CN111979192A - 一种共培养体的建立方法及建立得到共培养体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种共培养体的建立方法及建立得到共培养体及其应用。本发明的共培养体的建立方法至少包括以下步骤：培养得到树突细胞或树突细胞的外泌体；培养得到肠道类器官；在培养有肠道类器官的孔板上放置transwell小室，将树突细胞的悬液或树突细胞的外泌体加入到transwell小室的上室内进行共培养，建立得到共培养体。

Description

一种共培养体的建立方法及建立得到共培养体及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种共培养体的建立方法及建立得到共培养体及其应用。
背景技术
为了建立更类似于体内环境的培养体系，尽可能使体外环境与体内环境相吻合，从而使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖，人们在细胞培养技术的基础上发展出了细胞共培养技术。细胞共培养技术是将2种或2种以上的细胞共同培养于同一环境中，具有更好地反映体内环境的优点。共培养体系主要作用：诱导细胞向另一种细胞分化；诱导细胞自身分化；维持细胞功能和活力；调控细胞增殖；促进早期胚胎发育和提高代谢产物产量。
健康肠道的功能依赖于完整的屏障功能，而屏障功能是建立在正常的肠道干细胞分化增殖及时补充受损的肠道上皮细胞的。肠炎发生时，肠道免疫稳态被打破，免疫细胞功能异常，表现为树突细胞的过度活化，引发免疫激化。故研究树突细胞对于肠道干细胞的影响作用非常重要。但关于树突细胞对肠道干细胞分化的作用还未见报道，目前在缺乏可应用于研究的细胞体系。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种共培养体的建立方法，该建立方法能够建立得到树突细胞与肠道类器官的共培养体。
本发明的第二目的在于提供一种建立得到共培养体。
本发明的第三目的在于提供的该共培养体的应用。
为了完成上述发明目的，采用的技术方案为：
本发明涉及一种共培养体的建立方法，至少包括以下步骤，
S1、培养得到树突细胞或树突细胞的外泌体；
S2、培养得到肠道类器官；
S3、在培养有肠道类器官的孔板上放置transwell小室，将所述树突细胞的悬液或树突细胞的外泌体加入到所述transwell小室的上室内进行共培养，建立得到所述共培养体；
优选的，所述树突细胞数目与所述肠道类器官数目之比为40～80：1，更优选为40～60：1。
可选的，所述肠道类器官为小肠类器官。
可选的，在所述共培养过程中，通过肠道类器官球形结构形成率、肠道类器官结构形成率和类器官演化率评价肠道类器官的生长。
可选的，所述S1至少包括以下步骤：
S11、取骨髓细胞，加入红细胞裂解液，裂解后离心；
S12、加入含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素4的完全RPMI1640培养基重悬细胞，铺至细菌培养皿中进行培养；
S13、分别于第3、6、8天，加入新的含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素4的完全RPMI1640培养基重悬细胞；
S14、第10天收集悬浮细胞，此时为未成熟的树突细胞；
S15、将所述未成熟的树突细胞离心，用完全RPMI1640培养基重悬细胞，加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和脂多糖培养2天，获得所述树突细胞。
可选的，所述含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素4的完全RPMI1640培养基中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的浓度为10～30ng/mL，优选20ng/mL；白介素4的浓度为10～30ng/mL，优选20ng/mL；
在S15中，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的浓度为5～20ng/mL，优选10ng/mL，脂多糖的浓度为0.5～2μg/mL，优选1μg/mL。
可选的，所述S1中还包含鉴定所述树突细胞的步骤；
优选的，所述鉴定采用流式细胞术。
可选的，所述S2至少包括以下步骤：
S21、将肠道冲洗后剪碎，反复吹打，
S22、将肠道碎片加入消化液进行消化，获得消化产物；
S23、将所述消化产物吹打后取上清过滤、离心；
S24、调整浓度、加入肠道类器官培养基和基质胶混匀，加至孔板上进行培养，第15天得到成熟的肠道类器官。
可选的，所述共培养过程中每36～60小时更换树突细胞的悬液，优选48小时，所述悬液中含有新鲜分离的树突细胞悬液。
本发明还涉及一种采用上述的方法建立得到的共培养体。
本发明还涉及上述的共培养体在筛选用于治疗的肠炎药物的应用。
本发明的技术方案至少具有以下技术效果：
本发明以原代培养的树突细胞和肠道类器官为材料建立了两种细胞的共培养体系，两种细胞之间既存在物质的交换，又不互相接触，可以对树突细胞和类器官在共培养体系的基础上进行相对独立的研究，适合基于两种细胞互作机制的上的病理和药理研究，为肠道的免疫稳态研究提供。本发明的培养体系能有效地研究未成熟树突细胞、成熟树突细胞对肠道类器官的生长影响作用，并可以明确不同状态下外泌体对类器官的作用。
附图说明
图1为本发明实施例培养得到的小肠类器官的照片；
图2为成熟树突细胞和不成熟树突细胞对Enteroids形成率影响的结果图；
图3为成熟树突细胞和不成熟树突细胞对类器官演化率影响的结果图；
图4为肠炎小鼠类器官的照片；
图5为未成熟树突细胞外泌体和肠炎小鼠类器官培养4天后的照片。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例涉及一种共培养体的建立方法，至少包括以下步骤，
S1、培养得到树突细胞或树突细胞的外泌体；
S2、培养得到肠道类器官；
S3、在培养有肠道类器官的孔板上放置transwell小室，将树突细胞的悬液或树突细胞的外泌体加入到所述transwell小室的上室内进行共培养，建立得到共培养体。
因为树突细胞的直径为10微米左右，而类器官的直径达100微米左右，数目比会直接影响共培养体系的实验效率，发明人经过深入研究，最终确定在0.3微米transwell小室内上层树突细胞数目为400～600个，优选500个，下层类器官数目为5～15个。
优选的，树突细胞数目与肠道类器官数目之比为40～80：1，更优选为40～60：1。
可选的，肠道类器官为小肠类器官。
可选的，在共培养过程中，通过肠道类器官球形结构形成率、肠道类器官结构形成率和类器官演化率评价肠道类器官的生长。
可选的，S1至少包括以下步骤：
S11、取骨髓细胞，加入红细胞裂解液，裂解后离心；
S12、加入含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素4的完全RPMI1640培养基重悬细胞，铺至细菌培养皿中进行培养；
S13、分别于第3、6、8天，加入新的含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素4的完全RPMI1640培养基重悬细胞；
S14、第10天收集悬浮细胞，此时为未成熟的树突细胞；
S15、将未成熟的树突细胞离心，用完全RPMI1640培养基重悬细胞，加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和脂多糖培养2天，获得树突细胞。
可选的，含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素4的完全RPMI1640培养基中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的浓度为10～30ng/mL，优选20ng/mL；白介素4的浓度为10～30ng/mL，优选20ng/mL；
在S15中，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的浓度为5～20ng/mL，优选10ng/mL，脂多糖的浓度为0.5～2μg/mL，优选1μg/mL。
可选的，S1中还包含鉴定树突细胞的步骤；优选采用流式细胞术进行鉴定。
可选的，S2至少包括以下步骤：
S21、将肠道冲洗后剪碎，反复吹打；
S22、将肠道碎片加入消化液进行消化，获得消化产物；
S23、将消化产物吹打后取上清过滤、离心；
S24、调整浓度、加入肠道类器官培养基和基质胶混匀，加至孔板上进行培养，第15天得到成熟的肠道类器官。
可选的，共培养过程中每36～60小时更换树突细胞的悬液，优选48小时，悬液中含有新鲜分离的树突细胞悬液。共培养周期为整个类器官的生长周期，时间较长，考虑到树突细胞的活性状态，故每48小时更换上层的树突细胞，以保证维持树突细胞对干细胞的影响作用。
本发明实施例还涉及一种采用上述的方法建立得到的共培养体。
本发明实施例还涉及上述的共培养体在筛选用于治疗的肠炎药物的应用。
实施例1树突细胞培养与鉴定
1、25％乌来糖处死健康雄性4到6周龄的雄性小鼠，75％乙醇浸泡10分钟。
2、无菌条件下取双侧股骨、胫骨，75％乙醇浸泡3分钟，冰冷的PBS冲洗后，用1ml注射器刺穿骨两端后，用RPMI1640培养基(Gibco公司)冲洗骨髓腔，重悬骨髓细胞。
3、在离心管中加入红细胞裂解液Tris-NH4Cl(碧云天公司)，裂解1分钟后800rpm离心5分钟，弃上清。
4、加入含20ng/mL重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)(Stemcelltech公司)和20ng/mL重组猕猴白介素4(rmIL4)(Stemcell tech公司)的完全RPMI1640培养基重悬细胞，以105/mL浓度10mL铺至100mm细菌培养皿中，以抑制巨噬细胞贴壁发育，37℃，5％CO2培养箱培养。
5、第三天，加入10ml新的rmGMCSF/rmIL4(浓度同步骤4)完全RPMI1640培养基重悬。
6、第六天和第八天，吸取3/4量培养液离心后，加入rmGMCSF/rmIL4(浓度同步骤4)完全RPMI1640培养基重悬，放回原皿。
7、第十天收集悬浮树突细胞，此时为未成熟树突细胞。
8、将细胞800rpm离心5分钟后，弃上清，用4完全RPMI1640培养基重悬细胞于细胞培养皿，加入10ng/mL的rmGM-CSF和1μg/mL的LPS，37℃，5％CO2培养箱培养两天。悬浮细胞即为成熟树突细胞。
9、收集树突细胞，1mL PBS缓冲液清洗，加入15ML管中，800rpm离心5分钟。
10、重复上述步骤两次。
11、重悬细胞于0.1mLPBS中，并转移到1.5mL离心管中。
12、按照1:100加入CD11c、CD40、CD86、I-A/I-E单抗，室温孵育1小时。
13、800rpm离心5分钟，去除上清，加1mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后将洗好的细胞重悬于0.1mLPBS中。
14、荧光二抗DyLight 488、DyLight 567按照1:100比例加入细胞悬液中，室温孵育1小时。
15、1500rpm离心5分钟，去除上清，加1mLPBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后重悬细胞于0.2mL PBS中。
16、用锡箔纸包住避光，将细胞加入流式管中，用流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司)检测。
实验结果为:
用流式细胞术结果显示：细胞表面CD80，CD86，MHCII的表达水平为96.12+1.22％，91.32+4.28％，92.67+5.52％，均呈高水平表达，符合成熟DC的表达特征。
鉴定结果为85％以上为树突细胞。
实施例2小肠类器官培养
1、25％乌来糖处死健康雄性4到6周龄的雄性小鼠，75％乙醇浸泡10分钟。
2、无菌条件下剖腹取小肠段20cm，用冰冷的PBS反复冲洗至冲洗液无色透明，灭菌剪刀将肠段剪至1cm碎片。
3、置于含有冰冷PBS约15ml的50ml的离心管中用10ml预湿的吸液管吹打5次，静置后弃上清，重复此步骤15次。
4、吸弃上清后加入消化液，室温摇床消化25分钟。
5、吸弃上清，加入15ml含1％牛血清的PBS上下吹打肠段5次，取上清经70μm细胞筛过滤。
6、过滤液4℃290RCF离心5分钟后弃上清，加入含1％牛血清的PBS10ml。
7、4℃200RCF离心3分钟后弃上清，加10ml DMEM。
8、计数并调整浓度为以500个/ml，取15ml 4℃200RCF离心5分钟后弃上清，加入150微升肠道类器官培养基和150微升基质胶(sigma)混匀，轻轻吹打10次。
9、吸取50微升加至24孔板每孔中心，37℃，5％CO2培养箱中静置10分钟
10、每孔加入750微升培养基。
11、隔天换液。
12、第十五天即为成熟类器官。制备得到的小肠类器官的照片如图1所示。
实施例3构建共培养体
1、在培养肠道类器官的24孔板上，放置0.3微米的transwell小室，将成熟或不成熟的DCs悬液750微升加到上室进行培养，24小时候更换DCs悬液，尽量保证状态良好的DCs去刺激类器官，观察类器官的各类指标。
2、每次传代铺板后，均记录每孔铺板时隐窝的数量。
培养过程中，在光学微镜下观察小肠类器官形态和结构的改变，针对肠道类器官球形结构(Enterospheres)和典型的肠道类器官结构(Enteroids)进行数量记录。在第1天和第7天计算每孔中Enterospheres数量，第2天和第10天时，记录Enteroids的数量，Enteroids的出芽数量，计算Enterospheres形成率，Enteroids形成率和Enterospheres生长成为Enteroids的类器官演化率，计算公式如下：
Figure BDA0002662346300000091
Figure BDA0002662346300000092
Figure BDA0002662346300000093
计算得到的成熟树突细胞和不成熟树突细胞对肠道类器官生长影响的的结果图如图2和图3所示。
由图2和图3可知，不成熟树突细胞对肠道类器官的生长无明显影响，成熟树突细胞能明显抑制肠道类器官的发育，提示了树突细胞对肠道类器官生长的作用。
实施例4树突细胞外泌体和肠道类器官共培养物的建立
按照实施例1的方法培养树突细胞，收集细胞上清，超速离心管300g离心10分钟后取上清，1200g离心20min，收集上清；10000g离心30min，收集上清；10000g离心60min，收集沉淀；PBS洗涤后，10000g离心60min，收集沉淀；1ml PBS重悬沉淀，0.22微米超滤离心管14000g离心5min。BCA蛋白定量。
外泌体的鉴定：
流式细胞术：100微升PBS重悬外泌体后密封置于冰上，加入20微升荧光直标抗体(CD63、CD81)，孵育30min，以pbs代替抗体为阴性对照。之后将外泌体悬液加入分支聚乙烯亚胺，37℃孵育15min，然后超速离心去除分支聚乙烯亚胺，加入纳米金颗粒，重悬后37℃60min。加入APC-DNA染料，室温15分钟后进行流式细胞术鉴定。
鉴定结果为外泌体标志蛋白CD9为阳性。
以外泌体与肠道类器官进行共培养观察，在培养肠道类器官的24孔板上，放置0.3微米的transwell小室，将8μg/mL的外泌体悬液750微升加到上室进行培养，观察类器官的各类指标。
用未成熟树突细胞外泌体和肠炎来源肠道类器官培养(共培养第四天)，发现肠炎后类器官发育缓慢现象得以缓解。实验结果图如4、图5所示。其中图4为肠炎小鼠类器官的照片，图5为未成熟树突细胞外泌体和肠炎小鼠类器官培养4天后的照片。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种共培养体的建立方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
S1、培养得到树突细胞或树突细胞的外泌体；
S2、培养得到肠道类器官；
S3、在培养有肠道类器官的孔板上放置transwell小室，将所述树突细胞的悬液或树突细胞的外泌体加入到所述transwell小室的上室内进行共培养，建立得到所述共培养体；
优选的，所述树突细胞数目与所述肠道类器官数目之比为40～80：1，更优选为40～60：1。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述肠道类器官为小肠类器官。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，在所述共培养过程中，通过肠道类器官球形结构形成率、肠道类器官结构形成率和类器官演化率评价肠道类器官的生长。
4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述S1至少包括以下步骤：
S11、取骨髓细胞，加入红细胞裂解液，裂解后离心；
S12、加入含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素4的完全RPMI1640培养基重悬细胞，铺至细菌培养皿中进行培养；
S13、分别于第3、6、8天，加入新的含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素4的完全RPMI1640培养基重悬细胞；
S14、第10天收集悬浮细胞，此时为未成熟的树突细胞；
S15、将所述未成熟的树突细胞离心，用完全RPMI1640培养基重悬细胞，加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和脂多糖培养2天，获得所述树突细胞。
5.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于，所述含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素4的完全RPMI1640培养基中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的浓度为10～30ng/mL，优选20ng/mL；白介素4的浓度为10～30ng/mL，优选20ng/mL；
在S15中，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的浓度为5～20ng/mL，优选10ng/mL，脂多糖的浓度为0.5～2μg/mL，优选1μg/mL。
6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述S1中还包含鉴定所述树突细胞的步骤；
优选的，所述鉴定采用流式细胞术。
7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述S2至少包括以下步骤：
S21、将肠道冲洗后剪碎，反复吹打，
S22、将肠道碎片加入消化液进行消化，获得消化产物；
S23、将所述消化产物吹打后取上清过滤、离心；
S24、调整浓度、加入肠道类器官培养基和基质胶混匀，加至孔板上进行培养，第15天得到成熟的肠道类器官。
8.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述共培养过程中每36～60小时更换树突细胞的悬液，优选48小时，所述悬液中含有新鲜分离的树突细胞悬液。
9.一种采用权利要求1～8任一项所述的方法建立得到的共培养体。
10.如权利要求9所述的共培养体在筛选用于治疗的肠炎药物的应用。
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