KR100250630B1

KR100250630B1 - 생물학적 인공 간

Info

Publication number: KR100250630B1
Application number: KR1019930703031A
Authority: KR
Inventors: 에드워드 베이커 죠오지; 조셉 벡크 데일; 박형 리 알버트; 다니엘 화잇헤드 티모디
Original assignee: 죤 에이치. 뷰센; 몬산토 컴퍼니
Priority date: 1992-02-07
Filing date: 1993-01-06
Publication date: 2000-04-01
Also published as: GR3020619T3; EP0579804A1; JP3339685B2; AU3437393A; DK0579804T3; CA2107582A1; AU661561B2; ATE140726T1; MX9300674A; EP0579804B1; WO1993016171A1; DE69303779T2; DE69303779D1; ES2090963T3; JPH06509476A

Abstract

관류입구수단과 관류출구수단을 갖는 함유용기; 매트릭스의 관류를 허용하면서 상기 함유용기내에 간세포 집합체를 포획하도록 상기 함유용기내에 있는 매트릭스로 이루어지는 간세포 생체반응기 또는 생체 인공 간이 개시되어 있다. 본 발명은 인공 간으로서 유용하다.

Description

[발명의 명칭]

생물학적 인공 간

[도면의 간단한 설명]

제1도는 본 발명에 의해 기술되는 간세포 생체반응기의 개략선도이며,

제2도는 대사물질 생성을 위한 간세포 생체반응기의 사용을 위한 흐름도이며,

제3도는 간 보조장치를 필요로 하는 환자에 연결된 제1도의 간세포 생체반응기를 나타내는 흐름도이다.

[발명의 상세한 설명]

[발명의 배경]

본 발명은 인공기관에 관한 것이며, 더 구체적으로는 간세포 배양을 위한 간 생체 반응기와 그의 용도에 관한 것이다.

[관련기술]

효과적인 간 보조장치가 존재한다면, 이식에 중개역으로서 제공될 수 있다.

간 이식을 기다리고 있는 환자의 대부분은 만성 간 기능부전증을 가지며 간성 혼수 쇼크에 있지는 않다. 급성 간 기능부전증을 가진 환자들을 구조하기 위한 여러가지 간 보조장치가 사용되어 왔다. 대부분의 시도들은 실망적이었다.

과거 10년동안에, 막 혈장분리기술의 사용을 수반하는 방법들이 간 지지물의 분야에 도입되었다. 혈관류, 혈여과 및 투석과 같은 종래의 방법들이 개선되었다.

그러나, 대부분의 최신 간 보조기술의 적용은 급성 간 부전증을 가진 환자의 생존율을 개선시키지 못하였다.

대부분, 이것은 간 부전증의 병리학의 제한된 이해에 기인할 수도 있다.

한편, 면역학 및 외과적 기술의 개선으로, 간이식은 치명적인 간질환에 대한 확립된 치료 양상이 되어 왔다.

그러나, 간의 재생능력은 무제한임을 여전히 인색해야 할 것이다.

간 손상이 원인이 바이러스에 의한 것이든, 독성이든, 외과적인 것이든지, 전격성 간기능부전(FHF) 과 말기 간 경변의 경우를 제외하고는 간은 보통 2주내에 생명을 지속할 수 있도록 상당한 기능을 회복한다.

전격성 간 기능부전의 경우는 간 재생이 신속하지도 않을 뿐더러 개인이 살아있도록 유지시키기에 충분하지도 못하며, 말기 간 경변의 경우는 간 재생이 일어날 수 없다(Takahashi, T., et al., ''Artificial liver state of the art'', in Digestive Diseases and sciences, Vol. 36, No. 9 (September 1991), Pg. 1327-1340).

이들 이유로, 인공간의 요구가 본 분야에서 잘 인식되고 있다.

(JAUREGUI, H.O., et al., ''Hybrid Artificial Liver'', in Szycher, N. (Ed.), Biocompatible Polymers, Metals, and Other Composites (Lancaster, Pa, Technomic Pub.) 1983, Pg. 907-928; Matsumura 미국특허 No. 3,734,851).

간의 기능을 수행하는 몇가지 장치들이 제안되었다.

하가 외(Haggar, et al., ''Neonatal Hepatocyte Culture on Artificial Capillaries. A Model for Drug Metabolism and the Artificial Liver'', ASAIO J., 6:26-35 (January/March 1983)), 조레귀 외(Jauregui, H.O., et al., ''Adult Rat Hepatocyte Cultures as the Cellular Component of an Artificial Hybrid Liver'') 및 폴(Paul, J. (Ed.), Biomaterials in Artificial Organs, (MacMillan) 1983, Pg. 130-140)은 간세포 (건강한 간세포) 가 카트리지내의 빈, 반투과성 섬유의 벽들의 외표면에서 그안으로 성장시킨 실험들을 기술하고 있다.

나중 문헌들은 부착성을 개선하기 위해 간세포를 파종하기에 앞서 콜라겐으로 섬유를 처리하는 것을 제안하고 있다. 조레귀의 미국특허 No. 5,043,260는 간세포를 성장 및 유지시키는 관류장치를 개시하고 있다.

그것은 간세포 구획으로부터 관류구획을 분리하기 위한 다공성 막을 포함하며 간세포 구획에서 생체중합체 지지부재에 간세포를 부착하기 위해 올리고 당류 렉틴인식결합을 사용한다. 데메트리오 외(Demetriou, et al., ''New Method of Hepatocyte Transplantation and Extracorporeal Liver Support'' Ann. Surg. Sep. Pg. 259-271; 1986)는 크로마토그래피 컬럼에 놓인다음 관류되는 콜라겐 피복된 미세담체상에 간세포부착을 허용하는 기술을 나타내고 있다.

EP 출원 9040158은 간세포와 합성고분자막간에 부착을 일으키기 위해 세포배양기질을 사용하는 것을 기술하고 있다.

리 외(Lie, et al., ''Successful Treatment at Hepatocyte Coma by a New Artificial Liver Device in the Pig'' Res. Exp. Med (1985) 185, 483-492) 는 관류챔버내에 다공성 막에 의해 유지된 간조각 또는 입방체를 사용하는 것을 가르쳐준다.

울프와 문켈트(Wolf, F.W., and Munkelt, B.E., ''Bilirubin Conjugation by an Artificial Liver Composed of Cultured Cells and a Synthetic Capillaries, ''Vol. 21 Trans. Amer. Soc. Artif. Int. Organs, 1975, Pg. 16-23)은 랫트 간종양 (종양성 간) 세포들이 빈 반투과성 섬유와 카트리지 사이의 영역들에 제공되며 혈액이 이들 섬유를 통과하고 간종양 세포에 의해 처리되는 실험을 기술하고 있다.

이러한 빈 섬유장치들에서, 섬유는 환자의 면역방어시스템으로부터 이들 세포를 분리하기 위해 사용되며 독성물질의 이동을 허용하도록 하는 기공도를 갖는다.

카이 외(Cai, Z., et al., ''Microencapsulate Hepatocyte for Bio-Artificial Liver Support'' Artif. Organs, 12:388-393, 1988)는 알기네이트-폴리리신 막내에 간세포를 캡슐화하는 것을 가르쳐 주며 간 지지물 시스템으로서 제공된다.

[발명의 개시]

본 발명은 관류입구수단과 관류출구수단을 갖는 함유용기와, 이 함유용기내의 매트릭스로 이루어져 이 매트릭스의 관류를 허용하면서 상기 함유용기내에 간세포 집합체를 포획하도록 하는 간세포 생체반응기 또는 생체 인공간이다.

간세포 생체반응기와 그의 제조방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

간 지지물을 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 장치 및 방법을 제공하는 것이 본 발명의 여전히 또다른 목적이다.

대사물 및 기타 간세포 생성물의 제조를 위한 장치 및 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.

간세포와의 화학적 상호작용을 연구하기 위한 장치를 제공하는 것이 본 발명의 여전히 또다른 목적이다.

본 발명의 이점은 3차원 세포-세포접촉을 가진 집합체로서 간세포를 배양함으로써 종래기술과 비교할 때 생육성 및 간세포 분화를 유지하면서 간세포 농도를 증가시킬 수 있다는 것이다.

본 발명의 여전히 또다른 이점은 원하는 배지와 직접적이고 조절가능한 간세포 접촉을 가질 수 있다는 것이다.

본 발명의 여전히 또다른 이점은 사람의 간세포가 아닌 간세포를 사용할 수 있는 사람의 치료를 위한 체외의 간 지지물을 제공한다는 것이다.

사람 간세포가 아닌 간세포에 대한 환자의 가능한 면역반응은 간세포와 환자의 혈세포들간의 접촉을 의도적으로 회피함으로써 최소화된다.

본 발명은 요구되는 간세포의 양을 수용하도록 비율에 따라 정해질 수 있다는 것이 여전히 또다른 이점이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부도면과 연관하여 다음의 설명을 고려할 때 명백해질 것이다.

[바람직한 구체예의 기술]

제1도를 참조하면, 간세포집합체를 포획하기 위한 지지물 매트릭스(6) 를 수용하기 위한 함유용기(1) 로 구성되는 간세포 생체반응기를 나타낸다.

함유용기(1) 는 유리바닥부(2) 와 뚜껑(3) 으로 구성되어 있다.

바닥부(2) 에, 간세포 집합체의 포획을 위한 매트릭스를 제공하는 유리 비이드(6) 를 감금하도록 제공되는 수직단면으로 융합된 유리봉(5) 을 갖는 단일의 L형 관류출구(4) 가 부착되어 있다.

유리 비이드(6) 에 대한 감금장치로서 제공되는 수직 단면으로 융합된 유리봉(5) 을 갖는 뚜껑(3) 에 부착된 L형 관류입구(7) 가 있다. 또한 뚜껑(3) 에 부착되어, 고무관조각(11)을 갖는 유리관(9) 에 부착된 금속 루어-로크(luer-lock) 삽입부(10)를 갖는 뚜껑(3) 에 융합된 유리관(9) 으로 구성되는 세포 주입구(8) 가 있다.

주입구(7) 는 호스 클램프(12)를 사용하여 폐쇄시킬 수 있다.

바닥부(2) 와 뚜껑(3) 은 O-링(13) 및 O-링 유리조인트 클램프(14)를 사용하여 함께 유지되고 밀폐된다.

O-링에 대한 긴장은 긴장조절 놉(15)에 의해 증가될 수 있다.

바람직한 구체예에서 생체반응기, 매트릭스 및 기타 부품들을 만들기 위해 유리를 사용하였다. 그러나, 선택된 물질이 생체반응기의 기능 또는 간세포의 생육성을 방해하지 않는한 다른 유형의 물질도 사용될 수 있다.

[제조 및 용도]

함유용기(1) 는 ㅍ준의 들어맞는 O-링 유리 조인트로 만들어진 바닥부(2) 와 뚜껑(3) 을 갖는다. O-링 유리 조인트의 내경은 어떤 크기도 될 수 있다.

바닥부 절반은 선택된 내경을 요하는 유리 비이드 또는 매트릭스(6) 의 부피를 수용하기에 충분한 길이인 것을 필요로 한다.

지지물 매트릭스 부피는 첨가될 간세포 또는 그것의 집합체의 수에 의존한다.

간세포밀도는 적어도 3 × 10⁶세포/ ㎖이나 6.70 × 10⁶세포/ ㎖의 매트릭스에서 거의 최적이다. 관류입구(7) 와 관류출구(4) 는 파이렉스 유리관으로 만들어진다.

유리봉 비이드 감금장치(5) 는 유리 비이드가 유리봉(5) 과 유리관(4) 또는 (7) 사이의 각진 공간을 통해 끼워지지 않을 정도로 충분한 직경으로 되어야 한다.

간세포 주입구(8) 의 루어-로크 삽입부(10)는 불꽃 살균을 허용하도록 스테인레스 강으로 되어 있다. 루어-로크 삽입부(10)는 표준 플라스틱 루어-로크 삽입부를 맞추기 위해 특이적으로 가공된다.

매트릭스 또는 비이드(6) 는 파이렉스 유리로 만들어지며 1 내지 3㎖의 어떤 크기도 될 수 있으며, 간세포 집합체의 성공적인 포획을 위해 1.4 내지 1.7㎜ 크기범위(No. 14 내지 No. 12 메시) 가 바람직하다.

유리 비이드 이외에 간세포 집합체를 포획하는데 다른 유형의 매트릭스가 사용될 수도 있다. 성공적인 매트릭스는 관류를 허용하면서 간세포 또는 집합체를 포획하게 되는 것이 될 것이다.

또다르게는, 함유용기의 바닥부(2) 는 표준의 유리관으로 만들어질 수 있다.

상기한 다른 특징들은 같은 방법으로 제조되면서 고무마개가 뚜껑(3) 으로 사용될 수 있다.

제2도에 나타낸 회로에 놓일때 앞서 기술된 간세포 생체반응기 (제1도) 가 간세포 대사 반응기로서 사용될 수 있다.

부품들은 재순환 연동 펌프(19) 및 산소 발생기(20), 탈기용기(21), pH 프로브(22), 용해된 산소 프로브(23), 및 주입/ 샘플채취구(24)이다. 모든 이들 부품들은 원하는 온도, 바람직하게는 약 37℃에서 유지된 인큐베이터(25)내에 놓인다.

신선한 배지의 병(26), 공급펌프(27), 생성물 분리용기(28), 및 생성물 수집병(29)은 인큐베이터(25)의 외측에 유지된다.

시스템은 공급펌프(27)를 사용하여 병(26)으로부터 라인(30)을 통해 신선한 배지로 채워진다. 배지는 액면이 재순환 복귀라인(31)위에 올때까지 탈기용기(21)로 흘러들어간다. 재순환 펌프는 가동하여 액의 흐름이 라인(31)을 통한 통로를 따르며 프로브(23) 및 (22)내 주입구(24)를 통과하며 함유용기(1) 를 바닥으로부터 채우도록 된다.

공기는 밀려나와 입구(7) 를 통하고 산소발생기(20)를 통하고 라인(32)을 통해 용기(21)로 간다. 공기는 라인(33)을 통해 시스템을 떠나 용기(28)로 간다.

시스템이 전부액으로 찰 때까지 신선한 배지를 가하며, 배지 재순환 방향이 역전되어 배지가 이제는 입구(7) 를 통해 함유용기(1) 로 들어간다.

공기는 액 흐름에 역류하는 방향으로 고리모양 산소발생기(20)를 통해 흐른다.

초기산소조성은 공기의 조성과 가까워야 한다.

일단 용해된 산소농도가 공기의 농도와 평형을 이루면, 재순환 펌프(19)를 끄고 간세포 또는 그의 간세포 집합체를 주사기로 입구(8) 에서 시스템에 주사한다.

바뀐 부피가 라인(33)을 통해 시스템에서 흘러나와 용기(28)로 간다.

세포를 주사한 후, 재순환 펌프(19)를 정지상태 재순환 유속보다 다소 더 낮은 속도로 켠다. 그다음 배지와 세포를 대부분의 간세포 또는 그의 집합체가 유리 비이드내에 포획될 때까지 시스템으로부터 재순환시킨다.

그다음 포획된 세포 백만개당 1일 1㎖의 배지에 대응하는 속도로 신선한 배지를 용기(26)로부터 라인(30)을 통해 시스템에 첨가한다.

화학적 화합물들이 많은 다른 방법들로 도입될 수 있다.

한 방식에서는 그것들이 병(26)내 신선한 배지에서 일정조성공급으로서 도입될 수 있다. 또다르게는, 그것들은 주입구(24)를 통해 알약주입으로서 도입될 수 있다.

대사생성물을 병(29)에 수집할 수 있고, 또는 주입구(24)를 통해 샘플을 채취함으로써 반응속도론을 연구할 수 있다. 당업자라면 간세포 생체반응기로 화학약품들을 도입하는 많은 방법을 유도할 수 있다. 도입되는 화학약품은 대사운명 및 독성과 같은 간세포들과의 그것들의 상호작용에 관하여 연구할 수 있고, 또는 대사물로서 다른 화합물의 합성을 위한 기질로서 사용될 수 있다.

간세포 생체반응기(1) 는 또한 필요로 하는 환자에게 보충 간기능을 제공하는 인공기관으로서 또한 사용될 수 있다.

이 방식에서, 간세포 생체반응기는 간 보조장치를 필요로 하는 포유동물을 치료하기 위한 간 보조장치를 형성하기 위해 제3도에 나타낸 바와 같이 배열된다.

간세포 생체반응기(1) 는 모듈러스 단위로서 생각될 수 있고 수행능력을 증가시키기 위한 동일한 단위와 병행하여 실행될 수 있다. 이 방식으로 관류 반응기를 실행하기 위한 필수부품들은 다음 것들을 수정하여 상기한 것과 같다.

재순환 펌프(19)는 개개의 관류 반응기 장치(1) 를 통해 배지의 같은 흐름을 보증하기 위한 멀티헤드 연동펌프이어야 하며, 탈기병(37)은 이제 또한 저장소로서도 제공되며, 액이 용기(28)로 흘러나가는 것을 막기 위해 라인(33)에 클램프(34)가 부가되었으며, 공급라인(35)은 탈기병(37)으로 보다는 입구라인(36)에 도입된다.

시스템은 초기에 라인(30)을 통해 병(26)으로부터 배지로 채워진다.

채우는 기간동안에, 클램프(34)는 열려있고 클램프(38)는 폐쇄되어 있다.

병(37)이 재순환 복귀라인(31)위로 배지로 채워질 때, 재순환 펌프(19)는 가동하며 시스템은 라인(31)을 통해 펌프(19)를 통해 반응기(1) 의 상부를 통한 치환하는 공기로 채워져 라인(36)을 통해 탈기병(37)으로 간다.

시스템이 전부 배지로 찼을 때, 배지공급펌프(27)를 끄고 펌프(19)를 사용하여 배지 재순환의 방향을 역전시켰다.

공기는 공기와 같은 조성을 가진 산소발생기(20)의 고리모양쪽에 가해진다.

일단 배지가 공기로 포화되면, 재순환 펌프를 끄고 용액중의 간세포 또는 그것의 사전형성된 집합체를 주사기를 사용하여 입구(8) 를 통해 반응기(1) 에 첨가한다.

재순환 펌프(19)는 다시 가동되고 세포와 용액은 대부분의 살아있는 간세포 집합체가 매트릭스 또는 비이드(6) 에 포획될 때까지 시스템을 통해 재순환하도록 허용된다.

간세포 집합체가 포획되는 시간을 가진후, 시스템은 병(26)으로부터 신선한 배지를 분출시켜 살아있지 않는 세포들과 기타 부스러기들을 제거한다.

분출이 완결된 후, 클램프(34)를 닫고 클램프(38)를 연다.

액체 또는 혈장, 소위 비세포성 혈액성분 또는 여액이 혈액으로부터 제거되는 혈액 농축기(40)를 통해 환자(39)로부터 모든 혈액이 흘러나온다. 이것은 간세포 또는 그것의 집합체에 대한 환자의 면역반응을 최소화하기 위해 행해진다.

농축된 혈액 또는 혈세포들은 혈액 농축기를 나와 혈액 혼합용기(41)로 돌아가고 여기서 그것은 생체반응기 시스템을 나오는 여액과 재혼합되거나, 또는 다르게는 환자에게로 직접 재도입된다. 여액은 라인(42)을 통해 혈액농축기(40)를 나오고 여액 저장소/ 탈기병(43)으로 들어간다. 펌프(44)는 라인(35)을 통해 병(43)으로부터 여액을 흘려 라인(36)을 통해 시스템에 들어가게 하는데 사용된다.

여액은 시스템을 통해 흐르는데, 처음에 산소발생기(20)를 통해 상부로부터 함유용기로 들어가고 바닥으로부터 반응기를 나와 저장소(37)로 돌아간다.

여액 재순환의 일부는 라인(35)을 통한 여액유입흐름과 같은 부피로 저장소(37)로 흘러들어간다음 용기(41)에서 농축된 혈액과 재혼합되기전에 혈액여과기(46)를 통해 통과하면서 라인(45)을 통해 생체반응기 회로를 나오거나 또는 환자에게 직접 재도입된다.

시스템은 일반적으로 두개의 회로로 구성되는 것으로 일반적으로 관찰될 수 있다. 즉, 간세포 생체반응기 회로와 환자쪽 회로.

두 회로는 라인(31)을 통해 간세포 생체반응기로부터 처리된 비세포 혈액성분들을 수용하는 저장소(37)에 의해 추가로 연결된다. 그것은 처리된 비세포 혈액성분들의 일부가 라인(45)을 통해 환자에게 흐르도록 허용하며 또한 일부가 라인(36)을 통해 간세포 생체반응기로 되돌아 재순환되도록 허용한다.

저장소(37)는 이로써 포유동물에게 들어가고 나오는 혈액의 유속과 간세포 생체반응기에 들어가고 나오는 비세포혈액성분의 유속에 대한 독립적 조절을 허용한다.

두 유속에 대한 이 조절은 서로 다른 유속들이 각 회로의 최적성능을 제공하기 때문에 바람직하다. 간세포 생체반응기는 간세포에 최소의 전단손상을 가지고 적당한 산소 및 영양제를 제공할 수 있는 유속을 필요로 한다.

이 유속은 포유동물의 혈액유속과 같지 않을 수도 있다.

당업자라면, 전술한 설명을 사용하여, 충분히 본 발명을 이용할 수 있다.

그러므로, 다음의 바람직한 구체예는 단순히 예시로서 해석되어야 하며 명세서의 나머지 부분에 결코 제한되지 않는다.

[세포집합체의 형성]

간세포 집합체는 두가지 일반적 양식으로 형성될 수 있다.

배지내 생체반응기를 통해 간세포를 재순환시킴으로써 (배지 조성물에 대해 실시예 1 참조), 간세포를 서로 접촉시키고 집합체를 형성시키게 되며 궁극적으로 매트릭스에 포획될 정도의 크기로 한다.

본 발명자는 대략 2-5시간내에 대략 50%의 간세포가 포획됨을 관찰하였다.

대략 16-24시간에, 대략 100%의 세포가 집합체로서 포획될 것이다.

간세포 집합체를 형성하는 또다른 방식은 생체반응기의 외측에 간세포 ''구체(spheroids)''를 형성하는 것이다. 간세포를 CO₂인큐베이터(5% CO₂, 95% 습한 공기) 에서 회전하는 플랫폼상의 플라스틱 또는 유리 패트리접시에 놓는다.

분당 30 주기의 회전이 효과적인 것으로 발견된다.

간세포는 대략 24시간에 집합할 것이다.

이러한 집합체 또는 구체는 생체반응기를 통과할 때 매트릭스에 의해 포획될 것이다.

어느 방법으로든 간세포 집합체의 포획후, 간세포는 연장된 기간동안 크게 생육성으로 남아있다 (실시예 1 참조). 본 발명의 중요한 이점은 집합체가 서로 집합부를 형성할 수 있거나 서로 상호 연결되어 세포-세포 커뮤니케이션 또는 다수 간세포 집합체들간의 접촉을 허용한다는 것이다.

이 삼차원 세포-세포 접촉과 세포간 커뮤니케이션은 체내에서 간과 유사하다.

사람 간세포는 본 발명에서 작용하며 어떤 상황에서 우선이 될 수도 있다.

처치에 대한 환자 면역학적 반응을 더 감소시킬 필요가 있는 경우에 그렇다.

그러나, 사람 간세포가 아닌 간세포가 간세포 집합체로서 생체반응기에 사용될 수 있다.

환자의 혈세포들은 간세포와 접촉하는 것을 방해하기 때문에 면역반응이 제한될 것이다.

그러므로, 유용성 때문에, 사람 간세포가 아닌 간세포가 바람직하며, 더 바람직하게는 소, 돼지, 염소등의 간세포이며 가장 바람직하게는 돼지 간세포이다.

간세포 생체반응기를 지지하는데 사용되는 배지는 간세포 또는 그의 집합체의 생육성을 유지하기 위해 필요로 하는 영양분을 함유해야 한다.

배지는 기질이라 불리는 연구하고 있는 화학약제 또는 대사물이라 불리는 기질의 대사로부터 형성된 화학약제를 함유할 수도 있다.

간세포 생체반응기가 체외 지지물 시스템으로서 사용될 때 포유동물 혈액의 비세포 혈액성분들이 배지의 대신에 간세포 집합체를 지지하는 필요한 영양분을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

다음의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 의도가 아니다. 당업자라면 다음 과정들의 조건 및 공정들에 기지의 변동을 가하여 본 발명을 실시하는데 사용할 수 있음이 쉽게 이해될 것이다.

[실시예 1]

[간세포 생체반응기에서 간세포의 배양 (제1도)]

베리와 프렌드(Berry and Friend, 1969 ''High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells'' J. Cell Biol. 43, 506-520) 의 생검법을 사용하여 약간의 수정을 가하여 (Loretz et al., ''Promutagen activation by freshly isolated and cryopreserved rat hepatocytes'', Environ. Mol. Mutag. 12: 335-341; 1988; ''Optimization of cryopreservation procedures for rat and human hepatocytes'' Xenobiotica 19; 489-498; 1989), 스프라아그 더얼리 랫트로부터 간세포를 분리하였다.

상기 문헌들의 명세서는 참고로 여기에 포함된다.

과정은 2-단계 콜라게나제(0.5% w/v, 타입 I) 관류기술이었다. 분리된 세포집단은 트리판 블루 축출에 의해 산정한 바 일상적으로 80% 이상의 생육성을 가졌다.

분리에 이어서, 간세포를 11.2㎎/ℓ 알라닌, 12.8㎎/ℓ 세린, 24㎎/ℓ 아스파라긴, 2g/ ℓ 지방산 적은 소혈청 알부민, 0.168㎎/㎖ 아미노레불린산, 5㎎/ℓ올레산, 5㎎/ℓ d, ℓ-토코페놀, 0.393㎎/ℓ 덱사메타손, 7.9㎎/ℓ d-티록신, 0.03㎎/ℓ 글루카곤, 20U./ ℓ 인슐린 및 84㎎/ℓ 겐타마이신을 보충한 웨이마우스(Waymouth) 752/L 배지에 재현탁시켰다(Green et al., Green, C.E., Segall, H. J., and Byard, J.L. pg. 176-185 (1981) ''Metabolism, Cytotoxicity, and genotoxicity of the pyrrolizidine alkaloid senecionine in primary cultures of rat hepatocytes.'' Toxicol. Appl. Pharmacol. 60, 176).

세포밀도는 대략 5 × 10⁶세포/ ㎖로 조절하였다.

총수 대략 200 × 10⁶세포를 생체반응기에 접종시켰다.

이 수의 세포들에 대해 사용된 생체반응기는 대략 30㎖의 1.5㎜ 직경 파이렉스 유리 비이드를 함유하는 내경 22㎜ 및 높이 83㎜의 크기를 가졌다.

생체반응기는 접종에 앞서 상기한 배지로 적어도 24시간동안 사전 평형화시켰다.

배지는 분당 40㎖의 속도로 재순환시켰다. 시스템에 함유된 전체 배지는 150㎖이었다.

새로운 배지는 하루에 대략 200㎖의 속도로 첨가되었다.

시스템을 온도조절된 인큐베이터에서 37℃로 유지시켰다.

생체반응기에서 배양된 간세포의 높은 생육성은 안정한 산소소비, 요소생성, 및 알부민 합성에 의해 증명되었다.

생육성의 이들 지시사항들에 대한 대표적인 데이타를 표 1에 나타내었다.

약물대사에 책임있는 주효소 시스템, 즉 화학기질, 7-에톡시쿠마린, 을 7-OH-쿠마린으로 전환시키는 간세포의 능력에 의해 측정한 바 P-450 혼합된 기능의 산화효소 활성을 몇가지 연구들에 대해 표 2에 묘사하였다.

전자현미경 연구는 집합체내 세포가 담즙소관, 퍼옥시좀(peroxisomes), 확대 소포체(extensive endoplasmic reticulumn), 밀착세포결합, 및 건강한 미토콘드리아를 포함하는 체내에서의 간세포의 형태학적 특성들을 가짐을 증명하였다.

또한, 매트릭스내 집합체들은 세포-세포 접촉을 통해 서로 연결되어 있다.

이 방식으로 생체반응기에서 배양된 간세포는 따라서 생체이물 (예를들면 약제) 의 대사운명의 평가를 위해서 또는 대사물질의 대량생산을 위해서 둘다에 대해 생체이물 대사의 연구에 적합하다.

여기 기술된 시스템은 간세포에 의해 생성되는 것으로 알려진 생물학적 분자의 제조를 위해서 또한 사용될 수 있다.

시스템은 또한 화학적 및 약물 독성을 연구하기 위해 사용될 수 있다.

[실시예 2]

[체외 간 지지물 시스템으로서 생체반응기의 적용]

실시예 1에 기술된 과정을 사용하여 이계교배된 요오크셔/ 화이트 돼지로부터 제거된 간으로부터 간세포를 배양하였다. 돼지간으로부터, 일상적으로 높은 (80% 이상) 생육성의 2 내지 5십억개 세포가 얻어질 수 있다.

사용된 배지는 실시예 1에 기술된 바와 같이 호르몬 보충된 웨이마우스 배지이었다.

2 내지 5십억개 세포들을 수용하기 위해, 생체반응기는 각각 40㎜의 내경과 100㎜의 높이를 갖는 두개의 함유용기로 크기를 늘였다.

함유용기당 대략 2㎜ 직경과 총부피 250㎖의 유리 비이드를 사용하였다.

배지를 360㎖/ 분의 재순환속도로 관류시켰다.

간세포의 높은 생육성은 안정한 산소 비율에 의해 증명되었다 (표 3).

생체반응기를 간세포 접종 대략 2시간후에 간없는 돼지 (완전 간 기능부전을 모사하기 위해 수술에 의해 간을 제거함) 에 부착시켰다.

체외 간 지지물 시스템으로서 생체반응기의 적용의 개략도를 제3도에 나타내었다.

왼쪽 대퇴골 동맥으로부터의 혈액을 민테크(Minntech) 혈액농축기로 향하게 하였다.

12 프린지 엘리카스(elecath) 카뉼레를 대퇴골 동맥에 삽입하고 혈액농축기에 1/4'' PVC 관에 연결시켰다. 혈액 농축기는 혈액을 세포없는 한외여과 분획과 혈세포 분획으로 분리시켰다. 혈세포 분획은 유사한 관을 통해 대퇴골정맥으로 복귀시켰다.

한외여과액은 1/4'' PVC 관을 통해 혈액농축기에서 나와서 로울러 펌프를 사용하여 40㎖/ 분으로 조절된 유속으로 간세포 생체반응기 시스템에 들어갔다.

생체반응기를 통해 관류후, 한외여과액을 왼쪽 경정맥을 통해 동물에 복귀시켰다.

체외간 대사의 제공을 증명하기 위해 간에 의해 대사되는 것으로 알려진 두가지 다른 화학약품, 7-에톡시쿠마린과 리도케인을 생체반응기의 입구에서 한외여과액에 투여하였다. 각각의 대사물질, 7-OH-쿠마린과 모노에틸글리신크실리디드(MEGX)를 한외여과액을 동물에 복귀시키기전에 생체반응기의 출구에서 측정하였다.

7-에톡시쿠마린과 리도케인 둘다의 상당한 대사가 관찰되었다 (표 4 및 표 5).

결과는 따라서 지지물 시스템으로서 생체반응기의 적용을 증명하며 체외간 대사를 제공한다.

이 시스템은 간 기능부전을 가진 사람 환자의 관류를 위해 사용될 수 있다.

혈장으로부터의 혈세포의 분리는 간세포에 대한 수용체의 면역학적 반응을 최소화할 것이다. 사람 공여자로부터의 간세포 (예를들면 해부용 시체로부터 얻은 이식가능한 간)과 사람아닌 제공원 (예를들면 돼지) 로부터의 간세포가 생체반응기에 사용되어 체외간 지지물을 제공할 수 있다.

상기에서 제안되고 기술된 장치의 변형 및 수정외에, 다른 변형 및 수정안들이 당업자에게는 명백하며 따라서 발명의 범위는 나타내고 제안된 특정구체예에 제한됨을 암시하지 않으며 오히려 첨부청구범위를 참조로 결정되어야 한다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

몬산토 간세포 생체반응기에 의한 7-에톡시쿠마린의 7-히드록시쿠마린(A) 과 콘주게이트(B) 로의 대사. 실행 1과 2는 간 절제 수술을 하고 간없는 동물을 생체반응기에 연결후 1시간 및 6시간에 수행되었다.

[표 5]

몬산토 간세포 생체반응기에 의한 리도케인의 모노에틸글리신크실리드(MEGX)로의 대사

Claims

관류입구수단과 관류출구수단을 갖는 함유용기, 상기 관류입구수단 및 상기 관류출구수단과 액 소통되어 있는, 상기 함유용기내의 매트릭스, 그리고 상기 매트릭스내에 포획되어 있는 다수의 간세포 집합체로 이루어지는 간세포 생체반응기.
제1항에 있어서, 상기 간세포 집합체는 구체인 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기.
제1항에 있어서, 상기 간세포 집합체는 상기 매트릭스를 통해 상기 간세포의 관류에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 유리 비이드인 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기.
제1항에 있어서, 상기 간세포 집합체는 연결조직이 없는 것이 필수인 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 적어도 약 3.00 × 10⁶세포/ ㎖ 매트릭스의 간세포 밀도를 갖는 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기.
제1항에 있어서, 상기 간세포 집합체는 세포-세포 접촉에 의해 상기 매트릭스내에서 서로 연결되는 것을 특징으로하는 간세포 생체반응기.
관류입구수단과 관류출구수단을 갖는 함유용기를 제공하는 단계, 상기 관류입구수단 및 상기 관류출구수단과 액 소통되어 있는 매트릭스를 상기 함유용기내에 제공하는 단계, 그리고 상기 매트릭스내에 다수의 간세포 집합체를 포획하는 단계로 이루어지는 생체반응기의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 간세포 집합체는 구체인 것을 특징으로 하는 생체반응기의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 매트릭스는 유리 비이드인 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 간세포 집합체는 연결조직이 없는 것이 필수인 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 매트릭스는 적어도 약 3.00 × 10⁶세포/ ㎖ 매트릭스의 간세포 밀도를 갖는 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 간세포의 세포 집합체는 세포-세포 접촉에 의해 상기 매트릭스내에서 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기의 제조방법.
관류입구수단과 관류출구수단을 갖는 함유용기를 제공하는 단계, 상기 관류입구수단 및 상기 관류출구수단과 액 소통되어 있는 매트릭스를 상기 함유용기내에 제공하는 단계, 상기 함유용기내에 다수의 간세포 집합체를 포획하는 단계, 그리고 배지로 하여금 상기 관류입구수단, 상기 함유용기 및 상기 관류출구수단을 통해 관류되도록 하는 단계로 이루어지는 간세포 생체반응기의 사용방법.
제14항에 있어서, 상기 다수의 간세포 집합체는 구체인 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기의 사용방법.
제14항에 있어서, 상기 간세포 집합체는 상기 매트릭스를 통해 상기 간세포의 관류에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기의 사용방법.
제14항에 있어서, 상기 배지는 대사물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기의 사용방법.
제14항에 있어서, 상기 매트릭스는 유리 비이드인 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기의 사용방법.
제14항에 있어서, 상기 간세포 집합체는 연결조직이 없는 것이 필수인 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기의 사용방법.
제14항에 있어서, 상기 매트릭스는 적어도 약 3.00 × 10⁶세포/ ㎖ 매트릭스의 간세포 밀도를 갖는 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기의 사용방법.
제14항에 있어서, 상기 간세포 집합체는 세포-세포 접촉에 의해 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기의 사용방법.
간 보조장치를 필요로 하는 포유동물로부터 혈액을 추출하는 수단, 세포 및 비세포 성분으로 처리되도록 하기 위해 포유동물의 혈액을 분리하는 수단, 관류입구수단과 관류출구수단을 갖는 함유용기, 상기 관류입구수단 및 상기 관류출구수단과 액 소통되어 있는, 상기 함유용기내의 매트릭스, 그리고 상기 매트릭스내에 포획되어 있는 다수의 간세포 집합체로 이루어지는 간세포 생체반응기, 처리되어야 하는 포유동물의 상기 비세포 혈액성분들을 상기 관류입구수단, 상기 매트릭스 및 상기 관류출구수단을 통해 관류되도록 하는 수단, 상기 처리된 비세포 혈액성분들 및 세포혈액성분들을 상기 포유동물에 복귀하는 수단으로 이루어지는 간 보조장치를 필요로 하는 포유동물을 치료하기 위한 간세포 생체반응기 간 보조 시스템.
제22항에 있어서, 환자쪽 회로와 독립적인 간세포 생체반응기 회로의 유속을 유지하는 수단으로 더 이루어지는 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기 간 보조 시스템.
제22항에 있어서, 상기 간세포 집합체는 구체인 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기 간 보조 시스템.
제22항에 있어서, 상기 간세포 집합체는 상기 매트릭스를 통해 상기 간세포의 관류에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기 간 보조 시스템.
제22항에 있어서, 상기 매트릭스는 유리 비이드인 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기 간 보조 시스템.
제22항에 있어서, 상기 간세포 집합체는 연결조직이 없는 것이 필수인 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기 간 보조 시스템.
제22항에 있어서, 상기 매트릭스는 적어도 약 3.00 × 10⁶세포/ ㎖ 매트릭스의 간세포 밀도를 갖는 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기 간 보조 시스템.
제22항에 있어서, 상기 간세포 집합체는 세포-세포 접촉에 의해 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 간세포 생체반응기 간 보조 시스템.