CN116515754A - 一种脂肪肉瘤类器官、培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种脂肪肉瘤类器官、培养基及培养方法。脂肪肉瘤类器官培养基包括基础培养基、基础营养因子、特异性添加因子和添加试剂；所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：1‑5mg/ml的亚油酸‑牛血清白蛋白，0.1x‑2x的胰岛素‑转铁蛋白‑亚硒酸钠，0.5x‑2x的不含维生素A的B27，1‑5mM的Glutamine，1％‑2％的MEM非必需氨基酸；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：10‑50ng/ml的PDGF‑BB，10‑50ng/ml的EGF，500‑1000ng/ml的R‑spondin1，20‑100ng/ml的WNT3a；所述添加试剂包括以下终浓度的组分：10‑100nM的地塞米松，20‑100nM的抗坏血酸‑2磷酸酯，10μM的ROCK抑制剂Y‑27632，1％的P/S。本发明的脂肪肉瘤类器官培养基添加组分简单，涉及的组分明确，能够维持脂肪肉瘤细胞的长时间培养和增殖，适用范围广。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种脂肪肉瘤类器官、培养基及培养方法。
背景技术
随着类器官(Organoids)培养和建模技术的不断发展，肿瘤类器官相关技术逐渐成为肿瘤领域内研究肿瘤发生、转移、复发、耐药机制和新药研发以及临床药效预测的有利工具。自2009年类器官技术被发明后，该技术在2013年和2017年依次被science和naturemethods评为十大突破技术和年度最佳技术，并逐渐受到国家机构的重视和认可。由于3D培养的肿瘤类器官相较于传统的细胞模型，能够更优的还原体内肿瘤组织的真实状态，不仅能够最大程度上保留原始肿瘤组织的遗传学和分子、病理等特征，在肿瘤异质性、肿瘤微环境等方面也具有极大的优势。目前已成功建立不同组织来源的肿瘤类器官，包括呼吸系统、消化道、子宫、内脏和神经系统相关的鼻咽癌、肺癌、胃癌、肠癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌和神经胶质瘤类器官等。
脂肪肉瘤(liposarcoma)是一组源于脂肪细胞的软组织肿瘤，占成人软组织肿瘤的25％，具有显著的肿瘤异质性。目前，手术结合术后化疗的方法是治疗侵袭性脂肪肉瘤的一种治疗策略。然而，化疗及靶向治疗效果差强人意，该疾病的治疗面临着手术切除难度大、复发率高、治疗有效率低等瓶颈。有效的体外研究模型对于该疾病发展、耐药和药物筛选等研究具有重大的推动作用，然而目前尚缺乏相关有效的体外模型。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种脂肪肉瘤类器官、培养基及培养方法。本发明根据脂肪肉瘤生长及肿瘤干细胞培养相关信号通路，提供了一种适用于脂肪肉瘤生长的类器官培养基及相关的培养方法，能够为后续的脂肪肉瘤类器官建模、疾病机制研究和相关药物研发提供有利的体外研究平台。
为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
第一方面，本发明提供一种脂肪肉瘤类器官培养基，包括基础培养基、基础营养因子、特异性添加因子和添加试剂；
所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：1-5mg/ml的亚油酸-牛血清白蛋白，0.1x-2x的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，0.5x-2x的不含维生素A的B27，1-5mM的Glutamine，1％-2％的MEM非必需氨基酸；
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：10-50ng/ml的PDGF-BB，10-50ng/ml的EGF，500-1000ng/ml的R-spondin1，20-100ng/ml的WNT3a；
所述添加试剂包括以下终浓度的组分：10-100nM的地塞米松，20-100nM的抗坏血酸-2磷酸酯，10μM的ROCK抑制剂Y-27632，1％的P/S。
进一步的，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
进一步的，所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：1mg/ml的亚油酸-牛血清白蛋白，1x的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，1x的不含维生素A的B27，2mM的Glutamine，1％的MEM非必需氨基酸；
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：10ng/ml的PDGF-BB，10ng/ml的EGF，500ng/ml的R-spondin1，100ng/ml的WNT3a；
所述添加试剂包括以下终浓度的组分：10nM的地塞米松，100nM的抗坏血酸-2磷酸酯，10μM的ROCK抑制剂Y-27632，1％的P/S。
进一步的，所述脂肪肉瘤类器官培养基的制备方法为将基础营养因子、特异性添加因子和添加试剂添加到基础培养基中，混合均匀。
第二方面，本发明提供一种脂肪肉瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
步骤1：对获取的脂肪肉瘤组织样本进行预处理，得到脂肪肉瘤细胞；
步骤2：用DMEM/F12培养基重悬步骤1得到的细胞，离心后再用DMEM/F12和Matrigel的混合液重悬细胞后得到细胞悬液，将细胞悬液种胶滴；在37℃孵育20～40min待胶滴固化后，加入上述脂肪肉瘤类器官培养基，于37℃，5％CO2的恒温培养箱中维持培养。
步骤3：每隔3-5天更换一次脂肪肉瘤类器官培养基，每隔7-10天进行类器官传代。
进一步的，步骤1中预处理方式为用HBSS缓冲液或生理盐水对组织样本进行多次洗涤去除血水，然后进行剪切、消化和过滤，除去细胞杂质。
进一步的，步骤2混合液中DMEM/F12和Matrigel混合比例为1：1.5～2。
进一步的，步骤2中种胶滴的细胞密度为104-105个细胞/30μL。
进一步的，步骤3中传代的方法为使用TrypLE消化液消化脂肪瘤类器官，37℃温度下消化5-10min，用3-5倍消化液体积的DMEM/F12培养基终止消化后，离心收集细胞，用DMEM/F12和Matrigel的混合液重悬细胞后得到细胞悬液，将细胞悬液种胶滴，种胶滴的细胞密度为104-105个细胞/30μL。
第三方面，本发明提供使用上述脂肪肉瘤类器官培养基或采用上述脂肪肉瘤类器官的培养方法培养得到的脂肪肉瘤类器官。
本发明的有益效果为：
1、本发明的脂肪肉瘤类器官培养基为无血清添加培养基，添加组分简单，涉及的组分明确，避免了血清带来的批间稳定性差异等问题，适用范围广，可用于基础科研、临床医学和再生医学等领域的研究；
2、本发明的脂肪肉瘤类器官培养基能够维持脂肪肉瘤细胞的长时间培养和增殖；其中添加的特异性细胞因子包括血小板生长因子PDGF-BB、Wnt信号通路激活剂Wnt3a,R-spondin1以及表皮细胞生长因子EGF，这些因子对于脂肪肉瘤细胞的增殖、存活具有重要的作用；添加的地塞米松，抗坏血酸-2磷酸酯组分有利于长时间培养的肿瘤干性维持，ROCK抑制剂(Y-27632)有利于细胞的存活；
3、本发明的脂肪肉瘤类器官培养基有利于类器官在体外进行长期、稳定的类器官培养、扩增、传代和肿瘤细胞的干性维持。
附图说明
图1为实施例4培养得到的脂肪肉瘤类器官图片；
图2为实施例5培养得到的脂肪肉瘤类器官图片；
图3为实施例6培养得到的脂肪肉瘤类器官图片；
图4为对比例1培养得到的脂肪肉瘤类器官图片；
图5为对比例2培养得到的脂肪肉瘤类器官图片；
图6为对比例3培养得到的脂肪肉瘤类器官图片；
图7为对比例4培养得到的脂肪肉瘤类器官图片；
图8为对比例5培养得到的脂肪肉瘤类器官图片；
图9为对比例6培养得到的脂肪肉瘤类器官图片；
图10为采用实施例3的脂肪肉瘤类器官培养基培养至P5代后脂肪肉瘤类器官图片；
图11为采用对比例1的类器官培养基培养到P1代后脂肪肉瘤类器官图片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例采用的DMEM/F12培养基，亚油酸-牛血清白蛋白，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，不含维生素A的B27，Glutamine,MEM非必需氨基酸，PDGF-BB,EGF,R-spondin1,WNT3a，地塞米松，抗坏血酸-2磷酸酯，ROCK抑制剂(Y-27632)，P/S均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种脂肪肉瘤类器官培养基，包括基础培养基、基础营养因子、特异性添加因子和添加试剂；
所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：1mg/ml的亚油酸-牛血清白蛋白，0.5x的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，1x的不含维生素A的B27，1mM的Glutamine，1％的MEM非必需氨基酸；
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：10ng/ml的PDGF-BB，10ng/ml的EGF，500ng/ml的R-spondin1，50ng/ml的WNT3a；
所述添加试剂包括以下终浓度的组分：10nM的地塞米松，50nM的抗坏血酸-2磷酸酯，10μM的ROCK抑制剂Y-27632，1％的P/S；
所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
脂肪肉瘤类器官培养基的制备方法为将基础营养因子、特异性添加因子和添加试剂添加到基础培养基中，混合均匀。
实施例2
一种脂肪肉瘤类器官培养基，包括基础培养基、基础营养因子、特异性添加因子和添加试剂；
所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：2mg/ml的亚油酸-牛血清白蛋白，2x的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，1x的不含维生素A的B27，5mM的Glutamine，2％的MEM非必需氨基酸；
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：50ng/ml的PDGF-BB，50ng/ml的EGF，500ng/ml的R-spondin1，100ng/ml的WNT3a；
所述添加试剂包括以下终浓度的组分：10nM的地塞米松，100nM的抗坏血酸-2磷酸酯，10μM的ROCK抑制剂Y-27632，1％的P/S；
所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
制备方法同实施例1。
实施例3
一种脂肪肉瘤类器官培养基，包括基础培养基、基础营养因子、特异性添加因子和添加试剂；
所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：1mg/ml的亚油酸-牛血清白蛋白，1x的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，1x的不含维生素A的B27，2mM的Glutamine，1％的MEM非必需氨基酸；
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：10ng/ml的PDGF-BB，10ng/ml的EGF，500ng/ml的R-spondin1，100ng/ml的WNT3a；
所述添加试剂包括以下终浓度的组分：10nM的地塞米松，100nM的抗坏血酸-2磷酸酯，10μM的ROCK抑制剂Y-27632，1％的P/S；
所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
制备方法同实施例1。
实施例4
一种脂肪肉瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
步骤1：对获取的脂肪肉瘤组织样本进行预处理，得到脂肪肉瘤细胞；预处理方式为用HBSS缓冲液或生理盐水对组织样本进行多次洗涤去除血水，然后进行剪切、消化和过滤，除去细胞杂质；
步骤2：用DMEM/F12培养基重悬步骤1得到的细胞，离心后再用DMEM/F12和Matrigel按照1：1.5混合得到的混合液重悬细胞后得到细胞悬液，将细胞悬液种胶滴，种胶滴的细胞密度为104细胞/30μL；在37℃孵育20min待胶滴固化后，加入实施例1中脂肪肉瘤类器官培养基，于37℃，5％ CO2的恒温培养箱中维持培养。
步骤3：每隔3天更换一次脂肪肉瘤类器官培养基，每隔7天进行类器官传代；传代的方法为使用TrypLE消化液消化脂肪瘤类器官，37℃温度下消化8min，用3倍消化液体积的DMEM/F12培养基终止消化后，离心收集细胞，用DMEM/F12和Matrigel的混合液重悬细胞后得到细胞悬液，将细胞悬液种胶滴，种胶滴的细胞密度为105个细胞/30μL。
培养得到的类器官图片如图1所示。
实施例5
一种脂肪肉瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
步骤1：对获取的脂肪肉瘤组织样本进行预处理，得到脂肪肉瘤细胞；预处理方式为用HBSS缓冲液或生理盐水对组织样本进行多次洗涤去除血水，然后进行剪切、消化和过滤，除去细胞杂质；
步骤2：用DMEM/F12培养基重悬步骤1得到的细胞，离心后再用DMEM/F12和Matrigel按照1：1.5混合得到的混合液重悬细胞后得到细胞悬液，将细胞悬液种胶滴，种胶滴的细胞密度为105细胞/30μL；在37℃孵育30min待胶滴固化后，加入实施例2中脂肪肉瘤类器官培养基，于37℃，5％ CO2的恒温培养箱中维持培养。
步骤3：每隔3天更换一次脂肪肉瘤类器官培养基，每隔9天进行类器官传代；传代的方法为使用TrypLE消化液消化脂肪瘤类器官，37℃温度下消化10min，用5倍消化液体积的DMEM/F12培养基终止消化后，离心收集细胞，用DMEM/F12和Matrigel的混合液重悬细胞后得到细胞悬液，将细胞悬液种胶滴，种胶滴的细胞密度为5×104个细胞/30μL。
培养得到的类器官图片如图2所示。
实施例6
一种脂肪肉瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
步骤1：对获取的脂肪肉瘤组织样本进行预处理，得到脂肪肉瘤细胞；预处理方式为用HBSS缓冲液或生理盐水对组织样本进行多次洗涤去除血水，然后进行剪切、消化和过滤，除去细胞杂质；
步骤2：用DMEM/F12培养基重悬步骤1得到的细胞，离心后再用DMEM/F12和Matrigel按照1：2混合得到的混合液重悬细胞后得到细胞悬液，将细胞悬液种胶滴，种胶滴的细胞密度为7×104细胞/30μL；在37℃孵育30min待胶滴固化后，加入实施例3中脂肪肉瘤类器官培养基，于37℃，5％ CO2的恒温培养箱中维持培养。
步骤3：每隔3天更换一次脂肪肉瘤类器官培养基，每隔9天进行类器官传代；传代的方法为使用TrypLE消化液消化脂肪瘤类器官，37℃温度下消化10min，用4倍消化液体积的DMEM/F12培养基终止消化后，离心收集细胞，用DMEM/F12和Matrigel的混合液重悬细胞后得到细胞悬液，将细胞悬液种胶滴，种胶滴的细胞密度为8×104个细胞/30μL。
培养得到的类器官图片如图3所示。
对比例1
一种脂肪肉瘤类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中不含有PDGF-BB，其余均相同。采用本对比例的培养基和实施例6的培养方法培养得到的类器官图片如图4所示。
对比例2
一种脂肪肉瘤类器官培养基，与实施例3的区别在于添加试剂中不含有R-spondin1，其余均相同。采用本对比例的培养基和实施例6的培养方法培养得到的类器官图片如图5所示。
对比例3
一种脂肪肉瘤类器官培养基，与实施例3的区别在于添加试剂中不含有EGF，其余均相同。采用本对比例的培养基和实施例6的培养方法培养得到的类器官图片如图6所示。
对比例4
一种脂肪肉瘤类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中EGF替换为BFGF，其余均相同。采用本对比例的培养基和实施例6的培养方法培养得到的类器官图片如图7所示。
对比例5
一种脂肪肉瘤类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中PDGF-BB替换为VEGF，其余均相同。采用本对比例的培养基和实施例6的培养方法培养得到的类器官图片如图8所示。
对比例6
采用实施例3的培养基和实施例6的培养方法培养骨肉瘤类器官。即与实施例6的区别在于培养的组织样本为骨肉瘤组织。培养得到的类器官图片如图9所示。
由实施例1～6与对比例1～6得到的类器官对比可知，本发明实施例1～3的脂肪肉瘤培养基组分相互作用，在其整体作用效果下，本发明实施例4～6获得了稳定的脂肪肉瘤类器官，得到的脂肪肉瘤类器官具备囊性类器官结构和成纤维细胞样细胞组分，并且能够在体外进行长期培养和有效的扩增、传代。而对比例1～6中的培养基缺少本发明中的某一种组分或采用相似组分替代本发明的组分时，便不具有本发明良好的培养效果。此外，由对比例7可知，本发明的培养基对脂肪肉瘤类器官具有专属性，其他肿瘤类器官不具有脂肪肉瘤类器官的培养效果。
传代测试：
采用实施例6的培养方法，分别使用实施例3、对比例1的培养基进行培养。其中实施例1的培养基在传代至P5代仍具保持良好的类器官形态和扩增能力，如图10所示；而对比例1的培养基传至P1代左右，类器官形态开始出现明显萎缩，增殖能力明显减弱，如图11所示。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种脂肪肉瘤类器官培养基，其特征在于，包括基础培养基、基础营养因子、特异性添加因子和添加试剂；
所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：1-5mg/ml的亚油酸-牛血清白蛋白，0.1x-2x的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，0.5x-2x的不含维生素A的B27，1-5mM的Glutamine，1％-2％的MEM非必需氨基酸；
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：10-50ng/ml的PDGF-BB，10-50ng/ml的EGF，500-1000ng/ml的R-spondin1，20-100ng/ml的WNT3a；
所述添加试剂包括以下终浓度的组分：10-100nM的地塞米松，20-100μg/ml的抗坏血酸-2磷酸酯，10μM的ROCK抑制剂Y-27632，1％的P/S。
2.根据权利要求1所述脂肪肉瘤类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
3.根据权利要求1所述的脂肪肉瘤类器官培养基，其特征在于，所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：
1mg/ml的亚油酸-牛血清白蛋白，1x的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，1x的不含维生素A的B27，2mM的Glutamine，1％的MEM非必需氨基酸；
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：10ng/ml的PDGF-BB，10ng/ml的EGF，500ng/ml的R-spondin1，100ng/ml的WNT3a；
所述添加试剂包括以下终浓度的组分：10nM的地塞米松，100nM的抗坏血酸-2磷酸酯，10μM的ROCK抑制剂Y-27632，1％的P/S。
4.根据权利要求1所述的脂肪肉瘤类器官培养基，其特征在于，所述脂肪肉瘤类器官培养基的制备方法为将基础营养因子、特异性添加因子和添加试剂添加到基础培养基中，混合均匀。
5.一种脂肪肉瘤类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：对获取的脂肪肉瘤组织样本进行预处理，得到脂肪肉瘤细胞；
步骤2：用DMEM/F12培养基重悬步骤1得到的细胞，离心后再用DMEM/F12和Matrigel的混合液重悬细胞后得到细胞悬液，将细胞悬液种胶滴；在37℃孵育20～40min待胶滴固化后，加入权利要求1～4任意一项所述的脂肪肉瘤类器官培养基，于37℃，5％CO2的恒温培养箱中维持培养。
步骤3：每隔3-5天更换一次脂肪肉瘤类器官培养基，每隔7-10天进行类器官传代。
6.根据权利要求5所述的脂肪肉瘤类器官的培养方法，其特征在于，步骤1中预处理方式为用HBSS缓冲液或生理盐水对组织样本进行多次洗涤去除血水，然后进行剪切、消化和过滤，除去细胞杂质。
7.根据权利要求5所述的脂肪肉瘤类器官的培养方法，其特征在于，其特征在于，步骤2混合液中DMEM/F12和Matrigel混合比例为1：1.5～2。
8.根据权利要求5所述的脂肪肉瘤类器官的培养方法，其特征在于，步骤2中种胶滴的细胞密度为104-105个细胞/30μL。
9.根据权利要求5所述的脂肪肉瘤类器官的培养方法，其特征在于，步骤3中传代的方法为使用TrypLE消化液消化脂肪瘤类器官，37℃温度下消化5-10min，用3-5倍消化液体积的DMEM/F12培养基终止消化后，离心收集细胞，用DMEM/F12和Matrigel的混合液重悬细胞后得到细胞悬液，将细胞悬液种胶滴，种胶滴的细胞密度为104-105个细胞/30μL。
10.一种脂肪肉瘤类器官，其特征在于，采用权利要求1～4任意一项所述脂肪肉瘤类器官培养基或使用权利要求5～9任意一项所述脂肪肉瘤类器官的培养方法培养获得。
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