JPH03198782A - 遺伝子導入用キャリアー、該キャリアーと遺伝子との複合体及び細胞への遺伝子導入法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は遺伝子導入用のキャリアー　該キャリアーと遺
伝子との複合体及び該複合体を細胞に取（従来の技術） 近年、単離された遺伝子やクローン化された遺伝子を細
胞内へ導入する技術によりその遺伝子の形質発現調節の
解析や細胞の形態変化の解明等について種々の基礎的知
見が得られるようになった。

又、医薬等の分野における有用物質の生産や遺伝性疾患
の治療を目的とした遺伝子の動物細胞への導入技術も極
めて重要なものとなっている。

細胞内に遺伝子を導入するために従来から種々の技術が
開発されてきた。例えば、細胞の食合作用を利用する燐
酸カルシウム共沈法［Ｆ　、Ｌ　。

Ｇｒａｈａｍ等”Ｊ、　Ｖｌｒｏｌｏｇｙ”第５２巻、
第４５６頁（１９７３年）］、多価カチオンを利用した
ＤＥＡＥｄｅｘｔｒａｎ法［Ｊ、　Ｈ，ＭｃＯｕｔｃｈ
ａｎ等”Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、”第
４１巻、第３５１頁（１９１１ｉ８年）］、ポリブレン
法［Ｓ、　Ｋａｗａｌ等”Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｌｏ
ｌ、”第４巻、第１１７２頁（１９８４年）］、細胞内
に物理的な方法で穴をあけて注入するマイクロインジェ
クション法［Ｆ、　Ｙａｍａｍｏｔｏ等”Ｅｘｐ、　Ｃ
ｅ１ｌ　Ｒｅｓ、”第１４２巻、第７９頁（１９８２年
）］、細胞質膜との融合能を利用したリポソーム融合法
［Ｇ。

Ｇｒｅｇｏｒｊａｄｉｓ　”Ｎａｔｕｒｅ”第２８３巻
、第８１４頁（１９８０年）コ及びリボフェクション法
［Ｐ、　Ｌ。

Ｆｅｌｇｎｅｒ等”Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ”第８４巻、第７４１３頁（１９
８７年）］等の諸方法がある。

（発明が解決しようとする課題） 上述の従来提案されてきた細胞への遺伝子導入法は、そ
れぞれ何等かの課題を有している。例えば、最も汎用さ
れている燐酸カルシウム共沈法においては生成し得る沈
澱粒子の大きさが細胞への取り込みに重大な影響を与え
るために沈澱粒子の大きさを注意深く揃える必要があり
、細胞の種類によっては遺伝子の導入が困難な場合もあ
り、更に食食能が低い細胞や浮遊細胞には有効とは云え
ない点に課題がある。マイクロインジェクション法は操
作に熟練を要し、−度に多くの細胞を処理することがで
きず、従って操作性と処理能力に難点がある。リポソー
ム融合法やりポフェクション法はリポソームの調製操作
が容易でない点及びリポソーム構成脂質の酸化等が生じ
易く、従って安一 定性が低いために保存が困難である点に課題ををしてい
る。更にＮ　　ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ法やポリブレ
ン法は操作が簡単であるが、合成高分子であるために遺
伝性疾患の治療を目的とする場合に生体への適応性に関
して課題を残しており、又遺伝子の導入量が比較的低い
点に課題がある。

（課題を解決するための手段及び作用）本発明者等は生
体に対して安全性が高いこと、−度に多数の細胞の処理
が可能なこと、安定性が高く保存性に優れていること、
更に操作が容易であることを主眼として検討を重ねた結
果、水溶性の低分子量キトサンをキャリアーとして該キ
ャリアーと遺伝子との複合体を調製し、該複合体と細胞
とを接触させ、更に細胞膜透過性を増強する剤を添加す
れば、遺伝子を細胞に効率良く導入することができ、こ
れにより上述した従来法における種々の課題を一挙に解
決し得ることを見い出して本発明を完成するに至った。

従って、本発明の本質的な特徴は低分子量キトサンを細
胞への遺伝子導入用キャリアーとするこ− とにあり、他の特徴は低分子量キトサンと遺伝子との複
合体にあり、又更に他の特徴は上記の低分子量キトサン
と遺伝子との複合体を細胞と接触させた後に細胞膜透過
性を増強する剤を添加する、細胞への遺伝子導入法にあ
る。

本発明において用いられる低分子量キトサンは特開平１
−１８５３０１公報に記載の方法により天然のキチンか
ら得られるキトサンの低分子化合物であり、０．１−１
．０　ｄｌ／ｇ程度の固有粘度（η）（３０℃、０．２
Ｎ酢酸＋０．ＩＮ酢酸ナトリウム溶液を用いて測定）を
有しているものが適当である。また本発明において上記
の低分子量キトサンは水溶液の形で用いられ、この場合
に滅菌乃至除菌されていることが好ましく、その処理方
法としてはオートクレーブによる高圧蒸気滅菌でも濾過
除菌でも差し支えないが、操作性の面から濾過除菌の方
が好ましい。本発明において使用される低分子量キトサ
ンは合成高分子ではなく天然に存在するキチンより得ら
れたものであるので、合成高分子が有している生体適応
性に関する問題は生じない。

本発明による低分子量キトサンと遺伝子との複合体を調
製する場合に、遺伝子に対する低分子量キトサンの重量
比は導入した細胞での形質発現に影響を与えることが判
明した。この点に関して、実験によれば、遺伝子に対し
て低分子量キトサンの重量比を４０−１０００倍、好ま
しくは５０−８００倍に設定するのが適当である。複合
体を形成させる場合に格別の制限はなく両者を試験管内
で混合、攪拌するだけで静電気的な結合により容易に複
合体となる。

上述した条件により低分子量キトサンと遺伝子との複合
体を調製し、目的とする細胞に添加する際、細胞膜に上
記複合体を静電結合させるためには低分子量キトサンの
解離を充分に行わしめる必要がある。従って、この場合
に１）Ｈ７，５以下の緩衝液又は血清を含まない培地を
用いることが好ましい。この際に、複合体を充分に細胞
膜に付着させることが重要であり、これは細胞と複合体
との接触時間に依存する。所要接触時間は遺伝子の導入
されるべき細胞により異なるので、予備実験を行って至
適所要時間を設定すべきである。尚、この操作において
所定時間にわたり細胞と接触させた後、低分子量キトサ
ン−遺伝子複合体液は後述の細胞膜透過性を増強する剤
の濃度を低下させない観点から系外に除去することが望
ましい。

本発明による細胞への遺伝子導入は２段階の工程を経て
、即ち、上述した方法により正電荷を帯びた低分子量キ
トサンと遺伝子との複合体を負に荷電している細胞膜に
付着させる工程と、次いで細胞膜から細胞内へ遺伝子含
有複合体を取り込ませる工程を経て行われる。

後者の工程において、複合体と接触させた後に更に細胞
膜透過性を増強する剤を加えることにより形質転換頻度
を上昇させることができる。このための増強剤としては
、その効果があるものであれば格別の制限はなく、例え
ばジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、ジ
エチレングリコール、グリセロール及びスクロースやマ
ンニトール等の高張液を単独で又は混合物の形で用いる
ことができるが、これらの剤による処理は細胞に対して
損傷を与える可能性があるために、遺伝子導入に先立ち
至適条件を検討しておくことが望ましい。キトサンと遺
伝子との複合体を細胞内に取り込ませる操作についても
格別の制限はないが、例えば低分子量キトサンと遺伝子
との複合体を細胞と接触させた後に複合体液を除去し、
次いで細胞膜透過性を増強する剤を添加し、設定された
至適条件下に当該増強剤と細胞とを所定時間接触させる
ことにより行うことができる。

本発明方法に従い、叙上のように、低分子量キトサンを
遺伝子のキャリアーとして細胞への遺伝子導入を行えば
、従来から汎用されてきたＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ法
におけるよりも高い効率で遺伝子を細胞内に取り込ませ
ることができる。

（実施例等） 次に、実施例により本発明を更に詳細に且つ具体的に説
明する。

尚、以下の実施例中で言及されている原料、試薬、試験
法等は下記の通りである。

− ａ）低分子量キトサン： 特開平１−１８５３０１公報の実施例１−３に記載され
ている製法により得られ、固有粘度（η）が０．３０及
び０．４５　ｄｌ／ｇのもの。

ｂ）　ｐｃＨ１１０プラスミド　： ファルマシア社から市販のモノ。

Ｃ）グリセロール： 和光純薬工業株式会社から市販のもの。

ｄ）　Ｃ！０Ｓ−１細胞（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬＩＧ
５０）　：ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓細胞であ
って、大日本製薬株式会社から市販のもの。

ｅ）　ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ法による遺伝子の細胞
導入法： 市販のＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ法トランスフェクショ
ンキット（ストラテジーン社製）を用いて常法により行
われた。

ｆ）β−ガラクトシダーゼ活性の測定法：遺伝子導入を
行った細胞の抽出液における　β−ガラクトシダーゼの
酵素活性を、文献 ”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”第　３５２　頁、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、　（１９７２年）
に記載の方法に従って定量した。

ｇ）細胞抽出液中の蛋白の定量法： 文献”Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”
第７２巻）第２９６頁（１９８１年）に記載の方法に従
って定量した。

支直桝」 （低分子量キトサンと遺伝子との複合体の調製）固有粘
度が０．３０　ｄｌ／ｇの低分子量キトサン（以下にお
いてはｒ　Ｃ−９Ｊと称する）　１００ｍｇを精製水２
ｍｌに添加し、次いでＩＮ塩酸１ｍｌを添加し攪拌した
後に室温下に３０分間放置し、完全に溶解させた。その
後、１Ｎ水酸化ナトリウムを攪拌しながら添加してｐＨ
８，０となし、更に精製水を添加して全量をＬＯｍｌに
なした。得られた低分子量キトサン水溶液を０．２２μ
ｍのメンブレンフィルターを用いて濾過することにより
除菌した。

本実施例においては遺伝子としてｐｃＨ１１０プラスミ
ドを採択した。一定量のｐｃＨ１１０プラスミドを燐酸
緩衝生理食塩水（−）［以下においてはｒＰＢＳ（−）
Ｊと称する、ｐＩ（７，４コに添加し、それに対して重
量比で１．−１００倍量の上記低分子量キトサン含有水
溶液を添加し攪拌混合することにより低分子量キトサン
と遺伝子との複合体を調製した。

この複合体を１ｘ）ＩＪス酢酸ＥＤＴＡ緩衝液中の０．
８％アガロースゲル上に載置して電気泳動（泳動電圧：
　７０Ｖ）を行った。結果は第１図に示される通りであ
り、遺伝子としてのｐＣ旧１０プラスミドに対して重量
で８０倍以上のＣ−９を加えることによりプラスミドを
完全に保持した複合体を調製し得ることが判明した。

史胤■」 実施例１と同様に、但し固宵粘度（η）が０．４５　ｇ
／ｄｌの低分子量キトサン　（以下においてはｒｅ−７
４と称する）を精製水に溶解させた後に除菌フィルター
を通してキトサンの無菌水溶液を調製し、予めＰＢＳ（
−）　（ｐＨ７，４）に添加しておいた２μｇのｌｌＩ
Ｃ旧】０プラスミドに対して重量比で１００、２００．
４００倍量宛添加し、ポルテックスミキサーを用い撹拌
混合することによりＣ−７とｐｃＨ１１０プラスミドと
の複合体をそれぞれ調製した。

１ １０％牛脂児血清含をダルベツコ改変イーグル培地（２
ｍｌ）を添加した３５ｍｍφ　の培養皿に約１　ｘ　１
０’個のＣＯＳ　−’　１を添加して細胞培養を行った
。

約１６時間後に培地を除去し、ＰＢＳ（−）　２ｍｌに
より２回洗浄した後に、上述のＤＮＡ　（但し、プラス
ミド）を２μｇ含有している複合体液を細胞表面に添加
して約１０分間静置した。次いで複合体液を除去し、０
．４ｍｌの１５％グリセロール溶液を添加し、３７°Ｃ
にて２分間処理した。その後、グリセロール溶液を除去
し、細胞が剥がれないように注意しながら２ｍｌのＰＢ
Ｓ（−）で洗浄し、次いで上述の血清含有培地を添加し
て培養し、更に１６時間後に培地の交換を行った。尚、
対照についてはグリセロール処理を施さずに培養を行っ
た。

キトサンとプラスミドとの複合体の添加時から７２時間
後に培養皿より培地を除去し、２ｍｌのＰＢＳ（−）に
より細胞を洗浄した。その後に１ｍｌのＰＢＳ（−）を
培養皿に添加し、次いで細胞を剥してサンプルチューブ
に集め、１４．００Ｏｒｐｍで２分間遠心した後、」二
清を除去した。沈澱した細胞に１２ ０．２乃至０．３ｍｌのＰＢＳ（−）を添加して細胞を
懸濁させた後、ドライアイス−エタノール浴で３回凍結
−融解操作を繰り返し、１４．００Ｏｒｐｍで５分間遠
心し回収された上清を細胞抽出液とした。

この細胞抽出液中の　β−ガラクトシダーゼの酵素活性
を測定した。

結果は下記の表１に示されている通りであり、低分子量
キトサン（Ｃ−７）の添加量は細胞内で発現したβ−ガ
ラクトシダーゼの酵素活性と相関し、ｐｃＨ１１０プラ
スミドに対して４００倍量のキトサンを用いた場合に細
胞への遺伝子導入効率の最も高いことが判明した。尚、
グリセロール処理を行わないと細胞内で殆ど発現しない
ことも併せて判明した。

返ヨ」 木：グリセロール処理の有無 夫ｉ叢」 （複合体と細胞との処理時間が発現に及ぼす影響） 実施例２における結果を踏まえて遺伝子と低分子量キト
サンとの重量比を１　：　４００に設定し、即ち２μｇ
のｐＣＣｌＯ２対して８００μｇのＣ−７を用いて複合
体を調製し、ＣＯ３−１細胞に添加し、２゜４．８及び
１６分間静置処理した。その後グリセロール処理を３７
°Ｃにて２分間行った後に、２ＩｎｌのＰＢＳ（−）で
洗浄し、次いでＩＯ％牛脂児血清含有ダルベツコ改変イ
ーグル培地を添加して培養を行った。

尚、比較のためにＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ法を下記の
要領で実施した。即ち、２００μｍのＰＢＳ（−）にｐ
ｃ旧１０プラスミドを２μｇ添加し、更に生理食塩水に
溶解させたＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎを１００μｇ添加
した後にポルテックスミキサーを用いて攪拌混合した。

得られたプラスミド−ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ溶液を
ＰＢＳ（−）で洗浄したＣＯ５−１細胞に添加し、キト
サンと遺伝子との複合体の場合と同様に静置処理した。

ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ溶液を除去した後にＰＢＳ（
−）で洗浄し、次いで既述の場合と同一の条件下に７２
時間にわたり培養を行った。

上記の両培養細胞について実施例２におけると同様に処
理して細胞抽出液を得た後、蛋白量当りの　β−ガラク
トシダーゼ活性を比活性として求めた。

１５− 結果は第２図に示される通りであり、ｐＣＩ（１１０プ
ラスミドだけの添加では全く発現せず、ＤＥＡＥ−ｄｅ
ｘｔｒａｎ法において、ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎとｐ
ｃＨ１１０プラスミドの混合溶液と細胞との処理時間は
発現に対して殆ど影響を与えず、一方、Ｃ−７とプラス
ミドとの本発明による複合体の場合は処理時間とβ−ガ
ラクトシダーゼの発現量とは相関し、１０分間以上処理
することによりＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ法の場合と比
較して高い比活性を示し、従って発現効率の高くなるこ
とが判明した。

丸敷桝」 実施例２と同様にして、但し４００μｇのＣ−７にｐｃ
Ｈ１１０プラスミドを２及び４μｇ宛添加し、ＰＢＳ（
−）により全量を２００μｌとした上で撹拌混合するこ
とにより　Ｃ−７とプラスミドとの複合体を調製した。

この複合体を既述の方法と同様にして１　ｘ　１０’個
のＣＯ３−１細胞に添加し、１０分間静置処理した後に
グリセロール処理を行い、次いで７２時間にわたり細胞
を培養した。

ＩＥｉ 尚、比較のために実施例３において言及した要領でＤＥ
ＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ法を実施した。即ち、生理食塩水
に溶解させた１００μｇのＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎに
ｐＣＣｌＯ２２及び４μｇ宛添加し、ＰＢＳ（−）によ
り全量を２００μｍになして複合体を調製し、次いで実
施例３と同様に処理し、その後７２時間にわたり細胞を
培養した。

両培養細胞について実施例２と同様に処理して細胞抽出
液をそれぞれ調製し、β−ガラクトシダーゼの比活性を
測定した結果は下記の表２に示される通りであり、本発
明方法によればＤＥＡＥｄｅｘｔｒａｎ法と比較する場
合に同等若しくはそれ以上の高い効率でＣＯ５−１細胞
へ遺伝子を導入し得ることが判明した。

表二λ 実施例Ｉ及び２と同様にして２μｇの ｐｃ旧１０をＰＢＳ（−）に添加し、Ｃ−７を８００μ
ｇ添加してキトサンと遺伝子との複合体を調製した。こ
の複合体を実施例２に記載の方法に従って１ｘ１０６個
のｃｏｓ−を細胞に添加し、その後１５分間静置処理し
た。次いで複合体を除去し、３０％ジエチレングリコー
ル０．４ｍｌを加え、３７℃にて２分間処理し、ＰＢＳ
（−）で細胞を静かに洗浄した後に１０％牛脂児血清含
有ダルベツコ改変イーグル培地にて培養を行った。７２
時間にわたり細胞を培養した後に、実施例２と同様にし
て細胞抽出液を調製し、β−ガラクトシダーゼの比活性
を測定した。その結果、本発明方法を利用して調製され
た細胞抽出液は８１．４ｎｍｏｌ／ｍｌｎ／ｍｇ−蛋白
の比活性を示し、方ｐｃＨＩＩｏだけを添加した場合で
は１．０２ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ−蛋白の比活性を示
した。

（発明の効果） 本発明によれば、低分子量キトサンを遺伝子のキャリア
ーとして用いることにより簡易な操作でキトサンと遺伝
子との複合体を形成させることができる。更に、この複
合体を細胞と接触せしめた後にグリセロール等の細胞膜
透過性増強剤を添加して処理すれば極めて効率よく遺伝
子を細胞内に導入させることができる。

尚、本発明において遺伝子のキャリアーとして用いられ
るキトサンは天然物から得られたものであるために生体
に対する毒性は存在しないか或は極めて少ないので、本
発明による複合体は生体への適用に極めて有利である。

１９−

【図面の簡単な説明】

第１図はキトサンと遺伝子としてのプラスミドとを種々
の重量比で用いるこ七により調製された各種の複合体に
ついて電気泳動試験を実施した際の泳動パターンを描記
した図面であり、第２図はキトサンと遺伝子上の複合体
と細胞との接触処理時間を種々に設定し、当該処理時間
が遺伝子導入細胞の産生物質発現に及ぼす影響を調べた
結果を示すグラフである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）低分子量キトサンであることを特徴とする、遺伝
   子導入用キャリアー。
2. （２）低分子量キトサンと遺伝子とから構成されている
   ことを特徴とする、遺伝子とキャリアーとの複合体。
3. （３）遺伝子と低分子量キトサンとの複合体を細胞と接
   触させた後に、細胞膜透過性を増強する剤を添加するこ
   とを特徴とする、細胞への遺伝子導入法。