CN110628702B - 人体肠道上皮细胞模型的构建方法 - Google Patents

人体肠道上皮细胞模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种人体肠道上皮细胞模型的构建方法，涉及细胞模型构建技术领域。所述人体肠道上皮细胞模型，以Caco‑2细胞为模型细胞，并使用含有20％FBS的DMEM培养基在微流控芯片中对所述Caco‑2细胞进行3D培养，从而构建人体肠道上皮细胞的体外模型。一方面，采用人源性细胞培养，避免了采用动物细胞培养导致试验结果不准确的问题，另一方面，3D细胞培养使得肠道细胞拥有了更加类似人体生理学的机械微环境，能够促进肠道细胞分化。因此，本发明构建的人体肠道上皮细胞模型，更清楚、准确地反应了小肠上皮屏障的特性。

Description

人体肠道上皮细胞模型的构建方法
技术领域
本发明涉及细胞模型构建技术领域，特别涉及一种人体肠道上皮细胞模型的构建方法。
背景技术
目前人体肠道上皮细胞模型的构建方法已经建立的有两种，分别是Transwell模型和Gut-on-a-Chip肠道器官模型。
Transwell模型由borchardt和workers在1989年提出。获得了美国FDA的认证。从人肠肿瘤中分离出来的Caco-2细胞，通过在标准塑料培养皿或Transwell插入物中培养这些细胞来研究体外肠道吸收和代谢。虽然这些培养物形成了分子运输的上皮单层屏障，但这些细胞呈现出非生理的鳞状上皮形态(并不是真实生理环境中的柱状突起)，并不能重现人体肠道大多数的细胞分化及组织特异性特征。
Gut-on-a-Chip肠道器官模型是由Hyun Jung Kim等在2012年创建，通过模拟人体肠道结构、运输吸收、生理病理属性以及关键微生物共生体，研制开发成功的仿生微型装置。肠道芯片由两条微流体通道组成，通道被涂有细胞外基质的多孔渗透柔性膜隔开，采用人肠道上皮细胞填满渗透性柔性膜，且通过施加循环应变模拟肠道生理蠕动运动，一个柱状上皮组织迅速向两级分化，自发地生长成折叠肠道绒毛结构，更加精确的模拟肠道复杂结构及生理变化。该模型的缺点是细胞接种过程复杂，需要的时间长，培养过程中需要添加额外的机械装置(蠕动泵，真空控制器)，很难规模化应用。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种人体肠道上皮细胞模型的构建方法，旨在使构建的肠道上皮细胞模型能更清楚、更准确的反应小肠上皮屏障的特性。
为实现上述目的，本发明提出一种人体肠道上皮细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
将Caco-2细胞配制成肠道细胞悬液；
向预热后的DMEM培养基中加入牛血纤维蛋白原，配制成纤维蛋白原母液；
将凝血酶溶解于DPBS中，配制成凝血酶母液；
将所述肠道细胞悬液、DMEM培养基、所述纤维蛋白原母液和所述凝血酶母液混合，配制成细胞凝胶溶液；
将所述细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中，经过恒温孵育至所述细胞凝胶溶液凝胶化后，向所述微流控芯片的上室和下室中均加入含有20％FBS的DMEM培养基，并保持所述微流控芯片的上室和下室之间存在有培养基落差，构建成3D细胞培养芯片；
对所述3D细胞培养芯片进行连续培养，并每天观察其生长状态，待其形成完整的膜结构并分化成柱状上皮结构，然后进行免疫组化，采用激光共聚焦显微镜对所述3D细胞培养芯片进行断层扫描，采集荧光图像进行细胞形态鉴定，并观察到其自发形成波状结构，即构建成肠道上皮细胞模型。
可选地，向预热后的DMEM培养基中加入牛血纤维蛋白原，配制成纤维蛋白原母液的步骤，具体包括：
将DMEM培养基预热至37℃后，加入牛血纤维蛋白原，配制成牛血纤维蛋白原浓度为100mg/mL的纤维蛋白原母液。
可选地，所述肠道细胞悬液、DMEM培养基、所述纤维蛋白原母液和所述凝血酶母液的体积比为(65～70)：9：20：l；和/或，
所述凝血酶母液中，每毫升含有100单位的凝血酶。
可选地，将所述肠道细胞悬液、DMEM培养基、所述纤维蛋白原母液和所述凝血酶母液混合，配制成细胞凝胶溶液的步骤，具体包括：
将所述肠道细胞悬液、DMEM培养基和所述纤维蛋白原母液进行第一次混合，制得第一混合液；
向所述第一混合液中加入所述凝血酶母液，进行第二次混合，制得细胞凝胶溶液；
其中，两次混和必须在冰上进行操作。
可选地，所述肠道细胞悬液中的肠道细胞浓度为(2.0～3.0)×107cell/mL。
可选地，将所述细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中，经过恒温孵育至所述细胞凝胶溶液凝胶化后，向所述微流控芯片的上室和下室中均加入含有20％FBS的DMEM培养基，并保持所述微流控芯片的上室和下室之间存在有培养基落差，构建成3D细胞培养芯片的步骤中：
所述细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中的注入量为10μL/孔；和/或，
所述微流控芯片的上室和下室中加入含有20％FBS的DMEM培养基的差值为20～25μL。
可选地，所述恒温孵育的孵育温度为37℃、孵育时间为50min-70min。
可选地，所述连续培养的培养时间为2～4天。
可选地，所述含有20％FBS的DMEM培养基包括DMEM培养基、FBS、双抗和非必需氨基酸，其中，所述FBS、双抗和非必需氨基酸在所述含有20％FBS的DMEM培养基中的体积分数对应为20％、1％和1％。
本发明提供的技术方案中，通过以Caco-2细胞为模型细胞，并使用含有20％FBS的DMEM培养基在微流控芯片中进行3D培养，对所述3D细胞培养芯片进行连续培养，从而构建人体肠道上皮细胞模型。一方面，采用人源性细胞培养，避免了采用动物细胞培养导致试验结果不准确的问题，另一方面，3D细胞培养使得肠道细胞拥有了更加类似人体生理学的机械微环境，即提供提高细胞分化需要的自然机械微环境(固定的液体流动速度和剪切力)的微流控芯片中培养，与人体小肠内的环境相似，允许细胞在体外各个方向上生长，使细胞分化能力更加充分的表达。因此，本发明构建的人体肠道上皮细胞模型能够更清楚、准确地反应了小肠上皮屏障的特性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的肠道上皮细胞模型的构建方法的一实施例中所采用的微流控芯片的结构示意图；
图2为图1提供的局部区域A处在细胞连续培养0h后形成3D细胞体系的100倍明场光图片；
图3为图2中的细胞连续培养48h后形成3D细胞体系的100倍明场光图片；
图4为图2中细胞生长2天时紧密连接蛋白ZO-1的100倍荧光显微镜图像；
图5为图2中细胞生长2天时细胞核构成的100倍荧光显微镜图像；
图6为图2中细胞生长2天时紧密连接蛋白ZO-1和细胞核构成的100倍荧光显微镜组合图像；
图7为图2中细胞生长2天时紧密连接蛋白ZO-1的200倍荧光显微镜图像；
图8为图2中细胞生长2天时细胞核构成的200倍荧光显微镜图像；
图9为图2中细胞生长2天时紧密连接蛋白ZO-1和细胞核构成的200倍荧光显微镜组合图像；
图10为图2中细胞在微流控芯片上生长4天时的紧密连接蛋白ZO-1激光共聚焦显微镜100倍荧光图像；
图11为图2中细胞在微流控芯片上生长4天时的紧密连接蛋白ZO-1激光共聚焦显微镜200倍荧光图像；
图12为图3中细胞在微流控芯片上生长4天时的紧密连接蛋白ZO-1激光共聚焦显微镜断层扫描的Z-堆叠200倍图像的3D重建图像；
图13为图2中细胞在微流控芯片上生长4天时40×粘液图像；
图14为图2中细胞在微流控芯片上生长4天时100×粘液图像；
图15为图2中细胞在微流控芯片上生长7天时40×粘液图像；
图16为图2中细胞在微流控芯片上生长7天时100×粘液图像；
图17为图2中细胞在微流控芯片中生长4天时，载入荧光微粒在人体肠道上皮细胞模型100×下的运行轨迹图；
图18为图17中载入荧光微粒在肠道上皮细胞模型的运行5分钟后的40×荧光显微镜下的图像。
Figure BDA0002237830690000041
Figure BDA0002237830690000051
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
现有的人体肠道上皮细胞模型的构建方法主要有两种，分别是Transwell模型和Gut-on-a-Chip肠道器官模型。Transwell模型是形成了分子运输的上皮单层屏障，但这些细胞呈现出非生理的鳞状上皮形态(并不是真实生理环境中的柱状突起)，并不能重现人体肠道大部分的细胞分化及组织特异性特征。Gut-on-a-Chip肠道器官模型的细胞接种过程复杂，培养过程中需要添加额外的机械装置(蠕动泵，真空控制器)，很难规模化应用。鉴于此，本发明提出一种人体肠道上皮细胞模型的构建方法，操作简单，并且构建的人体肠道上皮细胞模型，能更清楚、准确地反应了小肠上皮屏障的特性。
本发明提出一种人体肠道上皮细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤S10、将Caco-2细胞配制成肠道细胞悬液；
本发明的技术方案中，所述Caco-2细胞(购自中国典型培养物保藏中心，湖北武汉)。Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。因此，Caco-2细胞可以用来进行培养来模拟体内肠转运的实验。
首先，将购买的Caco-2细胞使用DMEM完全培养基进行复苏培养。所述DMEM完全培养基包括FBS、双抗、非必须氨基酸、DMEM培养基。其中，所述DMEM培养基为DMEM高糖培养基(Gibco公司)；所述FBS(Gibco公司)、双抗(Gibco公司)和非必需氨基酸(SIGMA公司)在所述DMEM完全培养基中的体积分数对应为10％、1％和1％。也就是说，配制100ml DMEM完全培养基需要向88mlDMEM高糖培养基中加入10mlFBS、1ml双抗、1ml非必须氨基酸。然后，将复苏后的Caco-2细胞培养至细胞融合度达80～90％时，收集细胞悬液，获得肠道细胞悬液。
具体地，细胞复苏培养是指将冻存在液氮或者-80℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程,培养过程一般包括：(1)从液氮容器或冰箱中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；(2)从37℃水浴中取出冻存管，在超净工作台中打开盖子，用移液枪吸出细胞悬液,加入到离心管中并滴加10倍以上所述DMEM完全培养基，混匀后，以1200rpm的转速离心，5min；(3)弃去上清液后，向离心管中加入DMEM完全培养基，计数，调整细胞密度,然后接种至培养瓶中，将培养瓶置于37℃的培养箱中静置培养(每隔一天或者两天更换一次培养液)。在本实施例中，步骤(3)中优选为调整细胞密度为l×l06cell/mL；步骤(4)中静置培养的培养条件为：培养温度37℃、培养湿度95％、CO2浓度5％。培养至细胞融合度达80～90％时，即可收集肠道细胞悬液。为了使微流控芯片中的细胞生长状态更好，调整所述肠道细胞悬液中的肠道细胞浓度为(2.0～3.0)×107cell/mL。
步骤S20、向预热后的DMEM培养基中加入牛血纤维蛋白原，配制成纤维蛋白原母液；
所述DMEM培养基为DMEM高糖培养基，具体地，将DMEM高糖培养基预热至37℃后，加入牛血纤维蛋白原，配制成牛血纤维蛋白原浓度为100mg/mL的纤维蛋白原母液。
步骤S30、将凝血酶溶解于DPBS中，配制成凝血酶母液；
所述DPBS指不含钙、镁离子的磷酸盐缓冲液PBS，本实施例中，所述DPBS购自Gibco公司。具体地，配制的所述凝血酶母液中，每毫升含有100单位的凝血酶。
需要说明的是，上述步骤S10、S20、S30的先后顺序不仅限于此，也可以任意调整配制所述肠道细胞悬液、所述纤维蛋白母液和所述凝血酶母液的先后顺序，只需要保证在步骤S40之前，分别配制成所述肠道细胞悬液、所述纤维蛋白母液和所述凝血酶母液即可。
步骤S40、将所述肠道细胞悬液、DMEM培养基、所述纤维蛋白原母液和所述凝血酶母液混合，配制成细胞凝胶溶液；
在进行步骤S40时，为了避免凝血酶溶液接触到血清而导致整个系统凝胶成为固体，可以通过如下步骤实现：
步骤S41、将所述肠道细胞悬液、DMEM培养基和所述纤维蛋白原母液进行第一次混合，制得第一混合液；
步骤S42、向所述第一混合液中加入所述凝血酶母液，进行第二次混合，制得细胞凝胶溶液。
其中，两次混和必须在冰上进行操作。
具体地，所述肠道细胞悬液、DMEM培养基、所述纤维蛋白原母液和所述凝血酶母液的体积比为(65～70)：9：20：l。此外，为了保证所述纤维蛋白原母液和所述凝血酶母液的活性，所述第一次混合和第二次混合操作均在冰上进行。所述DMEM培养基为DMEM高糖培养基。
步骤S50、将所述细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中，经过恒温孵育至所述细胞凝胶溶液凝胶化后，向所述微流控芯片的上室和下室中均加入含有20％FBS的DMEM培养基，并保持所述微流控芯片的上室和下室之间存在有培养基落差，构建成3D细胞培养芯片；
本实施例中，所述微流控芯片由AIM Biotech(Singapore)公司定制，型号为DAX-1，具有以下功能：模块化平台，可以培养细胞并形成3D结构；可以兼容多种凝胶基质，包括胶原蛋白、Matrigel、纤维蛋白；应用化学梯度和流动(通透性)为研究、药物开发和临床研究开发的器官型模型；芯片材料结构合理有利于荧光和共焦显微镜成像。
请参阅图1所示，所述微流控芯片100包括上室和下室，所述上室包括第一上室1和第二上室2，所述下室包括第一下室3和第二下室4，所述上室和下室之间设有2个细胞注入口5，任选一边用于向所述微流控芯片中的细胞凝胶溶液通道8中注入所述细胞凝胶溶液，所述第一上室1和第二上室2的一侧设有上室培养基通道6，所述第一下室3和第二下室4的一侧设有下室培养基通道7，所述上室和下室中注入所述含有20％FBS的DMEM培养基分别经过上室培养基注通道6和下室培养基注通道7来给细胞培养微流控芯片提供营养和机械微环境，且所述上室和下室中的培养基应定时每天进行两次更换。
高血清的培养基有助于细胞分化，为了助于所述Caco-2细胞的分化，所述含有20％FBS的DMEM培养基包括DMEM培养基、FBS、双抗和非必需氨基酸，其中，所述FBS、双抗和非必需氨基酸在所述含有20％FBS的DMEM培养基中的体积分数对应为20％、1％和1％。所述DMEM培养基为DMEM高糖培养基。所述含有20％FBS的DMEM培养基，其具体配制方式同上文DMEM完全培养基的配制，只是体积分数有所变化，在此不做赘述。
为了适于所述Caco-2细胞的生长，所述恒温孵育的孵育温度为37℃、孵育时间为50min～70min，优选为60min。
具体地，配制完所述细胞凝胶溶液后，迅速将新制的所述细胞凝胶溶液以10μL/孔的量加入到所述微流控芯片100的细胞注入口5中，然后将所述微流控芯片置于温度为37℃的培养箱中孵育lh，待注入的所述细胞凝胶溶液凝胶化后，此时，所述细胞凝胶溶液中的混合细胞固定在所述微流控芯片中，且处于分散状态。请参阅图2，细胞连续培养0h后形成3D细胞体系的100倍明场光图片所示，图中细胞为Caco-2细胞；然后向所述微流控芯片的上室和下室中注入含有20％FBS的DMEM培养基，并保持所述上室和下室之间存在有培养基落差，例如，在上室和下室中分别加入70μL和50μL的培养基，上室和下室之间存在有20μL的培养基落差，使得培养基在一定时间内由于存在势能差而保持流动性，进而使所述微流控芯片100形成有利于提高细胞分化需要的自然机械微环境(固定的液体流动速度和剪切力)，并保持每天更换两次新鲜的培养基，即构建成肠道3D细胞培养芯片。
步骤S60、对所述3D细胞培养芯片进行连续培养，并每天观察其生长状态，待其形成完整的膜结构并分化成柱状上皮结构，然后进行免疫组化，采用激光共聚焦显微镜对所述3D细胞培养芯片进行断层扫描，采集荧光图像进行细胞形态鉴定，并观察到其自发形成波状结构，即构建成肠道上皮细胞模型。
在对所述3D细胞培养芯片进行连续培养的过程中，每天对所述3D细胞培养芯片进行观察，采集图像进行细胞形态鉴定。请参阅图2和图3，图2和图3分别为细胞连续培养0h和48h后形成3D细胞体系的100倍明场光图片，可以观察到在培养的第2天形成平面上皮单层。
所述连续培养的培养条件设置为：培养温度37℃、培养湿度95％、CO2浓度5％，并每天更换两次培养基。
请参阅图4至图6，图4至图6分别为所述微流控芯片上的Caco-2细胞生长2天时紧密连接蛋白ZO-1的100倍荧光图像、细胞核的100倍荧光图像、紧密连接蛋白ZO-1和细胞核构成的100倍荧光组合图像。请参阅图7至图9，图7至图9分别为所述微流控芯片上的Caco-2细胞生长2天时紧密连接蛋白ZO-1的200倍荧光图像、细胞核的200倍荧光图像、紧密连接蛋白ZO-1和细胞核构成的200倍荧光组合图像。由上述图可以看出，细胞边界形成了轮廓分明的紧密连接组织，即Caco-2细胞在微流控芯片培养2天后形成了连续的平面上皮单层(紧密连接蛋白ZO-1用绿色荧光以488nm激发,以509nm发射光成像；细胞核蓝色荧光以405nm激发，以421nm发射光成像，使用荧光显微镜进行观察)。
图10为Caco-2细胞在所述微流控芯片中连续培养4天时的激光共聚焦显微镜100倍荧光图像，观察到细胞形成了一个波动的上皮细胞，其形态类似肠绒毛，排列这些绒毛的Caco-2细胞在它们的顶端表面的细胞间边界形成了轮廓分明的紧密连接组织；这些起伏的结构确实是发育良好的肠绒毛，肠绒毛的形成还导致模拟人肠吸收效率的肠表面积增加，具体形态如图11所示，图11为Caco-2细胞在所述微流控芯片中连续培养4天时的紧密连接蛋白ZO-1激光共聚焦显微镜200×倍荧光图像。
请参阅图12，图12为Caco-2细胞在所述微流控芯片中生长4天时的紧密连接蛋白ZO-1激光共聚焦显微镜断层扫描的Z-堆叠200倍图像的3D重建图像，可以观察到紧密连接蛋白ZO-1染色的z堆叠图像的3D荧光显微重建中，延伸的绒毛结构更加明显。其中，紧密连接蛋白ZO-1绿色荧光以488nm激发，以509nm发射光成像。
因此，在连续培养2天后，观测到的Caco-2细胞出现了一定的肠道上皮细胞的细胞形态，但不明显。到连续培养4天时，采集荧光图像进行细胞形态鉴定，观察到肠道细胞在所述3D细胞培养芯片上培养到细胞形成完整的上皮细胞膜结构和分化成柱状上皮，并自发形成波状结构，即人体肠道上皮细胞的体外模型构建成功。所以，所述连续培养的培养时间为2～4天。
本发明提供的技术方案中，通过以Caco-2细胞为模型细胞，并使用含有20％FBS的DMEM培养基在微流控芯片中进行3D培养，对所述3D细胞培养芯片进行连续培养，从而构建人体肠道上皮细胞模型。一方面，采用人源性细胞培养，避免了采用动物细胞培养导致试验结果不准确的问题，另一方面，3D细胞培养使得肠道细胞拥有了更加类似人体生理学的机械微环境，即提供提高细胞分化需要的自然机械微环境(固定的液体流动速度和剪切力)的微流控芯片中培养，与人体小肠内的环境相似，允许细胞在体外各个方向上生长，使细胞分化能力更加充分的表达。因此，本发明构建的人体肠道上皮细胞模型能够更清楚、准确地反应了小肠上皮屏障的特性。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)肠道细胞悬液的制备：先配制DMEM完全培养基：88％DMEM高糖培养基+10％FBS+1％双抗+1％非必须氨基酸。取购买之后存放于液氮的Caco-2细胞在37℃水浴中融化后，滴加10倍DMEM完全培养基，混匀后，以1200rpm的转速离心5min；弃去上清液后，向离心管中加入DMEM完全培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度为l×l06cell/mL，然后接种至培养瓶中，将培养瓶置于37℃、95％湿度、5％CO2浓度的培养箱中静置培养(每隔两天更换一次培养液)。直至将Caco-2细胞培养到细胞融合度达80～90％时，收集肠道细胞悬液，并将肠道细胞悬液中的肠道细胞浓度调整为(2.0～3.0)×107cell/mL，即为获得的肠道细胞悬液。
(2)纤维蛋白原母液的配制：将DMEM高糖培养基预热至37℃后，加入牛血纤维蛋白原，配制成牛血纤维蛋白原浓度为100mg/mL的纤维蛋白原母液。
(3)凝血酶母液的配制：将凝血酶溶解于DPBS中，配制成每毫升含有100单位的凝血酶凝血酶母液。
(4)细胞凝胶溶液的配制：取1300μL肠道细胞悬液、180μL DMEM高糖培养基和400μL纤维蛋白原母液进行第一次混合，制得第一混合液；向第一混合液中加入20μL凝血酶母液，进行第二次混合，制得细胞凝胶溶液，所有的混合操作均在冰上进行。
(5)3D细胞培养芯片的制备：迅速将上述配制的细胞凝胶溶液以10μL/孔的量加入到微流控芯片(由AIMBiotech，Singapore定制)的细胞注入口中，然后将微流控芯片置于37℃的培养箱中孵育1h，直至所述细胞凝胶溶液凝胶化后，再向微流控芯片的上室培养基注入口和下室培养基注入口中均加入含有20％FBS的DMEM培养基，并保持上室和下室之间存在20μL的培养基落差，即制备成3D细胞培养芯片，保持每天更换两次新鲜的含有20％FBS的DMEM培养基。
(6)3D细胞培养芯片的培养：对所述3D细胞培养芯片进行连续培养2～4天，并每天观察其生长状态，待其形成完整的膜结构并分化成柱状上皮结构，然后进行免疫组化，采用激光共聚焦显微镜对所述3D细胞培养芯片进行断层扫描，采集荧光图像进行细胞形态鉴定，并观察到其自发形成波状结构，即构建成肠道上皮细胞模型。
实施例2
(1)肠道细胞悬液的制备：先配制DMEM完全培养基：88％DMEM高糖培养基+10％FBS+1％双抗+1％非必须氨基酸。取购买之后存放于液氮的Caco-2细胞在37℃水浴中融化后，滴加10倍DMEM完全培养基，混匀后，以1200rpm的转速离心5min；弃去上清液后，向离心管中加入DMEM完全培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度为l×l06cell/mL，然后接种至培养瓶中，将培养瓶置于37℃、95％湿度、5％CO2浓度的培养箱中静置培养(每隔一天更换一次培养液)。直至将Caco-2细胞培养到细胞融合度达80～90％时，收集肠道细胞悬液，并将肠道细胞悬液中的肠道细胞浓度调整为(2.0～3.0)×107cell/mL，即为获得的肠道细胞悬液。
(2)纤维蛋白原母液的配制：将DMEM高糖培养基预热至37℃后，加入牛血纤维蛋白原，配制成牛血纤维蛋白原浓度为100mg/mL的纤维蛋白原母液。
(3)凝血酶母液的配制：将凝血酶溶解于DPBS中，配制成每毫升含有100单位的凝血酶凝血酶母液。
(4)细胞凝胶溶液的配制：在冰上，取700μL肠道细胞悬液、90μL DMEM高糖培养基和200μL纤维蛋白原母液进行第一次混合，制得第一混合液；在冰上，向第一混合液中加入10μL凝血酶母液，进行第二次混合，制得细胞凝胶溶液，所有的混合操作均在冰上进行。
(5)3D细胞培养芯片的制备：迅速将上述配制的细胞凝胶溶液以10μL/孔的量加入到微流控芯片(由AIMBiotech，Singapore定制)的细胞注入口中，然后将微流控芯片置于37℃的培养箱中孵育50min，直至所述细胞凝胶溶液凝胶化后，再向微流控芯片的上室培养基注入口和下室培养基注入口中均加入含有20％FBS的DMEM培养基，并保持上室和下室之间存在25μL的培养基落差，即制备成3D细胞培养芯片，保持每天更换两次新鲜的含有20％FBS的DMEM培养基。
(6)3D细胞培养芯片的培养：对所述3D细胞培养芯片进行连续培养2～4天，并每天观察其生长状态，待其形成完整的膜结构并分化成柱状上皮结构，然后进行免疫组化，采用激光共聚焦显微镜对所述3D细胞培养芯片进行断层扫描，采集荧光图像进行细胞形态鉴定，并观察到其自发形成波状结构，即构建成肠道上皮细胞模型。
实施例3
(1)肠道细胞悬液的制备：先配制DMEM完全培养基：88％DMEM高糖培养基+10％FBS+1％双抗+1％非必须氨基酸。取购买之后存放于液氮的Caco-2细胞在37℃水浴中融化后，滴加10倍DMEM完全培养基，混匀后，以1200rpm的转速离心5min；弃去上清液后，向离心管中加入DMEM完全培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度为l×l06cell/mL，然后接种至培养瓶中，将培养瓶置于37℃、95％湿度、5％CO2浓度的培养箱中静置培养(每隔两天更换一次培养液)。直至将Caco-2细胞培养到细胞融合度达80～90％时，收集肠道细胞悬液，并将肠道细胞悬液中的肠道细胞浓度调整为(2.0～3.0)×107cell/mL，即为获得的肠道细胞悬液。
(2)纤维蛋白原母液的配制：将DMEM高糖培养基预热至37℃后，加入牛血纤维蛋白原，配制成牛血纤维蛋白原浓度为100mg/mL的纤维蛋白原母液。
(3)凝血酶母液的配制：将凝血酶溶解于DPBS中，配制成每毫升含有100单位的凝血酶凝血酶母液。
(4)细胞凝胶溶液的配制：取1340μL肠道细胞悬液、180μL DMEM高糖培养基和400μL纤维蛋白原母液进行第一次混合，制得第一混合液；向第一混合液中加入20μL凝血酶母液，进行第二次混合，制得细胞凝胶溶液，所有的混合操作均在冰上进行。
(5)3D细胞培养芯片的制备：迅速将上述配制的细胞凝胶溶液以10μL/孔的量加入到微流控芯片(由AIMBiotech，Singapore定制)的细胞注入口中，然后将微流控芯片置于37℃的培养箱中孵育70min，至所述细胞凝胶溶液凝胶化后，再向微流控芯片的上室培养基注入口和下室培养基注入口中均加入含有20％FBS的DMEM培养基，并保持上室和下室之间存在20μL的培养基落差，即制备成3D细胞培养芯片，保持每天更换两次新鲜的含有20％FBS的DMEM培养基。
(6)3D细胞培养芯片的培养：对所述3D细胞培养芯片进行连续培养2～4天，并每天观察其生长状态，待其形成完整的膜结构并分化成柱状上皮结构，然后进行免疫组化，采用激光共聚焦显微镜对所述3D细胞培养芯片进行断层扫描，采集荧光图像进行细胞形态鉴定，并观察到其自发形成波状结构，即构建成肠道上皮细胞模型。
(一)、细胞模型的杯状细胞的鉴定
肠道杯状细胞能够分泌粘液，其中的一部分杯状细胞能够产生酸性黏多糖，用阿尔新蓝溶液对三维培养体系中的粘液进行鉴定。为了染色肠黏液内的酸性黏液多糖，在微流控芯片上培养的Caco-2细胞用PFA(4％，w/v)固定，用1％(w/v)阿利新蓝溶液(pH 2.5)在3％乙酸(Sigma)中染色30分钟，然后用PBS洗涤，使用明场光观察，具体形态见图13和图14，图13和图14分别为细胞在微流控芯片连续培养4天后形成3D细胞体系的40x，100x粘液图像。
由图13和图14可以看出，细胞在微流控芯片连续培养4天后，产生了酸性黏多糖，也就是说本发明构建的肠道上皮细胞模型分化出了杯状细胞。
图15和图16分别为细胞在微流控芯片连续培养7天后形成3D细胞体系的40x，100x粘液图像。由图15和图16可以看出，所述肠道上皮细胞模型继续产生酸性黏多糖，也就是还存在杯状细胞，杯状细胞会继续分泌出酸性黏多糖，进而言之，所述人体肠道上皮细胞模型继续维持。
(二)、细胞模型的上皮屏障功能鉴定
在上述实施例1的步骤(6)之后，向人体肠道上皮细胞模型的3D细胞培养芯片中培养基体积高的一侧载入微粒，载入的微粒由于液体压力在肠道上皮模型中持续流动，因此，通过荧光显微镜观测载入的微粒在肠道上皮细胞模型的运行轨迹，可以验证小肠上皮模型的通透性。微粒的运行轨迹的结果见图17和图18所示，图17为3D细胞培养芯片中细胞生长4天时，载入荧光微粒在人体肠道上皮细胞模型的运行轨迹，箭头表明荧光微粒的运行轨迹。图18为3D细胞培养芯片中细胞中生长4天时，载入荧光微粒在肠道上皮细胞模型的运行5分钟后的图像。
由图17和图18可以观测到微粒在肠道上皮屏障中移动并随着流体流动，通过肠道上皮细胞模型而迁移，载入荧光微粒在人体肠道上皮细胞模型的运行轨迹，说明由Caco-2细胞生成的上皮细胞模型的肠道上皮屏障功能已重现，表现出很好的结构完整性。
综上所述，本发明构建的肠道上皮细胞模型，比现有技术的细胞模型模拟小肠的功能和生理特征更清楚、准确。并且该模型建立成功后可以维持三天以上，预计可以完成与肠道微生物的共培养，因此，所述人体肠道上皮细胞模型可能是一个新的甚至是潜在的强大的替代平台，用于研究人体肠道生理学，胃肠道疾病，毒理学和药物开发。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种人体肠道上皮细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将Caco-2细胞配制成肠道细胞悬液；
向预热后的DMEM培养基中加入牛血纤维蛋白原，配制成纤维蛋白原母液；
将凝血酶溶解于DPBS中，配制成凝血酶母液；
将所述肠道细胞悬液、DMEM培养基、所述纤维蛋白原母液和所述凝血酶母液混合，配制成细胞凝胶溶液；
将所述细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中，经过恒温孵育至所述细胞凝胶溶液凝胶化后，向所述微流控芯片的上室和下室中均加入含有20％FBS的DMEM培养基，并保持所述微流控芯片的上室和下室之间存在有培养基落差，构建成3D细胞培养芯片；
对所述3D细胞培养芯片进行连续培养，并每天观察其生长状态，待其形成完整的膜结构并分化成柱状上皮结构，然后进行免疫组化，采用激光共聚焦显微镜对所述3D细胞培养芯片进行断层扫描，采集荧光图像进行细胞形态鉴定，并观察到其自发形成波状结构，即构建成肠道上皮细胞模型；
其中，所述微流控芯片包括上室和下室，所述上室包括第一上室和第二上室，所述下室包括第一下室和第二下室，所述上室和下室之间设有2个细胞注入口，任选一边用于向所述微流控芯片中的细胞凝胶溶液通道中注入所述细胞凝胶溶液，所述第一上室和第二上室的一侧设有上室培养基通道，所述第一下室和第二下室的一侧设有下室培养基通道。
2.如权利要求1所述的人体肠道上皮细胞模型的构建方法，其特征在于，向预热后的DMEM培养基中加入牛血纤维蛋白原，配制成纤维蛋白原母液的步骤，具体包括：
将DMEM培养基预热至37℃后，加入牛血纤维蛋白原，配制成牛血纤维蛋白原浓度为100mg/mL的纤维蛋白原母液。
3.如权利要求1所述的人体肠道上皮细胞模型的构建方法，其特征在于，所述肠道细胞悬液、DMEM培养基、所述纤维蛋白原母液和所述凝血酶母液的体积比为(65～70)：9：20：l；和/或，
所述凝血酶母液中，每毫升含有100单位的凝血酶。
4.如权利要求1所述的人体肠道上皮细胞模型的构建方法，其特征在于，将所述肠道细胞悬液、DMEM培养基、所述纤维蛋白原母液和所述凝血酶母液混合，配制成细胞凝胶溶液的步骤，具体包括：
将所述肠道细胞悬液、DMEM培养基和所述纤维蛋白原母液进行第一次混合，制得第一混合液；
向所述第一混合液中加入所述凝血酶母液，进行第二次混合，制得细胞凝胶溶液；
其中，两次混合必须在冰上进行操作。
5.如权利要求1所述的人体肠道上皮细胞模型的构建方法，其特征在于，所述肠道细胞悬液中的肠道细胞浓度为(2.0～3.0)×107cell/mL。
6.如权利要求1所述的人体肠道上皮细胞模型的构建方法，其特征在于，将所述细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中，经过恒温孵育至所述细胞凝胶溶液凝胶化后，向所述微流控芯片的上室和下室中均加入含有20％FBS的DMEM培养基，并保持所述微流控芯片的上室和下室之间存在有培养基落差，构建成3D细胞培养芯片的步骤中：
所述细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中的注入量为10μL/孔；和/或，
所述微流控芯片的上室和下室中加入含有20％FBS的DMEM培养基的差值为20～25μL。
7.如权利要求1所述的人体肠道上皮细胞模型的构建方法，其特征在于，所述恒温孵育的孵育温度为37℃、孵育时间为50min-70min。
8.如权利要求1所述的人体肠道上皮细胞模型的构建方法，其特征在于，所述连续培养的培养时间为2～4天。
9.如权利要求1所述的人体肠道上皮细胞模型的构建方法，其特征在于，所述含有20％FBS的DMEM培养基包括DMEM培养基、FBS、双抗和非必需氨基酸，其中，所述FBS、双抗和非必需氨基酸在所述含有20％FBS的DMEM培养基中的体积分数对应为20％、1％和1％。
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