CN111004771A - 建立体外模拟肝病模型的方法及其专用三维培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种建立体外模拟酒精性肝病模型的方法及其专用三维培养基，属于生物工程技术领域。本发明提供的体外模拟酒精性肝病模型由多能性干细胞诱导获得的肝脏类器官与基质细胞混合采用本发明提供的专用三维培养基共培养获得，其能够表达酒精代谢相关的酶，可以用来在体外通过添加酒精来模拟酒精性肝病的效应。提供的专用三维培养基包含有多种小分子和细胞因子，更适合于基质细胞与肝脏类器官混合共培养体系，具有无血清、化学成分确定、简单易操作等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种建立体外模拟肝病模型的方法及其专用三维培养基，具体涉及一种利用由多能性干细胞诱导获得的肝脏类器官建立体外模拟酒精性肝病模型的方法及其专用三维培养基。
背景技术
酒精性肝病(Alcoholic liver diseases，ALD)是全世界范围内导致死亡的重要原因，其进展包括几个阶段：单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化、以及肝细胞癌(Gao,B.,and Bataller,R等.Alcoholic liver disease:pathogenesis and newtherapeutic targets.Gastroenterology 2011Nov；141(5):1572-85)。然而，由于缺乏可靠的模型来模拟人类ALD的病理过程及阐述其发生的机制，因此开发针对ALD的预防或治疗方法仍面临重大挑战。
传统的动物模型是常用的工具来研究酒精性肝病，然而，动物模型存在个体差异大、观察周期长、实验费用昂贵、实验条件不易控制、不易观察指标等不利因素，并且由于啮齿类动物和人类在酒精代谢方面存在显著差异，因此构建模拟酒精性肝病的体外模型是进一步了解ALD发病机制和发现新的治疗方法的有效途径。
酒精损伤的主要脏器是肝脏，因此体外模型一般是以肝实质细胞作为主要细胞类型。目前报道的酒精肝模型构建主要采用二维培养的肝实质细胞，如人肝细胞系、人的原代肝实质细胞以及人多能性干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)诱导分化产生的肝实质细胞(In Vitro Modeling of Alcohol-Induced Liver Injury Using Human-Induced Pluripotent Stem Cells.Lipeng Tian,Neha Prasad,and Yoon-YoungJang.Methods Mol Biol.2016；1353:271-83.)，酒精肝病的评价指标主要包括乙醇导致的肝细胞的凋亡、氧化应激、线粒体损伤、脂肪累积和纤维化等。传统二维肝细胞培养无法模拟体内肝脏细胞的三维微环境，因此肝细胞的生理功能距离体内的肝细胞还有较大差距且难以在体外长期维持，因此基于二维肝细胞构建的酒精肝模型也就难以再现酒精在体内对肝细胞造成的真正损伤。而三维培养肝细胞能更好的模拟肝脏的体内微环境，且三维化培养环境下的肝功能能更好、更长时间的维持。已有文献报道使用人肝细胞系HepaRG和肝星状细胞进行三维共培养产生三维细胞模型，用于毒性评估和纤维化研究(Leite SB,Roosens T,El Taghdouini A等.Novel human hepatic organoid model enablestesting of drug-induced liver fibrosis in vitro.Biomaterials 2016；78:1-10.Coll M,Perea L,Boon R等.Generation of Hepatic Stellate Cells from HumanPluripotent Stem Cells Enables In Vitro Modeling of Liver Fibrosis.Cell StemCell 2018；23:101-113e107.)，但是目前尚未有使用人干细胞来源的肝细胞建立三维肝细胞培养模型用于酒精性肝病的研究。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种建立体外模拟肝病模型的方法，包括以下步骤：
S1：将多能性干细胞定向诱导分化为肝干/祖阶段细胞；其中所述多能性干细胞不包括直接分解自人胚胎或胚泡的人多能干细胞或胚胎干细胞；
S2：将步骤S1获得的肝干/祖阶段细胞使用三维扩增培养基进行三维扩增培养，获得肝脏类器官；和
S3：将步骤S2获得的肝脏类器官与基质细胞混合后共培养形成共培养体系，作为体外模拟肝病的基础模型。
上述建立体外模拟肝病模型的方法还包括向所述共培养体系中添加酒精得到体外模拟酒精性肝病模型；优选地，所述共培养体系中酒精的浓度为80-200mM，优选为100mM。
上述建立体外模拟肝病模型的方法的步骤S1中，所述多能性干细胞为H9系干细胞；和/或所述基质细胞为胎肝基质细胞系(商品号为FL 62891
CRL-11005TM)、间充质干细胞、来源于已分离肝脏(含动物肝脏)且具有一群肝星状细胞样细胞的肝脏基质细胞、或保藏号为CGMCC No.1804的bFGF-FLSC细胞株及其传代细胞。
上述建立体外模拟肝病模型的方法的步骤S2中所述三维扩增培养的条件为：37℃、5％CO2培养箱中培养，培养时间为9-10天，其中每2天更换为所述三维扩增培养基一次；和/或步骤S2中所述三维扩增培养基以Advanced DMEM/F-12培养基或Advanced RPMI 1640培养基作为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27、0.2％-10％N2添加剂、1-50mM HEPES、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂，以及以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、Sirt1蛋白抑制剂、胃泌素、TGF-β信号通路抑制剂、Wnt信号通路激动剂、表皮细胞生长因子、腺苷酸环化酶激动剂、青霉素和链霉素；优选地，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1.25mM；所述Sirt1蛋白抑制剂为尼克酰胺，浓度为1-100mM，优选为10mM；所述胃泌素为Gastrin，浓度为1-100nM，优选为10nM；所述Wnt信号通路激动剂为Wnt3a和R-spondin 1，Wnt3a浓度为10-1000ng/mL，优选为100ng/mL，R-spondin 1浓度为10-1000ng/mL，优选为250ng/mL；所述TGFβ信号通路抑制剂为A83-01，浓度为0.1-10μM，优选为5μM；所述腺苷酸环化酶激动剂为佛司可林FSK，浓度为1-100μM，优选为10μM；所述表皮细胞生长因子为EGF，浓度为5-200ng/mL，优选为50ng/mL；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL。
上述三维扩增培养基的配方选自以下配方中的任一种：
配方1：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、1％N2添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、50ng/mLEGF、250ng/mL R-Spondin 1、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、1％N2添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、5μM A83-01、50ng/mL EGF、250ng/mL R-Spondin 1、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、1％N2添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、10nM Gastrin、5μM A83-01、10μM Forskin、50ng/mL EGF、100ng/mL Wnt3a、250ng/mLR-Spondin 1、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
上述建立体外模拟肝病模型的方法的步骤S1中将多能性干细胞定向诱导分化为肝干/祖阶段细胞的具体方法为：
1)用Dispase把所述多功能干细胞消化成单个细胞后进行接种，培养基为TeSR-E8培养基加10μM Y-27632(Stem Cell)促进细胞贴附；
2)待24h细胞贴附后，将细胞培养基更换为RPMI1640培养基(Gibco)，添加1％B-27(Gibco)，100ng/mL Activin A(R&D)，50ng/mL Wnt3a(R&D)，向定性内胚层阶段进行诱导分化；
3)隔日弃去废液，将细胞培养基更换为RPMI 1640培养基，添加1％B-27，100ng/mLActivin A作用一天；
4)重复步骤3)一次，定性内胚层阶段诱导结束；
5)隔日弃去废液，将细胞培养基更换为HCM培养基(Lonza)，添加10ng/mL FGF-2(R&D)，20ng/mL BMP-4(R&D)，共作用5天，每隔2天换一次培养基，诱导获得肝干/祖阶段细胞。
上述建立体外模拟肝病模型的方法的步骤S3中所述肝脏类器官和基质细胞以2:1的比例混合；和/或步骤S3中所述共培养的条件为：37℃、5％CO2培养箱中培养，包括第一阶段和第二阶段，两个阶段培养时间各为7天，其中每2天更换共培养的培养基一次。
上述建立体外模拟肝病模型的方法的步骤S3中所述共培养的第一阶段培养基以Advanced DMEM/F12培养基为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂、1-50mM HEPES，以及以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、L-抗坏血酸盐、肝细胞生成因子、ROCK信号通路抑制剂、青霉素和链霉素；优选地，所述共培养的第一阶段培养基中，抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1.25mM；所述L-抗坏血酸盐的浓度为0.05-2mM，优选为0.2mM；所述肝细胞细胞生长因子为HGF，浓度为5-50ng/mL，优选为20ng/mL；所述ROCK信号通路抑制剂为Y-27632，浓度为1-50μM，优选为10μM；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL。
上述建立体外模拟肝病模型的方法步骤S3中所述共培养的第二阶段培养基以HCM培养基(Lonza)为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA；优选地，所述第二阶段培养基还包含以及以下组分中的一种或多种：抑瘤素M、地塞米松、青霉素和链霉素；优选地，所述第二阶段培养基中所述抑瘤素M为OSM，浓度为5-50ng/mL，优选为20ng/mL；所述地塞米松为Dex，浓度为0.1-1mM，优选为0.5μM；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL。
上述建立体外模拟肝病模型的方法的步骤S3中所述共培养的第一阶段培养基的配方为以下配方中的任一种：
配方1：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、20ng/mL HGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.2mM L-抗坏血酸盐、20ng/mL HGF、10μM Y-27632、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
上述建立体外模拟肝病模型的方法的步骤S3中所述共培养的第二阶段培养基的配方为以下配方中的任一种：
配方1：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、20ng/mL OSM、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、20ng/mL OSM、0.5μM Dex、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
本发明另一方面还提供一种用于上述的建立体外模拟肝病模型的方法的三维培养基，所述三维培养基包括第一阶段三维培养基和第二阶段三维培养基；其中所述第一阶段三维培养基以Advanced DMEM/F12培养基为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂、1-50mM HEPES，以及以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、L-抗坏血酸盐、肝细胞生成因子、ROCK信号通路抑制剂、青霉素和链霉素；
优选地，在所述第一阶段三维培养基中，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1.25mM；所述L-抗坏血酸盐浓度为0.05-2mM，优选为0.2mM；所述肝细胞细胞生长因子为HGF，浓度为5-50ng/mL，优选为20ng/mL；所述ROCK信号通路抑制剂为Y-27632，浓度为1-50μM，优选为10μM；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL；
所述第二阶段三维培养基以HCM培养基(Lonza)为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA；优选地，所述第二阶段三维培养基还包含以下组分中的一种或多种：抑瘤素M、地塞米松、青霉素和链霉素；进一步优选地，所述抑瘤素M为OSM，浓度为5-50ng/mL，优选为20ng/mL；所述地塞米松为Dex，浓度为0.1-1mM，优选为0.5μM；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL。
上述第一阶段三维培养基的配方为以下配方中的任一种：
配方1：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、20ng/mL HGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.2mM L-抗坏血酸盐、20ng/mL HGF、10μM Y-27632、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
上述二阶段三维培养基的配方为以下配方中的任一种：
配方1：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、20ng/mL OSM、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、20ng/mL OSM、0.5μM Dex、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
由上述建立体外模拟肝病模型的方法建立的体外模拟肝病模型也属于本发明的内容。
上述的体外模拟肝病模型在筛选预防或治疗肝病的药物中的应用也属于本发明的内容。
基于以上技术方案提供的建立体外模拟肝病模型的方法将由多能性干细胞诱导获得的肝脏类器官与基质细胞按一定的比例混合进行共培养建立共培养体系，共培养体系细胞表达酒精代谢相关的两个主要的酶乙醇脱氢酶(ADH)和细胞色素P450 2E1(CYP2E1)，因此该共培养体系可以用来建立体外模拟肝病模型，尤其是建立体外模拟酒精性肝病模型，在体外通过添加酒精(EtOH)来模拟酒精性肝病的效应，这可以为研究酒精性肝病的潜在发病机制、肝脏的发育、先天遗传代谢性肝病、胆道疾病提供良好的研究模型，为肝毒性药物的筛选提供良好的研究平台，以找到合适的药物预防和治疗酒精性肝病。并且本发明提供的模型建立方法中，使用到的多能性干细胞可以为商业化的人胚胎干细胞系，因此获取相对容易，可以稳定建系，因此可以简单高效获得肝脏类器官，以稳定高效提供建立体外模拟肝病模型的源材料。同时本发明提供的建立体外模拟肝病模型的专用三维培养基包含有多种小分子和细胞因子，更适合于基质细胞与hEHOs混合建立共培养体系，具有无血清、化学成分确定、简单易操作等特点。
附图说明
图1是本发明的技术路线图；
图2是多能性干细胞不同诱导阶段的相差图像(A)；hEHOs连续生长的相差图像(B)；hEHOs在第1代、第20代以及复苏冻存后的相差图像(C)；
图3是hEHOs在第1代-第3代以及第13代-第15代的生长曲线(A)；hEHOs在第1代以及第15代的核型分析结果，染色体数目＝46(B)；
图4是对于PHH、hAHOs、FSCs、HS、HB、hEHOs的第1代及第3代的全基因组RNA-Seq，主成分分析(A)；聚类分析(B)；热敏图(C)；
图5是hEHOs特异性肝干/祖细胞相关蛋白的免疫荧光图像；
图6是基质细胞与hEHO混合共培养后形成的hFLMC/hEHO的HE染色图像、以及肝细胞特异性蛋白与基质细胞特异性蛋白共染和主要酒精代谢酶的免疫荧光图像；
图7是基质细胞与hEHO共培养后在对照组和酒精处理组7天后细胞活力的免疫荧光染色图和定量检测柱状图；
图8是基质细胞与hEHO共培养后对照组和酒精处理组在纤维化基因表达水平的定量检测柱状图；
图9是基质细胞与hEHO共培养后对照组和酒精处理组在纤维化相关蛋白以及天狼星红的免疫组化染色图(A)、胶原蛋白前体分泌的定量柱状图(B)；
图10是基质细胞与hEHO共培养后在对照组和酒精处理组7天后氧化应激的免疫荧光染色图和定量检测柱状图；
图11是基质细胞与hEHO共培养后在对照组和酒精处理组7天后线粒体膜电位的免疫荧光染色图和定量检测柱状图；
图12是基质细胞与hEHO共培养后在对照组和酒精处理组7天后脂质堆积改变的免疫荧光染色图和定量检测柱状图；
图13是基质细胞与hEHO共培养后在对照组和酒精处理组在脂质相关基因表达水平的定量检测柱状图(A)、以及乙酰辅酶A羧化酶免疫荧光染色图(B)；
图14是基质细胞与hEHO共培养后的对照组和酒精处理组分别收集细胞培养上清的炎性因子芯片分析定量图(A)、基因富集的生物学过程(B)、代谢途径分析(KEGG)定量图(C)。
具体实施方式
本发明根据多能性干细胞向肝细胞进行分化的阶段规律，以肝谱系特化的早期阶段(Hepatic specification，HS)为肝脏类器官建立的起始，这一阶段被认为是肝脏干细胞存在的阶段。然后参照其他类器官的培养方法(Sato T,Vries RG,Snippert HJ等.SingleLgr5stem cells build crypt–villus structures in vitro without a mesenchymalniche.Nature 2009；459:262.Eiraku M,Takata N,Ishibashi H等.Self-organizingoptic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.Nature 2011；472:51.Lancaster MA,Renner M,Martin C-A等.Cerebral organoids model human braindevelopment and microcephaly.Nature 2013；501:373.Takasato M,Er PX,Chiu HS等.Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and modelhuman nephrogenesis.Nature 2016；536:238.Huch M,Bonfanti P,Boj SF等.Unlimitedin vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.The EMBO Journal 2013；32:2708-2721.Yamamoto Y,Gotoh S,Korogi Y等.Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells inorganoids.Nature Methods 2017；14:1097)，由HS阶段大量高效的培养出肝脏类器官(hEHOs)，并对类器官的肝脏干细胞属性进行了大量的表型鉴定，包括扩增传代潜能，肝脏干细胞相关的基因和蛋白表达等。随后利用三维培养基建立hEHOs和基质细胞(hFLMC)的共培养模型，并通过额外添加酒精在体外模拟酒精性肝病。
以下将通过具体实施方式详细说明本发明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。培养基中“％”的含义为相对于培养基总量的百分比浓度，单位为mL/100mL。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、肝脏类器官培养体系的建立及表型鉴定
在该实施例中，以多能性干细胞(细胞系H9，人胚胎干细胞(human EmbryonicStem Cells)，购自美国Wicell研究中心)为起始细胞，如图1所示，依次经过定性内胚层阶段、肝干/祖细胞阶段获得肝脏类器官(hEHOs)。具体包括以下步骤：
1.1、细胞系H9细胞的培养
1)提前一天把Matrigel(Corning)从-80℃冰箱取出，置于4℃冰箱融化，待其融化后，用预冷的DMEM/F12培养基(Gibco)按1:100比例稀释Matrigel。
2)将稀释好的Matrigel均匀铺于六孔板，每孔1mL，置于37℃培养箱孵育1小时备用。
3)从37℃培养箱中取出待传代的H9细胞，吸去废液，用DMEM/F12培养基洗一遍。
4)每孔加入1mL 0.1mg/mL Dispase(Sigma)消化细胞，置于37℃培养箱8-10min。
5)弃去Dispase，用DMEM/F12培养基轻轻地洗两遍，每孔再加入1mL DMEM/F12培养基，用枪头轻刮贴附于孔底的细胞克隆，将刮下来的细胞转移至15mL离心管，再用DMEM/F-12培养基洗一遍原孔，一起放入15mL离心管。
6)室温1000rpm，离心3min。
7)弃去上清，用TeSR-E8培养基(StemCell)轻轻地重悬细胞。
8)接种于含有提前包被Matrigel的六孔板中，每天给细胞换液。
1.2、H9细胞系向肝干/祖细胞诱导分化
该步骤中对步骤1.1中培养的H9细胞进行诱导分化，具体包括以下步骤：
1)待步骤1.1中培养的H9细胞在孔内融合度达到70-80％左右，细胞可开始进行诱导。
2)提前3小时将Matrigel，Laminin(Gibco)，Collagen IV(Gibco)按3:1:1比例均匀涂抹于24孔板，室温超净台(北京东联哈尔技术有限公司)内晾干。
3)按上述步骤1.1中H9细胞系传代的操作步骤，用Dispase把H9细胞消化成单个细胞，按1×105密度接种于步骤2)的24孔板中，培养基为TeSR-E8培养基加10μM Y-27632(Stem Cell)促进细胞贴附。
4)待24h细胞贴附后，将细胞培养基更换为RPMI1640培养基(Gibco)，添加1％B-27(Gibco)，100ng/mL Activin A(R&D)，50ng/mL Wnt3a(R&D)，向定性内胚层阶段进行诱导分化。
5)隔日弃去废液，将细胞培养基更换为RPMI 1640培养基，添加1％B-27，100ng/mLActivin A作用一天。
6)隔日弃去废液，将细胞培养基更换为RPMI 1640培养基，添加1％B-27，100ng/mLActivin A再作用一天。定性内胚层阶段诱导结束，向肝干/祖细胞阶段进行诱导。
7)隔日弃去废液，将细胞培养基更换为HCM培养基(Lonza)，添加10ng/mL FGF-2(R&D)，20ng/mL BMP-4(R&D)，共作用5天，每隔2天换一次液体，肝干/祖阶段细胞诱导结束。
对以上步骤中不同诱导阶段的细胞形态进行观察，结果如图2A所示，可见：在不同的诱导阶段细胞(多能性干细胞-定性内胚层阶段细胞-肝干/祖细胞)呈现出不同的细胞形态。
1.3、肝干/祖阶段细胞的三维扩增培养
该步骤中继续对上述步骤1.2获得的肝干/祖阶段细胞进行三维扩增培养，具体包括以下步骤：
1)上述步骤1.2中肝干/祖阶段作用结束后，用1×PBS(无Ca2+、Mg2+PBS的配制：将8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4溶于1L去离子水中，待充分溶解后使用0.22μm滤膜过滤并放入高压锅高压蒸汽灭菌后使用，下同)洗两遍，然后用0.25％Trypsin-EDTA(Gibco)消化成单个细胞，用胎牛血清(Gibco)终止消化。
2)室温1000rpm，离心5min。
3)提前把BME-2和/或Matrigel置于冰上备用。
4)将离心好的细胞用BME-2或Matrigel进行重悬，以每孔30-50μL的液滴(3,000-10,000个细胞密度)接种于低吸附24孔板中，置于37℃培养箱孵育7-8min。
5)待胶凝固后，往孔内添加三维扩增培养基(配方为：Advanced DMEM/F12培养基+0.1％BSA(Sigma)+1％N2+1％B-27+1％谷氨酰胺添加剂(Glutamax，Gibco)+N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，1.25mM，Sigma)+Gastrin(10nM，Sigma)+尼克酰胺(Nicotinamide，10mM，Sigma)+HEPES(10mM，Gibco)+A83-01(5μM，Selleck)+Forskolin(10μM，Selleck)+R-spondin1(250ng/mL，R&D)+EGF(50ng/mL，R&D)+Wnt3a(100ng/mL，R&D)+100U/mL青霉素+0.1mg/mL链霉素)。
6)每隔两天更换一次三维扩增培养基。三维扩增培养肝干/祖细胞后获得肝脏类器官。
该肝脏类器官(hEHOs)是具有自我更新能力的干细胞群，可双向分化为功能性肝细胞和胆管细胞，在向成熟肝细胞进行三维诱导分化后与肝脏器官拥有类似的空间组织并能够重现肝脏器官的部分功能，从而能够复制和模拟体内肝组织的三维环境。
其中步骤5)中的三维扩增培养基的配方还可以为以下配方中的任一种：
配方1：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％BSA、1％B-27、1％N2添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、50ng/mL EGF、250ng/mLR-Spondin 1、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％BSA、1％B-27、1％N2添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、5μM A83-01、10μM Forskolin、50ng/mL EGF、250ng/mL R-Spondin 1、100ng/mL Wnt3a、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
对上述步骤1.3获得的肝脏类器官进行以下处理和功能验证。
1.3.1、肝脏类器官的传代
1)待上述步骤1.3中的细胞扩增培养7-9天左右后进行连续传代培养，按1:6-8比例进行传代，先在原孔内以机械法把细胞吹散，然后把细胞转移至15mL离心管，冰上预冷30min。
2)室温800rpm，离心3min。
3)弃去上清，再添加Accutase(Sigma)把细胞消化成小块。
4)室温1000rpm，离心5min。
5)用上述步骤1.3中的三维扩增培养基进行重悬细胞，三维扩增培养基也为传代培养基，接种方法如上所述。
6)每隔两天换一次培养基。
1.3.2、肝脏类器官的冻存
1)待上述步骤1.3.1中细胞传代培养7-10天左右后，按前述步骤1.3.1中方法进行消化，离心。
2)离心后弃去废液，采用无血清快速细胞冻存液(StemCell)进行冻存细胞，放置于液氮中可长期保存。
1.3.3、肝脏类器官的复苏
1)提前把水浴锅(北京长风仪器仪表公司)预热至42℃。
2)从液氮中取出上述步骤1.5冻存的细胞，在42℃水浴锅内进行快速解冻。
3)待细胞解冻后，转移至15mL离心管。
4)室温1000rpm，离心5min。
5)弃去上清，复苏培养基和上述步骤1.3中的扩增培养基相同，但在前两天的培养中加入10μM Y-27632(Stem Cell)促进细胞聚合。
6)两天后弃去废液，更换为无Y-27632的三维扩增培养基。
7)待细胞培养7-10天左右，按上述方法进行传代培养。
对肝脏类器官连续生长的形态进行观察，结果如图2B所示，示出了其从第0天至第10天的形态图，可见肝脏类器官生长状态良好；对肝脏类器官的传代和复苏冻存后的形态进行观察，结果如图2C所示，示出了肝脏类器官第1代以及第20代，和复苏冻存后的形态图，可见肝脏类器官传代至第20代仍然保持活力和较高的存活力，复苏冻存后细胞形态清晰。
1.3.4、倍增曲线
1)将上述经传代后的细胞按照每孔1×104细胞密度接种在上述三维扩增培养基中培养8-10天；
2)将获得的肝脏类器官用Accutase酶消化成单个细胞，每个时间点用血球计数板进行台盼蓝计数；
3)增殖曲线按照y(t)＝y0×e(生长率×t)(y＝最终时间点的细胞数；y0＝每个时间点的细胞数；t＝时间)进行定量计算；
4)倍增时间按照ln(2)/生长率计算每个时间点。
结果如图3A所示，示出了肝脏类器官的倍增曲线，可见肝脏类器官从第1代到第3代的细胞倍增时间为62.24±1.09小时，第13代到第15代的细胞倍增时间为68.69±1.84小时，可见在长期传代培养过程中，肝脏类器官仍维持着细胞倍增时间的稳定增长。
1.3.5、核型分析
1)在上述1.3.4中培养的第1代和第15代的肝脏类器官培养基中添加40ng/mL秋水仙碱，37℃培养箱内孵育4小时。
2)4小时后，1×PBS洗两遍。
3)用Accutase酶消化成单个细胞，按照标准核型分析操作步骤进行操作。
肝脏类器官的核型分析结果如图3B所示，可见肝脏类器官第1代和第15代的细胞核型均正常，染色体数n＝46。
1.3.6、确定hEHOs的发育阶段
1.3.6.1、前肠干细胞(FSCs)、成人肝来源的肝脏类器官(hAHOs)、肝祖细胞(HB)、原代人肝细胞(PHH)的获得
(1)前肠干细胞(FSCs)的获得
1)人多能性干细胞(可商购获得的多能性干细胞系ESC或iPSC，例如H1、H7、H9、H13和H14等)来源的定性内胚层细胞在RPMI 1640培养基基础上添加2％B27和50ng/mLActivin A中培养3-4天；
2)把上述获得的定性内胚层细胞用0.25％胰酶进行消化并重新接种于Matrigel包被的孔板内；
3)前肠干细胞培养基以RPMI 1640培养基为基础，添加1％B27、1％NEAA(Gibco)、10ng/mL Activin A、20ng/mL bFGF、10ng/mL BMP4、20ng/mLHGF、50ng/mLEGF，作用3天，即为获得的前肠干细胞。
(2)肝祖细胞(HB)
人多能性干细胞(可商购获得的多能性干细胞系ESC或iPSC，例如H1、H7、H9、H13和H14等)来源的肝谱系特化早期阶段(HS)在HM培养基基础上，添加1％B27、0.2mM L-抗坏血酸盐、4.5×10-4MTG(Sigma)、20ng/mL HGF、0.5μM Dex、20ng/mLOSM，作用9天，即为获得的肝祖细胞。
(3)原代人肝细胞(PHH)的获得
1)原代人肝细胞的分离方法参照已发表文献(Lecluyse EL,AlexandreE.Isolation and culture of primary hepatocytes from resected human livertissue.Methods Mol Biol 2010；640:57-82.)中改进的两步胶原酶灌注法，其中使用到的原代人肝组织是从肝移植手术中的供体获得，征得北京友谊医院患者的知情同意。该方法经北京友谊医院和军事医学研究院卫生勤务与血液研究所医学伦理委员会批准；
2)原代人肝组织用含0.5mM EGTA(Sigma)和0.5％BSA的HBSS溶液冲洗15-30分钟，用已预热的1mg/mLIV型胶原酶(Sigma)灌注20-40分钟；
3)消化得到的肝细胞悬液过100μm滤网，75g离心3分钟；
4)细胞沉淀重悬于Percoll(GE healthcare，密度1.130g/mL)溶液，100-150g室温离心10分钟；
5)细胞沉淀用DMEM/F12(Gibco)洗三遍；
6)原代人肝细胞接种培养基为Williams’E培养基(Gibco)添加1％谷氨酰胺、5％胎牛血清(Gibco)，接种细胞于I型胶原(Corning)包被的孔板；
7)待细胞贴附4-10小时后，培养基更换为HM培养基。
(4)成人肝来源的肝脏类器官(hAHOs)的获得
1)成人肝来源的肝脏类器官(hAHOs)参照已发表文献(Huch M,Gehart H,vanBoxtel R等.Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from AdultHuman Liver.Cell 2015；160:299-312.Broutier L,Andersson-Rolf A,Hindley CJ等.Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver andpancreas 3D organoids and their genetic manipulation.Nature Protocols 2016；11:1724.)方法进行分离培养，其中使用到的原代人肝组织是从肝移植手术中的供体获得，征得北京友谊医院患者的知情同意。该方法经北京友谊医院和军事医学研究院卫生勤务与血液研究所医学伦理委员会批准；
2)流式分选EpCAM+(BD biosciences,PE-CD326)细胞重悬于Matrigel或BME2，按照3000-10000细胞接种于低吸附24孔板；
3)hAHOs培养基以Advanced DMEM/F12为基础，添加1％N2、1％B27、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10nM gastrin、10mM尼克酰胺、1％谷氨酰胺、5μM A83-01、10μMForskolin、50ng/mL EGF、250ng/mL R-Spondin 1、50ng/mLEGF、100ng/mLFGF10、25ng/mLHGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素，作用10-14天；
4)hAHOs传代、冻存复苏如1.3.1-1.3.3所述
1.3.6.2、Trizol法提取hEHOs第1代及第3代细胞的RNA样品；作为参照，同法提取前肠干细胞(FSCs)、成人肝来源的肝脏类器官(hAHOs)、肝祖细胞(HB)、HS细胞(根据上述步骤1.2中多能性干细胞诱导分化过程获得)、原代人肝细胞(PHH)的RNA样品：
1)按10cm2/mL的比例分别向上述细胞培养液中加入Trizol细胞裂解液(Gibco)，室温放置5min使细胞充分裂解，RNA充分溶出；
2)12000rpm，5min，4℃条件下离心，弃沉淀；
3)按200μL氯仿/ml Trizol加入氯仿溶液，刷推15s，振荡混匀后，室温放置10min；
4)12000rpm，5min，4℃离心；
5)溶液分层，共分为三层，RNA位于上层水相，DNA和蛋白位于中间层面和下层酚，只吸取上层水相至另一个1.5ml EP管；
6)按500μL异丙醇/ml Trizol加入预冷的异丙醇溶液，上下颠倒混匀，室温放置10min；
7)12000rpm，10min，4℃离心，弃上清液，RNA沉于1.5ml EP管底；
8)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加75％乙醇溶液，温和振荡1.5ml EP管；
9)12000rpm，5min，4℃离心，弃上清液；
10)超净台干燥5-10min；
11)加入15-20μL无RNA酶的水溶液RNA，室温放置3-5min并充分混匀；
12)Nanodrop 2000(Thermo)测定RNA浓度。
1.3.6.3、基因测序处理及分析(北京安诺优达公司协作完成)
根据步骤1.3.6.1中提取的FSCs、hAHOs、HB、hEHOs第1代及第3代、HS、PHH的RNA样品，使用Illumina 
UltraTMRNALibrary Prep试剂盒(E7530L,NEB,USA)用于产生RNA测序文库。测序由安诺优达公司(中国)进行，使用Noves6000进行RNA测序。通过DESeq2分析差异表达的基因(DEG)，其中q≤0.05和|log2_ratio|≥1的基因被鉴定为DEG。使用R包进行热图生成和主成分分析。上述6种细胞的原始RNA数据已上传至Gene ExpressionOmnibus database(accession number GSE128717)。
为了确定hEHOs的发育阶段，转录组由包括第1代和第3代细胞的hEHOs，hESC(人胚胎干细胞)衍生的FSC细胞，HS细胞，HB细胞，hAHOs细胞和PHH细胞的RNA建立。如图4中A幅所示，主成分分析显示每个分析组的清晰聚类，并且hEHO(第1代和第3代)稳定地显示出与HS和HB更多的相似性，但与它们保持不同。如图4中B幅所示，层级分层聚类分析显示，hEHOs介于FSC和两组未成熟肝系(HS和HB)之间，与HS和HB密切相关，远离PHH。如图4中C幅所示，成熟肝细胞标志物(包括CYP3A4，CYP1A2，CYP2E1，CYP2A6，CYP2C8，CYP2C9和CYP2D6)的显著表达在PHH中，而前肠特异性转录因子包括SOX17，SOX2和CER1在FSC中表达。hEHOs显示了早期肝脏发育的几种转录因子(PROX1，ONECUT2、SOX9、FGFR4,FOXA1，FOXA3和ONECUT1)基因的激活，而Wnt信号传导的上调成分(LGR5,ZNRF3,RNF43,AXIN2,CD44,DKK1,WNT7A和WNT10A)在hAHOs中表达，表明hEHOs在全基因组基因表达谱上显示与HS和HB相似。
1.3.7、细胞免疫荧光
1)将HS细胞及三维培养获得的肝脏类器官的细胞用4％多聚甲醛(配方：将3.56gNaOH，42.7g PFA，13.6g KH2PO4溶于1LPBS中，磁力搅拌器65℃加热搅拌至澄清透亮后分装使用)室温固定15-20min，PBS洗两遍。
2)0.25％Triton X-100(Sigma)破膜10-15min，PBS洗两遍。
3)用和二抗种属来源相同的血清室温封闭1小时。
4)用和二抗种属来源相同的血清稀释一抗(如下表1中所示)，一抗的浓度按说明书进行稀释，一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS洗三遍。
5)用和二抗(如下表2中所示)种属来源相同的血清稀释二抗，二抗室温避光孵育1小时，PBS洗三遍。
6)用DAPI(Sigma)衬染细胞核，室温避光孵育10分钟，PBS洗三遍。
7)水溶性封片剂封片。
8)激光共聚焦显微镜下观察并照相(Nikon TiE-A1)。
免疫荧光结果如图5所示，可见肝脏类器官表达肝干/祖细胞的特异性蛋白SOX9、EPCAM、CK19、HNF4A、TBX3，表达不成熟肝细胞的蛋白AFP，不表达肝细胞成熟的蛋白ALB，不表达干性标志OCT4、SOX2，细胞保持增殖特性，Ki67蛋白呈阳性表达。
表1：用于肝脏类器官(hEHOs)免疫荧光检测的第一抗体
| 一抗 | 公司来源 | 货号 | 一抗种属 | 稀释比 |
| AFP(甲胎蛋白) | Abcam | Ab169552 | 兔 | 200 |
| AFP(甲胎蛋白) | Sigma | A8452 | 小鼠免疫球蛋白2a | 200 |
| EPCAM(上皮细胞粘附分子) | Neomarker | MS-181 | 小鼠免疫球蛋白1 | 200 |
| EPCAM(上皮细胞粘附分子) | CST | 2929 | 小鼠免疫球蛋白1 | 800 |
| ALB(Albumin) | Bethyl | AF2400 | 山羊免疫球蛋白 | 200 |
| ALB(Albumin) | R&D | MAB1455 | 小鼠免疫球蛋白2a | 200 |
| SOX9(性别决定区域Y基因9) | Abcam | Ab185966 | 兔 | 100 |
| CK19(细胞角蛋白19) | Abcam | ab7754 | 小鼠免疫球蛋白2a | 200 |
| CK19(细胞角蛋白19) | Abcam | Ab52625 | 兔 | 100 |
| TBX3(T-框蛋白3) | Abcam | Ab99302 | 兔 | 100 |
| OCT4(八聚体结合转录因子4) | Abcam | Ab19857 | 兔 | 100 |
| SOX2(性别决定区Y框蛋白2) | R&D | 245610 | 小鼠免疫球蛋白2a | 100 |
| HNF4A(肝细胞核因子4) | Santa Cruz | sc-6556 | 山羊免疫球蛋白 | 100 |
| Ki67 | Thermo | 14-5698-80 | 大鼠免疫球蛋白2a | 200 |
表2：用于肝脏类器官(hEHOs)免疫荧光检测的第二抗体
实施例2：体外模拟肝病模型的建立
如图1所示，该实施例基于实施例1获得的hEHOs与基质细胞共培养建立体外模拟酒精性肝病模型。基质细胞与添加的培养基成份共同组成hEHOs分化的微环境，促进hEHOs向成熟肝细胞的诱导分化。另外添加的基质细胞可作为显示酒精性损伤能否造成纤维化的指示。通常酒精性肝脏病理损伤中的纤维化改变主要是肝脏基质细胞的激活，增殖和纤维化，添加基质细胞是为了能够模拟酒精性肝病的这一病理学现象。该实施例中使用的基质细胞可以为可商业获得的胎肝基质细胞系(FL 62891
CRL-11005TM)、可商业获得的间充质干细胞、来源于已分离肝脏(含动物肝脏)且具有一群具有肝星状细胞的肝脏基质细胞、或CN101205531A公开且已保藏的bFGF-FLSC细胞株(CGMCC No.1804)及其传代细胞株，其中所述bFGF-FLSC细胞株的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2006年09月08日。
2.1、hEHOs与基质细胞共培养体系
1)提前用0.8％琼脂预处理96孔板；
2)hEHOs与基质细胞分别消化成单个细胞并按照2:1的比例接种，接种培养基为第一阶段培养基(配方为：Advanced DMEM/F12、0.1％BSA、1％B-27、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.2mM L-抗坏血酸盐、20ng/mL HGF、10μM Y-27632、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素，每2天更换一次，作用7天；
3)更换为第二阶段培养基(配方为：HCM、0.1％BSA、20ng/mL OSM、0.5μM Dex、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素)，每2天更换一次，作用7天，获得hEHOs与基质细胞的共培养体系，命名为hFLMC/hEHO。
其中上述第一阶段培养基的配方还可以为以下配方中的任一种：
配方1：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、20ng/mL HGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
其中上述第二阶段培养基的配方还可以为以下配方中的任一种：
配方1：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、20ng/mL OSM、0.5μM Dex、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
2.2、免疫荧光染色
该步骤对hFLMC/hEHO的共培养体系细胞的石蜡切片进行免疫荧光染色和HE染色，其中使用的一抗如下表3所示，使用的二抗如下表4所示。其中采用的免疫荧光染色方法同实施例1；HE染色的操作方法为：
1)梯度酒精脱蜡，即二甲苯两遍各5min，100％乙醇两遍各3min，95％乙醇一遍3min，70％乙醇一遍3min，结束后放入蒸馏水中洗两遍。
2)苏木素衬核5min，水洗，若颜色较淡可多衬几分钟。
3)1％盐酸酒精分色10-20s，水洗。
4)稀氨水反蓝染色10-20s，镜下观察可见切片呈淡蓝色透亮，水洗。
5)伊红染色1min，水洗。
6)梯度酒精脱水，95％酒精一遍3min，100％酒精两遍各3min，二甲苯两遍各5min。
7)中性树脂封片。
8)显微镜下观察并采集图像(Perkin Elmer)。
表3：用于共培养模型免疫荧光检测的第一抗体
| 一抗 | 公司来源 | 货号 | 一抗种属 | 稀释比 |
| Collagen I(I型胶原) | Sigma | C2456 | 小鼠免疫球蛋白1 | 500 |
| COL1A1(Ⅰ型胶原α链) | GeneTex | GTX112731 | 兔 | 500 |
| Desmin(结蛋白) | Abcam | ab15200 | 兔 | 200 |
| ADH(乙醇脱氢酶) | Abcam | ab108203 | 兔 | 50 |
| α-SMA(α-横纹肌肌节肌动蛋白) | Abcam | ab124964 | 兔 | 500 |
| ACC1(乙酰辅酶A羧化酶1) | proteintech | 21923-1-AP | 兔 | 50 |
| PDGFR-β(血小板源生长因子-β受体) | Abcam | ab32570 | 兔 | 100 |
| ALB(白蛋白) | R&D | MAB1455 | 小鼠免疫球蛋白2a | 200 |
表4：用于共培养模型免疫荧光检测的第二抗体
如图6所示，示出了hFLMC/hEHO共培养的石蜡切片的HE染色和免疫荧光染色结果，可见其表达成熟肝细胞的标志ALB，主要位于organoid的外部，而PDGFR-β阳性的基质细胞主要位于organoid的中心，并且hFLMC/hEHO共培养物表达酒精代谢相关的酶，乙醇脱氢酶(ADH)和CYP2E1。因此hFLMC/hEHO的共培养体系能够执行酒精代谢的功能且可以作为检测酒精对肝脏效应的一种评价模型。
实施例3：体外模拟酒精性肝病
如图1所示，该实施例使用实施例2建立的hFLMC/hEHO的共培养体系，通过添加酒精的方法在体外模拟酒精性肝病，具体包括以下方法：
3.1、hFLMC/hEHO共培养体系的酒精处理
1)hFLMC/hEHO共培养14天后，培养基分别更换为添加100mM酒精的HM培养基继续处理7天作为酒精处理组，对照组的96孔板更换为无酒精的HM培养基继续处理7天；
2)每天更换培养基，并用封口膜紧紧缠绕96孔培养板防止酒精挥发。
3.2、Dead/Live染色定量分析
1)收集上述3.1中对照组和酒精处理组的三维球，弃去上清，用PBS洗两遍；
2)加入8μM钙黄绿素AM(Calcein AM)与4μM乙锭同源二聚体-1(EthD-1)在37℃孵箱内孵育30分钟；
3)PBS洗三遍上机检测；
4)整个球体区域活细胞与死细胞的平均荧光强度用于检测细胞活力。
如图7所示，示出了Dead/Live染色定量分析结果，可见hEHO与基质细胞共培养体系在添加酒精后与对照组相比，死细胞/活细胞的平均荧光强度增高，因此酒精的添加能够促进细胞凋亡。
3.3、RNA提取、反转录及实时定量PCR
该步骤中使用RNA提取试剂盒(Qiagen)进行RNA提取，使用反转录试剂盒(TOYOBO)进行反转录，使用实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad)进行实时定量PCR。
1)收集上述3.1中对照组和酒精处理组的三维球，加入适量的裂解液Buffer RLT(Sigma)充分裂解细胞。
2)加入等体积的70％乙醇到上述裂解液中，用移液枪混匀，并转移至spincolume，室温12000rpm，离心30s。
3)弃废液，加入700μL的Buffer RW1至spin colume，室温12000rpm，离心30s。
4)弃废液，加入500μL的Buffer RPE至spin colume，室温12000rpm，离心30s。
5)弃废液，加入500μL的Buffer RPE至spin colume，室温12000rpm，离心2min。
6)弃废液，室温12000rpm空离1min。
7)把spin colume转移至新的1.5mL的收集管内，加入30μL RNeasy-free water，室温12000rpm，离心1min。收集管内的液体即为RNA提取液。
8)使用NanoDrop 2000检测提取液中RNA浓度。
9)按1μg的RNA总量反转，RNA和RNeasy-free water的总体积为16μL，65℃加热5min变性，然后快速转移至冰上预冷2min。
10)加入4μL反转录试剂中的5×RT.MM，达到总体积为20μL的量，设置普通PCR仪的反转录程序为37℃15min，50℃5min，98℃5min，4℃终止。
11)准备三蒸水，将反转录得到的cDNA，及SYBR GREEN(TOYOBO)一起配制Q-PCR的混合物，提前于96孔板中加入引物(下表5所示的引物，每对引物的用量是2OD，每孔中加入表5所示引物的混合物)，每孔总体系为20μL(体系包括：引物、SYBR GREEN、cDNA、Mix)，封闭膜封闭96孔板(Bio-Rad)，放入实时定量PCR仪中，检测程序为：95℃3min，95℃10s，60℃35s，65℃5s，95℃5s，总共循环40次。实时定量PCR结果如图8所示。
表5：PCR引物序列
如图8所示，示出了hEHO与基质细胞共培养体系在酒精处理7天后纤维化基因的PCR定量检测结果，可见酒精处理组能够显著上调纤维化相关的基因如LOXL2、COL1A1、COL3A1、ACTA2、TGFβ1等，因此酒精能够促进细胞的纤维化。
3.4、免疫组织化学染色
3.4.1、纤维化相关蛋白免疫组织化学染色
该实施例使用免疫组织化学染色试剂盒、Avidin/Biotin Blocking Kit、NovaRED试剂盒、苏木素(均购自Vector laboratories)对hEHO与基质细胞共培养体系细胞的石蜡切片进行以下操作：
1)梯度酒精脱蜡，即二甲苯两遍各5min，100％乙醇两遍各3min，95％乙醇一遍3min，70％乙醇一遍3min，结束后放入蒸馏水中洗两遍。
2)经脱蜡后的石蜡切片在枸橼酸钠抗原修复缓冲液(配方为：将20.01g 0.1MC6H8O7·H2O溶于1L去离子水为A液，将29.41g 0.1M C6H5Na3O7·2H2O溶于1L去离子水为B液，抗原修复缓冲液为9mL A液加41mL B液溶于450mL去离子水中)中微波炉抗原热修复10分钟，待自然冷却至室温后用双蒸水洗两遍。
3)使用Pap-pen沿着组织块的范围划圈，1×TBS(10×TBS配制：将61g Tris Base，90g NaCl溶于1L去离子水，待溶解后使用HCl调整液体PH值为7.4)洗两遍。
4)0.3％过氧化物酶室温作用10-15min，去除内源性过氧化物酶的活性，1×TBS洗两遍。
5)0.2％Triton X-100破膜10-15min，1×TBS洗两遍。
6)配制马血清封闭液，即一滴马血清溶于2.5mL 1×TBS中，室温封闭1小时，1×TBS洗两遍。
7)Avidin/Biotin溶液各处理组织块15min，1×TBS洗两遍。
8)加一抗(表3)，按照试剂盒说明书用含有马血清的1×TBS配置抗体，抗体的稀释浓度按说明书进行配比，一抗4℃冰箱孵育过夜，1×TBS洗三遍。
9)二抗(Vector试剂盒中提供)按试剂盒说明书进行配制，室温孵育1小时，1×TBS洗三遍。
10)提前30min配制ABC试剂，ABC试剂室温孵育1h，1×TBS洗三遍。
11)用NovaRED试剂盒显色，1×TBS洗三遍。
12)苏木素衬核15-20s，自来水冲净。
13)衬完核的切片自然干燥，梯度酒精脱水，95％酒精一遍3min，100％酒精两遍各3min，二甲苯两遍各5min。
14)中性树脂封片。
15)显微镜下进行观察并摄取图像(Perkin Elmer)。
3.4.2、天狼星红染色
该步骤中使用天狼星红染色试剂盒(LEAGENE)进行操作，具体包括以下步骤：
1)收集上述3.1中对照组和酒精处理组的三维球用4％PFA固定，梯度程序脱水后，进行石蜡包埋；
2)石蜡切片机制备4μm石蜡切片，梯度程序脱蜡；
3)用天狼星红染液室温孵育60分钟，并用流动水清洗；
4)100％酒精脱水，二甲苯透明，用中性树脂干胶进行封片；
5)显微镜下进行观察并摄取图像(Perkin Elmer)。
3.5、胶原蛋白前体分泌的定量检测
该步骤中使用胶原蛋白前体检测试剂盒(Takara)进行检测，具体包括以下步骤：
1)收集上述3.1中对照组和酒精处理组的细胞培养上清，可以冻存在-80℃冰箱直到检测；
2)细胞培养上清使用10kD Amicon Ultra-15过滤柱5000g条件下离心15分钟；
3)收集浓缩上清按照试剂盒说明书进行定量检测。
如图9所示，示出了hEHO与基质细胞共培养体系在添加酒精和不添加酒精的纤维化相关蛋白和天狼星红染色结果(A幅)以及胶原蛋白前体分泌的定量检测柱状图(B幅)。由图9中A幅可知酒精处理组的Col1、Col1α1、Desmin、α-SMA等蛋白相对于对照组明显上调；由图9中B幅可知酒精处理组分泌的细胞外基质(由胶原蛋白前体分泌量体现)比对照组明显增加。
3.6、ROS(活性氧)/GSH(谷胱甘肽)染色定量分析
1)收集上述3.1中对照组和酒精处理组的三维球，弃去上清，用PBS洗两遍；
2)加入5μM CellROX(Invitrogen)与100μmM BCI(Invitrogen)在37℃孵箱内孵育30分钟；
3)PBS洗三遍上机检测；
4)整个球体区域的平均荧光强度(AFI)用于检测细胞的氧化应激。
4.7、JC-1染色定量分析
1)收集上述4.1中对照组和酒精处理组的三维球，弃去上清，用PBS洗两遍；
2)加入15μM JC-1在37℃孵箱内孵育30分钟；
3)PBS洗三遍上机检测；
4)整个球体区域JC-1红色与绿色的平均荧光强度的比率用于检测细胞的线粒体损伤。
4.8、Nile Red(尼罗红)染色定量分析
1)收集上述4.1中对照组和酒精处理组的三维球，弃去上清，用PBS洗两遍；
2)加入1μM Nile Red在37℃孵箱内孵育30分钟；
3)PBS洗三遍上机检测。
4)Nile Red在细胞脂质斑点区的平均荧光强度(AFI)用于检测细胞脂肪变性。
hFLMC/hEHO共培养体系可用来探讨酒精诱发肝病的机制，基于现有技术LouvetA,Mathurin P.Alcoholic liver disease:mechanisms of injury and targetedtreatment[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2015；12:231-242.报道的ADH和CYP2E1在代谢酒精为乙醛的同时活性氧大量产生能够进一步诱导氧化应激和脂质堆积，在该实施例中利用hFLMC/hEHO来检测氧化应激和脂质堆积的变化。如图10-12所示，示出了hFLMC/hEHO共培养体系细胞的氧化应激和脂质堆积的变化结果，其中图10为通过检测细胞内的活性氧和谷胱甘肽来反映氧化应激的水平，可见在酒精处理组中，hFLMC/hEHO的ROS/GSH比值明显增加。乙醛能够导致线粒体结构和功能的改变，JC-1可用来定量检测hFLMC/hEHO线粒体膜电位的损伤，如图11所示，示出了hFLMC/hEHO共培养体系细胞的JC-1染色定量分析结果，可见酒精处理组中JC-1红色荧光/绿色荧光的比值明显下降，显示出线粒体膜电位去极化，发生线粒体损伤。氧化应激和线粒体损伤可通过扰乱肝脏脂质代谢来促进脂质堆积，如图12所示，示出了hFLMC/hEHO共培养体系细胞的脂质量的分析结果，可见酒精处理组与对照组相比，尼罗红脂滴的平均荧光强度显著增加，显示出酒精的添加能够促进细胞脂质堆积。如图13中A幅所示，在酒精处理7天后，和对照组相比，其脂质代谢相关酶(ACC1、FASN、SCD)和转录因子(SREBP1、PPAR-γ)均显著上调；如图13中B幅所示，在酒精处理7天后，相对于对照组，其ACC1(脂肪生成限速酶)的表达在转录水平和翻译水平均有所增加，这进一步显示了EtOH诱导的氧化应激增加了脂肪酸的生物合成。
3.9、细胞因子芯片分析(北京博奥晶典公司协作完成)
收集上述3.1中对照组和酒精处理组的细胞培养上清液。使用博奥晶典公司的RayBio Human Inflammation Antibody Array G-Series 3(Ray Biotech，Inc.)进行细胞因子阵列实验。使用激光扫描仪(Innopsys)检测来自G系列阵列的信号。
炎症之前被报道(Xu MJ,Zhou Z,Parker R,Gao B.Targeting inflammation forthe treatment of alcoholic liver disease[J].Pharmacol Ther 2017；180:77-89.)在酒精性肝病的病理改变中发挥着重要角色，因此，炎性因子的释放可用来评估该实施例中对照组和酒精处理组的改变。如图14中A幅示出了炎性因子芯片的结果，显示酒精处理组与对照组相比细胞因子如I-309、MIP-1d、MCP-2、MIP-1a、EOTAXIN和白介素如IL-3、IL-12p40、IL-1β、IL-17、IL-10、IL-6等明显增加。如图14中B幅示出了GO分析结果(GO分析公司协助完成)，显示IL-1信号通路高度激活，并且之前有文献报道(Petrasek J,Bala S,Csak T等.IL-1 receptor antagonist ameliorates inflammasome-dependent alcoholicsteatohepatitis in mice.The Journal of clinical investigation 2012；122:3476-3489.Tilg H,Moschen AR,Szabo G.Interleukin-1 and inflammasomes in alcoholicliver disease/acute alcoholic hepatitis and nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis.Hepatology 2016；64:955-965.)IL-1β是一个很重要的促炎因子，在酒精性肝炎患者体内其明显上调。另外，IL-1，IL-17对于酒精性肝病也是很重要的促炎因子，由图14中C幅所示，IL-17在酒精处理组也明显上调。可见，hFLMC/hEHO共培养体系可用来研究酒精性肝病的潜在机制。
综上实施例结果，可见hFLMC/hEHO共培养体系提供了一种全新的工具来研究肝病的潜在机制，并实现工业规模的新药筛查，以预防或治疗酒精性肝病。酒精性肝病模型的建立可以用于研究酒精性肝病的发病机制，发现新的诊断靶点以及为筛选预防和治疗性药物提供研究平台。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京达博威迎医药技术有限公司
中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 建立体外模拟肝病模型的方法及其专用三维培养基
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagtcaacgg atttggtcgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgattttgg agggatctcg 20
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caattcctgg cgatacctca g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcacaactcc ggtgacatca a 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggtggaggt gtactatgat gg 22
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttgccgtag gaggagctg 19
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgcgatgac gtgatctgtg a 21
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cggtggtttc ttggtcggt 19
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgaaggagg atgttcccat ct 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acagacacat atttggcatg gtt 23
<210> 11
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aaaagacagc tacgtgggtg a 21
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<212> DNA
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gccatgttct atcgggtact tc 22
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caattcctgg cgatacctca g 21
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gcacaactcc ggtgacatca a 21
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<212> DNA
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acagtgactt ccctggccta t 21
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gcatggacgg gtacatcttc aa 22
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tactgtcggt ttcagaaatg cc 22
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<400> 26
gaccaagttt tccacgacgt t 21
Claims (10)
1.一种建立体外模拟肝病模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将多能性干细胞定向诱导分化为肝干/祖阶段细胞；其中所述多能性干细胞不包括直接分解自人胚胎或胚泡的人多能干细胞或胚胎干细胞；
S2：将步骤S1获得的肝干/祖阶段细胞使用三维扩增培养基进行三维扩增培养，获得肝脏类器官；和
S3：将步骤S2获得的肝脏类器官与基质细胞混合后共培养形成共培养体系，作为体外模拟肝病的基础模型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括向所述共培养体系中添加酒精得到体外模拟酒精性肝病模型；
优选地，所述共培养体系中酒精的浓度为80-200mM，优选为100mM。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述多能性干细胞为H9系干细胞；和/或
所述基质细胞为胎肝基质细胞系(商品号为FL 62891
CRL-11005TM)、间充质干细胞、来源于已分离肝脏(含动物肝脏)且具有肝星状细胞样细胞的肝脏基质细胞、或保藏号为CGMCC No.1804的bFGF-FLSC细胞株及其传代细胞；其中所述bFGF-FLSC细胞株的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2006年09月08日。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述肝脏类器官和基质细胞以2:1的比例混合；和/或
步骤S3中所述共培养的条件为：37℃、5％CO2培养箱中培养，包括第一阶段和第二阶段，两个阶段培养时间各为7天，其中每2天更换共培养的培养基一次。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述共培养的第一阶段培养基以Advanced DMEM/F12培养基为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂、1-50mM HEPES，以及以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、L-抗坏血酸盐、肝细胞生成因子、ROCK信号通路抑制剂、青霉素和链霉素；
优选地，所述共培养的第一阶段培养基中，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1.25mM；所述L-抗坏血酸盐的浓度为0.05-2mM，优选为0.2mM；所述肝细胞细胞生长因子为HGF，浓度为5-50ng/mL，优选为20ng/mL；所述ROCK信号通路抑制剂为Y-27632，浓度为1-50μM，优选为10μM；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL；
步骤S3中所述共培养的第二阶段培养基以HCM培养基(Lonza)为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA；优选地，所述第二阶段培养基还包含以及以下组分中的一种或多种：抑瘤素M、地塞米松、青霉素和链霉素；
优选地，所述第二阶段培养基中，所述抑瘤素M为OSM，浓度为5-50ng/mL，优选为20ng/mL；所述地塞米松为Dex，浓度为0.1-1mM，优选为0.5μM；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述共培养的第一阶段培养基的配方为以下配方中的任一种：
配方1：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、20ng/mLHGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.2mM L-抗坏血酸盐、20ng/mLHGF、10μM Y-27632、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
所述共培养的第二阶段培养基的配方为以下配方中的任一种：
配方1：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、20ng/mL OSM、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、20ng/mL OSM、0.5μM Dex、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
7.一种用于权利要求1-6中任一项所述的建立体外模拟肝病模型的方法的三维培养基，其特征在于，所述三维培养基包括第一阶段三维培养基和第二阶段三维培养基；其中所述第一阶段三维培养基以Advanced DMEM/F12培养基为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA、0.2％-10％B-27、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂、1-50mM HEPES，以及以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、L-抗坏血酸盐、肝细胞生成因子、ROCK信号通路抑制剂、青霉素和链霉素；
优选地，在所述第一阶段三维培养基中，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1.25mM；所述L-抗坏血酸盐浓度为0.05-2mM，优选为0.2mM；所述肝细胞细胞生长因子为HGF，浓度为5-50ng/mL，优选为20ng/mL；所述ROCK信号通路抑制剂为Y-27632，浓度为1-50μM，优选为10μM；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL；
所述第二阶段三维培养基以HCM培养基(Lonza)为基础培养基，还包含0.01％-1％BSA；优选地，所述第二阶段三维培养基还包含以下组分中的一种或多种：抑瘤素M、地塞米松、青霉素和链霉素；进一步优选地，所述抑瘤素M为OSM，浓度为5-50ng/mL，优选为20ng/mL；所述地塞米松为Dex，浓度为0.1-1mM，优选为0.5μM；所述青霉素的浓度为10-1000U/mL，优选为100U/mL；所述链霉素的浓度为0.01-1mg/mL，优选为0.1mg/mL。
8.根据权利要求7所述的三维培养基，其特征在于，所述第一阶段三维培养基的配方为以下配方中的任一种：
配方1：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、20ng/mL HGF、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以Advanced DMEM/F-12培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、1％B-27、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.2mM L-抗坏血酸盐、20ng/mLHGF、10μM Y-27632、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
所述二阶段三维培养基的配方为以下配方中的任一种：
配方1：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、20ng/mL OSM、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：以HCM培养基为基础培养基，还包含0.1％BSA、20ng/mL OSM、0.5μM Dex、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
9.一种体外模拟肝病模型，其由权利要求1-6中任一项所述的方法建立。
10.权利要求9所述的体外模拟肝病模型在筛选预防或治疗肝病的药物中的应用。
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|---|
| 王洪武: "《支气管介入治疗王洪武2019观点》", 30 April 2019, 科学技术文献出版社 * |
| 王璇: "构建人多能性干细胞来源具有双向分化潜能的肝脏类器官的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111961642A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-11-20 | 创芯国际生物科技(广州)有限公司 | 一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用 |
| CN111961642B (zh) * | 2020-08-10 | 2021-05-14 | 创芯国际生物科技(广州)有限公司 | 一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111004771B (zh) | 2022-04-29 |
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