo u otro mamífero. Alternativamente, los ácidos nucleicos exógenos extraños u homólogos se transfieren a las células de la presente invención por diversas técnicas adicionales familiares para los expertos en la técnica. De esta manera, los ácidos nucleicos son transferidos por métodos tales que incluyen, pero que no se limitan a electroporación, fosfato de calcio, micróinyección, lipofección, un vector retroviral u otro vector viral microbiano, o por cualquier otro método conocido por los expertos en la técnica.

E) Caracterización Celular Por "caracterización" de las células diferenciadas resultantes se pretende la identificación de las formas superficiales e intracelulares de proteínas, genes u otros marcadores indicativos de la línea a la que pertenecen las células estromales a un estado diferenciado terminal particular. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a: (a) detección de las proteínas de superficie celular por métodos inmunofluorescentes utilizando anticuerpos monoclonales específicos de proteína unidos, utilizando una etiqueta fluorescente y secundaria, que incluye el uso de métodos de citometría de flujo; (b) detección de proteínas intracelulares por métodos inmunofluorescentes utilizando anticuerpos monoclonales específicos de proteína unidos, utilizando una etiqueta fluorescente secundaria que incluye el uso de métodos de citometría de flujo; (c) detección de los genes celulares por reacción en cadena de polimerasa, hibridación in situ y análisis de transferencia Northern. Las células diferenciadas de manera terminal se pueden caracterizar por la identificación de las formas de superficie e intracelulares de proteínas, genes y otros marcadores indicativos del complemento de la línea de las células estromales a un estado diferenciado terminal particular. Estos métodos incluirán, pero no se limitan a: (a) detección de proteínas de superficie celular por ensayos inmunofluorescentes tales como citometría de flujo o inmunotinción in situ de proteínas de superficie de células estromales derivadas de tejido adiposo tales como fosfatasa alcalina, CD44, CD146, integrna ß? u osteopontina (Grontos et al. 1994 Blood 84:4164-4173), (b) detección de proteínas intracelulares por métodos inmunofluorescentes tales como citometría de flujo o inmunotinción in situ de células estromales derivadas de tejido adiposo utilizando anticuerpos monoclonales específicos; (c) detección de la expresión de los ARNm selectivos de línea tales como los producidos por células epiteliales corneales que incluyen TGF i y ß2, IGF, bFGF y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) , por métodos tales como reacción en cadena de polimerasa, hibridación in situ u otro análisis de transferencia (véase Gimble et al. 1989 Blood 74:303-311).

F) Uso de las células de la invención como agentes terapéuticos De manera más preferible, las células y poblaciones de la presente invención se utilizan como agentes terapéuticos. En una modalidad, la células estromal derivada de tejido adiposo se administra al ojo, preferiblemente en el lugar deseado, y permite diferenciarse ya sea a través de: (i) coadministración de citocinas apropiadas u otros factores biológicos, o (ii) factores in vivo ya presentes o inducidos en el hospedador. Generalmente, tales métodos involucran la transferencia de las células al tejido o depósito deseado, ya sea in vitro como un injerto antes de implantación o injertación, o bien in vivo al animal directamente. Las células son transferidas al tejido deseado por cualquier método apropiado, el cual generalmente variará de acuerdo con el tipo de tejido. Por ejemplo, las células se transfieren a un injerto al bañar al injerto o al suministrar una infusión con medio de cultivo que contiene las células . Alternativamente, las células se siembran sobre el sitio deseado dentro del tejido para establecer una población. Las células se pueden transferir a los sitios in vivo utilizando dispositivos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo catéteres, trocares, cánulas o endoprótesis colocadas con las células, etc. Las células estromales derivadas de tejido adiposo diferenciadas o no diferenciadas de la invención encuentran uso en el tratamiento para diversos desórdenes . Las células se utilizan para tratar desórdenes de la córnea que incluyen, pero que no se limitan a: aniridia o ausencia del iris; eitroqueratodermia o enrojecimiento e hiperqueratosis de la piel; queratitis con deficiencia endocrina múltiple; daños químicos, daños térmicos; queratopatía de lentes de contacto y cirugías límbicas · repetitivas o insuficiencia límbica. De manera adicional, las células de la invención se utilizan para regenerar la córnea posterior a procedimientos quirúrgicos tales como queratectomía fotorrefractaria o queratomileusis in situ láser, ambas involucran la remoción de una porción de la córnea. La recuperación de estos procedimientos con frecuencia resulta en una "opacidad estromal" anterior postquirúrgica caracterizada en modelos animales por la aparición de células miofibroblásticas que expresan actina de músculo liso a (a-SMA, por sus siglas en inglés) , lo cual se evita mediante el uso de las células y procedimientos de la presente invención. El estado de enfermedad que va a ser tratado puede resultar de una disfunción autoinmunitaria o infección por un virus o algún otro agente infeccioso.

IV. Ingeniería de Te ido Las células que se describen en la presente se pueden utilizar en ingeniería de tejido. La invención proporciona métodos para producir material animal que comprende mantener las células de la invención bajo condiciones insuficientes para que se expandan y diferencien hasta el material deseado. El material puede incluir, por ejemplo, una porción de un ojo. Como tal, las células descritas en la presente se utilizan combinadas con cualquier técnica conocida de ingeniería de tejidos, que incluyen pero que no se limitan a aquellas tecnologías descritas en los siguientes documentos: Patente de E.U.A. número 5,902,741 y 5,863,531 para Advanced Tissue Sciences, Inc.; Patente de E.U.A. número 6,139,574, Vacanti et al.; Patente de E.U.A. número 5,759,830, Vacanti et al.; Patente de E.U.A. número 5, 741, 685, Vacanti et al. ; Patente de E. U.A. número 5, 736, 372 , Vacanti et al. ; Patente de E. U.A. número 5, 804, 178, Vacanti et al. ; Patente de E. U.A. número 5, 770,417, Vacanti et al. ; Patente de E. U.A. número 5, 770, 193, Vacanti et al. ; Patente de E. U.A. número 5, 709, 854, Griffith--Cima et al . ; Patente de E .U.A. número 5,516,532, Atala et al.; Patente de E.U.A. número 5,855,610, Vacanti et al.; Patente de E.U.A. número 5,041,138, Vacanti et al.; Patente de E.U.A. número 6,027,744, Vacanti et al.; Patente de E.U.A. número 6,123,727, Vacanti et al.; Patente de E.U.A. número 5,536,656, Kemp et al.; Patente de E.U.A. número 5,144,016, Skjak-Braek et al.; Patente de E.U.A. número 5,944,754, Vacanti; Patente de E.U.A. número 5,723,331, Tubo et al.; y Patente de E.U.A. número 6,143,501, Sittinger et al . Para producir tal estructura, las células y poblaciones se mantienen bajo condiciones adecuadas para ellas para que se expandan y dividan para que formen el órgano. Esto se puede llevar a cabo al transferirlas a un animal típicamente en el sitio en el cual se desea el material nuevo. De esta manera, la invención puede facilitar la regeneración de parte de un ojo dentro de un animal en donde las células se implantan dentro de tales tejidos. En otras modalidades adicionales, las células se inducen para diferenciarse y expandirse en tejido in vitro. De esta manera, las células se pueden administra solas o en una mezcla de células, o alternativamente se pueden cultivar sobre sustratos que faciliten la formación en estructuras tridimensionales conductoras del desarrollo de tejido. Así, por ejemplo, las células se pueden cultivar o sembrar sobre una retícula biocompatible tales como aquellas que incluyen un material de matriz extracelular, polímeros sintéticos, citocinas, factores de crecimiento, etc. , tal retícula se puede moldear en formas deseadas para facilitar el desarrollo de tipos de tejido. De esta manera, la invención proporciona una composición que comprende las células de la invención y poblaciones, y una retícula biológicamente compatible. La retícula se puede formar de material polimérico que tiene fibras como una malla o esponja, típicamente con espacios del orden de entre 100 um y aproximadamente 300 um. Tal estructura proporciona área suficiente sobre la cual pueden crecer y proliferar las células. De manera deseable, la retícula es biodegradable con respecto al tiempo, de manera que se absorberá dentro del material animal conforme se desarrolle. Las retículas poliméricas o copoliméricas adecuadas se preparan utilizando monómeros tales como ácido glicólico, ácido láctico, fumarato de propilo, caprolactona y similares. Otras retículas pueden incluir proteínas, polisacáridos, polihidroxiácidos , poliortoésteres , polianhídridos, polifosfocenos , o polímeros sintéticos, particularmente polímeros biodegradables o cualquier combinación de los mismos. Además, la retícula puede incluir hormonas tales como factores de crecimiento, citocinas, morfógenos (por ejemplo ácido retinoico) , materiales de matriz extracelular deseados (por ejemplo fibronectina, laminina, colágeno, etc.) u otros materiales (por ejemplo ADN, virus u otros tipos de células, etc.), según se desee. Para formar la composición, las células se introducen en la retícula de manera que permean en los espacios intersticiales en los mismos. Por ejemplo, la matriz se puede enjuagar con una solución o suspensión que contenga las células, o la solución o suspensión de células se puede suministrar por infusión o inyectar dentro de la matriz. Preferiblemente, se utiliza un hidrogel formado por reticulación de una suspensión que incluye el polímero y que también tiene las células de la invención dispersadas en el mismo. Este método de formación permite que las células se dispersen a través de la retícula, facilitando una mayor permeación de la retícula con las células. Por supuesto, la composición también puede incluir células maduras de un fenotipo deseado o precursores de las mismas, particularmente para potenciar la inducción de las células de la invención dentro de la retícula o promover la producción de hormonas dentro de la retícula. Los expertos en la técnica apreciarán que las retículas adecuadas para inclusión dentro de la composición se derivan de cualquier fuente adecuada, por ejemplo matrigel, y por supuesto pueden incluir fuentes comerciales para retículas adecuadas. Otra retícula adecuada se deriva de la porción acelular de tejido adiposo, por ejemplo, una matriz celular de tejido adiposo que carezca sustancialmente de células. Típicamente, tales retículas derivadas de tejido adiposo incluyen proteínas tales como proteoglucanos, glucoproteínas , hialuronina, fibronectinas , colágenos y similares, la totalidad de los cuales sirven como sustratos excelentes para crecimiento celular. Adicionalmente, tales retículas derivadas de tejido adiposo pueden incluir hormonas, citocina, factores de crecimiento y similares. Los expertos en la técnica conocerán métodos para aislar tal retícula derivada de tejido adiposo, tal como se describe en el documento WO 00/53795 para la University of Pittsburg, incorporado en la presente como referencia. Las células, poblaciones, retículas y composiciones de la invención se utilizan en ingeniería de tejido y regeneración. De esta manera, la invención pertenece a una estructura implantable que incorpora cualquiera de las características de la invención descritas . La naturaleza exacta del, implante variará de acuerdo con el uso deseado. El implante puede comprender tej ido maduro o puede incluir tejido inmaduro o la retícula. Así, por ejemplo, un implante puede comprender una población de células de la invención que están experimentando diferenciación, sembradas opcionalmente dentro de una retícula de un tamaño y dimensión adecuados. Tal implante se inyecta o se injerta dentro de un hospedador para fomentar la generación o regeneración de tejido ocular dentro del paciente . La retícula derivada de tejido adiposo convenientemente se utiliza como parte de un equipo de cultivo de células. En consecuencia, la invención proporciona un equipo que incluye una retícula derivada de tejido adiposo, de la invención, y uno o más componentes tales como agentes hidratantes (por ejemplo agua, soluciones salinas fisiológicamente compatibles, medios de cultivos celular preparados, suero o combinaciones, o derivados de los mismos) , sustratos de cultivo celular (por ejemplo recipientes, frascos de placas, etc.), medio de cultivo celular (ya sea en forma líquida o pulverizada) , antibióticos, hormonas y similares. Aunque el equipo puede incluir cualquiera de tales ingredientes, preferiblemente incluye todos los ingredientes necesarios para soportar el cultivo y crecimiento de las células deseadas mediante una combinación apropiada. El equipo deseado también puede incluir células las cuales se siembran dentro de la retícula, como se describe. De manera alternativa, las células de la invención se diferencian en células que poseen por lo menos una característica de una célula epitelial corneal las cuales se expanden in vitro para hacer crecer tejido epitelial corneal para implantación subsecuente en un paciente . Las células se implantan solas o combinadas con otro tejido tal como tejido de membrana amniótica. Ahora se describirá de manera más completa la presente invención con base en los ejemplos que siguen. No obstante, la invención debe considerarse en muchas formas diferentes y no debe considerarse que está limitada a las modalidades que se establecen en la presente. En vez de esto, estas modalidades se proporcionan de manera que esta descripción será amplia y completa y presenta de modo completo el alcance de la invención para los expertos en la técnica.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Métodos Inductivos In Vi tro Se aislan embriocitos derivados de tejido adiposo de material de desperdicio de liposucción como se ha descrito (Sen et al., 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319) . Estas células pueden continuar en cultivo, en presencia de, pero sin limitarse a los siguientes medios: Neurobasal™ (JnVitrogren) suplementado con o sin suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés), N2 , B27 (InVi trogen) o factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF, por sus siglas en inglés) . También se realiza modulación de las concentraciones de glucosa en el medio. Las células se siembran a diversas densidades y se alimentan a intervalos de cada 3-6 días. De manera más preferible, se siembran a una densidad de aproximadamente 1000 a aproximadamente 500,000 células/cm2. Durante el período de cultivo, el medio condicionado se analiza utilizando radioinmunoensayos disponibles comercialmente o ensayos inmunosorbentes unidos a enzima para marcadores bioquímicos y la expresión de marcadores fenotípicos asociados con células estromales oculares o con células epiteliales corneales. Se realiza análisis inmunohistoquímico (IHC, por sus siglas en inglés) utilizando anticuerpos contra (pero sin limitarse a) cualquiera de los marcadores fenotípicos descritos en lo anterior.

Ejemplo 2 Uso de Células Derivadas de Tejido Adiposo con una Membrana Biocompatibíe Se proporcionan enfoques o soluciones para el uso de células estromales derivadas de tejido adiposo en su estado no diferenciado o diferenciado a adipocito, en una composición con un material biocompatible para transplante con el fin de reparar una lesión intraocular. Los pacientes quirúrgicos que experimentan queratectomía fototerapéutica utilizando un haz excimerico de 193 nm generado con un láser excimer VISX Star S2 (VISX, Inc., Santa Clara, CA) y a quienes se les suministra a 10 Hz con una fluencia de 160 mJ/cm2 como se describe en Lee et al (2001, Journal of Cellular . Biochemistry 81:312-319) . Se realiza un fotodesprendimiento con láser, con un diámetro central de 6 mm, estandarizado, con una profundidad de 45 µp? ajustado para eliminación de residuos epiteliales y un ajuste apropiado para desprendimiento epitelial. Después de PRK, se introducen en el área desprendida tanto embriocitos adultos derivados de tejido adiposo no diferenciados o diferenciados en adipocitos, en una composición con un material biocompatible . Antes de la introducción, las células derivadas de tejido adiposo se cultivan de una manera direccional sobre la superficie de una membrana biocompatible, que incluye pero que no se limita a membrana amniótica, submucosa intestinal porcina, Ampligraft1^, Dermagraft™ o un producto similar. Las células derivadas de tejido adiposo se cultivan como células similares a fibroblastos no diferenciados o inducidos para experimentar diferenciación de linfocitos, de acuerdo con los métodos descritos en Halvorsen et al (2001, Metabolism 50:407-413). El material compuesto celular/biomaterial se corta para que ajuste al tamaño del defecto. La superficie de las células derivadas de tejido adiposo se coloca adyacente al área desnuda de la córnea. El material compuesto de células/biomaterial se sutura en el lugar utilizando nylon 10-0 utilizando puntadas interrumpidas o continuas en la córnea y el limbo; y cualquier exceso de material compuesto se elimina por recorte (Anderson et al 2001, . Br J Ophthalmol ; 85 (5) : 557-575) . Después de la cirugía se inserta un lente de contacto de una banda desechable y se aplican por instilación antibióticos tópicos. Se evalúan a los pacientes postquirúrgicamente durante 1 a 4 días después de la cirugía y se mantienen en tratamiento con antibióticos durante períodos apropiados de tiempo (hasta 1 mes) . Se realizan exámenes de seguimiento a los 1, 3 y 6 meses que incluyen prueba de agudeza visual, refracción manifiesta, evaluación de ranura de lámpara y microscopía confocal in vivo.

Ejemplo 3 Métodos de Terapia de Genes A continuación se describen métodos para convertir células estromales derivadas de tejido adiposo en células que expresen por lo menos un factor de crecimiento o una proteína que acelere la reparación intraocular (proteína bloqueadora de ?TGß) utilizando cualquier enfoque de vector (vector viral, de transfección u otro) . Los pacientes quirúrgicos que experimentan queratectomía fototerapéutica utilizando un haz excimérico de 193 nm generado dentro de un láser excimer VISX Star S2 (VISX, Inc., Santa Clara, CA) y se suministran a 10 Hz con una fluencia de 160 mJ/cm2 como se describe en Lee et al (2001, Ophthalmology; 108 (1) : 112-20) . Se realiza un fotodesprendimiento con láser, con un diámetro central de 6 mm, estandarizado, con una profundidad de 45 ym ajustado para eliminación de residuos epiteliales en un ajuste apropiado para desprendimiento estromal . Después de PRK, se introducen en el área desprendida tanto embriocitos adultos derivados de tejido adiposo no diferenciados o diferenciados en una composición con un material biocompatible. Antes de la introducción, las células se transfectan o transducen con un vector apropiado de ácido nucleico que exprese una proteína receptora de factor de crecimiento transformante tipo II beta soluble. Esta proteína se une al factor de crecimiento transformante ß citocina e inhibe su capacidad para iniciar una cascada de transducción de señal a nivel celular (Rowland-Goldsmith et al 2001, Clin Cáncer Res. 2001, 7 (9) :2931-40) . El factor de crecimiento transformante beta se sabe que interfiere con la recuperación después de cirugía de la córnea y promueve fibrosis corneal (Jester et al 1997, Cornea; 16 (2) :177-87) . Las células sometidas a ingeniería genética después se cultivan de una manera direccional sobre la superficie de una membrana biocompatible que incluye, pero que no se limita a membrana amniótica, submucosa intestinal porcina, Ampligraftm, Dermagraft"11 o un producto similar. Estas células se cultivan como células similares a fibroblastos no diferenciadas o se inducen para experimentar diferenciación de adipocitos, de acuerdo con los métodos descritos en Halvorsen et al (2001, etabolism 50:407-413). El compuesto de célula/biomaterial se corta para colocarse en el tamaño defectuoso. La superficie celular se coloca adyacente al área desnuda de la córnea. El material compuesto de células/biomaterial se sutura en el lugar utilizando nylon 10-0 utilizando puntadas interrumpidas o continuas en la córnea y limbo; y cualquier exceso de compuestos se elimina por recorte (Anderson et al 2001, Br J Ophthalmol; 85 (5) :567-575) . Después de la cirugía, se inserta un lente de contacto dé banda desechable y se administran por instilación antibióticos tópicos. Se valúan los pacientes postquirúrgicamente durante 1 a 4 días después de la cirugía y se mantienen bajo tratamiento con antibióticos durante períodos de tiempo apropiados (hasta 1 mes) . Los exámenes de seguimiento realizados a los 1, 3 y 6 meses incluyen prueba de agudeza visual, refracción manifiesta, > evaluación de ranura de lámpara y microscopía confocal in vivo. Ej emplo 4 Transplante Sencillo Células estromales derivadas de tejido adiposo se transplantan solas, intraocularmente . Los pacientes quirúrgicos que experimentan queratectomía fototerapéutica utilizando un haz excimérico de 193 nm generado dentro de un Láser Excimer VISX Star S2 (VISX, Inc., Santa Clara, CA) y se suministran a 10 Hz con una fluencia de 160 mJ/cm2 como se describe en Lee et al (2001, Ophthalmology; 108 (1) : 112-20) . Se realiza un fotodesprendimiento con láser, con un diámetro central de 6 mm, estandarizado, con una profundidad de 45 µp? ajustado para eliminación de residuos epiteliales y un ajuste apropiado para desprendimiento estromal. Después de P K, tanto embriocitos adultos derivados de tej ido adiposo no diferenciados o diferenciados en adipocitos se introducen en el área desprendida por inyección directa. Las células se introducen como una suspensión celular única o como láminas de células . Después de la cirugía se inserta un lente de contacto de vendaje desechable y se instilan antibióticos tópicos. Se evalúan los pacientes postquirúrgicamente durante 1 a 4 dias después de la cirugía y se mantienen en tratamiento con antibióticos durante períodos de tiempo apropiados (hasta 1 mes) . Los exámenes de seguimiento realizados a las 1, 3 y 6 meses incluyen prueba de agudeza visual, refracción manifiesta, evaluación de ranura de lámpara y microscopía confocal in vivo. Ejemplo 5 Perfil de Expresión de Citocina de Células Estromales Derivadas de Tejido Adiposo Humano Se ha determinado el perfil de expresión de citocina de células estromales derivadas de tejido adiposo humano a partir de donadores múltiples. En estos experimentos se inducen cultivos de células estromales derivadas de tej ido adiposo en reposo confluentes, inducidas con lipopolisacárido (LPS, 100 ng/ml) y medio acondicionado con AR total que se cosecha después de períodos de 1 a 24 horas. En común tanto en células murinas como con células estromales derivadas de médula ósea humana, las células estromales derivadas de tejido adiposo expresan los siguientes ARNm para citocina: interleucinas 6, 7, 8 y 11 (IL-6, -7, -8, -11), factor inhibidor de leucemia (LIF, por sus siglas en inglés) , factor estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF, por sus siglas en inglés) , factor estimulante de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, por sus siglas en inglés) , factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF, por sus siglas en inglés), ligando flt-3, factor de embriocitos, factor de necrosis tumoral a (TNFa, por sus siglas en inglés) y proteínas 2 y 4 morfogenéticas óseas t (B P-2, -4, por sus siglas en inglés) . Ejemplo 6 Capacidad De Las Células Estromales Derivadas de Tejido Adiposo Humano Para Soportar La Proliferación Y Diferenciación De Células Progenitoras de Sangre de Cordón Umbilical Se determinó la capacidad de las células estromales derivadas de tejido adiposo humano para soportar la proliferación y diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ de sangre de cordón umbilical humano. Se establecieron cultivos confluentes de células estromales derivadas de tejido adiposo en placas de 24 pozos (6 X 104 células por pozo) . Las muestras de sangre de cordón umbilical (UCB, por sus siglas en inglés) , se suprimen de eritrocitos contaminantes por tratamiento con almidón y calor y de granulocitos contaminantes por centrifugación en un gradiente de densidad Ficoll . Las células mononucleares UCB restantes se les suprime la línea de acuerdo con el protocolo StemSep11 (StemCells, Vancouver, BC) ; esto se basa en una selección inmunomagnética de células negativos utilizando una mezcla de anticuerpos dirigidos contra CD2 , CD3, CD14, CD16, CD19, CD24, CD5S, CD66b y glucoforina A. En la última etapa de purificación, las células UCB lin~ se tiñen con anticuerpos CD34 y se clasifican por citometría de flujo. Se han cocultivado hasta 10,000 de células de UCB CD34+ en pozos individuales con una capa de células estromales derivadas de tejido adiposo confluente. Los cultivos se mantienen en ausencia de citocinas exógenas por períodos de 12 días, 3 semanas o 6 semanas . Al final de estos períodos los pozos individuales se cosechan por digestión con tripsina/EDTA y se analizan por citometría de flujo utilizando una combinación de las siguientes combinaciones de anticuerpos (las etiquetas fluorescentes se indican entre paréntesis) : CD45 (FITC) , CD34 (APC) , y cualquiera de CD7 , CD10 o CD38 (PE). Los resultados de estos ensayos se describen en lo siguiente. Estos estudios examinaron la expansión de poblaciones de células heraatopoyéticas UCB en cocultivos soportados por células estromales adiposas de 12 días . En ausencia de citocinas exógenas, las células estromales derivadas de tej ido adiposo soportaron una expansión de 5.1 veces los números de células hematopoyéticas totales (promedio n = 4 donadores estromales, n = 2 donadores UCB, intervalo 2 - 9.4) . Esto corresponde a una expansión de 2.4 veces de la población de células UCB CD34+ (promedio, n = 4 donadores estromales, n = 2 donadores de UCB; intervalo 1.4 - 3.3) .· Un porcentaje significativo de células tanto de CD34+ como CD34" expresan cualquiera de los antígenos CD7 o CD10 (figura 4, promedio n = 4 donadores estromales, n = 2 donadores UCB) . Los fenotipos individuales representan los siguientes porcentajes de la población hematopoyética total: progenitores linfoides tempranos, 20.02% (CD34+, CD7+) y 9.5% (CD34+, CD10+) , respectivamente; progenitores de células NK/T (CD34~ CD7+) , 31.4% y progenitores de linfocitos B (CD34" CD10+) , 7.7%. Un análisis posterior indica que existe una expansión significativa de los progenitores linfoides tempranos. La población CD34+ CD7+ se expande 4.8 + 2.2 veces sobre los progenitores del período de 12 días (media +_ desviación estándar, n = 4 donadores estromales, n = 2 donadores UCB) . De igual manera, la población CD34+ CD10+ se expande 3.5 + 1.6 veces los progenitores (media + desviación estándar, n = 4 donadores estromales, n = 2 donadores UCB) . Estos valores exceden las veces de expansión de la población CD34+ en general y sugieren que este enfoque enriquecerá los progenitores linfoides humanos. Estos resultados indican que las células estromales derivadas de tejido adiposo pueden soportar la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas in vitro. Las modificaciones y otras modalidades de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a la cual pertenece la invención que tengan el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores y en los dibujos relacionados. Por lo tanto, debe entenderse que la invención no se limita a las modalidades específicas descritas y que las modificaciones y otras modalidades se considera que están incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones anexas . Aunque se utilizan en la presente términos específicos, estos se utilizan en un sentido genérico y descriptivo y no con propósitos de limitación. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Células estromales derivadas de tejido adiposo aisladas, caracterizadas porque se inducen para que expresen por lo menos una característica de una célula ocular. 2. La célula ocular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se diferencia in vitro . 3. La célula ocular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se diferencia in vivo. . La célula ocular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el material genético exógeno se ha introducido dentro de la célula estromal derivada de tejido adiposo aislada antes de diferenciación. 5. La célula ocular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la célula es humana. 6. La célula ocular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se implanta en un hospedador . 7. La célula ocular de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el material genético exógeno se ha introducido en la célula. 8. La célula ocular de conformidad con cualquiera - se ¬ de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la célula es una célula epitelial corneal. 9. La célula ocular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la célula es una célula estromal ocular. 10. Una composición caracterizada porque comprende una célula estromal derivada de tejido adiposo aislada, inducida para expresar por lo menos una característica de una célula ocular y un material biocompatible . 11. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el material biocompatible se selecciona del grupo que consiste de membrana amniótica, colágeno, hidrogel, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, ácido poliglicólico/poliláctico, ialuronato o fibrina. 12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el material biocompatible es membrana amniótica. 13. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizada porque la célula ocular es una célula epitelial corneal . 1 . La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizada porque la célula ocular es una célula estromal ocular. 15. Un método para diferenciar células estromales derivadas de tejido adiposo aisladas para mostrar por lo menos un marcador de célula asociado ocular caracterizado porgue comprende la etapa de poner en contacto una célula estromal derivada de tejido adiposo aislada dentro de un tejido intraocular en un hospedador. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque las células estromales derivadas de tejido adiposo aisladas se obtienen del hospedador. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque las células estromales derivadas de tejido adiposo se aislan de un donador que no es el hospedador . 18. Un método para diferenciar células estromales derivadas de tejido adiposo aisladas, para mostrar por lo menos un marcador celular ocular caracterizado porque comprende pone en contacto una célula estromal derivada de te ido adiposo aislada, con una sustancia inductora ocular. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la sustancia inductora ocular es un medio de cultivo de células definido químicamente. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el marcador celular ocular esta en un marcador para una célula epitelial corneal. 21. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el marcador celular ocular es un marcador para una célula estromal ocular. 22. Un método para tratar una enfermedad ocular, una condición degenerativa o una condición postquirúrgica en un hospedador, caracterizado porque comprende: i) inducir a una célula estromal derivada de tejido adiposo aislada para que exprese por lo menos un marcador celular ocular; y ii) transplantar la célula inducida en el hospedador. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque las células estromales derivadas de tejido adiposo se aislan del hospedador. 24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el desorden ocular, condición degenerativa o condición quirúrgica es aniridia, eitroqueratodermia, queratitis, daños químicos; daños térmicos; queratopatía por lentes de contacto; cirugías limbales repetitivas, insuficiencia limbal, queratectomía fotorrefractaria, queratomileusis in situ láser y disfunción autoinmune o infección viral o bacteriana. 25. Un método para tratar una enfermedad ocular, condición degenerativa o condición postquirúrgica en un hospedador, caracterizado porque comprende: i) aislar células estromales derivadas de tejido adiposo; y ii) transplantar las células dentro del sitio intraocular en el hospedador. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque las células estromales derivadas de tejido adiposo se aislan del hospedador. 27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porgue el desorden ocular, condición degenerativa o condición quirúrgica es aniridia, eitroqueratodermia, queratitis, daños químicos; daños térmicos; queratopatía por lentes de Contacto; cirugías limbales repetitivas, insuficiencia limbal, queratectomía fotorrefractaria, queratomileusis in situ láser y disfunción autoinmune o infección viral o bacteriana. 28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, caracterizado porque las células estromales derivadas de tejido adiposo se desdiferencían antes del transplante en el hospedador.