JPH06509476A - 生物学的人工肝臓 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的人工肝臓 本発明は人工臓器に関し、さらに詳しくは肝細胞培養のための肝臓バイオリアク ターおよびその使用法に関する。

関連技術 もし有効な肝臓援助システムが存在するなら、それは移植への橋渡しになるであ ろう。肝臓移植を待っている多くの患者は慢性肝不全であるが、肝昏睡ショック におちいってはいない。急性肝不全の患者を助けるために種々の肝臓援助システ ムか使用されてきたが、これらの試みの多くはうまく入っていない。

過去１０年間に肝臓援助の分野に換型血漿分離技術を用いる方法が導入され、肝 潅流、肝臓濾過、および透析なとの従来法も改良されてきている。しかし最新の 肝臓援助技術を応用しても急性肝不全の患者の生存率は改善されていない。その 原因は多くの場合、肝不全の病理に対する我々の理解か不充分なためである。

−力先疫学や外科技術の進歩により、肝臓移植は致命的な肝疾患の１つの治療法 として確立されてきている。

しかし肝臓の再生力はほとんど無限であることを認識する必要かある。肝障害か ウィルス、中毒または外傷が原因であっても、肝臓は普通２週間位で生命か維持 できる程度の充分な機能を回復する。ただし生命を維持するのに充分に急速に肝 臓の再生が起きない劇症肝炎や、肝臓の再生の起きない末期肝硬変は別である。

タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｔ）ら、「最新の人工肝臓」（”Ａｒｔｉｆｉ ｃａｉｌ　１ｉｖｅｒｓｔａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｒｔ”）、Ｄｉｇｅｓｔｉ ｖｅ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ａｎｄｓｃｉｅｎｃｅｓ、３６巻、９号（１９９１年 ９月号）、＋３２７−１３４０頁を参照。

これらの理由のため人工肝臓の利点は、当該分野において充分認識されている。

ジョレグイ （ＪＡＵＲＥＧＵＩ、Ｈ，Ｏ，）　ら、　「ハイブリッド人工肝臓Ｊ　（”Ｈｙ ｂｒｉｄ　ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＬｉｖｅｒ”）、ジシャー（Ｓｚｙｃｈｅｒ、 Ｎ、）編、Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ。

Ｍｅｔａｌｓ、　ａｎｄ　Ｏｔｈｅｒ Ｃｏｍｐｏｓ　ｉ　ｔｅｓ、ランカスター（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）、ペンシルバ ニア州、テクノミンク出版（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ　Ｐｕｂ、）１９８３．９０７ −９２８頁、マツムラ（Ｍａ　ｔ　ｓ　ｕｍｕ　ｒ　ａ）、米国特許３，７３４ ，８５１号を参照。

肝臓の機能を果たすいくつかの装置か提唱されている。

ハガー （Ｈａｇｇａｒ）ら、「人工毛細管上での新生児肝細胞の培養、薬物代謝と人工 肝臓のモデル」（Ｎｅｏｎａｔａｌ　ＨｅｐａｔｏｃｙｔｅＣｕｌｔｕｒｅ　ｏ ｎ　ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＣａｐｉｌｌａｒｉｅｓ、Ａ　Ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒＤ ｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　ｔｈｅＡｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｌｉｖ ｅｒ”）、アサイオ（ＡＳＡＩＯＪ、）、６：２６−３５　（１月号／３月号１ ９８３）、ジョレグイ（Ｊａｕｒｅｇｕｉ、Ｈ。

０、）ら、「人工バイブリッド肝臓の細胞成分としての成体ラット肝細胞の培養 」　じＡｄｕｌｔ　ＲａｔＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ａｓｔｈ ｅ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆａｎ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ 　Ｈｙｂｒｉｄｌ、１ｖｅｒ”）、およびボール（Ｐａｕｌ、Ｊ、）纏、Ｂｉｏ ｍａｔｅｒｉａｌｓ　１ｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｏｒｇａｎｓ、マクミラン（ＭａｃＭｉｌｌａｎ）、１ ９８３．１３１−１４０頁は、カートリッジ中の中空で半透性のファイバーの外 表面上およびその壁中で肝細胞（健康な肝細胞）を増殖させた実験を記載してい る。後者の実験は、肝細胞の接種の前にファイバーをコラーゲンで処理すること により接着が改良されることを示唆している。ジョレグ（Ｊａｕｒｅｇｕ）の米 国特許５，０４３，２６０号は、肝細胞を増殖させ維持するための潅流装置を開 示している。これは肝細胞コンパートメントから潅流コンパートメントを分離す るための多孔膜を含み、肝細胞コンパートメント中でバイオポリマー支持体に肝 細胞を結合させるためにオリゴサツカライドレクチン認識結合を使用している。

デメトリオウ（Ｄｅｍｅ　ｔ　ｒ　１ｏｕ）ら、［肝細胞移植と体外肝臓支持の 新しい方法」　（ＮｅｗＭｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ＨｅｐａｔｏｃｙｔｅＴｒａｎｓ ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄＥｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ　ＬｉｖｅｒＳｕ ｐｐｏｒピ）　、Ａｎｎ、　Ｓｕｒｇ、　Ｓｅｐ、、２５９−２７１頁、１９８ ６は、コラーゲン被覆マイクロキャリアーに肝細胞を結合させ、これをクロマト グラフィーカラムに入れ、次に潅流するという技術を示している。

ヨーロッパ特許出願９０４０１５８号は、肝細胞と合成高分子膜の層との間の接 着を引き起こすために細胞培養基質を用いる方法を開示している。リー（Ｌ　ｉ 　ｅ）ら、［ブタにおける新しい人工肝臓装置による肝細胞昏睡の治療の成功Ｊ 　（”ＳｕｃｃｅｓｓｆｕｌＴｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｔ　Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｃｏｍａ　ｂｙ　ａ　Ｎｅｗ　ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＬｉｖｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ 　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｉｃ″）、Ｒｅｓ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、（１９８５）１８５． ４８３−４９２は、潅流チャンバー中の多孔膜により支持される肝臓片または肝 臓キューブの使用について記載している。

ウルツとムンケルト（Ｗｏ　１　ｆ、Ｆ、Ｗ、、　ａｎｄＭｕｎｋｅ　Ｉ　ｔ、 Ｂ、Ｅ、）、「培養細胞と合成毛細管で構成される人工肝臓によるビリルビン結 合」（’Ｂ１１１ｒｕｂｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｂｙ　ａｎ　Ａｒ１ｔｉ ｆｉｃｉａｌ　ＬｉｖｅｒＣｏｍｐｏｓｅｄ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｄＣｅｌｌ ｓ　ａｎｄ　ａ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃＣａｐｉｌｌａｒｉｅｓ”）、２１巻、Ｔ ｒａｎｓ。

Ａｍｅｒ、Ｓｏｃ、Ａｒｔｉｆ、Ｉｎｔ、Ｏｒｇａｎｓ。

１９７５．１６−２３は、ラットの肝癌（腫瘍性肝）細胞を中空の半透性ファイ バーとカートリジの間に置き、これらのファイバーに血液を流し、肝癌細胞によ り治療した実験について記載している。そのような中空ファイバー装置ではファ イバーは患者の免疫防御システムからこれらの細胞を単離するために使用され、 毒性物質の輸送を可能にする孔径を有している。カイ（Ｃａｉ、Ｚ）ら、「生体 人工肝臓支持体のためのマイクロカプセル化物肝細胞Ｊ　（Ｍｉｃｒｏｅｎｃａ ｐｓｕｌａｔｅＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｆｏｒ　Ｂｉｏ−Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ 　Ｌｉｖｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ″）　、Ａｒ　ｔ　ｉ　ｆ、Ｏｒｇａｎｓ。

１２　：　３８８−３９３．１９８８は、アルギニン−ポリリジン膜中に肝細胞 をカプセル化し肝支持装置として用いる方法を記載している。

発明の要約 本発明は、潅流入口手段と潅流出口手段を有する閉じ込め容器（ｃｏｎｔａｉｎ ｍｅｎｔ　ｖｅｓｓｅｌ）；マトリックスの潅流をしながら該閉じ込め容器中に 肝細胞凝集物を捕捉するための閉じ込め容器内の該マトリックスよりなる、肝細 胞バイオリアクターまたは生体人工肝臓である。

本発明の目的は、肝細胞バイオリアクターおよびその作成法を与えることである 。

本発明の別の目的は、肝臓支持体が必要な患者を治療するための装置と方法を与 えることである。

本発明のさらに別の目的は、代謝物および他の肝細胞産生物の産生のための装置 と方法を与えることである。

本発明の別の目的は、肝細胞との化学的相互作用を研究するための装置を与える ことである。

本発明の利点は、３次元の細胞−細胞接触により細胞凝集物として肝細胞を培養 することにより、先行技術に比較して細胞の生育活性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）と 肝細胞分化能を維持しながら肝細胞濃度を増加させることができることである。

本発明のさらに別の利点は、目的の培地に直接および調節しながら肝細胞を接触 させることができることである。

本発明のさらに別の利点は、非ヒト肝細胞を用いるヒトの治療に体外肝臓持体を 与えることである。非ヒト肝細胞と患者の血液細胞との接触を意図的に避けるこ とにより、非ヒト肝細胞に対する患者の免疫応答の可能性を最小にすることかで きる。

本発明は必要な肝細胞の量に応じてスケールを変更することかできることは、さ らに別の利点である。

本発明の他の目的および利点は、添付の図面とともに以下の記載を考慮すれば明 らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の肝細胞バイオリアクターの模式図である。

図２は、代謝物産生のための肝細胞バイオリアクターの使用法を示すフローダイ アグラムである。

図３は、肝補助の必要な患者に接続した図１の肝細胞バイオリアクターを示すフ ローダイアグラムである。

好適な実施態様の説明 図１には、肝細胞凝集物を捕捉するための支持体マトリックス（６）を収容する 閉じ込め容器（１）よりなる肝細胞バイオリアクターを示す。閉じ込め容器（１ ）は、ガラス性の底（２）と蓋（３）よりなる。底（２）には、肝細胞凝集物の 捕捉のためのマトリックスとなるガラスピーズ（６）を保持する垂直の部分に結 合したガラス棒（５）を有する１つのＬ形の潅流出口（４）が付いている。蓋（ ３）には、ガラスピーズ（６）を保持する垂直の部分に結合したガラス棒（５） を有する１つのＬ形の潅流入口（ア）が付いている。さらに蓋（３）に付いてい るのは、１つのゴム管（１１）を育するガラス管（９）に付いている金属性のル アーロック部品（ｌｕｅｒ−１ｏｃｋ　ｆｉｔｔｉｎｇ）（１０）を有する蓋（ ３）に結合したガラス管（９）よりなる細胞注入口（８）である。注入口（７） は、ホースの締め具（１２）を用いて閉じることができる。底（２）と蓋（３） はいっしょに保持され、０リング（１３）と０リングガラスジヨイント締め具（ １４）を用いて密封される。０リングの張力は、張力調製つまみ（１５）を回転 させることにより上げることかできる。好適な実施態様においては、バイオリア クター、マトリックスおよび他の部分を作成するのにガラスか使用されるが、材 質がバイオリアクターの機能や肝細胞の生育活性を妨害しない限りは他の材質を 使用することもできる。

製造方法と使用法 閉じ込め容器（１）は、標準適合性の０リングガラスジヨイントから作成された 底（２）と蓋（３）を有する。

０リングガラスンヨイントの内径は任意である。底半分は、ガラスピーズまたは 選択された内径を有するマトリックス（６）の容積を保持するのに充分な長さで ある必要かある。支持体マトリックスの容積は、添加される肝細胞またはその凝 集物の数に依存する。肝細胞の密度は、少なくとも３ＸＩＯ’細胞／ｍｌである が、最適に近いのは６．７０ＸＩＯ”細胞／ｍｌマトリックスである。

潅流入口（７）と潅流出口（４）は、パイレックスガラス管より作成される。ガ ラスピーズが、ガラス捧（５）とガラス管（４）またはガラス管（７）の間の角 張ったスペースに入らないように、ガラス捧保持容器（５）は充分な径を有して いなければならない。肝細胞注入口（８）のルアーロック部品（ｌＯ）は、フレ ーム滅菌を可能にするためにステンレススチールで作成される。ルアーロック部 品（１０）は、標準プラスチックルアーロック部品に適合するように作成される 。マトリックスまたはビーズ（６）はパイレックスガラスで作成され、ｌから３ ｍｌの間の任意の大きさであり、肝細胞凝集物の捕捉にはサイズの範囲１．４か ら１．７ｍｍ　（Ｎｏ、１４とＮｏ、Ｉ２メツシュのＩｎ’Ｊ）か好ましい。ガ ラスピーズの間に肝細胞凝集物を捕捉するのに他のタイプのマトリックスを使用 することもできる。好適なマトリックスは、潅流しなから肝細胞または凝集物の 捕捉を可能にするものであろう。

あるいは閉じ込め容器の底（２）は、標準のガラス管から作成される。前述した 他の特徴は同様に製造して、蓋（３）としてゴム栓（３）を使用することもでき る。

前述したバイオリアクター（図（１））は、図２の回路中にある時肝細胞代謝り アクタ−として使用することもてきる。その構成物は、再循環ペリスタポンプ（ １９）と酸素供給装置！（２ｏ）、ガス排出容器（２１）、ｐＨ検出器（２２） 、溶存酸素検出器（２３）　、および注入／サンプリング口（２４）である。こ れらすべての構成物は、所期の温度（好ましくは３７’Ｃ）でインキュベーター （２５）中に入れられる。新鮮な培地ビン（２６）、供給ポンプ（２７）　、生 成物分離容器（２８）、および生成物補集ビン（２９）は、インキュベーター（ ２５）の外に置かれる。

この装置は、まず供給ポンプ（２７）を用いてビン（２６）からライン（３０） を通して新鮮な培地か充填される。培地は、液体レベルが再循環返却ライン（３ １）より上になるまで、ガス排出容器（２１）中に流れる。液体の流れかライン （３１）　、検出器（２３）と（２２）の通過口（２４）を通り、底から閉じ込 め容器（１）を満たすように、再循環ポンプは活性化される。

空気は入口（７）、酸素供給装置（２０）を介して強制的に追い出され、ライン （３２）を通って容器（２１）中に入れられる。空気はライン（３３）から容器 （２８）に入る。装置が完全に液体で満たされるまで新鮮な培地か供給され、培 地が入口（７）から閉じ込め容器（１）に入ると、培地再循環の方向か逆転する 。空気は環状酸素供給装置（２０）を通して液体の流れと逆の方向に流される。

最初の酸素組成は空気に近い。溶存酸素濃度か空気の酸素濃度と平衡化すると、 再循環ポンプ（１９）が停止し、肝細胞または肝細胞凝集物はシリンジで装置の 注入口（８）に注入される。置換された容量はライン（３３）を通って装置から 出て容器（２８）に入る。細胞が注入されてから、定常状態の再循環流速より少 し遅い速度で再循環ポンプ（１９）か作動される。

こうして肝細胞またはその凝集物の大部分がガラスピーズ内に捕捉されるまで、 装置に培地および細胞か再循環される。次に捕捉された１００万の細胞当り１日 当り１ｍｌの培地に等しい速度で、ライン（３０）を介して容器（２６）から装 置に新鮮な培地か添加される。

化合物はいろいろな方法で導入される。１つの方法では、ビン（２６）の新鮮な 培地中の一定組成の供給物として導入することかできる。あるいは注入口（２６ ）を介して小塊として導入することもできる。代謝生成物はビン（２９）に捕捉 されるか、または注入口（２４）から試料を取って反応動力学を研究することも できる。化合物を肝細胞バイオリアクターに導入するのに当業者は多くの異なる 方法を使用することができる。導入される化合物は肝細胞との相互作用（例えば 最終代謝物または毒性）に関して研究されるか、または代謝物として他の化合物 の合成の基質として使用される。

肝細胞バイオリアクター（１）はまた、人工臓器供給補助肝臓として必要な患者 に使用することができる。この場合肝細胞バイオリアクターは図３に示すように 配置され、肝臓補助の必要な哺乳動物を治療するための肝臓補助システムを構成 する。

肝細胞バイオリアクター（１）はモジュール装置として考えることもでき、性能 を増加させるための同様の装置とともに使用される。この方法で潅流リアクター を使用するための必要な構成物は、以下の変更がある以外は前述したものと同様 である・ 再循環ポンプ（１９）は、個々の潅流リアクター（＋）からの培地の流れを等し くするために、複数ヘッドのペリスタポンプでなければならない；ガス排出容器 （３７）はまた、受は器として機能する；液が容器（２８）中に出るのを防ぐた めにライン（３３）に締め具（３４）を加える：ガス排出ビン（３７）中ではな く注入ライン（３６）に供給ライン（３５）が導入される。

この装置は最初、ライン（３０）を介してビン（２６）からの培地で満たされる 。この充填時間の間、締め具（３４）は開いており、締め具（３８）は閉じてい る。

ビン（３７）が再循環返却ライン（３１）より上まで培地で満たされると、再循 環ポンプ（１９）が活性化され、ライン（３１）を介して装置か充填され、ポン プ（１９）を介してリアクター（１９）の上部から空気か排出されて、ライン（ ３６）を介してガス排出ビン（３７）中にはいる。システムか培地で完全に充填 されてから、培地供給ポンプ（２７）は停止されポンプ（１９）を用いて培地再 循環の方向か逆転される。酸素供給装置（２０）の環状側に大気と同じ組成の空 気が添加される。培地か空気で飽和されたら再循環ポンプが停止され、肝細胞ま たは溶液中のあらかじめ形成されたその凝集物かシリンジを用いて注入口（８） を介してリアクター（１）に添加される。再循環ポンプが再び活性化され、生育 している肝細胞凝集物のほとんどがマトリックスまたはビーズ中に捕捉されるま で、細胞および溶液か装置内を再循環される。

肝細胞凝集物が捕捉されるまでの間、装置にビン（２６）から新鮮な培地を流し 込み生育していない細胞や他の破片を除去する。流し込みか完了してから締め具 （３４）を閉じ、締め具（３８）を開く。血液が患者（３９）から血液濃縮器を 介して流れ、この血液濃縮器中では、液体すなわち血漿（血液の非細胞成分また は濾液と呼ばれる）が血液から除去される。これは肝細胞またはその凝集物に対 する患者の免疫応答を最小にするために行われる。濃縮された血液または血液細 胞は血液濃縮器を出て血液混合容器（４１）に戻り、ここで濾液と再混合されて バイオリアクター装置から出るか、または直接患者に再導入される。濾液はライ ン（４２）を介して血液濃縮器（４０）を出て、濾液骨は器／ガス排出ビン（４ ３）に入る。ポンプ（４４）を用いて、濾液はライン（３５）を介してビン（４ ３）からライン（３６）を介して装置に入る。濾液は装置の中を流れ、まず酸素 供給装置（２０）を通過して上から閉じ込め容器に入り、底からりアクタ−を出 て受け器（３７）に戻る。再循環濾液の一部はライン（３５）を介して濾液入口 流に等しい容量で受け器（３７）に流れ、次にライン（４５）を介してバイオリ アクター回路を出て血液フィルター（４６）を通過し、容器（４１）中で濃縮血 液と再混合されるか、または直接患者に再導入される。

この装置は一般的に２つの回路（肝細胞バイオリアクター回路と患者側の回路） からなると考えることかできる。さらに２つの回路は受け器（３７）で接続され 、これはライン（３１）を介して肝細胞バイオリアクターから処理された非細胞 性血液成分を受け取る。これはライン（４５）を介して、処理された非細胞性血 液成分の一部の患者への流れを可能にし、またライン（３６）を介して肝細胞バ イオリアクターへ一部が戻るのを可能にする。こうして受け器（３７）は哺乳動 物の内または外への血液の流速と、肝細胞バイオリアクターの内または外への非 細胞性血液成分の流速を独立に制御することを可能にする。異なる流速は各回路 の最適性能を与えるため、この２つの流速の制御は好ましい。肝細胞バイオリア クターは、肝細胞に対する剪断力の障害を最小にして充分な酸素と栄養物を与え ることができる流速が必要である。

この流速は哺乳動物の血液の流速と同じであってもまたは異なってもよい。これ 以上説明しなくても当業者は、前記の記載から本発明を最大に利用することかで きる。

従って以下の説明は単に例示のためのみであり、本発明を限定するものではない ことを理解すべきである。

細胞凝集物の作成 肝細胞凝集物は２つの一般的な方法で作成することができる。培地（培地組成に ついては実施例１を参照）中の肝細胞をバイオリアクターを介して再循環するこ とにより、肝細胞は互いに接触し凝集物を形成し、最終的にマトリックスに捕捉 されるサイズになる。約２−５時間で約５０％の肝細胞か捕捉されるのが観察さ れた。約６−２４時間で約１００％の細胞が凝集物として捕捉されるてあろう。

肝細胞凝集物を作成する別の方法は、バイオリアクターの外に肝細胞［球状物質 Ｊ　（ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）を作成することである。肝細胞を、炭酸ガスインキ ュベーター（５％炭酸ガス、９５％の湿気を有する空気）中で）　回転台上のプ ラスチックまたはガラスシャーレ中に入れる。１分間３０サイクルの回転か効果 的であった。肝細胞は約２４時間で凝集した。そのような凝集物または球状物質 はバイオリアクターを通過し、マトリックスに捕捉される。

いずれかの方法で肝細胞を捕捉してからは、肝細胞は長時間（実施例１を参照） 高い生育活性を維持する。本発明の重要な利点は、凝集物は互いに結合部分を形 成し互いに連結されて、複数の肝細胞凝集物の間の細胞−細胞の連絡または接触 が可能になることである。この３次元の細胞−細胞接触と細胞間の連絡はインビ ボの肝臓に類似している。

本発明においてはヒト肝細胞も使用することができ、ある場合（例えば治療に対 する患者の免疫応答をさらにしい。しかし肝細胞凝集物として非ヒト肝細胞を使 用することができる。患者の血液細胞は肝細胞と接触しないようになっているた め、免疫応答は限定されるであろう。

従って非ヒト肝細胞は入手しやすいことから好ましく、さらに好ましくはウシ、 ヤギなどかあり、最も好ましくはブタである。

肝細胞バイオリアクターを維持するのに使用する培地は、肝細胞またはその凝集 物の生育活性を維持するのに必要な栄養物を含有する必要がある。培地は、基質 と呼ばれる化学物質、または代謝物と呼ばれる基質の代謝により形成される化学 物質を含有する。肝細胞バイオリアクターを体外支持装置として使用する時、肝 細胞凝集物を支持するのに必要な栄養物を供給するのに培地の代わりに哺乳動物 の非細胞性血液成分が使用することもできる。

以下の例は本発明を例示するための方法であり、決して本発明を限定するもので はない。本発明を実施するのに、以下の条件や方法の変法が可能であることは当 業者には容易に理解できるであろう。

例１ 肝細胞バイオリアクターでの肝細胞の培養（図１）ヘリ−とフレンド（Ｂｅｒｒ ｙ　ａｎｄＦｒｉｅｎｄ）、１９６９、「単離したラットの肝実質細胞の高収率 の調製」　じＨｉｇｈ−ｙｉｅｌｄｐｒｅｐａｒａｔｉｉｏｎ　ｏｆ　１ｓｏｌ ａｔｅｄｒａｔ　１ｉｖｅｒ　ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌｃｅｌｌｓ”）、Ｊ、Ｃ ｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、４３．　５０６−５２０のバイオプシーの方法に、変更（ ロレッツ（Ｌｏｒｅｔｚ）ら、「新たに調製した肝細胞および低温保存したラッ トの肝細胞によるプロ変異原活性化」じＰｒｏｍｕｔａｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔ ｉｏｎｂｙ　ｆｒｅｓｈｌｙ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒ ｖｅｄ　ｒａｔ ｈａｐａｔｏｃｙｔｅｓ”）、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｏｌ。

Ｍｕｔａｇ、１２：３３５−３４１；１９８８；　ｒラットおよびヒト肝細胞の 低温保存法の最適化」じＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔ　１ｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｆｏｒ　ｒａｔ　ａｎｄｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｃｙ ｔｅｓ″）、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ、１９；４８９−１９８；１９８９）を加 えて、スプレーゲート−レイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌ　ｅｙ）ラットから肝 細胞を単離した。これらの方法は参考のため本明細書中に引用されている。この 方法は２段階のコラゲナーゼ（０５％Ｗ／Ｖ、タイプ■）潅流法である。単離し た細胞集団はルーチンには、トリプシンブルー排除法により評価すると８０％以 上の生育活性を有していた。単離後、１１゜２ｍｇ／Ｉのアラニン、１２．８ｍ ｇ／Ｉのセリン、２４ｍｇ／ｌのアスパラギン、２ｇ／ｌの２脂肪酸ウシ血清ア ルブミン、０．１６８ｍｇ／ｍｌのアミルプリン酸、５ｍｇ／Ｉのオレイン酸、 ５ｍｇ／ｌのｄ、１−１−コレロール、０．３９３ｍｇ／ｌのデキサメタソン、 ７゜９ｍｇ／ｌのｄ−サイロキシン、０．０３ｍｇ／ｌのグルカゴン、２０Ｕ、 ／Ｉのインスリンおよび８４ｍｇ／ｌのゲンタマイシンを補足したウェイマウス （Ｗａ　ｙｍｏ　ｕ　ｔ　ｈ）　７５２／Ｌ培地中に再懸濁させた（グリーン（ Ｇｒｅｅｎ）ら、グリーン（Ｇｒｅｅｎ、Ｃ，Ｅ、）、セゴール（Ｓｅｇａ　１ １．Ｈ，Ｊ、）およびビアド（Ｂｙａｒｄ、Ｊ、Ｌ、）、＋７６−１８５（１９ ８１）、ラットの肝細胞の一次培養物のビロリジノンアルカロイドセネシ才二ン の代謝、細胞毒性および遺伝毒性（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ。

ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ａｎｄ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅｐｙｒｒｏｌｉｚｉｄｉｎｅ　ａｌｋ ａｌｏｉｄｓｅｎｅｃｉｏｎｉｎｅ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｓ　 ｏｆ　ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）、Ｔｏｘｉｃｏｌ、Ａｐｐｌ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、６０，１７６）ｏ細胞密度は約５ｘｔｏ＠細胞／ｍｌに調 整した。全部で約２００×ＩＯ“細胞をバイオリアクターに接種した。この数の 細胞に対して、バイオリアクターの大きさは内径２２ｍｍ。

高さ８３ｍｍであり、約３０ｍ１の径１．５ｍｍのパイレックスガラスビーズを 含有していた。バイオリアクターは前述したように接種前にあらかじめ少なくと も２４時間培地と平衡化させた。培地は４０ｍ１／分の速度で再循環させた。装 置中の総培地量は１５０ｍ１であった。

新しい培地は１日当り約２００ｍ１の速度で加えた。装置は温度調節インキュベ ーター中で３７°Ｃで維持した。

バイオリアクター中で培養した肝細胞の高い生育活性は、安定な酸素消費、尿素 産生およびアルブミン合成により証明された。これらの生育活性の代表的な数字 は表１に示す。化学的基質である７−エトキシクマリンを７−０Ｈ−クマリンへ 変換する能力により測定したいくつかの実験での、薬剤代謝の主要な酵素系であ るＰ−４５０混合機能オキシゲナーゼ活性は、表２に記載されている。

電子顕微鏡による試験は、凝集物中の細胞はインビボでの肝細胞の形態的特徴（ 小管（ｃａｎａｌｉｃｕｌｉ）、ペルオキシシーム（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｓ） 、広範な小胞体、細胞の密な接合および健常なミトコンドリア）を存しているこ とを示していた。さらにマトリックス中の凝集物は細胞−細胞接触により連結さ れていた。従ってこうしてバイオリアクター中で培養された肝細胞は、異種生物 物質（例えば薬剤）の代謝的運命または代謝物の大量産生の評価のいずれにも、 異種生物代謝の研究に適している。ここに記載した装置はまた、肝細胞により産 生されることか公知である生物分子の産生に使用することもできる。本装置はま た、化学毒性または薬剤毒性の研究に使用することができる。

例２ 体外肝支持装置としてのバイオリアクターの応用例１の方法を使用して非近交系 のヨークシャー／ホワイトのブタから取り出した肝臓の肝細胞を培養した。１匹 の肝臓から、高い（約８０％以上）生育活性を有する２０億から５０億の細胞が ルーチンに得られる。使用した培地は、実施例１に記載のホルモンを補足したウ ェイマウス（Ｗａ　ｙｍｏ　ｏ　ｕ　ｔ　ｈ）培地である。２０億から５０億の 細胞を入れるために、バイオリアクターを２つの閉じ込め容器にスケールアップ した。各閉じ込め容器の内径は４０ｍｍであり、高さは１０ｍｍである。直径約 ２ｍｍのガラスピーズと、閉し込め容器につき全部で２５０ｍ１のガラスピーズ を使用した。肝細胞の高い生育活性は安定な酸素消費速度（３６０ｍｌ／分）に より証明された（表３）。肝細胞接種約２時間後に、肝臓を除いたブタ（完全な 肝不室を模倣するために手術により肝臓を除去した）にバイオリアクターを取り 付けた。体外肝支持装置としてのバイオリアクターの応用を示す模式図を図３に 示す。左の大腿の動脈の血液をミンチツク（Ｍｉｎｔｅｃｈ）の血液濃縮器に導 いた。１２個のフリンジニレカス（ｆｒｉｎｇｅ　ｅｌｅｃａｔｈ）カニユーレ を大腿動脈に挿入し、ｌ／４インチのＰｖＣ管で血液濃縮器に接続した。血液濃 縮器により、血液は細胞を含まない限外濾過部分と血液細胞部分に分離された。

血液細胞画分は同様の管により大腿静脈に戻した。限外濾液は、ローラーポンプ を用いて４０ｍ１／分の調整した速度で、１／４インチ管により血液濃縮器より 出て肝細胞バイオリアクター装置に入った。バイオリアクターで潅流した後、限 外濾液は左の頚静脈を介して動物に戻した。体外肝代謝システムを証明するため に、肝臓で代謝されることが公知の２つの化学物質（７−エトキシクマリンとり ドナイン）を、バイオリアクターの注入口で限外濾液に添加した。限外濾液を動 物に戻す前に、バイオリアクターの出口で各代謝物（７−ＯＨクマリンとモノエ チルグリシンキシリダイド（ＭＥＧＸ））を測定した。７−エトキシクマリンと りドナインが両方ともかなり代謝されることが観察された（表４と５）。従って この結果は、バイオリアクターの支持装置としての応用性を示し、体外肝代謝を 提供することを示している。この装置は肝不全を有するヒトの患者の潅流に使用 することができる。血液細胞と血漿の分離は、肝細胞に対して受容者の免疫応答 を少なくするであろう。ヒトのドナー（例えば死体から得られた移植可能な肝臓 ）および非ヒトソース（例えばブタ）からの肝細胞は、体外肝支持を提供するた めのバイオリアクターに使用することができる。

当業者には前記の装置の変更や修飾に加えて、他の変更や修飾が可能であろう。

従って本発明の範囲は前記の各実施態様に限定されるものではなく、請求の範囲 により限定されるものである。

累ｆｉｆｍｇアルブミン 累積ｍｇ尿素又はμｌｏｚ摂取／分 表１ 表　１　＝　肝細胞バイオリアクターによる７−ニトキノクマリンから７−０Ｈ −り７リンの代謝 実験　肝細胞　接種後日数　産生速度 （μモル／　時間） ■　ラット、２００　ＸＩＯ’　５　３．８２　ラフト、２００　ＸＩＯ”　５ 　５．２３　ラフト、２００　ＸＩＯ’　７　４．９４　ウサギ、２００　ＸＩ Ｏ’　３　１．６８　０．６ ５　ウサギ、２００　ＸＩＯ’　１０　０．５表　２ μｌ摂取７分 表３ ７−エトキシクマリノ代謝、結合 図　２　：　モンサント　肝細胞バイオリアクターにょる７−ニドキノクマリン の７−ヒドロ牛塩酸リドカインの代謝 ロ実験−１＝１６１２ナノモル　ム実験＃２＝１３０７ナノモル図　３　：　モ ンサンド　肝細胞バイオリアクターによる塩酸リドカイン　のモノエチルグリノ ン士ノリド（八ＩＥＧＸ）　への代謝表　５ ＦＩＧ、　１ 、　−ＰＣＴＡＩＳ　９３１００１２１フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ 、ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ、　ＦＩ。

ＨＵ、ＪＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、 ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ（７２）発明者　リ、アルバート　パック　−　ハングアメリ カ合衆国６３０２１　ミズーリ州セントルイス、オーク　リーフ　マノ−コー ト　５２５ （７２）発明者　ホワイトヘッド、ティモジ−ダニエルアメリカ合衆国６３１４ ３　ミズーリ州セントルイス、ベレビュー　アベニュー　１９３５

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．灌流入口手段と灌流出口手段を有する閉じ込め容器（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎ ｔ　ｖｅｓｓｅｌ）；流体で灌流入口手段と灌流出口手段に接続されている、該 閉じ込め容器中のマトリックス； および該マトリックス内に捕捉された複数の肝細胞凝集物よりなる、肝細胞バイ オリアクター。
2. ２．肝細胞凝集物は球状物質（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）である、請求の範囲第１項に 記載の肝細胞バイオリアクター。
3. ３．肝細胞凝集物は該マトリックスを介した肝細胞の灌流により形成される、請 求の範囲第１項に記載のバイオリアクター。
4. ４．マトリックスはガラスビーズである、請求の範囲第１項に記載のバイオリア クター。
5. ５．肝細胞凝集物は基本的に結合組織を含まない、請求の範囲第１項に記載のバ イオリアクター。
6. ６．マトリックスは、マトリックス１ｍｌ当り少なくとも約３．００×１０６細 胞の密度の肝細胞を有する、請求の範囲第１項に記載のバイオリアクター。
7. ７．肝細胞凝集物は細胞−細胞接触によりマトリックス内で相互に結合されてい る、請求の範囲第１項に記載のバイオリアクター。
8. ８．バイオリアクターを作成する方法であって、灌流入口手段と灌流出口手段を 有する閉じ込め容器を提供し、 流体で灌流入口手段と灌流出口手段に接続されている、該閉じ込め容器中のマト リックスを提供し、マトリックス内に複数の肝細胞凝集物を捕捉する工程よりな る、上記方法。
9. ９．肝細胞凝集物は球状物質である、請求の範囲第８項に記載のバイオリアクタ ーの作成方法。
10. １０．マトリックスはガラスビーズである、請求の範囲第８項に記載の肝細胞バ イオリアクターの作成方法。
11. １１．肝細胞凝集物は基本的に結合組織を含まない、請求の範囲第８項に記載の 肝細胞バイオリアクターの作成方法。
12. １２．マトリックスはマトリックス１ｍｌ当り少なくとも約３．００×１０６細 胞の密度の肝細胞を有する、請求の範囲第８項に記載の肝細胞バイオリアクター の作成方法。
13. １３．肝細胞凝集物は細胞−細胞接触によりマトリックス内で相互に結合されて いる、請求の範囲第８項に記載の肝細胞バイオリアクターの作成方法。
14. １４．肝細胞バイオリアクターの使用方法であって、灌流入口手段と灌流出口手 段を有する閉じ込め容器を提供し、 流体で灌流入口手段と灌流出口手段に接続されている、該閉じ込め容器中のマト リックスを提供し、閉じ込め容器内に複数の肝細胞凝集物を捕捉し、培地を灌流 入口手段、閉じ込め容器および灌流出口手段を介して灌流させる工程よりなる、 上記方法。
15. １５．複数の肝細胞凝集物は球状物質である、請求の範囲第１４項に記載の肝細 胞バイオリアクターの使用方法。
16. １６．肝細胞凝集物はマトリックスを介した肝細胞の灌流により形成される、請 求の範囲第１４項に記載の肝細胞バイオリアクターの使用方法。
17. １７．培地は代謝物を含む、請求の範囲第１４項に記載の肝細胞バイオリアクタ ーの使用方法。
18. １８．マトリックスはガラスビーズである、請求の範囲第１４項に記載の肝細胞 バイオリアクター。
19. １９．肝細胞凝集物は基本的に結合組織を含まない、請求の範囲第１４項に記載 の肝細胞バイオリアクターの使用方法。
20. ２０．マトリックスはマトリックス１ｍｌ当り少なくとも約３．００×１０６細 胞の密度の肝細胞を有する、請求の範囲第１４項に記載の肝細胞バイオリアクタ ーの使用方法。
21. ２１．肝細胞凝集物は細胞−細胞接触によりマトリックス内で相互に結合されて いる、請求の範囲第１４項に記載の肝細胞バイオリアクターの使用方法。
22. ２２．肝臓補助の必要がある哺乳動物を治療するための肝細胞バイオリアクター 肝臓補助装置であって、肝臓補助の必要のある哺乳動物から血液を採取する手段 、治療される哺乳動物の血液を細胞性成分と非細胞性成分に分離する手段、 灌流入口手段と灌流出口手段を有する閉じ込め容器；閉じ込め容器内のマトリッ クス；流体で灌流入口手段と潅流出口手段に接続されている該マトリックス；お よびマトリックス内に捕捉された複数の肝細胞凝集物よりなる肝細胞バイオリア クター、 治療される哺乳動物の非細胞性血液成分を灌流入口手段、マトリックスおよび灌 流出口手段を介して灌流する手段、および処理した非細胞性血液成分と細胞性血 液成分を哺乳動物に戻す手段よりなる、上記装置。
23. ２３．患者側の回路とは独立に、肝細胞バイオリアクター回路の流速を維持する 手段をさらに含有することよりなる、請求の範囲第２２項に記載の肝細胞バイオ リアクター肝臓補助装置。
24. ２４．肝細胞凝集物は球状物質である、請求の範囲第２２項に記載の肝細胞バイ オリアクター肝臓補助装置。
25. ２５．肝細胞凝集物はマトリックスを介した肝細胞の灌流により形成される、請 求の範囲第２２項に記載の肝細胞バイオリアクター肝臓補助装置。
26. ２６．マトリックスはガラスビーズである、請求の範囲第２２項に記載の肝細胞 バイオリアクター肝臓補助装置。
27. ２７．肝細胞凝集物は基本的に結合組織を含まない、請求の範囲第２２項に記載 の肝細胞バイオリアクター肝臓補助装置。
28. ２８．マトリックスはマトリックス１ｍｌ当り少なくとも約３．００×１０６細 胞の密度の肝細胞を有する、請求の範囲第２２項に記載の肝細胞バイオリアクタ ー肝臓補助装置。
29. ２９．肝細胞凝集物は細胞−細胞接触によりマトリックス内で相互に結合されて いる、請求の範囲第２２項に記載の肝細胞バイオリアクター肝臓補助装置。