CN104726395A - 一种诱导人诱导多能干细胞定向分化为胰腺细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导人诱导多能干细胞定向分化为胰腺细胞的方法。本发明提供了抑制LSD1基因表达的物质在诱导干细胞定向分化为内胚层细胞中应用；或抑制LSD1基因表达的物质在诱导干细胞定向分化为胰腺细胞中应用。本发明的实验证明，本研究拟采用LSD1抑制剂或shRNA，不同程度地抑制或沉默hiPSCs内LSD1的表达水平，筛选出shRNA可以更好促进hiPSCs由增殖转向内胚层分化，为促使其均一进入分化状态做准备；随后，采用建立的四步诱导分化体系，诱导其高效定向分化为IPCs。为优化或建立hiPSCs向IPCs高效、定向分化方案奠定理论基础。

Description

一种诱导人诱导多能干细胞定向分化为胰腺细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种诱导人诱导多能干细胞定向分化为胰腺细胞的方法。

背景技术

糖尿病是一组以慢性血糖水平增高为特征的代谢性疾病，是由胰岛素分泌和(或)胰岛素作用缺陷引起的。胰岛移植已被认为是最有希望治愈糖尿病的方法。但胰岛移植手术需要2-3个供体来满足一位患者的需求，胰岛供体严重不足限制了胰岛移植的广泛临床应用。因此，寻找胰岛细胞的再生来源(或替代细胞)是丞待解决的问题。

随着干细胞与组织工程领域的相关研究飞速发展，人们将寻找胰岛细胞再生来源的目光集中在了干细胞身上。目前，能分化产生胰岛素分泌细胞(IPCS)的干细胞主要分三类：成体干细胞(ASCs)，胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)。

iPSCs来源的胰岛细胞，目前面临两大难题：①形成的效率低；②外源性因子的导入带来致癌性风险，这严重阻碍其深入研究及后续应用。

目前，ESCs与iPSCs主要通过以下模式：干细胞→内胚层细胞→胰腺祖细胞→胰腺内分泌祖细胞→IPCs，联合小分子化合物及细胞因子可诱导ESCs或ips细胞向IPCs定向分化。

2006年D^,Amour等首先运用五步法将人ESCs在体外诱导分化为IPCs，其中胰岛素阳性细胞的平均比率为7.3％。2007年，Jiang等仅用四种化合物(ActinA，RA，bFGF，Nic)成功将人ESCs诱导分化为Ins⁺/SST⁺/Gluc⁺的胰腺细胞群，其中胰岛素阳性细胞比率＞15％。然后，Kunisada等运用四步法成功诱导人ips细胞分化为Ins⁺/SST⁺/Gluc⁺/Ghre⁺的胰腺细胞群，但其分化效率只有16.9％。自2007年，人ips细胞的诞生避免了ESCs应用的伦理学问题，也为IPCs诱导分化研究提供了新的细胞来源。值得注意的是，Deng等人2009年依据类似于D^,Amour等的胰腺发育模式，采用四步化合物诱导法成功诱导hiPSCs分化为的胰岛素分泌细胞，其分化效率高达25％。Deng等的采用的诱导方法是目前分化效率相对较高，成熟度相对较高的(共表达insulin和Mafa)。

LSD1(又名KIAA0601，KDM1，AOF2，BHC110)是黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性的胺氧化酶，属单胺氧化酶家族的一个成员，在ESs、iPSCs及多种肿瘤细胞中高表达。

起初，人们对LSD1的研究主要集中肿瘤领域。2008年，Shao等使用LSD1的抑制剂bisguanidine 1c抑制小鼠胚胎干细胞LSD1活性后，细胞中的Oct4(POU5F1)基因表达上调，且发生不可逆性的发育阻滞，可见LSD1对小鼠胚胎发育是不可或缺的，且在全基因DNA甲基化修饰过程中发挥着重要作用。Zhang等指出LSD1高表达的肿瘤干细胞通常伴有多能性基因中Oct4和Sox2基因的表达，当LSD1失活时会抑制这些多能性基因的表达，这提示LSD1调控干细胞增殖分化的过程与多能性基因Oct4、Sox2的表达水平密切相关。另外，Whyte等人研究发现，LSD1在小鼠ESCs分化过程中可能通过锚定ESCs中多能性基因Oct4、Sox2、Nanog等的增强子区域，使多能性基因的增强子失去作用，从而不能正常启动多能性基因的表达，促进了ESCs的分化发育。人胚胎干细胞中，LSD1通常也维持着相对较高的表达水平，伴随其分化发育其表达水平逐渐下降。2011年，Adamo等利用shRNA敲除人ESCs的LSD1后发现，细胞的H3K4me2/me3水平升高，细胞开始分化，进一步研究发现LSD1通过REST结构域锚定在Oct4和Nanog的共价结构内，伴随LSD1的敲除Oct4和Nanog基因也被沉默，最终ESCs细胞自我更新能力降低，细胞开始转向分化。Sun等发现LSD1对维持神经干细胞的增殖分化也具有重要意义。利用LSD1抑制剂反环苯丙胺(TCP)或RNAi抑制LSD1基因的表达，均能下调神经干细胞的增殖能力(后者效果更为显著)。2013年，Tanabe等人发现由人角质细胞重编程获得的iPSCs也高表达LSD1，抑制LSD1基因表达后可促进iPSCs向造血谱系细胞分化。以上研究结果表明，LSD1的表达调控对为维持干细胞的增殖、分化平衡十分重要，除了对组蛋白甲基化水平的修饰外，其很可能通过共价修饰作用直接参与基因的表达调控，深入研究其调控机制对干细胞的相关研究均具有指导意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供抑制LSD1基因表达的物质的用途。

本发明提供了抑制LSD1基因表达的物质在诱导干细胞定向分化为内胚层细胞中应用；

或抑制LSD1基因表达的物质在诱导干细胞定向分化为胰腺细胞中应用；

或抑制LSD1基因表达的物质在制备诱导干细胞定向分化为内胚层细胞产品中应用；

或抑制LSD1基因表达的物质在制备诱导干细胞定向分化为胰腺细胞产品中应用。

上述应用中，所述抑制LSD1基因表达的物质为LSD1基因shRNA、反环苯丙胺或硫酸苯乙肼；

所述LSD1基因shRNA的核苷酸序列为序列表中序列1或序列2或序列3或序列4。

上述应用中，所述干细胞为离体胚胎干细胞或离体诱导多能干细胞；

所述离体胚胎干细胞为离体人胚胎干细胞；

所述离体诱导多能干细胞为离体人诱导多能干细胞。

本发明的另一个目的是提供一种使诱导多能干细胞定向分化为内胚层细胞的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：抑制离体诱导多能干细胞基因组中的LSD1基因表达，得到处理后细胞；诱导培养所述处理后细胞，得到内胚层细胞。

上述方法中，所述抑制离体诱导多能干细胞基因组中的LSD1基因表达方法为如下1)或2)：

1)用上述LSD1基因的shRNA转染离体诱导多能干细胞，得到处理后细胞；

2)将所述离体诱导多能干细胞在含有上述反环苯丙胺或硫酸苯乙肼的培养基中孵育，得到处理后细胞。

上述方法中，所述诱导培养为将所述处理后细胞在含有ActivinA(激活素A)和Wortmannin的DMEM/F12培养基中孵育；

所述含有ActivinA和Wortmannin的培养基中的ActivinA的浓度为100ng/mL；Wortmannin的浓度为1μM。

所述诱导培养的时间为4天。

本发明第三个目的是提供一种使诱导多能干细胞定向分化为胰腺细胞的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将上述方法制备的内胚层细胞在含有FGF7(成纤维细胞生长因子7)、RA(维生素A酸)和Noggin的DMEM/F12培养基中进行诱导培养(诱导培养时间为4天)，将得到的细胞称为第二次诱导后细胞；

所述含有FGF7、RA和Noggin的培养基中的RA的浓度为2μM、FGF7的浓度为20ng/mL，Noggin的浓度为50ng/mL；

2)将所述第二次诱导后细胞在含有EGF(表皮细胞生长因子)的DMEM/H培养基中进行诱导培养(诱导培养时间为5天)，将得到的细胞称为第三次诱导后细胞；

所述含有EGF的培养基中EGF的浓度为50ng/mL；

3)将所述第三次诱导后细胞在含有bFGF(成纤维细胞生长因子)、Exendin-4、BMP4和尼克酰胺的DMEM/F12培养基中进行诱导培养(诱导培养的时间为7-9天)，得到胰腺细胞；

所述含有bFGF、Exendin-4、BMP4和尼克酰胺的培养基中的bFGF的浓度为10ng/mL，Exendin-4的浓度为50ng/mL，BMP4的浓度为10ng/mL，尼克酰胺的浓度为10mM。

本发明第四个目的是提供一种使诱导多能干细胞定向分化为内胚层细胞的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述抑制LSD1基因表达的物质。

上述试剂盒还包括上述含有ActivinA和Wortmannin的培养基。

本发明第五个目的是提供一种使诱导多能干细胞定向分化为胰腺细胞的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述抑制LSD1基因表达的物质；

所述试剂盒还具体包括上述方法中的所述含有ActivinA和Wortmannin的培养基、上述的含有FGF7、RA和Noggin的培养基、含有EGF的培养基和含有bFGF、Exendin-4、BMP4和尼克酰胺的培养基。

上述含有ActivinA和Wortmannin的培养基为第一阶段诱导液，其按照如下方法制备：将BSA、N₂-supplement、B₂₇-supplement、ActivinA、Wortmannin添加至DMEM/F12液体培养基中混合均匀，得到第一阶段诱导液，且BSA的终浓度为0.2％(质量百分含量)，N₂-supplement为0.5×(商品化100×母液经上述DMEM/F12稀释)，B₂₇-supplement为0.5×(商品化50×母液经上述DMEM/F12稀释)，ActivinA(激活素A)的终浓度为100ng/mL，Wortmannin(渥曼青霉素)的终浓度为1μM。

上述含有FGF7、RA和Noggin的培养基为第二阶段诱导液，其按照如下方法制备：将BSA、ITS-supplement、B₂₇-supplement、RA、FGF7、Noggin添加至F12/IMDM液体培养基并混合均匀，得到第二阶段诱导液，且BSA的终浓度为0.5％(质量百分含量)，ITS-supplement的终浓度为0.5％(体积百分含量)，B₂₇-supplement为0.5×(商品化50×母液经上述F12/IMDM稀释)，RA的终浓度为2μM，FGF7的终浓度为20ng/mL，Noggin的终浓度为50ng/mL。

上述含有EGF的培养基为第三阶段诱导液，其按照如下方法制备：将BSA，ITS-supplement，N₂-supplement，EGF添加至DMEM high glucose液体培养基(以下简称DMEM/H培养基)并混合均匀，得到第三阶段诱导液，且BSA的终浓度为0.5％(质量百分含量)，ITS-supplement的终浓度为1％(体积百分含量)，N₂-supplement为1×(商品化100×母液经上述DMEM/H稀释)，EGF的终浓度为50ng/mL。

上述含有bFGF、Exendin-4、BMP4和尼克酰胺的培养基为第四阶段诱导液，其按照如下方法制备：将ITS-supplement，bFGF，Exendin-4、BMP4、尼克酰胺添加至DMEM/F12液体培养基并混合均匀，得到第四阶段诱导液，且ITS-supplement的终浓度为1％(体积百分含量)，bFGF的终浓度为10ng/mL，Exendin-4的终浓度为50ng/mL，BMP4的终浓度为10ng/mL，尼克酰胺的终浓度为10mM。

本发明的实验证明，本研究拟采用LSD1抑制剂或shRNA，不同程度地抑制或沉默hiPSCs内LSD1的表达水平，筛选出shRNA可以更好促进hiPSCs由增殖转向内胚层分化，为促使其均一进入分化状态做准备；随后，采用建立的四步诱导分化体系，诱导其高效定向分化为IPCs。为优化或建立hiPSCs向IPCs高效、定向分化方案奠定理论基础。

附图说明

图1为沉默或抑制LSD1后hiPSCs的形态变化。

图2为shRNA-LSD1对hiPSCs基因表达变化的影响(^*P＜0.05,^**P＜0.01)。

图3为TCP对hiPSCs的基因表达的影响。

图4为Phenelzine对hiPSCs基因表达的影响。

图5为shRNA-LSD1对hiPSCs增殖活性的影响(^*P＜0.05,^**P＜0.01)

图6为TCP和Phenelzine对hiPSCs增殖活性的影响(^*P＜0.05vs 0uM,^**P＜0.01vs 0uM)。

图7为shRNA-LSD1，TCP及Phenelzine对hiPSCs增殖能力的影响。

图8为shRNA-LSD1，TCP及Phenelzine对hiPSCs细胞周期的影响(^*P＜0.05vs iPSCsgroup)

图9为抑制或沉默LSD1的iPSCs内LSD1、H3K4me1/me2的表达变化

图10为抑制或沉默LSD1的hiPSCs内LSD1生物酶活性水平(^*P＜0.05vs iPSCs group,^**P＜0.01vs iPSCs group)

图11为hiPSCs-shRNA-LSD1-927向IPCs分化过程中的形态变化

图12为hiPSCs(LSD1⁺/^-)分化过程中的基因表达(^*P＜0.05,^**P＜0.01)

图13为hiPSCs(LSD1⁺/^-)分化为定型内胚层细胞的比率

图14为IPCs的分化效率

图15为免疫细胞荧光鉴定分化的IPCs(Scale bars＝50μm)

图16为DTZ染色鉴定分化的IPCs

图17为透射电镜下观察IPCs释放胰岛素的过程(Scale bars＝500μm)

图18为IPCs在葡萄糖刺激下的胰岛素及C-肽释放量(^*P＜0.05,^**P＜0.01)

图19为SCID-Beige小鼠肾包膜下移植手术示意图

图20为移植后各组小鼠血糖水平

图21为移植后各组小鼠血清胰岛素分泌水平(^*P＜0.05,^**P＜0.01；A图：各组小鼠血清中小鼠来源的胰岛素分泌量，B图：各组小鼠血清中人源性的胰岛素分泌量)

图22为移植后第7天、第21天各组小鼠葡萄糖耐量检测

图23为IPCs移植后小鼠左肾HE染色及免疫组织荧光染色(A1/B1/C1：IPCs-shRNA-LSD1-927，A2/B2/C2：IPCs；B1/B1Scale bars＝200μm，C1/C2Scalebars＝100μm)

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

人皮肤成纤维来源的hiPSCs(国际通用代码：hNF1④C11)，中国科学院广州生物医药与健康研究院。

BSA Sigma，美国；N₂-supplement Gibco公司，美国；B₂₇-supplement Gibco公司，美国；ActivinA Peprotech公司，美国；Wortmannin Sigma，美国；DMEM/F12液体培养基Hyclone公司，美国；RA Sigma，美国；FGF7Sigma，美国；Noggin Sigma，美国；F12/IMDM液体培养基Hyclone公司，美国；ITS-supplement Hyclone公司，美国；EGF Sigma，美国；DMEM high glucose液体培养基(DMEM/H培养基)Hyclone公司，美国；bFGF Sigma，美国；Exendin-4Sigma，美国；BMP4Sigma，美国；尼克酰胺Sigma，美国。

实施例1、抑制LSD1基因表达物质促进hiPSCs分化为内胚层细胞人皮肤成纤维来源的hiPSCs(国际通用代码：hNF1④C11)。

4种包装不同shRNA-LSD1序列的病毒液均为将不同shRNA-LSD1均通过慢病毒载体pGLV2-U6-Puro导入hNF1④C11细胞中(以下简称hiPSCs)，包装得到的不同病毒液，由上海吉玛生物制药有限公司制备。

上述shRNA-LSD1序列具体如下：

LSD1-homo-863  5'-GCAGTTGTGGTTGGATAATCC-3'(序列1)

LSD1-homo-1086  5'-GCAGCTCGACAGTTACAAAGT-3'(序列2)

LSD1-homo-927  5'-GCACCTTATAACAGTGATACT-3'(序列3)

LSD1-homo-2495  5'-GGGCTCTTATTCCTATGTTGC-3'(序列4)

Scrambled sequence  5'-GTCAAGTCTCACTTGCGTCAC-3'(序列5)

mTeSR^TM1培养基套装(stem cel l technologies,货号：05850,加拿大)：4℃冰箱内过夜解冻套装中TeSR^TM5×添加物、基础培养基，将两者混合均匀，分装后储存备用。4℃可存放2周，-20℃可存放6个月。

一、抑制LSD1基因表达物质抑制hiPSCs细胞LSD1基因表达

1、LSD1抑制剂抑制LSD1基因的表达

1)将hiPSCs细胞接种在10cm培养皿中，待铺板率达30％-50％(一般为接种后24h)，可进行加药。

2)给细胞添加含有不同浓度LSD1抑制剂的mTeSR^TM1培养基；每天更换上述培养基，连续培养72h。

含有不同浓度LSD1抑制剂的mTeSR^TM1培养基按照如下方法配置：将LSD1抑制剂和mTeSR^TM1培养基混匀，得到含有不同浓度LSD1抑制剂的mTeSR^TM1培养基。

上述LSD1抑制剂为抑制剂1(反环苯丙胺,TCP)，其不同浓度分别为：0μM，0.5μM，1.5μM，2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，20μM，30μM，40μM，60μM，80μM，120μM，160μM，200μM，300μM；

或上述LSD1抑制剂为抑制剂2(硫酸苯乙肼,Phenelzine)，其不同浓度分别为：0μM，0.5μM，1.5μM，2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，15μM，20μM，30μM，40μM，80μM，120μM，160μM，200μM。

3)弃去培养上清，用DPBS洗涤培养皿1次，弃液。

4)加入5ml DPBS，用细胞刮刮取细胞。

5)收集细胞悬液并混匀，分装成两组份(1ml用于提取总mRNA，4ml用于抽取核蛋白)，离心4℃，700×g，5min。

6)弃液，获取细胞沉淀用于下游实验，即为抑制剂处理后细胞。

上述抑制剂处理后细胞分别为不同浓度反环苯丙胺处理后细胞和不同浓度硫酸苯乙肼处理后细胞，均为抑制LSD1基因的细胞。

2、shRNA抑制LSD1基因的表达

1)将hiPSCs细胞接种在10cm培养皿中，待铺板率达30％-50％(一般为接种后24h)，可进行转染。

2)给细胞更换新鲜mTeSR^TM1培养基，分别取适量不同种包装有不同shRNA-LSD1序列的病毒液(MOI＝100)添加至对应培养皿中，轻轻晃动培养皿使病毒液充分混匀，然后置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

3)24h后，给细胞更换含1μg/ml Puro的新鲜mTeSR^TM1培养基，筛选成功转染的hiPSCs。

4)每天更换含Puro的mTeSR^TM1培养基，连续筛选72h后，更换无Puro的mTeSR^TM1，继续培养24h。

5)弃去培养上清，用DPBS洗涤培养皿1次，弃液。

6)加入5ml DPBS，用细胞刮刮取细胞。

7)收集细胞悬液并混匀，分装成两组份(1ml用于提取总mRNA，4ml用于抽取核蛋白)，离心4℃，700×g，5min。

8)弃液，获取细胞沉淀用于下游实验，即为shRNA转染后细胞。

上述包装有不同shRNA-LSD1序列的病毒液分别为包装LSD1-homo-863的病毒液、包装LSD1-homo-1086的病毒液、包装LSD1-homo-927的病毒液和包装LSD1-homo-2495的病毒液。

上述shRNA转染后细胞为转染LSD1-homo-863细胞、转染LSD1-homo-1086细胞、转染LSD1-homo-927细胞和转染LSD1-homo-2495细胞。

二、检测

1、抑制或沉默LSD1基因表达后hiPSCs的形态变化

观察上述一制备的抑制剂处理后细胞和shRNA转染后细胞，提前进入分化状态，结果见图1。正常的hiPSCs克隆(Control组)边界整齐，结构致密，细胞小且圆，胞核大且清晰，细胞核浆比高；转染LSD1-homo-927细胞(shRNA-LSD1-927)在转染48h后，克隆边缘细胞首先变得松散无序，该区域细胞体积变大，胞核变小，呈现典型的分化状态，每天更换培养基(含1μM的Puro)能出去未能成功转染的hiPSCs；

40μM TCP处理后细胞、20μM Phenelzine处理后细胞，其克隆结构均匀地呈现松散状态，集落细胞体积变大，核浆比降低，整个克隆开始分化。

表明，与不进行任何抑制处理的hiPSCs细胞相比，LSD1基因抑制剂TCP、Phenelzine和LSD1-homo-927均可促进细胞提前分化。

2、抑制或沉默LSD1后hiPSCs的形态表征基因表达变化

1)shRNA对hiPSCs细胞中相关基因表达的影响

分别检测转染LSD1-homo-863细胞(shRNA-LSD1-863)、转染LSD1-homo-1086细胞(shRNA-LSD1-1086)、转染LSD1-homo-927细胞(shRNA-LSD1-927)和转染LSD1-homo-2495细胞(shRNA-LSD1-2495)中LSD1基因的表达，采用的引物如表1所示。以IPSCs为对照。

表1为特征基因扩增所用引物

不同序列的shRNA-LSD1沉默hiPSCs内LSD1后，hiPSCs的多能性基因及三个胚层的标志性基因表达变化是不同的，结果见图2。与hiPSCs比较，不同序列的shRNA-LSD1转染hiPSCs得到的细胞中的LSD1基因的表达量均比未转染的hiPSCs细胞低，表明shRNA-LSD1均可降低hiPSCs细胞中LSD1基因的表达。

其他基因结果如下：与hiPSCs组比较，shRNA-LSD1-863与shRNA-LSD1-927细胞均可非常显著地上调表达内胚层基因Sox17(P＝0.006，P＝0.004)，显著上调内胚层基因FoxA2(P＝0.048，P＝0.045)和中胚层基因BMP2(P＝0.047，P＝0.043)；下调外胚层基因TUBB3但无统计学差异(P＝0.134，P＝0.276)；两者均能显著下调多能基因Oct4、Sox2、Nanog及LSD1的表达。

与hiPSCs组比较，shRNA-LSD1-2495显著下调多能基因Sox2(P＝0.031)和多能基因LSD1(P＝0.042)的表达，显著上调内胚层基因Sox17(P＝0.029)和中胚层基因BMP2(P＝0.049)的表达，对外胚层基因TUBB3的下调作用无统计学差异(P＝0.409)。

与hiPSCs组比较，shRNA-LSD1-1086可以显著下调Oct4、Sox2、Nanog的表达(P＝0.043，P＝0.039，P＝0.027)，对LSD1的下调作用具有显著性差异(P＝0.006)，对TUBB3的上调作用有统计学差异(P＝0.043)，对BMP2的上调作用无统计学差异(P＝0.090)。

可以看出，各组转染shRNA细胞中LSD1表达量下降，且转染后的hiPSCs细胞向内胚层细胞分化，且shRNA-LSD1-927细胞向内胚层细胞分化特征最明显(内胚层基因Sox17显著上调)。

2)TCP对hiPSCs基因表达的影响

分别检测不同浓度反环苯丙胺(TCP)处理后细胞中LSD1基因的表达，采用的引物如表1所示。

本研究针对TCP在0.0-300μM浓度区间内设置了浓度梯度，添加至hiPSCs培养基中进行培养，用以观察TCP对hiPSCs多能性基因与分化基因的影响，结果见图3(A、B)。随抑制剂浓度的升高，LSD1、Oct4、Nanog表达水平逐渐下降。在7.5μM时，LSD1的下调水平开始有统计学差异(0.7±0.05，P＝0.046)，80μM开始下调水平有显著性的差异(0.5±0.01，P＝0.008)。Oct4基因在40μM开始其下调水平有统计学差异(0.71±0.02，P＝0.042)，80μM开始下调水平有显著性差异(0.5±0.01，P＝0.007)。Nanog在40μM开始其下调水平有明显差异(0.069±0.01，P＝0.037)，80μM开始下调水平有显著性差异(0.51±0.01，P＝0.006)。Sox2在7.5μM时，其下调水平开始有统计学差异(0.065±0.01，P＝0.039)，从40μM-160μM之间下调水平逐渐降低，无明显统计学差异(P＞0.05)，160μM以后LSD1、Oct4、Nanog、Sox2四者的下调水平均有显著性差异(P＜0.001)。外胚层分化基因TUBB3在40μM开始上调(无统计学差异P＞0.05)，120μM上调至最大值(3.98.0±0.01，P＜0.01)，之后下调表达。中胚层分化基因BMP2在5μM以后开始上调表达，20μM时达到最大值(2.97±0.05，P＝0.05)，随后下调至初始水平。内胚层分化基因FoxA2从5μM开始上调表达，20μM时达到最大值(4.05±0.05，P＜0.01)，随后下调。另一个内胚层分化基因Sox17从0.5μM开始上调表达，2.5μM时有明显统计学差异(P＝0.049)，40μM达到上调水平最大值(10.1±0.15，P＝0.001)，随后上调水平下降，直至120μM后无明显统计学差异(P＞0.05)。

可以看出，TCP处理后细胞中LSD1表达量下降，且TCP处理后细胞向内胚层细胞分化，并在40μM TCP处理后内胚层基因表达量最大(内胚层基因Sox17表达量最大)。

3)Phenelzine对iPSCs基因表达的影响

分别检测不同浓度硫酸苯乙肼(Phenelzine)处理后细胞中LSD1基因的表达，采用的引物如表1所示。

本研究针对Phenelzine在0.0-200μM浓度区间内设置了浓度梯度，添加至hiPSCs培养基中进行培养，用以观察Phenelzine对hiPSCs基因表达的影响，结果见图4(A、B)。随抑制剂浓度的升高，LSD1、Oct4、Nanog表达水平逐渐下降。与对照组相比较，LSD1基因在5μM时，其下调水平开始有明显统计学差异(0.72±0.09，P＝0.048)，30μM时开始有显著性的下调(0.50±0.01，P＝0.007)。Nanog在5μM时，其下调水平具有明显统计学差异(0.70±0.01，P＝0.047)，160μM时具有显著性统计学差异(0.051±0.18，P＝0.042)。Oct4基因在30μM时，其下调水平开始有明显统计学差异(0.62±0.07，P＝0.041)，160μM时开始有明显的统计学差异(0.052±0.07，P＝0.045)。Sox2基因在20μM时下调水平有统计学差异(P＝0.047)，在20-160μM时下调幅度下降但无统计学差异(P＞0.05)，160μM以后其下调水平有统计学差异(P＝0.039)，200μM时下调具有显著性差异(P＝0.007)。分化基因TUBB3在0.5-5μM之间处于表达下调(P＞0.05)，7.5μM开始表达上调(P＞0.05)，80μM时达到最大值(1.51±0.02，P＝0.75)，随后其表达开始下调。内胚层基因Sox17在0.5μM时开始表达上调，7.5μM时达到最大值(1.49±0.03，P＝0.93)，随后表达下调。FoxA2和BMP2基因从0.5μM时均开始表达上调，且均在15μM时出现明显上调差异(P＝0.043，P＝0.039)，FoxA2在30μM达到最大值(3.99±0.08，P＝0.027)但在40μM时恢复正常表达水平，BMP2在40μM达到最大值(2.93±0.07，P＝0.031)，两者均在120μM接近正常表达水平。

可以看出，Phenelzine处理后细胞中LSD1表达量下降，且Phenelzine处理后细胞向内胚层细胞分化，并在40μM Phenelzine处理后内胚层基因BMP2表达量达到最大值。

3、LSD1抑制剂对hiPSCs增殖能力的影响

1)shRNA对hiPSCs增殖活性的影响

检测转染LSD1-homo-863细胞(shRNA-LSD1-863)、转染LSD1-homo-1086细胞(shRNA-LSD1-1086)、转染LSD1-homo-927细胞(shRNA-LSD1-927)和转染LSD1-homo-2495细胞(shRNA-LSD1-2495)的OD450值，以转染Scrambled sequence细胞(Scrambled)和hiPSCs细胞(control)为对照，具体如下：

将上述细胞在含1μg/ml Puro的新鲜mTeSR^TM1培养基，连续培养72h，每天更换新鲜培养基。弃去上清液，每孔加入100μL新鲜mTeSR^TM1培养基，随后快速加入10μLCCK-8溶液，(设置3孔，仅加mTeSR^TM1+CCK-8，用于扣除背景OD值)。将培养板置于37℃培养箱，孵育4h。使用酶标仪测定各孔于波长450nm的吸光度值，计算细胞增殖系数(细胞增殖系数＝样本孔OD值均数-背景孔OD值均数)。

结果见图5。对照组(iPSCs)与Scrambled组细胞的增殖活性无统计学差异(P＝0.542)；shRNA-LSD1-2495的增殖能力与对照组比较有统计学差异(P＝0.047)；shRNA-LSD1-863与shRNA-LSD1-927增殖能力类似(1.79±0.02，1.78±0.01)，且与对照组有显著差异(P＝0.041，P＝0.039)，尽管其增殖能力低于shRNA-LSD1-2495，但无统计学差异(P＝0.079)；shRNA-LSD1-1086的增殖能力最低(0.98±0.09)，与对照组有显著性差异(P＝0.009)且与其他各组均有统计学差异(与-2495，P＝0.039；与-863，P＝0.043；与-927，P＝0.043)。

可以看出，shRNA转染hiPSCs细胞，可以抑制hiPSCs细胞增殖，从另一个角度表明可能促进hiPSCs细胞分化。

2)TCP和Phenelzine对hiPSCs增殖能力的影响

分别检测不同浓度反环苯丙胺(TCP)处理后细胞和不同浓度硫酸苯乙肼(Phenelzine)处理后细胞的OD450值，以hiPSCs细胞(0mM)为对照。

结果见图6。如图6A所示，与对照组相比较(0μM)，TCP在5.0μM时对hiPSCs增殖抑制作用开始有统计学差异(P＝0.049)，80μM时有显著的抑制作用(P＝0.008)；如图6B所示，与对照组相比较(0.0μM)，Phenelzine在2.5μM时，对hiPSCs的增殖抑制作用开始有统计学差异(P＝0.047)，在80μM时有显著的抑制作用(P＝0.008)。

可以看出，TCP和Phenelzine处理hiPSCs细胞，可以抑制hiPSCs细胞增殖，从另一个角度表明可能促进hiPSCs细胞分化。

3、沉默或抑制LSD1对hiPSCs增殖曲线的影响

将上述2的shRNA、TCP、Phenelzine处理后的hiPSCs基因表达结果进行分析，初步确定shRNA-LSD1-927，40μM TCP，20μM Phenelzine可更好促进hiPSCs向内胚层分化，因此用上述三种处理继续进行试验：

分别以1.5×10⁴cells/孔和3.0×10⁴cells/孔的密度将hiPSCs细胞接种至96孔板，再分别进行如下处理：

转染shRNA-LSD1-927，培养24h,得到转染LSD1-homo-927细胞；

iPSCs细胞培养48h,TCP 40μM处理细胞，培养72h,得到40μM TCP处理后细胞；

iPSCs细胞培养48h,20μM Phenelzine处理细胞，培养72h,得到20μM Phenelzine处理后细胞；

检测各处理组细胞OD450值，以转染Scrambled sequence细胞(Scrambled)和hiPSCs细胞(iPSCs)为对照。

结果见图7。shRNA-LSD1-927处理组、Scrambled组的细胞起始接种密度为iPSCs组、TCP40μM组和Phenelzine 20μM组的2倍，但其转染后24h，细胞数目与对照组、抑制剂组(40μMTCP、20μM Phenelzine，还未添加)无统计学差异(P＝0.189)。接下来的72内(shRNA组使用Puro进行筛选，抑制剂组进行加药处理)，各组细胞数目开始出现变化，增殖能力出现差异。至接种后72h，Scrambled shRNA组与对照组(hiPSCs)的增殖曲线基本吻合，增殖能力无统计学差异(P＝0.195)；20μMPhenelzine组的细胞增殖速度次之，增殖能力有显著差异(P＝0.041)；40μM TCP组、shRNA-LSD1-927组的增殖能力均与对照组有非常显著的差异(P＝0.005)，且细胞增殖速率最慢的是shRNA-LSD1-927组。

可以看出，shRNA-LSD1-927组细胞增殖最慢，因此说明shRNA-LSD1-927比抑制剂更能抑制细胞增殖。

4、沉默或抑制LSD1对hiPSCs细胞周期的影响

用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况，分析了转染shRNA-LSD1-927、20μM Phenelzine处理后细胞和40μM TCP处理后细胞的hiPSCs细胞周期变化。以hiPSCs细胞为对照组。

结果见图8(A、B)。对照组(iPSCs，control)的G0/G1期细胞比率为20.99％±2.73％，S期为50.57％±2.47％；与对照组相比，20μM PhenelzineG0/G1期细胞比率(30.37％±1.92％)增高有无统计学差异(P＝0.013)，S期细胞(40.62％±2.09％)比率下降且存有统计学差异(P＝0.048)；40μM TCP组G0/G1期的细胞比率(37.04％±2.96％)比Phenelzine高但无统计学差异(P＝0.057)，S期细胞33.44％±1.94％)低也无统计学差异(P＝0.091)，但其G0/G1期、S期细胞比率较对照组均有显著差异(P＝0.009，P＝0.007)；shRNA-LSD1-927组G0/G1期细胞(47.54％±3.02％)，S期细胞(24.15％±1.01％)较对照组有显著的差异(P＝0.001，P＝0.003)。各组间G2/M期细胞比率变化的差异均无统计学意义。

说明使用shRNA-LSD1-927沉默或40μM TCP抑制iPSCs的LSD1会使细胞周期阻滞在G0/G1期，细胞增殖变慢，且shRNA-LSD1-927组较40μM TCP组作用更为明显。

5、hiPSCs核内LSD1、H3K4me1/2的表达变化

为观察抑制或沉默LSD1前后，hiPSCs核内总体LSD1、H3K4me/me2的表达变化，本研究对如下细胞提取核蛋白，并进行Western Blotting分析：转染LSD1-homo-863细胞(shRNA-LSD1-863)、转染LSD1-homo-1086细胞(shRNA-LSD1-1086)、转染LSD1-homo-927细胞(shRNA-LSD1-927)、转染LSD1-homo-2495细胞(shRNA-LSD1-2495)、40μM TCP处理后细胞以及20μM Phenelzine处理后的细胞。

以转染Scrambled sequence细胞(Scrambled)和hiPSCs细胞(iPSCs)为对照。

结果见图9。shRNA-LSD1-1086对LSD1的抑制作用最强，其次是shRNA-LSD1-927/-863，TCP及Phenelzine(条带的灰度水平显示这四者对LSD1的抑制水平类似)，shRNA-LSD1-2495的抑制能力最弱。与对照组相比，shRNA-LSD1、TCP、Phenelzine抑制LSD1后，hiPSCs的H3K4me1水平在以上各组间均有类似水平的明显上调变化；而H3K4me2的上调水平比H3K4me1水平要强，且与LSD1受抑制的程度成正相关。

6、hiPSCs核内LSD1的活性水平

本研究对如下细胞进行了核内的LSD1活性水平进行了检测：转染LSD1-homo-863细胞(shRNA-LSD1-863)、转染LSD1-homo-1086细胞(shRNA-LSD1-1086)、转染LSD1-homo-927细胞(shRNA-LSD1-927)、转染LSD1-homo-2495细胞(shRNA-LSD1-2495)、5μM TCP处理后细胞、40μM TCP处理后细胞、60μM TCP处理后细胞、80μM TCP处理后细胞、7.5μMPhenelzine处理后细胞、20μM Phenelzine处理后的细胞、40μM Phenelzine处理后的细胞、80μM Phenelzine处理后的细胞。

以转染Scrambled sequence细胞(Scrambled)和hiPSCs细胞(iPSCs)为对照。

检测方法如下：

(1)提取细胞核蛋白，并BCA法定量检测蛋白浓度；

(2)取出LSD1去甲基活性试剂盒(Epigentek,货号P-3074,美国)将试剂盒中LD1工作液，放置在冰上预冷，随后用其配制LD5/LD6工作液并于4℃保存备用；用LD2稀释LD4至工作浓度(5ng/μL)；

(3)将稀释好的LD4与LD2按照表2比例配制成不同浓度的LD4工作液，用于绘制标准曲线。

表2为各组分工作液浓度

(4)取出盒中的96孔板(已包被有二甲基基团修饰的H3K4)，设置空白对照：设置3孔，每孔加入49μL LD2，1μL LD3；设置标准品(用于制备标准曲线)：上表每一LD4浓度设置3孔，每孔加入49μL LD2及相应浓度LD4工作液1μL；设置样本孔：每组设置3孔，每孔加入47μL LD2,1μL LD3(LSD1substrate,50μg/mL)，2μL核蛋白，保证每孔终体积为50μL。

(5)使用酶标仪专用覆膜封板，置于37℃孵育90min。

(6)弃去各孔反应液，每孔加入150μL LD1工作液，洗板3次。

(7)每孔加入50μL LD5工作液，封口膜封板，室温下孵育60min。

(8)弃去各孔LD5工作液，每孔加入150μL LD1工作液，洗板3次。

(9)每孔加入50μL LD6工作液，封口膜封板，室温下孵育30min。

(10)弃去各孔LD6工作液，每孔加入150μL LD1工作液，洗板4次。

(11)每孔加入100μL LD7(Developer solution)，室温避光孵育5min。

(12)每孔加入100μL LD8(Stop solution)，终止反应。

(13)将96孔板放入荧光酶标仪中，读取450nm处的OD值，依据相关公式计算LSD1活性程度。

结果见图10。分析发现，Scrambled shRNA的LSD1活性与对照组(hiPSCs)无明显差异(12.47±0.03，12.63±0.02)(P＞0.05)；TCP、Phenelzine四个作用浓度的LSD1活性与对照组相比较均有明显差异(按上述浓度顺序，TCP：P＝0.037，P＝0.035，P＝0.035，P＝0.029；Phenelzine：P＝0.040，P＝0.036，P＝0.023，P＝0.021)；与对照组相比较，shRNA-LSD1-2495的LSD1活性明显下降(P＝0.043)，shRNA-LSD1-863与-927处理组的LSD1活性类似且均有明显下降现象(8.13±0.07，7.91±0.10)(P＝0.034，P＝0.035)，shRNA-LSD1-1086处理的hiPSCs内LSD1活性水平最低(1.92±0.09)，下降程度非常明显(P＝0.001)。

上述结果表明，沉默或抑制LSD1后，hiPSCs增殖速率变慢；通过对沉默前后的hiPSCs的细胞周期进行分析，发现沉默或抑制LSD1后hiPSCs的G0/G1期细胞显著增多，处于S合成期细胞明显减少(G2/M期细胞比例变化无统计学差异)，这是有利于hiPSCs进入分化状态的。shRNA-LSD1-927可有效抑制LSD1活性至正常组的53.4％，此时最有利于hiPSCs向内胚层分化。

实施例2、LSD1基因表达抑制的hiPSCs细胞体外高效定向分化为IPCs

一、hiPSCs的诱导分化

常规诱导组：正常hiPSCs直接进行四步诱导法诱导；

实验组(RNAi诱导组)：

A、抑制LSD1基因表达

将LSD1-homo-927通过包装LSD1-homo-927的病毒转染hiPSCs细胞，得到转染shRNA-LSD1-927细胞，用浓度为1μg/mlPuro筛选72h后，存活为阳性转染shRNA-LSD1-927细胞，即为LSD1-homo-927。

B、将LSD1-homo-927细胞进行如下四步诱导法诱导：

1、第一分化阶段：向定型内胚层分化

将hiPSCs和LSD1-homo-927细胞分别接至Matrigel包被好的培养瓶或培养板中，加入mTeSR^TM1培养基，铺板率达60％左右，弃去mTeSR^TM1培养基，加入第一阶段诱导液(RNAi诱导组完成Puro筛选后可加诱导液)。每天更换新鲜诱导液，连续诱导4天，得到第一阶段诱导后细胞。

第一阶段诱导液按照如下方法制备：将BSA、N₂-supplement、B₂₇-supplement、ActivinA、Wortmannin添加至DMEM/F12液体培养基中混合均匀，得到第一阶段诱导液，且BSA的终浓度为0.2％(质量百分含量)，N₂-supplement为0.5×(商品化100×母液经上述DMEM/F12稀释)，B₂₇-supplement为0.5×(商品化50×母液经上述DMEM/F12稀释)，ActivinA(激活素A)的终浓度为100ng/mL，Wortmannin(渥曼青霉素)的终浓度为1μM。

将上述第一阶段诱导液经0.22μm滤膜过滤除菌后使用，4℃避光储存1周内有效。

2、第二分化阶段：向胰腺祖细胞分化

弃去上述经第一阶段诱导处理后的体系中的第一阶段诱导液，更换第二阶段诱导液。每天更换新鲜诱导液，连续诱导4天，得到第二阶段诱导后细胞。

上述第二阶段诱导液按照如下方法制备：将BSA、ITS-supplement、B₂₇-supplement、RA、FGF7、Noggin添加至F12/IMDM液体培养基并混合均匀，得到第二阶段诱导液，且BSA的终浓度为0.5％(质量百分含量)，ITS-supplement的终浓度为0.5％(体积百分含量)，B₂₇-supplement为0.5×(商品化50×母液经上述F12/IMDM稀释)，RA的终浓度为2μM，FGF7的终浓度为20ng/mL，Noggin的终浓度为50ng/mL。

F12/IMDM培养基为将F12与IMDM以1:1比例(体积比)混合，得到的液体培养基。

将上述第二阶段诱导液经0.22μm滤膜过滤除菌后使用，4℃避光储存1周内有效。

3、第三分化阶段：胰腺祖细胞进一步分化

弃去上述经第二阶段诱导处理后的体系中的第二阶段诱导液，更换第三阶段诱导液。每天更换新鲜诱导液，连续诱导5天，得到第三阶段诱导后细胞。

上述第三阶段诱导液按照如下方法制备：将BSA、ITS-supplement、N₂-supplement、EGF添加至DMEM high glucose液体培养基(以下简称DMEM/H培养基)并混合均匀，得到第三阶段诱导液，且BSA的终浓度为0.5％(质量百分含量)，ITS-supplement的终浓度为1％(体积百分含量)，N₂-supplement为1×(商品化100×母液经上述DMEM/H稀释)，EGF的终浓度为50ng/mL。

将上述第三阶段诱导液经0.22μm滤膜过滤除菌后使用，4℃避光储存1周内有效。

4、第四分化阶段：IPCs的分化成熟

弃去上述经第三阶段诱导处理后的体系中的第三阶段诱导液，更换第四阶段诱导液。每天更换新鲜诱导液，连续诱导9天，得到第四阶段诱导后细胞。

上述第四阶段诱导液按照如下方法制备：将ITS-supplement，bFGF，Exendin-4、BMP4、尼克酰胺添加至DMEM/F12液体培养基并混合均匀，得到第四阶段诱导液，且ITS-supplement的终浓度为1％(体积百分含量)，bFGF的终浓度为10ng/mL，Exendin-4的终浓度为50ng/mL，BMP4的终浓度为10ng/mL，尼克酰胺的终浓度为10mM。

将上述第四阶段诱导液经0.22μm滤膜过滤除菌后使用，4℃避光储存1周内有效。

二、检测

1、分化过程中细胞的形态变化

在上述一的诱导期间，每天使用倒置显微镜观察细胞的形态变化，并拍照，结果见图11。hiPSCS(day-4)经shRNA-LSD1-927转染后24h(day-2)，光滑的克隆边界逐渐松散，细胞胞核变小体积变大，细胞开始分化；使用Puro连续筛选48h后(day0)，通过换液将未能成功转染的细胞除去，细胞此时可均一进入IPCs诱导分化过程。诱导第2天，所有细胞集落几乎全部融合在一起；诱导第4天细胞呈现立体样结构细胞层；诱导第6天，细胞出现大量三维空泡样结构；诱导第8天，空泡塌缩、变平；诱导第10天，塌缩的泡样结构内细胞呈脊索样结构快速增殖；诱导第12天，脊索样结构细胞簇成型；诱导14天，大量塌缩的空泡内脊索样结构细胞簇连成一片；诱导第16天，簇状细胞开始变圆并向簇中心汇集生长；诱导第18天，原本成细胞簇的部位开始初具细胞团样结构；诱导第20天，细胞团样结构明显增大；至第22天诱导结束后，培养瓶内可见大量团样结构(图11最后一幅图)。

表明，用实验组的方法可以得到胰岛团样结构。

2、hiPSCs分化过程中基因表达变化

利用Reanltime-PCR动态监测实验组(shRNA-LSD1-927)和对照组(ips-induced)分化为IPCs过程中，多能性基因以及胰腺β细胞发育相关基因的表达变化(所用引物见表1)，结果见图12。在诱导分化的第4天(第一诱导阶段结束)发现，对照组和shRNA-LSD1-927组的Oct4、LSD1基本下降至接零表达水平；shRNA-LSD1-927组的Sox17基因表达相对较高，与对照组有着显著性的差异(P＝0.002)，FoxA2、Pdx1基因表达水平也存在明显差异(P＝0.044，P＝0.049)，其它基因变化无统计学差异。诱导分化的第8天(第二诱导阶段结束)发现，shRNA-LSD1-927组的胰腺转录因子Pdx1表达水平与对照组比较存在显著性差异(P＝0.007)，胰腺发育相关基因Hnf6、Pax4、Nkx6.1的表达对照组比较也有明显差异(P＝0.047，P＝0.039，P＝0.049)，其它基因的表达水平则无统计学意义。诱导分化的第13天(第三诱导阶段结束)发现，shRNA-LSD1-927组的Pdx1表达水平与对照组相比依旧存在明显的差异(P＝0.004)，Pax4的表达水平与对照组比较也非常明显差异(P＝0.009)，Hnf6、Pax6、Nkx6.1、insulin表达水平也存在明显的差异(P＝0.042，P＝0.034，P＝0.029，P＝0.049)，其它基因的表达水平与对照组相比则无统计学差异。诱导分化的第22天(第四诱导阶段结束)发现，shRNA-LSD1-927组的insulin的表达水平与对照相比存在显著性差异(P＝0.008)，其它胰腺发育相关转录因子Hnf6、Pax6、Pax4、Tcf1、Nkx6.1、Glucokinase、Mafa的表达水平与对照组比较有着明显的差异(P＝0.048，P＝0.049，P＝0.036，P＝0.042，P＝0.031，P＝0.039，P＝0.048)。

表明利用shRNA-LSD1-927沉默iPSCs的LSD1基因可以显著提高胰腺分化发育相关基因(Pdx1、Hnf6、Pax4、Nkx6.1、Pax6、Glut2、Glucokinase、insulin、Mafa)的表达量。

3、定型内胚层细胞的分化效率

(1)将LSD1-homo-927细胞按照上述方法进行第一阶段的诱导分化，得到第一阶段的诱导分化后细胞。

(2)弃去培养基，PBS洗涤1次，弃液。

(3)加入0.25％胰酶(不含钙、镁)，37℃消化5min，使用含10％FBS的DMEM:F12终止消化。

(4)收集细胞悬液，移至15min离心管中离心500g×5min。

(5)弃去上清，加入PBS洗涤细胞，离心500g×5min，重复操作该步骤1次。

(6)弃液，加入Cytofix/Cytoperm液500μL，涡旋混匀细胞，室温避光固定、破膜、封闭细胞30min。

(7)离心500g×5min，弃上清。

(8)加入1×Perm/Wash buffer，涡旋混匀细胞，室温下避光孵育10min，离心500g×5min，弃上清。

(9)使用1×Perm/Wash buffer稀释抗体及同型对照(Rabbit anti-human CXCR4-FITC，Rabbit anti-human Sox17-PE，Rabbit IgG-FITC，Rabbit IgG-PE)，加至细胞沉淀中，涡旋混匀，37℃避光孵育1h。

(11)离心500g×5min，弃上清。

(12)加入1×Perm/Wash buffer洗涤细胞，500g×5min，弃上清，重复操作2次。

(13)加入含2％多聚甲醛的PBS重悬细胞，上机检测。

以iPSCs细胞为对照。

第一阶段的诱导分化结束后流式分析两组的定型内胚层细胞(Sox17⁺CXCR4⁺细胞)的比率，结果见图13。在诱导分化的第4天，对照组(iPSCs)中有85.06％±2.14％的细胞为Sox17⁺CXCR4⁺细胞，而实验组(shRNA-LSD1-927)有96.3％±1.54％的定型内胚层祖细胞，两组有明显差异(P＝0.043)，证明shRNA-LSD1-927沉默iPSCs可提高其分化为定型内胚层细胞的效率。

4、IPCs的分化效率

(1)诱导结束后，弃去细胞诱导液，加入含27.5mM葡萄糖的DMEM:F12，37℃孵育1h。

(2)弃去DMEM:F12，加入含Brefeldin A(母液1000×，工作液1×)的DMEM:F12孵育3h。

(3)弃液，加入PBS洗涤2次后弃上清。

(4)加入0.25％胰酶(不含钙、镁)，37℃消化5min，使用含10％FBS的DMEM:F12终止消化。

(5)收集细胞悬液，移至15min离心管中离心500g×5min。

(6)弃去上清，加入PBS洗涤细胞，离心500g×5min，重复操作该步骤1次。

(7)弃液，加入Cytofix/Cytoperm液500μL，涡旋混匀细胞，室温避光固定、破膜、封闭细胞30min。

(8)离心500g×5min，弃上清。

(9)加入1×Perm/Wash buffer，涡旋混匀细胞，室温下避光孵育10min，离心500g×5min，弃上清。

(10)使用1×Perm/Wash buffer稀释一抗及同型对照(insulin Rabbit mAb-PEConjugate；Rabbit mAb IgG Isotype control-PE Conjugate,200μg/mL)，加至细胞沉淀中，涡旋混匀，37℃避光孵育1h。

(11)离心500g×5min，弃上清。

(12)加入1×Perm/Wash buffer洗涤细胞，500g×5min，弃上清，重复操作2次。

(13)加入含2％多聚甲醛的PBS重悬细胞，上机检测。

通过流式细胞术检测到hiPSCs经四步法诱导分化IPCs的效率为21.52％(见图14A)，但用shRNA-LSD1-927沉默细胞的LSD1基因后，分化效率提高至39.32％(见图14B)。

5、免疫细胞荧光鉴定IPCs

(1)将iPSCs接种到激光共聚焦专用培养皿中，诱导结束后吸弃培养基，PBS洗涤2次，弃液。

(2)使用4％多聚甲醛，37℃固定25min。

(3)PBS洗涤3次，每次15min。

(4)使用透膜封闭液，37℃摇床孵育1h，给细胞打孔并封闭非特异性抗原结合位点。

(5)使用透膜封闭液稀释一抗(Guinea pig anti-insulin1:100；Goatanti-Pdx11:10000；Mouse anti-Nkx6.11:100；Sheep anti-glucagon1:500，加至皿中，4℃孵育过夜(或者7-8h)。

(6)次日，将培养皿取出，37℃复温30min 1h。

(7)弃去一抗，PBST洗涤5次，每次10min。

(8)使用PBST稀释二抗(Goat anti-guinea pig IgG 1：250；Donkey anti-goat IgG1：250；Rabbit anti-mouse IgG 1：100；Rabbit anti-sheep IgG 1：300，加至皿中，室温孵育1h。

(9)弃去二抗，PBST洗涤5次，每次10min。

(10)使用PBS稀释DAPI(母液1mg/ml，工作浓度6μg/mL)，加至皿中，室温孵育3-5min。

(11)弃去DAPI工作液，先用甲醇洗涤2次，每次5min；PBST洗涤3次，每次15min。

(12)弃去洗涤液，加入适量抗淬灭剂后，激光共聚焦显微镜下观察、拍照。

hiPSCs经shRNA-LSD1-927处理后进行22天的诱导分化，利用免疫细胞荧光染色检测胰腺发育相关蛋白的表达情况，结果见图15。结果显示，诱导分化最后阶段得到的细胞共表达Nkx6.1(绿色)和Pdx1(红色)(如图15A4)；共表达insulin(绿色)和Glucagon(红色)(如图15B4)；共表达insulin(绿色)和Pdx1(红色)(如图15C4)；对分化而来的芽状或岛状组织进行免疫荧光染色，发现共表达insulin(绿色)和Pdx1(红色)(如图15D4)，证明分化后的细胞群中至少含有胰腺α样细胞或者β样细胞两个群体，其中α样细胞具有合成胰高血糖素的功能，β样细胞具有合成胰岛素的功能。

6、DTZ染色鉴定IPCs

(1)诱导结束后，弃去培养瓶中细胞诱导液，加入PBS轻柔洗涤3次，弃液。

(2)加入DTZ工作液，37℃避光孵育15min.

(3)弃液，加入PBS轻柔洗涤3次，弃上清。

(4)加入PBS，倒置显微镜下观察并拍照，猩红色细胞即为insulin阳性细胞。

hiPSCs经shRNA-LSD1-927处理后经22天的诱导分化，进行DTZ染色，结果见图16。分化的IPCs呈致密团样或球样组织，DTZ染色呈猩红色，说明经诱导后的细胞胞浆中含有大量锌离子，而未能成功分化或分化不成熟的细胞(见背景)呈浅粉色或黄棕色。可以看出，hiPSCs经shRNA-LSD1-927处理后诱导分化的为胰腺细胞。

7、透射电镜观察IPCs

(1)诱导结束后，弃去6孔板中细胞诱导液，加入Krebs Ringer buffer轻柔洗涤2次，弃液。

(2)在培养孔中加入1mL含27.5mM葡萄糖的Krebs Ringer buffer，加入后0min，15min，2h分别使用0.25％胰酶(不含钙、镁)，37℃消化5min，使用含10％FBS的DMEM:F12终止消化。

(3)置离心管中离心，200g/min，10min。

(4)弃液，加入1M PBS(pH7.2)洗涤3次后弃上清。

(4)1M PBS 5ml重悬细胞，将细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中。

(5)离心，250g/min，15～20min，使细胞成团。

(6)固定：小心吸去上清，加入2.5％戊二醛固定液固定细胞团。

(7)取出离心管内的琼脂，仔细切下尖槽内含有细胞团的琼脂块。

(8)漂洗：1M PBS缓冲液(pH7.2)洗3次，每次15min。

(9)后固定：1％锇酸后固定60min。

(10)漂洗：1M PBS缓冲液(pH7.2)洗3次，每次15min。

(11)脱水：室温下，梯度丙酮30％，50％，70％，80％，90％，每级作用30min，纯丙酮作用3次，每次30min。

(12)渗透：无水丙酮/包埋剂＝5：1作用2h→无水丙酮/包埋剂＝3：1作用2→无水丙酮/包埋剂＝1：1作用2→无水丙酮/包埋剂＝1：3作用2→无水丙酮/包埋剂＝1：5作用2→纯包埋剂作用45℃作用2h。

(13)包埋：用牙签将渗透好的样品挑到包埋板中，45℃聚合2h，60℃聚合5h。

(14)切片：准备载网和支持膜，修块后用超薄切片机切片。

(15)拍照：使用透射电镜观察切片并拍照。

对经shRNA-LSD1-927处理后的hiPSCs进行22天的诱导分化，利用透射电镜观察IPCs胞内分泌胰岛素的情况，结果见图17。图17A显示IPCs未经葡萄糖刺激时，胞浆内未见胰岛素分泌小泡；图17B显示，在27.5mM葡萄糖刺激15min后，细胞的高尔基体开始形成初始insulin分泌小泡(红色箭头所指)；图17C显示，在27.5mM葡萄糖刺激2h后，胞浆内形成大量成熟的isulin分泌小泡(红色箭头所指黑色小泡)，证明分化的IPCs在体外可以感应外界葡萄糖刺激并能成功分泌胰岛素。

8、IPCs的胰岛素及C-肽释放量

(1)诱导结束后，弃去6孔板中细胞诱导液，加入Krebs Ringer buffer轻柔洗涤2次，弃液。

(2)在不同孔中分别加入1mL含30mM KCl，2.5mM和27.5mM葡萄糖的Krebs Ringerbuffer，37℃孵育2h。

(3)收集上清，BCA法定量上清中蛋白。

(4)依据C-peptide/insulin ELISA试剂盒说明书分别检测上清液中释放的C-peptide和insulin的含量。

将诱导分化的IPCs与成年人胰岛β细胞相比较，通过测定其释放胰岛素与C-肽的量来评估成熟度，结果见图18。在低糖(2.5mM)和高糖(27.5mM)刺激下，对照组产生的IPCs与shRNA-LSD1-927组分化的IPCs(图中示为IPCs-shRNA-LSD1-927)释放的insulin均有有明显统计学差异(P＝0.039，P＝0.026)，两者的C-peptide释放量也均有明显统计学差异(P＝0.037，P＝0.048)。成年人胰岛细胞组或对照组或shRNA-LSD1-927组来源的IPCs各自组内低、高糖刺激下释放的insulin和C-peptide也存在明显统计学差异。低、高糖刺激下，对照组来源的IPCs释放的insulin或C-peptide仅为成年胰岛细胞的1/8；shRNA-LSD1-927组来源的IPCs释放的insulin或C-peptide为成年胰岛细胞的1/6。

综合上述，本研究证明了沉默LSD1可有效提高IPCs的体外分化效率；分化的IPCs具有葡萄糖感应能力，并能合成、分泌胰岛素；胰岛素或C-peptide的释放量相当于成年胰岛的1/6，成熟度较对照组而言有所提高。

实施例3、IPCs移植治疗糖尿病的疗效观察

实验小鼠SCID-Beige(雄性)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于深圳市疾病预防与控制中心SPF级动物房。

1、糖尿病模型鼠的制备

(1)SCID-Beige小鼠适应性喂养1周后(此时小鼠已达9周龄，体重在20g-25g之间)，依据体重大小编号随机分为2组：第1组(5只)作为后续正常组使用；第2组(35只)用于造模。

(2)以上35只小鼠禁食(不禁水)12h，以175mg/kg剂量腹腔注射STZ溶液1次，注射后马上进行正常喂养；

(3)每日清晨进行尾静脉采血监测空腹血糖，连续3天测得小鼠血糖浓度≥300mg/dL，视为造模成功。

2、移植实验与分组

1)实验分组

(1)对造模成功的小鼠(30只)称重编号，随机分为3组：IPCs组(8只，移植正常诱导分化的IPCs)；IPCs-LSD1-927组(8只，shRNA-LSD1-927组细胞诱导分化的IPCs)、Diabetes组(6只，糖尿病鼠)；Adult islets组(8只，植入100个成年人胰岛当量，即100个直径约150μm的胰岛团(分离方法参见文献：蔡寒青，许世清，门秀丽等.人胰岛的分离纯化和功能评价《中华医学杂志》.2009,89(12):836-840页)，总计约含1×10⁷个胰岛β细胞)；另外，Normal组(5只，正常SCID-Beige小鼠)。

2、细胞移植(图19)

(1)造模成功后第2天可进行细胞移植，术前1天水中投放恩诺沙星。

(2)以0.004mL/g剂量腹腔注射水合氯醛对需要移植的各组小鼠进行麻醉，同时进行细胞消化工作(消化酶更换为Accutase^TM，其方法同流式检测消化步骤)。

(3)剔除小鼠左侧腰部毛发，依次用医用酒精、碘伏、0.1％苯扎溴铵消毒备皮。

(4)用无菌眼科手术剪依次剪开小鼠左肾附近的表皮、腹膜，开口方向与脊柱呈60°角，切口长约1cm。

(6)用两手无名指轻轻按压切口两侧肌肤以挤出左肾，快速使用无菌注射器针头在肾包膜上划开2-3mm小口。

(7)用200μL移液器吸取50μL细胞悬液(约1×107个细胞)由小口向肾包膜内注射。

(8)电热灼合包膜小口，将左肾放回腹腔，缝合腹膜、表皮。

(9)对受体鼠进行37℃保暖4-5h，确保其完全苏醒并能正常活动后再放回鼠房正常饲养，水中连续1周投放恩诺沙星。

3、检测

1)小鼠血糖变化监测

(1)检测时间：移植0-7天，1天一次；8-27天，2天1次；28-30天，1天1次。

(2)检测方式：各组小鼠每天清晨6点对小鼠禁食4h后，称重并快速断尾采血检测其空腹血糖，之后恢复饮食。

(3)移植后第28天，摘除移植小鼠左肾(该肾用于3.13实验)后检测各组小鼠血糖水平至第30天。

健康SCID-Beige小鼠经过适应性饲养5天后，进行STZ腹腔注射制备糖尿病模型。结果发现在从注射完第3天开始，小鼠表现出，多饮、多食和多尿的糖尿病症状，并且血糖值升高，达到高血糖状态。

细胞移植后每天观察各组细胞移植鼠的血糖变化情况，第28天摘除小鼠左肾每天测量各组小鼠血糖水平，评价指标至30天，结果见图20。结果显示，移植后第1天开始，各组糖尿病受体鼠的血糖均开始迅速降低。其中，shRNA-LSD1-927组分化的IPCs移植组小鼠血糖降低的水平和速度明显快于正常诱导分化的IPCs细胞移植组，但两者都未达到成年胰岛细胞移植组的降糖效果。而且，摘除移植组的小鼠左肾后，发现两种来源细胞进行移植的小鼠，血糖水平均快速上升，达到糖尿病小鼠的高血糖水平。

2)小鼠血清胰岛素水平检测

(1)检测时间：移植后day3，day7，day14，day21。

(2)检测方式：各组小鼠眼周静脉采血，分离血清，ELISA试剂盒检测。

两种来源得到的IPCs对糖尿病小鼠进行左肾包膜移植，移植后第3、7、14和21天对各组小鼠分别进行眼眶采血，分离血清后采用ELISA法检测各组小鼠血清中人和小鼠胰岛素表达的情况，结果见图21。结果显示，两种来源得到的IPCs移植组小鼠血清中人源性胰岛素水平存在显著差异(P＜0.05)，且它们均与成年人胰岛细胞移植组的人胰岛素分泌水平存在明显差别(P＜0.05)；各移植组及糖尿病组小鼠血清中小鼠来源的胰岛素水平无统计学差异(P＞0.05)，但其均与正常组存在明显差异(P＜0.05)。以上数据说明，移植组小鼠体内鼠源性胰岛素分泌水平并不会受植入细胞的影响，或者在植入细胞后小鼠的血糖并没有出现自动恢复现象，小鼠血糖恢复皆靠植入的细胞发挥降糖作用；尽管植入shRNA-LSD1-927组来源的IPCs后可使小鼠血糖降至正常水平的临界点，但在小鼠体内释放的人源性胰岛素水平与成年人胰岛细胞存在着非常大的差距(P＜0.01)，说明诱导分化的细胞成熟度还有待提高。

3)葡萄糖耐量实验

(1)移植后day7，day21，对各组小鼠禁食6h，用灭菌注射用水中配制0.5g/ml葡萄糖水溶液，用于小鼠腹腔注射(2g/kg)。

(2)断尾采血监测注射第0、15、30、60和90min的小鼠血糖；

移植后第7天和第21天，对各组小鼠采取禁食6～8h后，进行葡萄糖耐量实验，结果见图22。结果显示，shRNA-LSD1-927组与正常诱导IPCs组在腹腔注射葡萄糖后，15分钟后血糖有所下降，表明移植的IPCs具有一定血糖调控能力。但调控血糖能力明显不如人胰岛β移植组，说明诱导分化的IPCs细胞还不能到达正常胰岛β细胞的功能。

4)移植部位组织学观察

HE染色方法如下：

(1)取材、固定：组织浸没于4％多聚甲醛24h。

(2)脱水：取出固定材料，修整使切面平整，置入梯度酒精75％酒精中脱水过夜；85％酒精中脱水2h；90％酒精中脱水2h；95％酒精中脱水1h；100％酒精Ⅰ中脱水30min；100％酒精Ⅱ中脱水30min。

(3)透明：无水乙醇二甲苯中透明5-10min；二甲苯Ⅰ中透明5-10min；二甲苯Ⅱ中透明5-10min(观察透明效果)。

(4)浸蜡包埋：石蜡Ⅰ中浸蜡1h；石蜡Ⅱ中浸蜡1h；石蜡Ⅲ中浸蜡1h；包埋机包埋。

(5)修块：将蜡块外部不整齐的部分切去，使蜡块形状规则便于切片。

(6)切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上连续切片，片厚4μm。

(7)摊片：将切片漂浮于40℃温水表面展平，然后用防脱处理过的载玻片捞起，(8)烤片及保存：放进60℃烘箱内烘烤，烘烤结束后室温保存备用。

(9)脱蜡：二甲苯Ⅰ中脱蜡10min；二甲苯Ⅱ中脱蜡10min；100％酒精Ⅰ中脱二甲苯5min；100％酒精Ⅱ中脱二甲苯5min；95％酒精中5min；85％酒精中5min；75％酒精中5min；蒸馏水中洗去酒精5min。

(10)苏木素-伊红(HE)染色：苏木素染色3-8min，流水稍冲洗；1％盐酸酒精溶液分化30sec(观察分化效果)，流水稍冲洗；1％氨水溶液返蓝30sec，流水稍冲洗；镜检着色满意后入伊红染液染色1-3min。

(11)脱水：梯度酒精95％酒精Ⅰ中脱水5min；95％酒精Ⅱ中脱水5min；100％酒精Ⅰ中脱水5min；100％酒精Ⅱ中脱水5min。

(12)透明：二甲苯Ⅰ中5min；二甲苯Ⅱ中10min。

(13)封片、拍照：中性树胶封片，镜下观察、拍照。

免疫组织荧光方法如下：

(1)石蜡切片置于65℃烘箱中烘片2h，脱蜡至水，用PBS冲洗三次，每次5min。

(2)切片置于EDTA缓冲液中微波修复，中火至沸后断电，间隔10min低火至沸。

(3)自然冷却后PBS洗3次，每次5min。

(4)切片放入3％过氧化氢溶液，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶。

(5)PBS洗3次，每次5min，甩干后5％BSA封闭20min(封闭电荷)。

(6)去除BSA液，每张切片加入50μL稀释的抗人Pdx1、insulin、Glucagon一抗(种属及工作浓度见本章节3.4)覆盖组织，4℃过夜。

(7)PBS洗三次，每次5min。

(8)去除PBS液，每张切片加50μL-100μL相应种属的荧光二抗(种属及工作浓度见本章节3.4)，避光室温下孵育50min-1h。

(9)避光PBS洗3次，每次5min。

(10)去除PBS液。每张切片加50-100μL DAPI避光染核5min。

(11)PBS洗3次，每次5min。

(12)切片稍干后用抗荧光淬灭封片剂封片，镜下观察、拍照。

移植后第28天，分别取出植入两种IPCs的小鼠左肾进行切片和HE染色结果见图23(A1、A2)，移植部位结构均正常，包膜下可见存活的细胞。为确认存在的细胞是移植的IPCs，对肾组织进行insulin和Glucagon双标记的免疫组织荧光染色，结果见图23(B1、B2，C1、C2)。结果显示包膜下存活的细胞为insulin阳性(绿色)和Glucagon阳性(红色)的混合细胞群，证明植入的IPCs在小鼠体内存存活，同时可分泌insulin和Glucagon，具有胰腺β和α细胞功能。另外，shRNA-LSD1-927组来源IPCs(B1、C1)表达insulin和Glucagon阳性细胞数目都高于对照组(B2、C2)。

综上所述，本研究认为两种来源的IPCs在糖尿病小鼠体内均有降低血糖的生理活性。沉默LSD1后，hiPSCs分化而来的IPCs转分化效率高及成熟度上的优势，故其(以相同移植细胞数目)植入免疫缺陷型糖尿病小鼠体内后能比常规诱导组的IPCs更好的发挥降糖疗效，但与成年人胰岛β细胞比较，仍存在一定差距。

Claims (10)

1.抑制LSD1基因表达的物质在诱导干细胞分化为内胚层细胞中应用；

或抑制LSD1基因表达的物质在诱导干细胞分化为胰腺细胞中应用；

或抑制LSD1基因表达的物质在制备诱导干细胞分化为内胚层细胞产品中应用；

或抑制LSD1基因表达的物质在制备诱导干细胞分化为胰腺细胞产品中应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述抑制LSD1基因表达的物质为LSD1基因shRNA、反环苯丙胺或硫酸苯乙肼；

所述LSD1基因shRNA的核苷酸序列为序列表中序列1或序列2或序列3或序列4。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述干细胞为离体胚胎干细胞或离体诱导多能干细胞；

所述离体胚胎干细胞为离体人胚胎干细胞；

所述离体诱导多能干细胞为离体人诱导多能干细胞。

4.一种使诱导多能干细胞分化为内胚层细胞的方法，包括如下步骤：抑制离体诱导多能干细胞基因组中的LSD1基因表达，得到处理后细胞；诱导培养所述处理后细胞，得到内胚层细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述抑制离体诱导多能干细胞基因组中的LSD1基因表达方法为如下1)或2)：

1)用权利要求2或3中的所述LSD1基因的shRNA转染所述离体诱导多能干细胞，得到处理后细胞；

2)将所述离体诱导多能干细胞在含有权利要求2或3中的反环苯丙胺或硫酸苯乙肼的培养基中孵育，得到处理后细胞。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述诱导培养为将所述处理后细胞在含有ActivinA和Wortmannin的培养基中孵育；

所述含有ActivinA和Wortmannin的培养基中的ActivinA的浓度为100ng/mL、Wortmannin的浓度为1μM；

所述诱导培养的时间为4天。

7.一种使诱导多能干细胞分化为胰腺细胞的方法，包括如下步骤：

1)将权利要求4-6中任一方法制备的内胚层细胞在含有FGF7、RA和Noggin的培养基中进行诱导培养，将得到的细胞称为第二次诱导后细胞；

所述含有FGF7、RA和Noggin的培养基中的RA的浓度为2μM、FGF7的浓度为20ng/mL，Noggin的浓度为50ng/mL；

2)将所述第二次诱导后细胞在含有EGF的培养基中进行诱导培养，将得到的细胞称为第三次诱导后细胞；

所述含有EGF的培养基中EGF的浓度为50ng/mL；

3)将所述第三次诱导后细胞在含有bFGF、Exendin-4、BMP4和尼克酰胺的培养基中进行诱导培养，得到胰腺细胞；

所述含有bFGF、Exendin-4、BMP4和尼克酰胺的培养基中的bFGF的浓度为10ng/mL，Exendin-4的浓度为50ng/mL，BMP4的浓度为10ng/mL，尼克酰胺的浓度为10mM。

8.一种使诱导多能干细胞分化为内胚层细胞的试剂盒，包括权利要求1-3中任一中的所述抑制LSD1基因表达的物质。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括权利要求6中的所述含有ActivinA和Wortmannin的培养基。

10.一种使诱导多能干细胞分化为胰腺细胞的试剂盒，包括权利要求1-3中任一中的所述抑制LSD1基因表达的物质；

所述试剂盒还具体包括权利要求6所述方法中的所述含有ActivinA和Wortmannin的培养基、权利要求7所述的含有FGF7、RA和Noggin的培养基、含有EGF的培养基和含有bFGF、Exendin-4、BMP4和尼克酰胺的培养基。