CN115820537A - 一种颅咽管瘤类器官、培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种颅咽管瘤类器官、培养基及培养方法。颅咽管瘤类器官培养基包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：不含维生素A的B27，0.2‑5×；N2，0.5‑5×；N‑acetylcysteine，0.2‑5mM；GlutaMAX:1‑5×；FGF:10‑500ng/mL；HKGS：5‑500ng/mL；NGF:10‑1000ng/mL；Y‑27632，5‑50μM；Nicotinamide，5‑50mM；青霉素链霉素混合液，1‑5×。本发明提供的颅咽管瘤类器官培养基可特异性地对人的颅咽管瘤组织进行体外培养，在培养过程中，形成从细胞构成及空间结构均近似于体内肿瘤的类器官，培养形成的类器官较好的维持了原发组织的形态结构和基因特征。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种颅咽管瘤类器官、培养基及培养方法。
背景技术
如何准确的认识人类疾病是科学家一直深思的重大课题，临床上发生的很多疾病之所以没有得到有效的治疗，主要的原因就是因为缺乏对疾病的发生原因和机制的了解。目前，小鼠是医学研究中最重要的模型动物，小鼠的基因与人类相似度达95％，拥有与人类相似的免疫系统，易于进行基因工程与细胞工程的改造，这些优点决定了小鼠模型在生物学医学科学研究中得天独厚的优势。然而，即便小鼠动物模型有诸多的优势，却仍然存在建模流程繁杂、建模时间长、操作难度大、硬件要求高和建模成本高昂等问题。
类器官是由诱导的多能干细胞、胚胎干细胞或成体组织驻留的祖细胞体外培养形成的三维细胞团结构。类器官是二维培养和活体模型之间的重要桥梁，其与单层细胞培养模型相比更具生理学相关性，同时又比活体模型更容易操纵利基成分、信号通路和基因组编辑。类器官的价值在于它们能够自组织成最小的生物单位，表现出与原始组织相似的功能和复杂性。类器官的可操作性表明类器官将为广泛的基础研究提供出色的模型系统，包括表达谱研究和体内难以获得的稀有细胞谱系的分析。此外，还可将从患者自身组织或诱导的多能干细胞产生的类器官用于研究缺乏动物模型的罕见疾病。在再生医学中，类器官技术有望替代严重受损的器官，如Ⅰ型糖尿病患者的胰腺。
颅咽管瘤是由起源于颅咽管的上皮细胞或拉克氏囊的残留或由原始口凹残留的鳞状上皮细胞化生而来。颅咽管瘤可从垂体-下丘脑轴的任何一点发生并沿此轴发展，肿瘤可从位于蝶鞍到大脑的第三脑室，大约50％的肿瘤起源于第三脑室底水平的漏斗和/或灰结节区域，主要向第三脑室发展。患者可出现头痛、视力损害和由中枢性尿崩症导致的多饮多尿等症状，儿童可出现发育迟缓，成人可出现性功能障碍和下丘脑综合征(如体温调节紊乱、水电平衡紊乱)。颅咽管瘤虽为良性肿瘤(WHO I级)，但手术切除会对患者造成严重的健康影响。因此，对颅咽管瘤药物的研究是治疗该疾病的重要方式。通过颅咽管瘤类器官进行药物筛选，观察肿瘤细胞在体外对药物的反应，判断药物能否对肿瘤形成杀伤，被视为下一代的个体化精准医学检测技术。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种颅咽管瘤类器官、培养基及培养方法。
为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
第一方面，本发明提供一种颅咽管瘤类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，0.2-5×；
N2，0.5-5×；
N-acetylcysteine，0.2-5mM；
GlutaMAX:1-5×；
FGF:10-500ng/mL；
HKGS：5-500ng/mL；
NGF:10-1000ng/mL；
Y-27632，5-50μM；
Nicotinamide，5-50mM；
青霉素链霉素混合液，1-5×。
进一步的，所述FGF为FGF-2。
进一步的，所述FGF为FGF-10。
进一步的，所述FGF为FGF-10和FGF-2。
进一步的，所述基础培养基由SFM与Advanced DMEM/F12混合而成。
优选的，按体积比计，SFM与Advanced DMEM/F12的混合比例为1:0.2～3。
最优选的，按体积比计，SFM与Advanced DMEM/F12的混合比例为1.2:1。
进一步的，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27:1×；
N2:1×；
N-acetylcysteine，1.5mM；
GlutaMAX:2×；
FGF:110ng/mL；
HKGS：50ng/mL；
NGF:100ng/mL；
Y-27632，20μM；
Nicotinamide，5mM；
青霉素链霉素混合液，1×。
进一步的，所述颅咽管瘤类器官培养基的制备方法为将特异性添加因子混合添加到基础培养基中混合均匀。
第二方面，本发明提供一种颅咽管瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的颅咽管瘤组织进行预处理得到组织块；
2)将组织块进行消化、过滤，获取细胞团，离心去除上清备用；
3)取上述颅咽管瘤类器官培养基重悬细胞，得到细胞悬液；
4)将细胞悬液与基质胶混匀；
5)接种至培养皿或细胞培养板，倒置直至基质胶凝固；
6)将接种后的细胞培养板或培养皿置于恒温培养箱，在37℃，5％ CO2浓度下培养；
7)每隔2-3天更换一次液体培养基，培养3-5天可获得颅咽管瘤类器官。
进一步的，步骤1)中所述预处理的方式为用含1％双抗的生理盐水进行数次洗涤、去除血块杂质，并充分切碎。
进一步的，步骤2)中细胞团的直径为20μm-40μm。
进一步的，步骤2)中细胞团的直径为70μm-100μm。
进一步的，步骤3)中按照1～2万细胞用10μl培养基比例重悬细胞。
进一步的，步骤4)中细胞悬液与基质胶的混合比例为1:1～3。
进一步的，步骤5)中倒置时间为15～30分钟。
进一步的，步骤6)置于恒温培养箱前，根据细胞培养板或培养皿的大小补充颅咽管瘤类器官培养基，使培养基体积占培养皿或培养板体积的30％-50％。
第三方面，本发明提供使用上述颅咽管瘤类器官培养基或采用上述颅咽管瘤类器官的培养方法培养得到的颅咽管瘤类器官。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供的颅咽管瘤类器官培养基可特异性地对人的颅咽管瘤组织进行体外培养，在培养过程中，形成从细胞构成及空间结构均近似于体内肿瘤的类器官。
2、本发明提供的颅咽管瘤类器官培养基含有颅咽管瘤细胞培养所需的最少组分，降低了生长因子用量，极大程度上节约了培养成本；所培养形成的类器官良好的维持了原发组织的形态结构和基因特征。
3、本发明提供的颅咽管瘤类器官培养基配合本发明的培养方法可将直径为20μ-40um、70-100μm的颅咽管瘤细胞团培养成器官；本发明提供的颅咽管瘤类器官培养基配合本发明培养方法，可将低至5000个细胞的新鲜细胞团培养成类器官；本发明培养得到的颅咽管瘤可以在体外长期扩增，大于5代。
4、本发明提供的颅咽管瘤类器官培养基及培养方法也适用于其他物种颅咽管瘤模型的体外培养；本发明操作简单，人员操作影响较少，培养结果稳定。
附图说明
图1为实施例4中采用本发明所述培养基培养的颅咽管瘤类器官；
图2为实施例5中采用本发明所述培养基培养的颅咽管瘤类器官；
图3为实施例6中采用本发明所述培养基培养的颅咽管瘤类器官；
图4为对比例1中采用不含HKGS培养基培养的颅咽管瘤类器官；
图5为对比例2中采用不含FGF培养基培养的颅咽管瘤类器官；
图6为对比例3中采用高FGF-2及FGF-10培养基培养的颅咽管瘤类器官；
图7为对比例4中采用仅含DMEM/F12，不含SFM培养基培养的颅咽管瘤类；
图8为对比例5中采用仅含SFM，不含DMEM/F12培养基培养的颅咽管瘤类；
图9为对比例6中采用本发明所述培养基培养的肠癌管瘤类器官。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例采用的不含维生素A的B27，购自Gibco；
本发明实施例采用的N2，购自Gibco；
本发明实施例采用的N-acetylcysteine，购自Sigma-Aldrich；
本发明实施例采用的GlutaMAX，购自Gibco；
本发明实施例采用的EGF，购自Novoprotein；
本发明实施例采用的NGF，购自Novoprotein；
本发明实施例采用的HKGS，购自Gibco；
本发明实施例采用的Y27632，购自Selleck；
本发明实施例采用的Nicotinamide，购自Selleck；
本发明实施例采用的SFM，购自Gibco；
本发明实施例采用的Advanced DMEM/F12，购自Gibco。
本发明实施例采用的青霉素链霉素混合液，购自Gibco。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明中所述的百分浓度表示质量浓度。
实施例1
一种颅咽管瘤类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，1×；
N2，1×；
N-acetylcysteine，1.5mM；
GlutaMAX:1×；
FGF-2:50ng/mL；
HKGS：5ng/mL；
NGF:10ng/mL；
Y-27632，5μM；
Nicotinamide，5mM；
青霉素链霉素混合液，1×；
所述基础培养基由SFM与Advanced DMEM/F12按体积比1:1混合而成。
实施例2
一种颅咽管瘤类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，1×；
N2，1×；
N-acetylcysteine，2mM；
GlutaMAX:1.5×；
FGF-10:20ng/mL；
HKGS：100ng/mL；
NGF:50ng/mL；
Y-27632，50μM；
Nicotinamide，30mM；
青霉素链霉素混合液，1×；
所述基础培养基由SFM与Advanced DMEM/F12按体积比1:2混合而成。
实施例3
一种颅咽管瘤类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，1×；
N2，1×；
N-acetylcysteine，1.5mM；
GlutaMAX:2×；
FGF-10:100ng/mL；
FGF-2:10ng/mL；
HKGS：50ng/mL；
NGF:100ng/mL；
Y-27632，20μM；
Nicotinamide，10mM；
青霉素链霉素混合液，1×；
所述基础培养基由SFM与Advanced DMEM/F12按体积比1.2:1混合而成。
实施例4
一种小鼠颅咽管瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的小鼠颅咽管瘤组织进行预处理，用含1％双抗的生理盐水进行数次洗涤、去除血块杂质，并充分切碎得到组织块；
2)将组织块进行消化、过滤，获取20μm-40μm细胞团，离心去除上清备用；
3)取实施例1中颅咽管瘤类器官培养基，按照1万细胞用10μL培养基的比例重悬细胞，得到细胞悬液；
4)将细胞悬液与基质胶按照体积比1:1混匀；
5)接种至细胞培养板，倒置20min至基质胶凝固；
6)将接种后的细胞培养板置于恒温培养箱，在37℃，5％ CO2浓度下培养；
7)每隔3天更换一次液体培养基，培养3天可获得人颅咽管瘤类器官。
图1为获得的小鼠颅咽管瘤类器官的光学显微镜图片。由图1可知使用该培养基可培养成成团的颅咽管瘤类器官。
实施例5
一种人颅咽管瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的人颅咽管瘤组织进行预处理，用含1％双抗的生理盐水进行数次洗涤、去除血块杂质，并充分切碎得到组织块；
2)将组织块进行消化、过滤，获取20μm-40μm细胞团，离心去除上清备用；
3)取实施例2中颅咽管瘤类器官培养基，按照2万细胞每10μL培养基的比例重悬细胞，得到细胞悬液；
4)将细胞悬液与基质胶按照体积比1:2混匀；
5)接种至细胞培养皿，倒置20min至基质胶凝固；
6)补充颅咽管瘤类器官培养基2mL，培养基体积约占培养皿体积的50％；将接种后的细胞培养皿置于恒温培养箱，在37℃，5％ CO2浓度下培养；
7)每隔2天更换一次液体培养基，培养4天可获得人颅咽管瘤类器官。
图2为获得的人颅咽管瘤类器官的光学显微镜图片。由图2可知该配方培养基可培养成团状颅咽管瘤类器官
实施例6
一种人颅咽管瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的人颅咽管瘤组织进行预处理，用含1％双抗的生理盐水进行数次洗涤、去除血块杂质，并充分切碎得到组织块；
2)将组织块进行消化、过滤，获取70μm-100μm细胞团，离心去除上清备用；
3)取实施例3中颅咽管瘤类器官培养基，按照每1.5万细胞用10μl培养基的比例重悬细胞，得到细胞悬液；
4)将细胞悬液与基质胶按照体积比1:3混匀；
5)接种至细胞培养板，倒置15min至基质胶凝固；
6)将接种后的细胞培养板置于恒温培养箱，在37℃，5％ CO2浓度下培养；
7)每隔3天更换一次液体培养基，培养5天可获得人颅咽管瘤类器官。
图3为获得的人颅咽管瘤类器官的光学显微镜图片。由图3可知该配方培养基可培养成团状颅咽管瘤类器官。
对比例1
一种颅咽管瘤类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中不含有HKGS，其余均相同。采用实施例6的培养方法，使用本对比例中的颅咽管瘤类器官培养基，培养得到的颅咽管瘤类器官如图4。由图4可知不含HKGS的培养基配方无法培养为成团的颅咽管瘤类器官。
对比例2
一种颅咽管瘤类器官培养基，与实施例2的区别在于特异性添加因子中不含有FGF-10，其余均相同。采用实施例5的培养方法，使用本对比例中的颅咽管瘤类器官培养基，培养得到的颅咽管瘤类器官如图5。由图5可知不含FGF-10的培养基配方无法培养为成团的颅咽管瘤类器官。
对比例3
一种颅咽管瘤类器官培养基，与实施例3的区别在于HKGS为3ng/mL；FGF-10为400ng/mL；FGF-2为400ng/mL；其余均相同。采用实施例6的培养方法，使用本对比例中的颅咽管瘤类器官培养基，培养得到的颅咽管瘤类器官如图6。由图6可知FGF浓度过高时，所培养细胞主要为成纤维细胞，肿瘤细胞无法正常增值。
对比例4
一种颅咽管瘤类器官培养基，与实施例3的区别在于基础培养基仅为AdvancedDMEM/F12，其余均相同。采用实施例6的培养方法，使用本对比例中的颅咽管瘤类器官培养基，培养得到的颅咽管瘤类器官如图7。由图7可知仅为DMEM/F12不含SFM的培养基所形成的类器官多为10个以下细胞形成的微小细胞团，培养效果不及DMEM/F12与SFM混合的培养基。
对比例5
一种颅咽管瘤类器官培养基，与实施例3的区别在于基础培养基仅由SFM构成，其余均相同。采用实施例6的培养方法，使用本对比例中的颅咽管瘤类器官培养基，培养得到的颅咽管瘤类器官如图8。由图8可知去除DMEM/F12培养基后肿瘤细胞无法正常自组织成类器官。
对比例6
采用实施例6的培养方法培养人肠癌类器官，其余均相同。得到的类器官如图9所示。由图9可知该培养基无法培养肠癌细胞形成类器官。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种颅咽管瘤类器官培养基，其特征在于，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，0.2-5×；
N2，0.5-5×；
N-acetylcysteine，0.2-5mM；
GlutaMAX:1-5×；
FGF:10-500ng/mL；
HKGS：5-500ng/mL；
NGF:10-1000ng/mL；
Y-27632，5-50μM；
Nicotinamide，5-50mM；
青霉素链霉素混合液，1-5×。
2.权利要求1所述颅咽管瘤类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基由SFM与Advanced DMEM/F12混合而成。
3.根据权利要求2所述的颅咽管瘤类器官培养基，其特征在于，按体积比计，SFM与Advanced DMEM/F12的混合比例为1:0.2～3。
4.根据权利要求1所述的颅咽管瘤类器官培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27:1×；
N2:1×；
N-acetylcysteine，1.5mM；
GlutaMAX:2×；
FGF:110ng/mL；
HKGS：50ng/mL；
NGF:100ng/mL；
Y-27632，20μM；
Nicotinamide，5mM；
青霉素链霉素混合液，1×。
5.根据权利要求1所述的颅咽管瘤类器官培养基，其特征在于，制备方法为将特异性添加因子混合添加到基础培养基中混合均匀。
6.一种颅咽管瘤类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将新鲜的颅咽管瘤组织进行预处理得到组织块；
2)将组织块进行消化、过滤，获取细胞团，离心去除上清备用；
3)取权利要求1～5任意一项所述的颅咽管瘤类器官培养基重悬细胞，得到细胞悬液；
4)将细胞悬液与基质胶混匀；
5)接种至培养皿或细胞培养板，倒置直至基质胶凝固；
6)将接种后的细胞培养板或培养皿置于恒温培养箱，在37℃，5％CO2浓度下培养；
7)每隔2-3天更换一次液体培养基，培养3-5天可获得颅咽管瘤类器官。
7.根据权利要求6所述的颅咽管瘤类器官的培养方法，其特征在于，步骤3)中按照1～2万细胞用10μl培养基比例重悬细胞。
8.根据权利要求6所述的颅咽管瘤类器官的培养方法，其特征在于，步骤4)中细胞悬液与基质胶的混合比例为1:1～3。
9.根据权利要求6所述的颅咽管瘤类器官的培养方法，其特征在于，步骤6)置于恒温培养箱前，根据细胞培养板或培养皿的大小补充颅咽管瘤类器官培养基，使培养基体积占培养皿或培养板体积的30％-50％。
10.一种颅咽管瘤类器官，其特征在于，采用权利要求1～5任意一项所述颅咽管瘤类器官培养基或使用权利要求6～9任意一项所述颅咽管瘤类器官的培养方法培养获得。
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