JPWO2017159862A1 - 多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結方法に関する。
(i)多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、および、
(ii)凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、
を含む、方法を提供する。
本発明は、さらなる態様において、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体の製造方法であって、
(i)多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、および、
(ii)凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、
を含む、方法を提供する。
本発明は、さらなる態様において、前記方法により凍結または製造された凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を提供する。
本発明は、さらなる態様において、薬剤応答評価または移植に用いるための、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を提供する。
本発明は、さらなる態様において、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含む組成物またはキットを提供する。
すなわち、多能性幹細胞由来心筋細胞は、
(1)多能性幹細胞をWNTシグナル活性化剤およびPKC活性化剤を含む培地中で培養すること、および
(2)工程(1)で得られた細胞をWNTシグナル阻害剤、Src阻害剤、およびEGF受容体阻害剤を含む培地中で培養すること、
を含む方法により得られたものでありうる。
(1)多能性幹細胞をWNTシグナル活性化剤およびPKC活性化剤を含む培地中で培養すること、および
(2)工程(1)で得られた細胞をWNTシグナル阻害剤、Src阻害剤、およびEGF受容体阻害剤を含む培地中で培養すること、
を含む方法により多能性幹細胞由来心筋細胞を得ることを、さらに含んでもよい。
1.多能性幹細胞の心筋分化誘導法であって、以下の工程を含む方法:
(1)多能性幹細胞をWNTシグナル活性化剤およびPKC活性化剤を含む培地中で培養する工程、および;
(2)工程(1)で得られた細胞をWNTシグナル阻害剤、Src阻害剤、およびEGF受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程。
2.Wntシグナル阻害剤が、以下の式(I)の化合物またはその塩である、前記1に記載の方法:
式(I):
R1−R5は、各々独立して、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基;非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基−NR12R13(R12及びR13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基である)である、ここでR1−R5のうち隣接する2つが一緒になって−O−CH2−O−または−O−(CH2)2−O−を形成していてもよい、
R6−R9は、各々独立して、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基;基−C(O)Aで置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基(Aは、非置換又は炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和5または6員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される1または2個の原子を含んでいてもよい);非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基−NR12R13(R12及びR13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基である)である、ここでR6−R9のうち隣接する2つが一緒になって−O−CH2−O−または−O−(CH2)2−O−を形成していてもよい、
R10−R11は、各々独立して、水素原子;又は炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基である、
Xは、−CR14(R14は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基である);酸素原子;硫黄原子;セレン原子;又は基−NR15(R15は、水素原子、炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数1〜5の直鎖又は分岐アシル基である)である、および
nは、0から6の整数である]。
3.R1、R4、R5、R6、R9、R10及びR11が水素原子であり、
R2及びR3が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
R7が、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基;基−C(O)Aで置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基(Aは、非置換又は炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和5または6員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される1または2個の原子を含んでいてもよい);非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基−NR12R13(R12及びR13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基である)であり、
R8が、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基;又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基であり、又は、
R7及びR8が、一緒になって−O−CH2−O−または−O−(CH2)2−O−を形成しており、
Xが、硫黄原子であり、および
nが、0から4の整数である、前記2に記載の方法。
4.R1、R4、R5、R6、R8、R9、R10及びR11が水素原子であり、
R2及びR3が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
R7が、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基;基−C(O)Aで置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基(Aは、非置換又は炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和5または6員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される1または2個の原子を含んでいてもよい);非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基−NR12R13(R12及びR13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基である)であり、
Xが、硫黄原子であり、および
nが、0から4の整数である、前記2に記載の方法。
5.R7が、ハロゲン原子である、前記4に記載の方法。
6.nが、1から4の整数である、前記3〜5のいずれかに記載の方法。
7.Wntシグナル阻害剤が、以下から選択される化合物またはその塩である、前記1に記載の方法:
KY02111
SO2077
8.Wntシグナル阻害剤が、KY02111、SO3031(KY01−I)、SO2031(KY02−I)、またはSO3042(KY03−I)である、前記7に記載の方法。
9.Wntシグナル阻害剤が、SO3042(KY03−I)である、前記8に記載の方法。
10.工程(2)の培地が2種以上のWNTシグナル阻害剤を含み、前記2種以上のWNTシグナル阻害剤の1つが前記2〜9のいずれかに記載の式(I)の化合物またはその塩であり、他のWNTシグナル阻害剤がIWP2、XAV939、およびIWR1から選択される1種以上の化合物である、前記1〜9のいずれかに記載の方法。
11.2種以上のWNTシグナル阻害剤が、前記2〜9のいずれかに記載の式(I)の化合物またはその塩およびXAV939である、前記10に記載の方法。
12.WNTシグナル活性化剤が、BIOまたはCHIR99021である、前記1〜11のいずれかに記載の方法。
13.WNTシグナル活性化剤が、CHIR99021である、前記1〜12のいずれかに記載の方法。
14.PKC活性化剤が、PMAまたはプロストラチンである、前記1〜13のいずれかに記載の方法。
15.PKC活性化剤が、PMAである、前記1〜14のいずれかに記載の方法。
16.Src阻害剤が、A419259またはSU6656である、前記1〜15のいずれかに記載の方法。
17.Src阻害剤が、A419259である、前記1〜16のいずれかに記載の方法。
18.EGF受容体阻害剤が、AG1478またはゲフィチニブである、前記1〜17のいずれかに記載の方法。
19.EGF受容体阻害剤が、AG1478である、前記1〜18のいずれかに記載の方法。
20.WNTシグナル活性化剤がCHIR99021であり、
PKC活性化剤がPMAであり、
WNTシグナル阻害剤が、KY02111、SO3031(KY01−I)、SO2031(KY02−I)、およびSO3042(KY03−I)から選択される化合物並びにXAV939であり、
Src阻害剤がA419259であり、および
EGF受容体阻害剤がAG1478である、前記1〜19のいずれかに記載の方法。
21.WNTシグナル阻害剤が、SO3042(KY03−I)およびXAV939である、前記20に記載の方法。
22.工程(1)および(2)における培地が蛋白質成分およびペプチド成分を含まない、前記1〜21のいずれかに記載の方法。
23.工程(1)および(2)において細胞を浮遊培養により培養する、前記1〜22のいずれかに記載の方法。
24.工程(1)が1〜3日間であり、工程(2)が2〜13日間である、前記1〜23のいずれかに記載の方法。
R1、R4、R5、R6、R8、R9、R10及びR11が水素原子であり、
R7が、ハロゲン原子であり、
R2及びR3が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
Xが、硫黄原子であり、および
nが、0から4、好ましくは1から4の整数である。
R1、R4、R5、R6、R8、R9、R10及びR11が水素原子であり、
R7が、ハロゲン原子であり、
R2及びR3が、メトキシ基であり、
Xが、硫黄原子であり、および
nが、0から4、好ましくは1から4の整数である。
(a)多能性幹細胞からの分化誘導で得られた心筋細胞の凝集体を、タンパク分解酵素を用いて単一細胞に分散すること、および
(b)上記(a)の細胞を容器に播種して培養し、心筋細胞の凝集体を作製すること、
を含んでもよい。
(i)多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、
(ii)凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、および
(iii)凍結された凝集体を血清およびRock阻害剤を含む培地で解凍すること
を含む方法もまた提供される。
約37℃に温めた血清およびRock阻害剤を含む培地を、前記凝集体を含む容器に、好ましくは容器中の凍結保護液の5倍量以上、より好ましくは10倍量以上の量で、加えること、
速やかに上清を捨て、再度、前記容器に前記培地を加えること、および
1日後に、培地を、血清を含みRock阻害剤を含まない培地に交換すること、
を含む。
1.多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結方法であって、
(i)多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、および、
(ii)凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、
を含む、方法。
2.凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体の製造方法であって、
(i)多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、および、
(ii)凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、
を含む、方法。
3.凝集体を5〜60分間凍結保護液に浸漬する、前記1または2に記載の方法。
4.凝集体を10〜30分間凍結保護液に浸漬する、前記1〜3のいずれかに記載の方法。
5.凝集体を2〜24℃で凍結保護液に浸漬する、前記1〜4のいずれか記載の方法。
6.凝集体を2〜10℃で凍結保護液に浸漬する、前記1〜5のいずれかに記載の方法。
7.凝集体を−60〜−150℃で凍結する、前記1〜6のいずれかに記載の方法。
8.凝集体を−70〜−90℃で凍結する、前記1〜7のいずれかに記載の方法。
9.凝集体の直径が50〜5000μmである、前記1〜8のいずれかに記載の方法。
10.凝集体の直径が50〜2000μmである、前記1〜9のいずれかに記載の方法。
11.凝集体の直径が100〜2000μmである、前記1〜10のいずれかに記載の方法。
12.多能性幹細胞由来心筋細胞がGFP−カルモジュリン−ミオシン軽鎖フラグメント結合蛋白質を発現する細胞である、前記1〜11のいずれかに記載の方法。
13.多能性幹細胞由来心筋細胞が、
(1)多能性幹細胞をWNTシグナル活性化剤およびPKC活性化剤を含む培地中で培養すること、および
(2)工程(1)で得られた細胞をWNTシグナル阻害剤、Src阻害剤、およびEGF受容体阻害剤を含む培地中で培養すること、
を含む方法により得られたものである、前記1〜12のいずれかに記載の方法。
14.工程(i)に先立ち、
(1)多能性幹細胞をWNTシグナル活性化剤およびPKC活性化剤を含む培地中で培養すること、および
(2)工程(1)で得られた細胞をWNTシグナル阻害剤、Src阻害剤、およびEGF受容体阻害剤を含む培地中で培養すること、
を含む方法により多能性幹細胞由来心筋細胞を得ることをさらに含む、前記1〜13のいずれかに記載の方法。
15.多能性幹細胞がヒトまたはサル多能性幹細胞である、前記1〜14のいずれかに記載の方法。
16.多能性幹細胞がヒトiPS細胞である、前記1〜15のいずれかに記載の方法。
17.多能性幹細胞がGFP−カルモジュリン−ミオシン軽鎖フラグメント結合蛋白質を発現する細胞である、前記1〜16のいずれかに記載の方法。
18.凍結保護液がDMSOまたはグリセロールを含む、前記1〜17のいずれかに記載の方法。
19.前記1〜18のいずれかに記載の方法により凍結または製造された、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
20.薬剤応答評価または移植に用いるための、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
21.解凍後に70%以上の生存率を有する、前記19または20に記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
22.凝集体の直径が50〜5000μmである、前記19〜21のいずれかに記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
23.凝集体の直径が50〜2000μmである、前記19〜22のいずれかに記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
24.凝集体の直径が100〜2000μmである、前記19〜23のいずれかに記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
25.直径が50〜5000μmである、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
26.凝集体の直径が50〜2000μmである、前記25に記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
27.凝集体の直径が100〜2000μmである、前記25または26に記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
28.前記19〜27のいずれかに記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含むキット。
29.マルチウェルプレート、ディッシュまたはチューブをさらに含む、前記28に記載のキット。
30.解凍用培地および/または培養用培地をさらに含む、前記28または29に記載のキット。
31.薬剤応答評価または移植に用いるための、前記28〜30のいずれかに記載のキット。
32.直径50〜5000μmの凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含む、組成物。
33.凝集体の直径が50〜2000μmである、前記32に記載の組成物。
34.凝集体の直径が100〜2000μmである、前記32または33に記載の組成物。
35.薬剤応答評価または移植に用いるための、前記32〜34のいずれかに記載の組成物。
36.前記19〜27のいずれかに記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体、前記28〜31のいずれかに記載のキット、または前記32〜34のいずれかに記載の組成物の、薬剤応答評価または移植のための使用。
国際公開第2015/182765号に記載の方法により、ヒトiPS細胞(253G1株)から心筋細凝集体を作製した。具体的には、心筋分化前期(day0−2)において、ヒトiPS細胞(253G1株)の浮遊コロニー(Minami, I. et al., Cell reports 2, 1448-1460 (2012)および国際公開第2013/111875号パンフレットに記載のとおり調製)をGSK3β阻害剤(2μM CHIR99021)とPKC活性剤(0.3μM PMA)を添加した表1の培地(以下、プロテインフリー心筋分化(PFCD)培地とも称する)により、浮遊培養条件下で培養した。次に、1日間(day2−3)、GSK3β阻害剤およびPKC活性剤化合物を含まないPFCD培地で培養した後、分化後期(day3−7)にWntシグナル阻害剤(3μM KY03−Iおよび1μM XAV939)とEGFR阻害剤(10μM AG1478)、Src阻害剤(0.3 μMA419259)を添加したPFCD培地中で、浮遊培養条件下(低接着ディッシュ(和光641−07391またはコーニングYO−01835−24)上で)で4日間培養した。その後、Wntシグナル阻害剤、EGFR阻害剤、およびSrc阻害剤を含まないPFCD培地で21〜30日間培養したものを以下の実験に使用した。
図1−Aと図1−Bの凝集体の形態について、外径と内径を計測し(図2−A)、その比率を計算し解析した(図2−B)。凝集体のまま凍結解凍したほうが、外径と内径の差が小さく、球形に近い形状であった。また、単一細胞凍結の凍結解凍の前後と凝集体凍結の凍結解凍の前後で、細胞数をセルカウンターで計測し細胞生存率の比較を行った(図2−C)。単一細胞凍結の細胞生存率が50%前後であったのに対して、凝集体凍結では85%前後と安定して高かった。
細胞内カルシウムと結合してGFP蛍光を発するカルシウム感受性GFPであるGCaMP3の遺伝子を、CRISPRを用いたAAVS1領域特異的遺伝子導入により、ヒトiPS細胞株(253G1)またはとサルiPS細胞株(HT4M2)に導入した。このGCaMP3−ヒトiPS細胞から、上記1と同様の方法で心筋細胞を誘導し、拍動時の細胞内カルシウム濃度変化に対応してGFP蛍光を発する心筋細胞凝集体を作製した。また、GCaMP−サルiPS細胞からサイトカインを用いる方法(Nat Biotechnol. 2007 Sep;25(9):1015-24. Epub 2007 Aug 26.に記載)で心筋細胞を誘導し、細胞内カルシウム濃度変化に対応してGFP蛍光を発する心筋細胞凝集体を作製した。具体的には、GCaMP−サルiPS細胞を、ヒト組換えアクチビンA(R&D Systems)(100ng/ml)を含むRPMI−B27培地(Invitrogen)で24時間培養した後、ヒト組換えBMP4(R&D Systems)(10ng/ml)を含むRPMI−B27培地で4日間培養し、その後、培地をこれらサイトカインを含まないRPMI−B27培地に交換して、21日間培養した。これらのGCaMP−心筋細胞をトリプシン/コラゲナーゼ溶液で単一細胞に分散した後、スミロンPrimeSurface 96ウェルV底プレートに1×105/ウェルで播種して均一な凝集体(直径700〜1000μm)を形成し、心筋細胞の拍動と同期する細胞内カルシウムイオン濃度変化の波形解析に用いた。
ヒトiPS細胞由来のGCaMP−心筋細胞の凝集体の、凝集体凍結前の細胞内カルシウム応答の波形パターンと解凍後1日における波形パターンを測定した(図3−A)。その結果、波形パラメータ(Time to peak(TtP)、CAD50、70、90、下記6参照)や拍動間隔(Peak to peak(PtP))について、凍結解凍前後で大きな変化がなかった(図3−B)。また、凝集体の外径は、凍結解凍後に5〜10%程度しか減少せず、また基本的な形状も保たれていた(図3−C)。これらの結果は、心筋細胞凝集体のサイズおよび形態、並びに電気生理学的応答のパターンが、凍結解凍前後で非常に良く保存されていることを示している。
凍結保護液として、セルバンカー1(日本全薬工業)にかえて、5%DMSO含有ウシ胎児血清(FBS)(5%DMSO/FBS溶液)(DMSO(Sigma)、FBS(Gibco))、10%グリセロール含有ウシ胎児血清(FBS)(10%グリセロール/FBS溶液)(グリセロール(Sigma)、FBS(Gibco))、ステムセルバンカー(日本全薬工業)、またはバンバンカー(日本ジェネティクス)を用いて、上記1と同様にヒトiPS由来心筋細胞の凝集体を凍結解凍し、凍結前と解凍後1日で凝集体の各パラメータを測定し、凍結前後の変化を解析した。また、上記3のサルiPS由来心筋細胞について、上記1と同様にセルバンカー1を凍結保護液として用いて凝集体凍結を行い、凍結前後の変化を解析した。ヒトiPS細胞由来心筋細胞の凝集体の外径の直径(図4中「直径」と示す)は、どの凍結保護液においても10%程度しか減少しなかった。また、GCaMP蛍光波形の各パラメータ(TtP、CaD50、70、90、PtP)の凍結前後の変化率は±25%以内であり、大きな変化は見られなかった。サルiPS細胞由来心筋細胞凝集体では、直径は20%程度減少し、GCaMP蛍光波形の各パラメータは20〜40%程度上昇していた。サイトカインを用いる方法で誘導されたサルiPS由来心筋細胞についても、ヒトiPS由来心筋細胞に比べ変化率は大きいものの、機能性を維持しつつ凍結解凍が可能であった。
凍結解凍後7日目のヒトiPS細胞由来のGCaMP−心筋細胞凝集体に、HERGチャネル阻害剤であるE4031(300nM)を添加し、E4031添加前と添加後10分におけるGCaMP蛍光波形(細胞内カルシウムイオン濃度変化)の各パラメータを比較した。蛍光波形の立ち上がりからピークまでの時間(TtP)、波形の立ち上がりからピークに達した後さらにピーク値の50%減衰するまでの時間(CaD50)、70%減衰するまでの時間(CaD70)、90%減衰するまでの時間(CaD90)を解析した(図5−A)。その結果、E4031の添加によりすべてのパラメータが40%前後延長しており、ウェル間のばらつきも非常に少なかった(図5−B)。HERGチャネルを阻害すると心筋活動電位と細胞内カルシウムイオン上昇の持続時間が延長し、心電図において薬剤誘導性QT延長が起こることが知られている。この結果は、凍結解凍後もHERGチャネル阻害剤の薬剤応答(QT延長)が安定して検出できることを示している。
凍結解凍後7日目のヒトiPS細胞由来のGCaMP−心筋細胞凝集体に、E4031を0、0.3、3、30、300nMの各濃度で添加し、E4031による変化率を解析した。E4031を300nMで添加した前後のGCaMP蛍光波形(図6−A)とその各波形パラメータ変化率(図6−B)を示す。TtP、CAD50、CAD70、およびCAD90の値が、3nM以上のE4031添加において濃度依存的に延長した(図6−C)。この結果は、凝集体の凍結解凍後において、HERGチャネル阻害剤の薬剤応答(QT延長)が安定して高感度に検出できることを示している。このように濃度依存的なE4031薬剤応答(QT延長)を示すことは、薬剤の心毒性評価において重要である。これらの結果により、凝集体の凍結解凍後に心毒性評価が可能であることが示された。
凍結解凍後7日目のヒトiPS細胞由来のGCaMP−心筋細胞凝集体に、300nM E4031、1μM アステミゾール、1μM ニフェカラント、10μM クロマノール293b、30μM メキシレチン、50nM ニフェジピン、300nM イソプロテレノール、1μM プロプラノロール、または50μM リアノジンを添加し、各パラメータの変化率を解析した(図7−A)。またTtP、CaD50、CAD70、およびCAD90の値をPtPの立方根で割って補正した値の変化率(TtPcF、CaD50cF、CAD70cF、およびCAD90cF)も示した(図7−B)。この補正は薬剤誘導性QT延長を解析する際に用いられる補正法である(修正QT間隔Fridericia法、QT corrected Fridericia)。E4031、アステミゾール、ニフェカラントはHERGチャネル阻害剤であり、クロマノール293bはKCNQ1チャネル阻害剤、メキシレチンは電位依存性ナトリウムチャネル阻害剤、ニフェジピンはL型カルシウムチャネル阻害剤、イソプロテレノールはβ刺激剤、プロプラノロールはβ阻害剤、リアノジンは小胞体リアノジン受容体の阻害剤である。HERG阻害剤、KCNQ1阻害剤または電位依存性ナトリウムチャネル阻害剤の添加によりTtP、CAD50、CAD70およびCAD90の値が延長し、L型カルシウムチャネル阻害剤でこれらのパラメータが短縮した。また、β刺激剤でPtPが減少(心拍数が増加)し、β阻害剤でPtPが増加(心拍数が減少)し、リアノジン受容体阻害剤でPtPが増加してGCaMP蛍光のピーク値(PeakValue、細胞内カルシウム増加量)が減少していた。これらの結果は、凍結解凍後の心筋細胞凝集体のカルシウム応答が実際の心臓における各種薬剤の効果を反映していることを示す。
凍結解凍後7日目のヒトiPS細胞由来のGCaMP−心筋細胞凝集体を用いて、アンスラサイクリン系抗がん剤の心毒性を検出するために、ドキソルビシン(Doxorubicin)(10μM)とダウノルビシン(Daunorubicin)(20μM)を24時間添加した。薬剤添加なしのコントロール心筋細胞凝集体(図8−A、8−B)とドキソルビシン添加後3日(図8−C)あるいはダウノルビシン添加後3日(図8−D)の凝集体の細胞内カルシウム波形をGCaMP蛍光でプロットした。その結果、アンスラサイクリン添加した凝集体ではPtPが短く、頻脈が見られ、また心拍間隔が一定ではなく、不整脈の発生が見られた(図8−C、8−D)。QT延長等の数分〜数十分の短期間で見られる心毒性だけでなく、抗がん剤による心毒性のような、数日以上の長期にわたる心毒性も検出可能であることが示された。
ドキソルビシン(10μM)とダウノルビシン(20μM)添加による、GCaMP蛍光波形のパラメータ変化を解析した(図9−A、9−B)。TtPやCaDに有意な変化はなかったが、PtPが有意に減少しており、頻脈が起こっていることが定量的に示されている。また、GCaMP蛍光波形の振幅(立ち上がりからピーク値までの蛍光量の絶対値)が有意に減少する傾向が見られた(図9−C)。この結果は、アンスラサイクリンの心毒性により心筋細胞死や細胞内カルシウムイオン増加量の低下が起こり、頻脈や不整脈が起きていることを示唆している。
上記1のヒトiPS由来心筋細胞を用いて、比較的少量の細胞数(0.1×105細胞/ウェル)で作製した直径100〜200μmの小さいサイズの凝集体(CB1_Small size)と、比較的大量の細胞数(2×105細胞/ウェル)で作製した直径1200〜1600μmの大きいサイズの凝集体(CB1_Large size)について、上記1と同様にセルバンカー1を凍結保護液として用いて凝集体凍結を行い、凍結前後の変化を解析した(図10)。上記5と同様に、凝集体の外径の直径(図10中「直径」と示す)は、どちらのサイズの凝集体においても、10%程度しか減少しなかった。また、GCaMP蛍光波形の各パラメータ(TtP、CaD50、70、90、PtP)の凍結前後の変化率は±25%以内であり、大きな変化は見られなかった。凝集体の細胞数とサイズを変えても、同様に凍結解凍が可能であった。
Claims (17)
- 多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結方法であって、
(i)多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、および、
(ii)凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、
を含む、方法。 - 凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体の製造方法であって、
(i)多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、および、
(ii)凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、
を含む、方法。 - 凝集体を5〜60分間凍結保護液に浸漬する、請求項1または2に記載の方法。
- 凝集体を2〜24℃で凍結保護液に浸漬する、請求項1〜3のいずれか記載の方法。
- 凝集体を−60〜−150℃で凍結する、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 凝集体の直径が50〜5000μmである、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 多能性幹細胞由来心筋細胞がGFP−カルモジュリン−ミオシン軽鎖フラグメント結合蛋白質を発現する細胞である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 多能性幹細胞由来心筋細胞が、
(1)多能性幹細胞をWNTシグナル活性化剤およびPKC活性化剤を含む培地中で培養すること、および
(2)工程(1)で得られた細胞をWNTシグナル阻害剤、Src阻害剤、およびEGF受容体阻害剤を含む培地中で培養すること、
を含む方法により得られたものである、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - 凍結保護液がDMSOまたはグリセロールを含む、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の方法により凍結または製造された、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
- 薬剤応答評価または移植に用いるための、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
- 解凍後に70%以上の生存率を有する、請求項10または11に記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
- 直径が50〜5000μmである、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
- 請求項10〜13のいずれかに記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含むキット。
- 薬剤応答評価または移植に用いるための、請求項14に記載のキット。
- 直径50〜5000μmの凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含む、組成物。
- 薬剤応答評価または移植に用いるための、請求項16に記載の組成物。
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