CN113215102A - 一种类器官的培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种类器官的培养基，包括如下原料：基础培养基，蛋白溶液，抗氧化添加剂，胰岛素，转铁蛋白；基础培养基的浓度为1‑10mM，所述蛋白溶液在基础培养基中的浓度为80μM，所述胰岛素在基础培养基中的浓度为2μM，所述转铁蛋白在基础培养基中的浓度为70nM，所述抗氧化添加剂在基础培养基中的浓度为5μM；本发明还公开了一种类器官的培养方法，包括如下步骤：将微孔芯片置于胸水中，富集肿瘤细胞，进行二维培养，培养结束后制得培养细胞，转移至类器官的培养基中进行三维培养；本发明培养基能够实现肿瘤细胞快速扩增成为类器官，而且能够防止肿瘤代谢旺盛，产生的氧自由基并对细胞造成伤害，降低细胞活力，引起分化。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤器官培养技术领域，具体为一种类器官的培养基及培养方法。
背景技术
干细胞研究领域取得的关键进展之一就是类器官体系的发展。类器官属于三维(3D)细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性。此类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。含有成体干细胞的组织样本、单一成体干细胞或者通过多能干细胞的定向诱导分化都能够产生类器官。由于部分类器官模型系统特征是具有活性干细胞群的存在，类器官能够极大地实现扩增。例如，在5到6周的时间内，一个单一祖细胞能够产生高达1×106个肝脏类器官，为研究人员提供了研究各种器官的高度可靠和可扩展的平台。
目前类器官培养主要集中在肿瘤组织，体液来源的报道较少。
发明内容
为了克服上述的技术问题，本发明提供一种类器官的培养基及培养方法。
本发明所要解决的技术问题：
现有的培养基在用于体外肿瘤细胞培养时肿瘤代谢旺盛，会产生氧自由基并对细胞造成伤害，降低细胞活力，引起分化、凋亡。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种类器官的培养基，包括如下原料：基础培养基，蛋白溶液，抗氧化添加剂，胰岛素，转铁蛋白；
所述抗氧化添加剂包括如下步骤制成：
步骤S1、将干燥后的鱼肉粉碎研磨，通过石油醚脱脂，脱脂结束后在35-50℃下干燥1h，制得肉蛋白，将肉蛋白和去离子水按照1∶10的重量比混合均匀，磁力搅拌10min，45-50℃水浴加热，滴加质量分数10％稀盐酸调节pH，直至pH＝6.5，加入蛋白酶，匀速搅拌并维持体系的pH＝6.5，磁力搅拌2h后升温至100℃，在此温度下加热5min，滴加质量分数10％葡萄糖水溶液，滴加结束后磁力搅拌5min，调节pH＝5，保温并匀速搅拌30min，反应结束后冷却至室温，制得初料，控制肉蛋白、蛋白酶和葡萄糖水溶液的重量比为1∶2∶10；
步骤S2、将海藻酸钠和壳聚糖加入去离子水中，搅拌均匀，制得溶液a，将步骤S1制得的初料加入溶液a中，以150-250r/min的转速磁力搅拌并超声，控制超声的功率为50-60W，超声2h，制得混合液，离心、过滤、烘干，制得抗氧化添加剂，控制海藻酸钠、壳聚糖和去离子水的用量比为5g∶5g∶20mL，初料和溶液a的用量比为2g∶30mL；
步骤S1中将鱼肉研磨脱脂，制备出一种肉蛋白，之后将肉蛋白进行酶解，制备之后调节体系为酸性，滴加质量分数10％葡萄糖水溶液，制备出一种初料，该初料为一种多肽，具有优异的抗氧化性能；步骤S2中将海藻酸钠和壳聚糖加入水中，制备出溶液a，之后加入初料，制备出抗氧化添加剂，该抗氧化添加剂为一种海藻酸钠和壳聚糖为包覆料，初料为核的复合结构，达到一种缓释抗氧化的作用。
进一步地，所述蛋白溶液为一型胶原、四型胶原和醋酸溶液溶解后制成的溶液，一型胶原、四型胶原和醋酸溶液的重量比为1∶1∶10。
进一步地，所述一型胶原的浓度为12-18mg/mL，所述四型胶原的浓度为0.1-1mg/mL，所述醋酸溶液的浓度为10-12mg/mL。
进一步地，所述基础培养基的浓度为1-10mM，所述蛋白溶液在基础培养基中的浓度为80μM，所述胰岛素在基础培养基中的浓度为2μM，所述转铁蛋白在基础培养基中的浓度为70nM，所述抗氧化添加剂在基础培养基中的浓度为5μM。
一种类器官的培养方法，包括如下步骤：
将孔径为7-20μm的微孔芯片置于胸水中，富集肿瘤细胞，在含氧量为2-6％的环境下进行二维培养，培养结束后制得培养细胞，转移至类器官的培养基中进行三维培养。
本发明的有益效果：
本发明制备出一种类器官培养基，包括基础培养基，蛋白溶液，抗氧化添加剂等材料，抗氧化添加剂在制备过程中步骤S1中将鱼肉研磨脱脂，制备出一种肉蛋白，之后将肉蛋白进行酶解，制备之后调节体系为酸性，滴加质量分数10％葡萄糖水溶液，制备出一种初料，该初料为一种多肽，具有优异的抗氧化性能；步骤S2中将海藻酸钠和壳聚糖加入水中，制备出溶液a，之后加入初料，制备出抗氧化添加剂，该抗氧化添加剂为一种海藻酸钠和壳聚糖为包覆料，初料为核的复合结构，达到一种缓释抗氧化的作用；本发明培养基一方面能够实现肿瘤细胞快速扩增成为类器官，另一方面能够防止肿瘤代谢旺盛，产生的氧自由基并对细胞造成伤害，降低细胞活力，引起分化。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种类器官的培养基，包括如下原料：基础培养基，蛋白溶液，抗氧化添加剂，胰岛素，转铁蛋白；
一种类器官的培养方法，包括如下步骤：
将孔径为10μm的微孔芯片置于胸水中，富集肿瘤细胞，在含氧量为5％的环境下进行二维培养，培养结束后制得培养细胞，转移至类器官的培养基中进行三维培养。
抗氧化添加剂包括如下步骤制成：
步骤S1、将干燥后的鱼肉粉碎研磨，通过石油醚脱脂，脱脂结束后在35℃下干燥1h，制得肉蛋白，将肉蛋白和去离子水按照1∶10的重量比混合均匀，磁力搅拌10min，50℃水浴加热，滴加质量分数10％稀盐酸调节pH，直至pH＝6.5，加入蛋白酶，匀速搅拌并维持体系的pH＝6.5，磁力搅拌2h后升温至100℃，在此温度下加热5min，滴加质量分数10％葡萄糖水溶液，滴加结束后磁力搅拌5min，调节pH＝5，保温并匀速搅拌30min，反应结束后冷却至室温，制得初料，控制肉蛋白、蛋白酶和葡萄糖水溶液的重量比为1∶2∶10；
步骤S2、将海藻酸钠和壳聚糖加入去离子水中，搅拌均匀，制得溶液a，将步骤S1制得的初料加入溶液a中，以150r/min的转速磁力搅拌并超声，控制超声的功率为50W，超声2h，制得混合液，离心、过滤、烘干，制得抗氧化添加剂，控制海藻酸钠、壳聚糖和去离子水的用量比为5g∶5g∶20mL，初料和溶液a的用量比为2g∶30mL；
蛋白溶液为一型胶原、四型胶原和醋酸溶液溶解后制成的溶液，一型胶原、四型胶原和醋酸溶液的重量比为1∶1∶10。
一型胶原的浓度为12mg/mL，所述四型胶原的浓度为0.1mg/mL，所述醋酸溶液的浓度为10mg/mL。
基础培养基的浓度为1mM，所述蛋白溶液在基础培养基中的浓度为80μM，所述胰岛素在基础培养基中的浓度为2μM，所述转铁蛋白在基础培养基中的浓度为70nM，所述抗氧化添加剂在基础培养基中的浓度为5μM。
实施例2
一种类器官的培养基，包括如下原料：基础培养基，蛋白溶液，抗氧化添加剂，胰岛素，转铁蛋白；
一种类器官的培养方法，包括如下步骤：
将孔径为10μm的微孔芯片置于胸水中，富集肿瘤细胞，在含氧量为5％的环境下进行二维培养，培养结束后制得培养细胞，转移至类器官的培养基中进行三维培养。
抗氧化添加剂包括如下步骤制成：
步骤S1、将干燥后的鱼肉粉碎研磨，通过石油醚脱脂，脱脂结束后在35℃下干燥1h，制得肉蛋白，将肉蛋白和去离子水按照1∶10的重量比混合均匀，磁力搅拌10min，50℃水浴加热，滴加质量分数10％稀盐酸调节pH，直至pH＝6.5，加入蛋白酶，匀速搅拌并维持体系的pH＝6.5，磁力搅拌2h后升温至100℃，在此温度下加热5min，滴加质量分数10％葡萄糖水溶液，滴加结束后磁力搅拌5min，调节pH＝5，保温并匀速搅拌30min，反应结束后冷却至室温，制得初料，控制肉蛋白、蛋白酶和葡萄糖水溶液的重量比为1∶2∶10；
步骤S2、将海藻酸钠和壳聚糖加入去离子水中，搅拌均匀，制得溶液a，将步骤S1制得的初料加入溶液a中，以150r/min的转速磁力搅拌并超声，控制超声的功率为50W，超声2h，制得混合液，离心、过滤、烘干，制得抗氧化添加剂，控制海藻酸钠、壳聚糖和去离子水的用量比为5g∶5g∶20mL，初料和溶液a的用量比为2g∶30mL；
蛋白溶液为一型胶原、四型胶原和醋酸溶液溶解后制成的溶液，一型胶原、四型胶原和醋酸溶液的重量比为1∶1∶10。
一型胶原的浓度为15mg/mL，所述四型胶原的浓度为0.5mg/mL，所述醋酸溶液的浓度为10mg/mL。
基础培养基的浓度为6mM，所述蛋白溶液在基础培养基中的浓度为80μM，所述胰岛素在基础培养基中的浓度为2μM，所述转铁蛋白在基础培养基中的浓度为70nM，所述抗氧化添加剂在基础培养基中的浓度为5μM。
实施例3
一种类器官的培养基，包括如下原料：基础培养基，蛋白溶液，抗氧化添加剂，胰岛素，转铁蛋白；
一种类器官的培养方法，包括如下步骤：
将孔径为10μm的微孔芯片置于胸水中，富集肿瘤细胞，在含氧量为5％的环境下进行二维培养，培养结束后制得培养细胞，转移至类器官的培养基中进行三维培养。
抗氧化添加剂包括如下步骤制成：
步骤S1、将干燥后的鱼肉粉碎研磨，通过石油醚脱脂，脱脂结束后在35℃下干燥1h，制得肉蛋白，将肉蛋白和去离子水按照1∶10的重量比混合均匀，磁力搅拌10min，50℃水浴加热，滴加质量分数10％稀盐酸调节pH，直至pH＝6.5，加入蛋白酶，匀速搅拌并维持体系的pH＝6.5，磁力搅拌2h后升温至100℃，在此温度下加热5min，滴加质量分数10％葡萄糖水溶液，滴加结束后磁力搅拌5min，调节pH＝5，保温并匀速搅拌30min，反应结束后冷却至室温，制得初料，控制肉蛋白、蛋白酶和葡萄糖水溶液的重量比为1∶2∶10；
步骤S2、将海藻酸钠和壳聚糖加入去离子水中，搅拌均匀，制得溶液a，将步骤S1制得的初料加入溶液a中，以150r/min的转速磁力搅拌并超声，控制超声的功率为50W，超声2h，制得混合液，离心、过滤、烘干，制得抗氧化添加剂，控制海藻酸钠、壳聚糖和去离子水的用量比为5g∶5g∶20mL，初料和溶液a的用量比为2g∶30mL；
蛋白溶液为一型胶原、四型胶原和醋酸溶液溶解后制成的溶液，一型胶原、四型胶原和醋酸溶液的重量比为1∶1∶10。
一型胶原的浓度为16mg/mL，所述四型胶原的浓度为0.8mg/mL，所述醋酸溶液的浓度为12mg/mL。
基础培养基的浓度为8mM，所述蛋白溶液在基础培养基中的浓度为80μM，所述胰岛素在基础培养基中的浓度为2μM，所述转铁蛋白在基础培养基中的浓度为70nM，所述抗氧化添加剂在基础培养基中的浓度为5μM。
实施例4
一种类器官的培养基，包括如下原料：基础培养基，蛋白溶液，抗氧化添加剂，胰岛素，转铁蛋白；
一种类器官的培养方法，包括如下步骤：
将孔径为10μm的微孔芯片置于胸水中，富集肿瘤细胞，在含氧量为5％的环境下进行二维培养，培养结束后制得培养细胞，转移至类器官的培养基中进行三维培养。
抗氧化添加剂包括如下步骤制成：
步骤S1、将干燥后的鱼肉粉碎研磨，通过石油醚脱脂，脱脂结束后在35℃下干燥1h，制得肉蛋白，将肉蛋白和去离子水按照1∶10的重量比混合均匀，磁力搅拌10min，50℃水浴加热，滴加质量分数10％稀盐酸调节pH，直至pH＝6.5，加入蛋白酶，匀速搅拌并维持体系的pH＝6.5，磁力搅拌2h后升温至100℃，在此温度下加热5min，滴加质量分数10％葡萄糖水溶液，滴加结束后磁力搅拌5min，调节pH＝5，保温并匀速搅拌30min，反应结束后冷却至室温，制得初料，控制肉蛋白、蛋白酶和葡萄糖水溶液的重量比为1∶2∶10；
步骤S2、将海藻酸钠和壳聚糖加入去离子水中，搅拌均匀，制得溶液a，将步骤S1制得的初料加入溶液a中，以150r/min的转速磁力搅拌并超声，控制超声的功率为50W，超声2h，制得混合液，离心、过滤、烘干，制得抗氧化添加剂，控制海藻酸钠、壳聚糖和去离子水的用量比为5g∶5g∶20mL，初料和溶液a的用量比为2g∶30mL；
蛋白溶液为一型胶原、四型胶原和醋酸溶液溶解后制成的溶液，一型胶原、四型胶原和醋酸溶液的重量比为1∶1∶10。
一型胶原的浓度为17mg/mL，所述四型胶原的浓度为0.9mg/mL，所述醋酸溶液的浓度为12mg/mL。
基础培养基的浓度为9mM，所述蛋白溶液在基础培养基中的浓度为80μM，所述胰岛素在基础培养基中的浓度为2μM，所述转铁蛋白在基础培养基中的浓度为70nM，所述抗氧化添加剂在基础培养基中的浓度为5μM。
实施例5
一种类器官的培养基，包括如下原料：基础培养基，蛋白溶液，抗氧化添加剂，胰岛素，转铁蛋白；
一种类器官的培养方法，包括如下步骤：
将孔径为10μm的微孔芯片置于胸水中，富集肿瘤细胞，在含氧量为5％的环境下进行二维培养，培养结束后制得培养细胞，转移至类器官的培养基中进行三维培养。
抗氧化添加剂包括如下步骤制成：
步骤S1、将干燥后的鱼肉粉碎研磨，通过石油醚脱脂，脱脂结束后在35℃下干燥1h，制得肉蛋白，将肉蛋白和去离子水按照1∶10的重量比混合均匀，磁力搅拌10min，50℃水浴加热，滴加质量分数10％稀盐酸调节pH，直至pH＝6.5，加入蛋白酶，匀速搅拌并维持体系的pH＝6.5，磁力搅拌2h后升温至100℃，在此温度下加热5min，滴加质量分数10％葡萄糖水溶液，滴加结束后磁力搅拌5min，调节pH＝5，保温并匀速搅拌30min，反应结束后冷却至室温，制得初料，控制肉蛋白、蛋白酶和葡萄糖水溶液的重量比为1∶2∶10；
步骤S2、将海藻酸钠和壳聚糖加入去离子水中，搅拌均匀，制得溶液a，将步骤S1制得的初料加入溶液a中，以150r/min的转速磁力搅拌并超声，控制超声的功率为50W，超声2h，制得混合液，离心、过滤、烘干，制得抗氧化添加剂，控制海藻酸钠、壳聚糖和去离子水的用量比为5g∶5g∶20mL，初料和溶液a的用量比为2g∶30mL；
蛋白溶液为一型胶原、四型胶原和醋酸溶液溶解后制成的溶液，一型胶原、四型胶原和醋酸溶液的重量比为1∶1∶10。
一型胶原的浓度为18mg/mL，所述四型胶原的浓度为1mg/mL，所述醋酸溶液的浓度为12mg/mL。
基础培养基的浓度为10mM，所述蛋白溶液在基础培养基中的浓度为80μM，所述胰岛素在基础培养基中的浓度为2μM，所述转铁蛋白在基础培养基中的浓度为70nM，所述抗氧化添加剂在基础培养基中的浓度为5μM。
对比例1
本对比例为普通RPMI-1640培养基。
在实施例1-4和对比例1作为培养基的培养条件下，测试P1代类器官的形成率，P0带类器官的单细胞5x104与基质胶混合后铺在预先湿润的24孔板中，在37摄氏度静止10分钟后，待基质胶固化后，分别在不同孔中加入1mL实施例1-4和对比例1培养基。分别在培养的第五天和第七天记录扩增的类器官数目。
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 对比例1 | |
| 第五天/孔 | 672 | 680 | 675 | 678 | 168 |
| 第七天/孔 | 780 | 785 | 783 | 783 | 210 |
从上表中能够看出实施例1-4在第五天为672-680/孔，在第七天为780-785/孔；对比例1在第五天为168/孔，在第七天为210/孔；所以本发明培养基一方面能够实现肿瘤细胞快速扩增成为类器官，另一方面能够防止肿瘤代谢旺盛，产生的氧自由基并对细胞造成伤害，降低细胞活力，引起分化。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种类器官的培养基，其特征在于，包括如下原料：基础培养基，蛋白溶液，抗氧化添加剂，胰岛素，转铁蛋白；
所述抗氧化添加剂包括如下步骤制成：
步骤S1、将干燥后的鱼肉粉碎研磨，通过石油醚脱脂，脱脂结束后在35-50℃下干燥1h，制得肉蛋白，将肉蛋白和去离子水按照1∶10的重量比混合均匀，磁力搅拌10min，45-50℃水浴加热，滴加质量分数10％稀盐酸调节pH，直至pH＝6.5，加入蛋白酶，匀速搅拌并维持体系的pH＝6.5，磁力搅拌2h后升温至100℃，在此温度下加热5min，滴加质量分数10％葡萄糖水溶液，滴加结束后磁力搅拌5min，调节pH＝5，保温并匀速搅拌30min，反应结束后冷却至室温，制得初料，控制肉蛋白、蛋白酶和葡萄糖水溶液的重量比为1∶2∶10；
步骤S2、将海藻酸钠和壳聚糖加入去离子水中，搅拌均匀，制得溶液a，将步骤S1制得的初料加入溶液a中，以150-250r/min的转速磁力搅拌并超声，控制超声的功率为50-60W，超声2h，制得混合液，离心、过滤、烘干，制得抗氧化添加剂，控制海藻酸钠、壳聚糖和去离子水的用量比为5g∶5g∶20mL，初料和溶液a的用量比为2g∶30mL。
2.根据权利要求1所述的一种类器官的培养基，其特征在于，所述蛋白溶液为一型胶原、四型胶原和醋酸溶液溶解后制成的溶液，一型胶原、四型胶原和醋酸溶液的重量比为1∶1∶10。
3.根据权利要求2所述的一种类器官的培养基，其特征在于，所述一型胶原的浓度为12-18mg/mL，所述四型胶原的浓度为0.1-1mg/mL，所述醋酸溶液的浓度为10-12mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种类器官的培养基，其特征在于，所述基础培养基的浓度为1-10mM，所述蛋白溶液在基础培养基中的浓度为80μM，所述胰岛素在基础培养基中的浓度为2μM，所述转铁蛋白在基础培养基中的浓度为70nM，所述抗氧化添加剂在基础培养基中的浓度为5μM。
5.根据权利要求1所述的一种类器官的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
将孔径为7-20μm的微孔芯片置于胸水中，富集肿瘤细胞，在含氧量为2-6％的环境下进行二维培养，培养结束后制得培养细胞，转移至类器官的培养基中进行三维培养。
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