JPH0740932B2 - 細胞培養組成物およびその用途 - Google Patents

細胞培養組成物およびその用途

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JPH0740932B2
JPH0740932B2 JP61203534A JP20353486A JPH0740932B2 JP H0740932 B2 JPH0740932 B2 JP H0740932B2 JP 61203534 A JP61203534 A JP 61203534A JP 20353486 A JP20353486 A JP 20353486A JP H0740932 B2 JPH0740932 B2 JP H0740932B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） この発明は基底膜錯体に係わり、特に再結合された基底
膜誘導細胞外基層（マトリゲル（matrigel））であっ
て、加熱により重合し、試験管内および生体内で細胞成
長および分化を促進するものに関する。
（従来技術） 基底膜は薄い連続的シートからなり、基質から上皮を分
離し、神経、筋繊維、平滑筋細胞および脂肪細胞を囲ん
でいる。この基底膜はタイプIVコラーゲン、グリコプロ
ティンラミニン（laminin）、エンタクチン（entacti
n）、ニドゲン（nidogen）およびヘパラン硫酸プロテオ
グリカン（heparan sulfate proteoglycan）からなる。
研究によると、これら物質はラミナデンサ（laminadens
a）およびラミナルシダ（lamina lucida）を横切る延長
部内に共分布を示す。電子顕微鏡によれば、これら成分
は5nm巾の索からなる網状体として現われ、これらの共
分布から基底膜の形成は種々の成分の相互作用を介して
生ずると考えられる。タイプIVコラーゲン分子は分子間
ジスルフィド結合を形成し、プラスミンで消化した基底
膜中に見られる連続的網状体と関連する（Inoue et a
l.,J.Cell Biol.97,1524−1537,1983）。
基底膜の各成分は相互に作用し合うことが知られてい
る。精製された各成分について試験管により研究した結
果、ラミニンはその短い鎖を介して、変性されたもので
なく生のタイプIVコラーゲンと結合し、また、その長い
鎖中のドメインを介してヘパランスルフェートプロテオ
グリカンと結合している。これらの基底膜成分は可溶性
である。しかし、これらの巨大分子を試験管中で相互に
混合したとき、ラミニン／タイプIVコラーゲン／ヘパラ
ン硫酸プロテオグリカンを1:1:0.1モル比の割合で含む
凝集状沈でんを生ずる（Kleinman et al,Biochemistry
22,4969−4974,1983）。しかし、この沈でん物は膜構造
から予想されるような弾性および結持性を示さない。基
底膜の精製成分は従来、培養細胞のコーテング剤として
使用されている（Terranova et al.,Cell 22:719;198
0）。しかし、この物質は可溶であって、本発明の組成
物で得られるような３次元マトリックスを形成しない。
（発明が解決すべき問題点） 本発明は再結合された基底膜誘導細胞外組成物（マトリ
ゲル）であって、加熱により重合し、３次元マトリック
スを形成し、試験管内および生体内で細胞成長および分
化を促進する組成物を提供することを目的とする。
さらに本発明はマトリゲルの製造法および細胞成長なら
びに分化を促進する方法を提供することを目的とする。
さらに本発明はヒト胎盤抽出物からマトリゲルを製造す
る方法を提供することを目的とする。
さらに本発明は腫細胞の転移性能を判定する方法および
転移性腫細胞を分離する方法を提供することを目的とす
る。
（問題点を解決するための手段） 上記問題点は60〜85重量％のラミニン、５〜30重量％の
コラーゲンIV、１〜10重量％のニドゲン、１〜10重量％
のヘパランスルフェートプロテオグリカンおよび１〜５
重量％のエントアクチンを含む生物学的活性重合性抽出
物からなる基底膜誘導組成物を提供することにより解決
し得る。ここで、“生物学的活性”とは上皮細胞を含む
種々の細胞の正常の成長、分化を補助する能力を意味す
る。
生理学的条件下で、タイプIVコラーゲン、ラミニン、ヘ
パランスルフェートプロテオグリカン、ニドゲン、エン
タクチン等の成分がほぼ一定の割合で相互に反応し、ラ
メラ構造のゲル、すなわち基底膜の次元と似た構造のゲ
ルを形成することが見出された。本明細書で記載した条
件下で、これらの成分はマトリックスの再結合のために
必要となる。これはこのゲルの全ての成分が超分子錯体
を形成し、これがマトリックス形成における中間体とな
っているものと思われる。本発明でこのゲルは叙述的用
語としてマトリゲル（matrigel）と呼ぶことにする。
この再結合マトリックス（マトリゲル）は種々の細胞の
成長と分化を促進する。特に本発明の再結合基底膜ゲル
は培養において上皮細胞のための良好な基板となる。こ
のマトリゲルは細胞接着、ノイロン、肝細胞、セルトリ
細胞、毛包、甲状腺細胞等の多くの細胞の成長および分
化を促進する。セルトリ細胞をこのゲル中で培養し、の
ちに動物に戻したところ、精子細胞の生存および熟成が
良好であった。本発明の組成物はさらに神経再生（視神
経および坐骨神経）が生体中で促進され、組織再結合が
生ずることが見出された。ヒト胎盤から抽出されたもの
を用い、マトリゲルを製造すると、免疫学的相互作用又
は拒否がヒトに対し使用したとき減少することが認めら
れた。
以下、本発明の好ましい具体例について説明する。
物質 タイプIVコラーゲン、ラミニンおよびヘパランスルフェ
ートプロテオグリカンをEHS（Engelbreth Holm−Swar
m）腫（Timpl et al,J.Biol.Chem.254:9933−9937;Hass
ell et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4494−4498;198
0;Kleinman,et al,Biochemistry 21:6188−6193;1982）
から製造した。この腫組織をプロテアーゼ抑制剤を含有
する3.4M NaCl,0.05Mトリス−HCl,pH7.4中で洗浄したの
ち、基底膜マトリックスを0.05Mトリス−HCl,pH7.4中で
0.5M HaClで抽出した。次に、上記Timpl et alに記載さ
れた方法でラミニンを0.5M NaCl抽出物から分離した。
エジプト豆中毒症動物からの腫組織の残渣を0.05Mトリ
ス−HCl,pH7.4中の2.0Mグアニジンで抽出し、さらに0.0
05Mジチオスレイトールを含む同じ緩衝液で抽出し、タ
イプIVコラーゲンを可溶化した（Kleinman at al）。低
比重ヘパランスルフェートプロテオグリカンは上記腫の
6.0M尿素抽出液からイオン交換クロマトグラフィを用
い、塩化セシウム比重遠心分離および分子篩コラムクロ
マトグラフィにより精製した（Hassell et al）。な
お、ヘパランはシグマケミカル社から入手した。
基底膜マトリックスの分画されない抽出物を、塩で洗っ
た組織を等量（1ml/gm）の2M尿素、0.05Mトリス−HCl,p
H＝7.4で４℃で一晩処理し、10.000Gで30分間遠心分離
することにより得た。この残渣を等量の緩衝液で一度洗
った。ついで、この抽出物および洗液を一緒にし、0.05
Mトリス−HClに0.15M NaClを溶かしたものpH＝7.4（TB
S）で透析し、遠心分離して不溶物質の少量を除去し
た。
この上澄分を少量づつ−20℃で貯ぞうし、以下の再結合
テストに用いた。公知の定量ELISA試験を用い、この抽
出物がラミニン（3.5mg/ml）、タイプIVコラーゲン（0.
1mg/ml）およびヘパランスルフェートプロテオグリカン
（0.1mg/ml）を含むことが見い出された。エンタクチ
ン、ニドゲン、その他の少量成分も含まれていることが
見い出された。コラムクロマトグラフィにおいては抽出
物は0.5M NaCl,0.05Mトリス−HCl、pH7.4を用い透析
し、ついで遠心分離して不溶物質を除去した。
再結合試験 生理学的緩衝液に2M尿素抽出物を0.05〜0.1ml加えたも
のを遠心分離管に入れ、これを用いてゲル化をおこなっ
た。0.15M NaCl,0.05Mトリス−HCl,pH7.4中に溶かした
精製成分を抽出物に加え、所定の濃度で培養した。0.15
M NaCl,0.05Mトリス−HCl,pH7.4を用いて最終量を0.5又
は1.0mlとし、各サンプルを35℃で１時間培養した。不
溶物質を遠心分離で分離し、ペレットはサンプル緩衝液
に溶かし、還元条件下で５％又は7.5％アクリルアミド
中で電気泳動させた（Laemmlj,1970,Natuve−ロンドン,
227:680−682）。各実験は最低３回繰り返した。沈でん
物中のタンパク質の総量は標準Lowry法により判定し
た。ニドゲンおよびエンタクチンのゲル中の量はヘレナ
濃度計（Quick Scan型、Helena Lab.Corp.テキサス州、
米国）を用いゲルの写真の走査によりラミニンの4000k
バンドに存在する物質の総量に関連するものであった。
エンタクチンおよびニドゲンはSDSゲル中の移行、およ
び適当な抗体を用いたWesternブロット分析における交
叉反応性（Cross reactivity）により同定された。ゲル
中のタイプIVコラーゲンは14C−ラベル付きタイプIVコ
ラーゲンを用い、又、ヘパランスルフェートプロテオグ
リカンは、35S−スルフェートラベル付き物質（別の平
行実験により比活性が予め知られたもの）を用いそれぞ
れ定量した。
回転影付け（shadowing） 0.5M NaCl,0.05Mトリス−HCl,pH:7.4で平衡させた2.0M
尿素抽出物をセファローズ4Bコラム上に載せた。このコ
ラムから溶出させたピーク分画（0.1mg/ml）の少量（30
μ）を0.155M酢酸アンモニウム、pH＝7.4,300μお
よびグリセロール600μで希釈した。この混合物を回
転影付けをおこなうためマイカ上にスプレイし、白金−
パラジウムで影付けし、カーボン塗布をおこない、JEOL
100C電子顕微鏡で検査した。
再結合された成分の超構造（ultrastructure） 上述の如くゲルをつくった。すなわち、抽出物0.2mlを
単独で、又はタイプIVコラーゲンおよびヘパランスルフ
ェートプロテオグリカンの存在下で35℃で培養した。こ
のゲルを遠心分離により分離し、ついで2.5％グルタア
ルデヒドで固定し、１％OSO4で処理し、２％酢酸ウラニ
ルでブロックステイン（block stain）をおこない、脱
水した。このゲルはついで電子写真のためEpon（Ladd R
esearch Industries,Inc.バーリントン、米国,VT;LX−1
12レジン）で処理した。薄い部分を酢酸ウラニルおよび
くえん酸鉛でステインし、JEOL100C電子顕微鏡で検査し
た。ラット腎細管基底膜の薄い部分をLaurie et al（A
m.J.Anat.169:463−481;1984）の方法で得た。
細胞培養 B16C3細胞を組織培養プラスチック上で直接、又はグル
タミン、抗生物質、20mMチロシンおよび５％胎児ウシ血
清を含むDMEM（Dulbeccoの変形イーグル培地、細胞の着
色可視化のためフェノールレッドを欠いたもの）および
F12培地の混合物中で1mm厚の基底膜ゲル上で培養した。
１週間後、細胞の写真を採った。
精製基底膜成分および基底膜の非分画抽出物を用いて基
底膜の集合体を分析した。精製したタイプIVコラーゲ
ン、ラミニンおよびヘパランスルフェートプロテオグリ
カンは生理学的条件下、35℃で１時間培養したところ凝
集状沈でんが形成された。これに対し、基底膜の尿素抽
出物を生理食塩水を用い透析し、ついで35℃で１時間温
めたところゲルが形成された。このゲルの成分を遠心分
離により分離し、SDSゲル電気泳動により検査した。第1
A図に示すようにラミニン、エンタクチン、ニドゲンの
ゲル中の量はタイプIVコラーゲンを抽出物中50〜60％に
なるまで添加するにつれ、それに比例して増大した。ヘ
パランスルフェートプロテオグリカンも基底膜成分の沈
でん量の増加に寄与した（第1B図）。
ゲル中の主成分のゲル電気泳動による分離および定量の
結果、添加されたタイプIVコラーゲン（第1A図）又はヘ
パランスルフェートプロテオグリカン（第1B図）の存在
下ではラミニン、エンタクチン、ニドゲンの割合は一定
であった。タイプIVコラーゲン（150μｇ）およびヘパ
ランスルフェートプロテオグリカン（10μｇ）の双方を
抽出物に添加したとき、培養物中80％までのタンパク質
をゲル中に導入した。ラミニンのより小さい鎖がタイプ
IVコラーゲンの鎖とともに共電気泳動し、SDSゲル中の
可視化を妨げた。
ゲル中のタイプIVコラーゲンの量を予測するため、3Hラ
ベル付きタイプIVコラーゲン（比活性が予め知られたも
の）を用い、その量に基づいてタイプIVコラーゲンの量
を測定した。同様に、ヘラランスルフェートプロテオグ
リカンも可視化できないため、35S−ラベル付きヘパラ
ンスルフェートプロテオグリカンを用いた。これらの実
験の結果ラミニンはゲル中約60％（264±56μｇ）を占
め、タイプIVコラーゲンは30％（127±７μｇ）を占
め、ヘパランスルフェートプロテオグリカンは２％以下
（８±0.7μｇ）、ニドゲンは５％、エンタクチンは１
％以下であることが判明した。これに対し、抽出物をタ
イプＩコラーゲン、フィブロネクチン又はヘパランで補
っても沈でんの増加はなく、特定の相互作用が生じてい
ることを示した（第1b図）。0.5M NaClを用いてプロテ
オグリカンのタンパク質核の培養による除去（１晩）を
おこなったところ、重合能が失われた。このことはプロ
テオグリカンのタンパル部分が他の成分との結合に係わ
ることを示すものである。
生理学的条件下ではゲル化は20分以内で完了する（第２
図）。このゲル化は温度に依存し、35℃で最大の重合が
生じる（第３図）。50℃で相互作用がなくなることから
熱的変性により重要な成分の不活性化がなされることを
示した。
ゲルの安定性について種々の溶媒を用いてテストした。
ゲルは冷い水性塩では溶解せず、酸性溶液で若干溶け、
グアニジン又は尿素溶液で完全に溶けることが認められ
た（表１）。これは各成分が比較的強い非共有結合によ
り連結されていることを意味する。グアニジン溶解ゲル
を生理学的緩衝液を用いて透析し、タイプIVコラーゲン
の存在下で温めたところ、ゲル状構造が再形成された。
この方法は数回繰り返しても同様の割合でラミニン、ニ
ドゲンおよびエンタクチンが沈でんする（各回毎にSDS
ポリアクリルアミドゲルを判定した。第４図）。タイプ
IVコラーゲンの存在下においては、ゲルの再形成がより
急速となり、各成分の沈でん量も増大した。
表１ 再結合された基底膜の可溶性 溶媒 溶解度（％） 0.15M NaCl ０ 0.5M NaCl ０ 0.5M HAc 43 1.0M尿素＋ジチオスレイトール 40 2.0M尿素 73 2.0Mグアニジン 97 （注）0.5M HAcを除き、全ての溶液は0.05Mトリス−HCl
でpH7.4に緩衝された。
可溶性は24℃で20分間おこない判断した。撹拌20分後、
溶液を遠心分離し、ペレットは再溶され、還元剤を用い
SDSゲル中で電気泳動させた。ペレット中の各成分の比
はSDSゲルを走査することによっておこなわれた。
さらに基底成分の可溶性錯体の存在についての判定をお
こなった。尿素抽出液を透析して尿素を除去し、セファ
ロース4Bコラム（0.5M NaCl,結合性条件）を通過させた
ところ、主ピーク中にラミニン、ニドゲン、エンタクチ
ンが溶出した（第5A、5B図）。この主ピークの物質をプ
ールし、同様の分子篩コラム（4Mグアニジン、解離条
件）に移したところ、これらの成分はそれらの分子量か
ら予想し得る態様で分離された（第5A図、第5C図）。こ
の結果から、錯体中にラミニン、ニドゲン、エンタクチ
ンの結合する非共有結合の強い結合が作用していること
が判明した。この物質の回転影付け電子顕微鏡写真から
可溶錯体の存在が認められた（第5A図）。この錯体は大
きいプロテオグリカンの存在を示した。このプロテオグ
リカンはいくつかのラミニン分子で囲まれているためヘ
パランスルフェート側鎖がつぶれたため大きい球形をな
している。ニドゲンおよびエンタクチン分子ははっきり
していないが、SDSポリアクリルアミドゲルから錯体中
での存在が知られている（第5B図）。
タイプIVコラーゲンおよびヘパランスルフェートプロテ
オグリカンをともない、あるいともなわない再結合基底
膜の超構造についても検査をおこなった。これらをとも
なわない場合、ゲルは多くの広く分離した薄いフィラメ
ント状の集合体からなるものであった（第6A図）。タイ
プIVコラーゲン、又はヘパランスルフェートプロテオグ
リカン／タイプIVコラーゲンを添加したものは相互に連
結した、あるいは合流した薄いシート状のものとなる
（第6B）。この網状物の各部分は腎細管基底膜のラミナ
デンサのものと似た平均幅のものである（第6C図）。し
かし、生の基底膜（ラミナデンサ様層が平行に配列して
いる。たとえばPYS腫基底膜（Martnez−Hernandez et a
l,Lab.Invest.47:247−257,198）又はReichertの膜（In
ove et al,J.Cell.Biol.97:1524−1537,1983））と異な
り、そのラミナデンサ様構造のものは相互に結合してい
るが、平行な多導層状構造のものではない。各部分は前
述の他の基底膜と同様に5nm中の索のものであった。
マトリゲル（再結合基底膜）は細菌学的ペトリ皿の表面
をコートするのに用いられ、種々の細胞の成長、分化の
基板としてテストされた。黒色腫（B16C3）はこの基底
膜ゲル上で成長させたとき、組織培養表面と比較して形
態学的に可成り異なった状態示した（第７図）。この基
板上において、細胞の早期およびより広い着色化が見ら
れた。内皮細胞はこのゲル上で管状構造が形成し、肝細
胞はこのゲル基板上で組織培養板又はタイプＩコラーゲ
ン上での場合より長く生存した。生体中において、基板
膜ゲルは末梢神経再生を促進することが見出された（Ma
dison et al,1985.Exptl.Neurol.,88:767−772）。
これらの研究から再結合基底膜は生物学的に活性であっ
て広範な細胞応答を誘発する。又、これは細胞接着、成
長および分化を各成分について知られているものを超え
る程度に補助、促進し得るから、このゲルはこれらの分
子を特異、かつ活性的配置で含んでいるものと思われ
る。
実施例１ ゲル化および細胞培養のためのEHS腫抽出物の製造 操作は約100gの腫に基づいておこなわれ、４℃でおこな
われた。
1.）3.4M NaCl（397g）、0.05Mトリス（12.1g）、0.004
M EDTA（3.0g）、0.002M NEM（0.5g）に水を加え２と
し、pH＝7.4に調整された3.4NaCl緩衝液200ml中に腫を
均質化する。
2.）10.000RPMで15分遠心分離し、上澄液を棄てる。
3.）腫残渣（3.4M NaCl緩衝液中）を均質化する。
4.）10.000RPMで15分遠心分離し、上澄液を棄てる。
5.）3.4M NaCl緩衝液中の腫残渣を均質化する。
6.）10.000RPMで15分遠心分離し、上澄液を棄てる。
7.）2M尿素（240g）、0.05Mトリス（12.1g）、0.15M Na
Cl（18g）に水を加え２とし、pH7.4に調整した2M尿素
緩衝液100ml中に腫を均質化する。
8.）４℃で１晩、撹拌する。
9.）14.000RPMで20分間遠心分離する。上澄液を貯え
る。
10.）2M尿素緩衝液を腫残渣に加え、均質化する。
11.）14.000RPMで20分間遠心分離し上澄液を貯える。
12.）上記上澄液を一緒にし、トリス−食塩水（0.05Mト
リス12.1g、0.15M NaCl18.0gに水を加えて２とし、pH
＝7.4としたもの）を用いて透析する。
１用目盛付きシリンダを用い、トリス−食塩水900ml
とクロロホルム5ml（これは滅菌処理）を加える。
13.）12時間透析する一端部のバッグを回転させる。
14.）透析をトリス−食塩水のみに変える。
15.）トリス−食塩水をさらに１度変えて透析する。
16.）最後の透析は培地塩、たとえばDMEM又はDulbecco
−Vogtを用いておこなう。
17.）バックの内側を滅菌する。バッグの外側はアルコ
ールで滅菌し、止血かん子およびはさみをアルコール中
で洗い、バック中のものを滅菌容器に移す。子分けをお
こなう。コラーゲンIVをこの段階で、0.1〜1mg/mlの範
囲で（重合したゲルマトリックスの結特性、強度をどの
ようにするかに準じて決定する）、液相に加えてもよ
い。高い濃度のゲルほど耐久性が良好である。
18.）直ちに冷却する。貯ぞうが必要なときは−20℃で
低温保持する。ゲル化について：抽出物を所望の容器に
入れ、30〜120分間重合のために約24〜35℃で温める。3
5mmペトリ皿については抽出物1ml以下を使用する。それ
を薄く広げる。
19.）ゲルを細胞培養基層として使用するため、適当な
成長媒体3mlを工程（18）で得た重合ゲルの上に加え、
所望細胞を分散させて培地を培養する。細胞の型に準じ
て成長培地を選ぶ。標準成長培地および条件は各細胞の
種類に準じてそれぞれ公知のものである。
ある細胞の種類についての他の成長促進方法は工程（1
8）の重合直前に冷い抽出液中に細胞を接種し、分散さ
せ、ついで重合をおこない、工程（19）へ進む方法であ
る。たとえば毛包、セルトリ細胞等は重合前に分散させ
た方が培養を良好におこなうことができる。これに対
し、上皮細胞、外分細葉細胞、坐骨神経細胞、脊髄ノイ
ロン、甲状腺培養等は重合されたゲル上に培養した方が
良い。
実施例２ 基底膜マトリゲルのヒト胎盤製剤 組成、生物学的活性において同等のものがEHSマウスに
ついて用いたと同様の方法によりヒト胎盤から得ること
ができる。しかし、胎盤はEHSマウス腫のような純粋な
基底膜からなるものでないので、以下に述べる如く別の
工程を必要とする。
（ａ）、胎盤から索および羊膜を除去する。
（ｂ）、ついで胎盤を洗い、フッ化フェニルメチルスル
ホニル;n−エチルマレイミドEDTA、ペプスタチン等の標
準プロテアーゼ抑制剤を含む3.4M NaCl、0.05Mトリス−
HCl、pH;7.4からなる溶液中で均質化する。
（ｃ）、組織残渣を0.5M NaCl、0.05−トリス−HCl、p
H:7.4からなる液の等量（g/ml）で４℃で１晩抽出す
る。
（ｄ）、緩衝液で抽出したのちの組織を同一の緩衝液の
等量で洗い、これを抽出物と一緒にする。
（ｅ）、組織残渣を2.0M尿素、0.05−トリス−HCl、pH:
7.4からなる液の等量（g/ml）で４℃で１晩抽出する。
（ｆ）、0.5M NaCl抽出物と、2.0M尿素抽出物を0.02Mり
ん酸ナトリウム、pH7.4で４℃で１晩透析し、透析した
サンプルを0.15M NaClを含む0.02Mりん酸ナトリウム緩
衝液で平衡させたヘパリンセファロースコラムを用い別
々にクロマトグラフィをおこなった。この結合された物
質を1.0M NaClで溶出し、透析し、イーグルの最少必須
培地とした。
胎盤抽出物の特徴と生物学的特徴 ヘパリンセファロースクロマトグラフィの前後の胎盤抽
出物をその純度について比較した。そのために、0.5M N
aClおよび2.0M尿素抽出物、およびヘパリンコラムから
の結合物質を水を用いて透析し、親油化し、SDSポリア
クリルアミドゲル中で電気泳動させた。これらサンプル
をタンパク含量についてのプロフィールを測定するため
Coomassieブルーで着色し、ニトロセルロースに移した
のち、抗−ラミニン抗体と免疫反応させた。その結果、
基底膜の主成分であるラミニンが、マウス基底膜製剤と
同様に、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィの後、
そのままの状態で胎盤抽出物中に存在することが確認さ
れた（第８図）。胎盤ラミニンはMr＝400,000およびMr
＝200,000成分の連鎖を含有していた。
この物質の生物学的活性を神経軸索突起について、NG10
8−15神経芽細胞＋神経膠腫混成細胞を用いてテストし
た。これらの細胞は抽出物およびヘパリン結合物質に対
して急速（２時間以内）に応答した。すなわち、長い神
経軸索突起の成長をおこないながら応答した（第９
図）。テストすべき物質をイーグルの最少必須培地（血
清、その他の培地を欠くもの）に新しく解離した細胞と
ともに加えた。組織培養プラスチック上で２時間培養し
たのち、胎盤物質に露出した細胞中に拡張した形成プロ
セスが認められた。すなわち、胎盤物質は神経軸索突起
発達を刺激する点において、マウス腫物質とほぼ同等の
活性を示した。
マウス腫からの基底膜を用いた腫細胞転移の評価および
転移性腫細胞の選択 全て腫細胞を転移させるため、血液流に導入し、ついで
離れた部位で流出させ成長させる。したがって腫細胞は
内皮基底膜に対し、付着し、分解し、通過して転移する
必要がある。これらは腫細胞転移に重要なことである。
これらの重要な工程を測定するための特異な試験管内テ
スト法を考案した。この方法は迅速で、定量的で、再現
性で、非転移性と転移性の細胞とを区別し得る。この方
法はマウス再結合基底膜を用いる。
腫細胞転移性試験 核孔フィルタをブライドウエルボイデン（Boyden）チャ
ンバー内に配置した。下方室には誘引剤としてフイブロ
ブラスト培地又はラミニンを設けた。マウス（ネズミ）
基底膜抽出物50μをこのフィルタ（上部室に設けたも
の）の上に置き、37℃で重合させた。イーグルの最少必
須培地又は他の適当な培地中の細胞を上方ウレルに加
え、チャンバー全体を37℃で、95％空気、５％CO2中で
５時間培養した。この間に転移性細胞をマトリックスに
付着させ、マトリックスを分解させ、その中およびフィ
ルタ孔内を通過させた。この方法を第10図に示す。マト
リックスを侵入した細胞数はフィルタ孔の下面で定量す
ることができた。たとえば細胞をDifquick（Havelco）
で着色したのち、顕微鏡で算定する。その他、細胞を放
射能ラベル化した場合はシンチレーションカウンターで
直接測定することができる。
生体中で非転移性の細胞はマトリックスを侵入しない。
すなわち、１フィールド当り５個以下の細胞がフィルタ
の下面に見られたにすぎない。これに対し、生体中で転
移性の細胞は高いフィールド当り10個以上の細胞がフィ
ルタの下面に見られる。公知の転移性の細胞株（10以上
のネズミおよびヒト腫細胞）をテストし、その結果、細
胞の接着能、分解能および移行能（再結合基底膜）と、
転移性との間に直接的関係が存在することが見出された
（表II）。
細胞はBoydenチャンバー試験において５時間おこなっ
た。フィルタの下面に５細胞／フィールド以下現われた
ものは非転移性（不可）とし、同じく10細胞／フィール
ド以上の細胞株は転移性（可）とした。腫瘍を生体中で
形成し得る細胞株の機能については公知である。
転移性細胞の選択 大きい転移性細胞はその接着能、分解能および移行能
（再結合基底膜に対して）に基づいて純粋な形で選択
し、得ることができる。ネズミ基底膜抽出物を組織培養
皿（0.5ml/mm径）上に置き、37℃で30分間重合した。こ
れら細胞は滅菌状態で完全培地に成長できるようにして
載せた。２日後、転移性細胞が付着し、分解を経て、マ
トリックス中を移行しプラスチック皿の表面に現われ
た。これを第11図に示す。この表面の転移性細胞を再結
合基底膜ゲルを除去したのち回収した。
非転移性細胞はこの方法が適応されず、極めて稀れにマ
トリゲル中又はプラスチック皿上に２日後に細胞を認め
ることができた（表III）。転移性細胞はこのマトリッ
クスに対し、付着し、分解作用を示し、さらにその中を
移行し多量に培養皿表面に発現する。この選ばれた細
胞、すなわちこのマトリックスを通過移行した細胞を腫
瘍細胞移行試験（Tumor Cell Invasion Assay）で再テ
ストしたところ、より均質で移行密度の大きい細胞が認
められた。
なお、全ての細胞はM.D.Anderson病院（Houston,テキサ
ス州，米国）から入手した。選ばれた細胞は親株でマト
リゲルを化学的侵蝕し、分離し、成長した。その移行能
を再テストしたところ、より強い移行能を示した。上記
データはマトリゲル±S.D.を移行した細胞凝集体の集を
表わしている。
【図面の簡単な説明】
第1a図および第1b図はともに基底膜抽出物からの基底膜
成分のゲル化に対するタイプIVコラーゲン、ヘパランス
ルフェートプロテオグリカンおよびヘパランの影響を示
す図であって、抽出物100μに対し、各成分を加え、
0.15M NaCl,0.05Mトリス−HCl,pH7.4中、35℃で１時間
培養したものである。各サンプルはついで遠心分離さ
れ、不溶物質はサンプル緩衝液中に溶かした。又、各サ
ンプルの等量を５％アクリルアミド中で電気泳動させ
た。ゲルの濃度測定走査によりペレット化されたタンパ
ク質の定量をおこなった。このうち第1a図はゲル中の総
タンパク量に対するタイプIVコラーゲンの影響を示した
生物の形態の写真、第1b図はゲル中の総タンパク量に対
するタイプIVコラーゲン、ヘパランスルフェートプロテ
オグリカン、ヘパランの量的影響を示している。 第２図は基底膜抽出物のゲル化に対するタイプIVコラー
ゲンの添加および時間的影響を示している。条件は第１
図と同様である。タイプIVコラーゲン（50μｇ）の存在
下（●）、非存在下（○）での比較がなされている。 第３図は基底膜抽出物のゲル化と温度との関係を示す図
である。これは第２図の凡例通りタイプIVコラーゲン
（50μｇ）の存在下でおこなわれた。 第４図はゲルの溶解後の基底膜の再ゲル化能を示す生物
の形態の写真である。“全抽出”と記載された最初の線
は出発物質の組成を示している。“第１のゲル”はタイ
プIVコラーゲンの存在下で形成されたゲル中の成分を示
している。タイプIVコラーゲンの非存在下で形成された
ゲル中の物質を2.0Mグラニジン中に20分で溶解し、0.15
M NaCl、0.05Mトリス−HCl、pH＝7.4を用い透析し、タ
イプIVコラーゲンの存在下又は非存在下で再ゲル化した
（２回目のゲル）。このサイクルをさらに２回繰り返し
た（第３回、第４回目のゲル）。又、ゲルの等量を５％
アクリルアミドゲル中で電気泳動させた。 第5A図、第5B図および第5C図は・・・を示している。こ
のうち、第5A図は・・・に導入した場合を示し、第5A図
の下部の図は吸光度を示す線図、上部の図はそのピーク
部分における生物の形態の写真である。第5B図は結合性
のものについての生物の形態の写真、第5C図は・・・を
示す生物の形態の写真である。なお、ここにおいて、・
・・した。ピーク分画の最も共通する錯体は中央のヘパ
ランスルフェートプロテオグリカンと周辺のラミニン分
子である。エンタクチンおよびニドゲンは小分子であっ
て見えないが存在することが知られている。 第６図は再結合ゲルと真正の基底膜を電子顕微鏡で拡大
した生物の形態を示す写真である。このうち、（Ａ）は
タイプIVコラーゲン又はヘパランスルフェートプロテオ
グリカンの非存在下で形成されたゲルを示す。（Ｂ）は
タイプIVコラーゲン、ヘパランスルフェートプロテオグ
リカンの存在下で形成されたゲルを示す。ゲルの端部が
上部にある。このゲルは鋼状をなし、その構造は巾が生
の基底膜のラミナデンサと似ている。厚さは多少変化し
ている。（Ｃ）は腎細胞（100gmラットからのもの）基
底膜で、ラミナルシダとラミナデンサとからなってい
る。ラミナデンサの延長部は細胞膜に接している（矢線
先端）。Bar＝200μｍ×47,500。 第7A図および第7B図は基底膜のB16C3メラニン形成の形
態学および分化に対する影響を示している。0.15M NaC
l,0.05Mトリス−HCl,pH＝7.4中のEHS−腫の滅菌2M尿素
抽出物をペトリ皿表面に37℃、30分でゲル化させ、同数
の細胞をゲル（左）上、又は対照組織培養プラスチック
皿に載せた。20mMチロシン、ゲンタミシン、グルタミン
および５％胎児ウシ血清を含むDMEM中で１週間培養させ
たのち、細胞の写真を取ったものであり、このうち第7A
図は細胞によるメラニン形成の評価および形態を示した
生物の形態を示す写真、第7B図は皿中のものを直接見た
生物の形態を示す写真である。端のゲルは偏向させて、
細胞がそれに接していることを示している。 第８図はヘパリンアフィニティクロマトグラフィののち
の胎盤の2.0M尿素抽出物のCoomassieブルーステインで
あってラミニンの純度を示す生物の形態を示す写真であ
る。 第９図はノイロンプロセス形成に対するヒト胎盤マトリ
ゲルの影響、すなわち神経軸索突起を強く促進すること
を示す生物の形態を示す写真である。 第10図はマトリゲルを用いた腫細胞転移性テストを示す
図。 第11図はマトリゲルを用いた転移性細胞選択を示す図で
ある。

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】60〜85重量％のラミニン、５〜30重量％の
    コラーゲンIV、１〜10重量％のニドゲン、１〜10重量％
    のヘパランスフェートプロテオグリカンおよび１〜５重
    量％のエントアクチンを含む抽出物からなる細胞培養組
    成物であって、加熱により重合し、細胞成長および分化
    を促進し得るものであることを特徴とする組成物。
  2. 【請求項２】該抽出物がエンゲルブレス−ホルム−スワ
    ルム腫（Engelbreth−Holm−Swarm）から得られるもの
    である特許請求の範囲第１項記載の組成物。
  3. 【請求項３】該抽出物がヒト胎盤から得られるものであ
    る特許請求の範囲第１項記載の組成物。
  4. 【請求項４】該組成物が重合の結果、三次元マトリック
    スを形成するものである特許請求の範囲第３項記載の組
    成物。
  5. 【請求項５】細胞成長促進は試験管内および生体内でお
    こなうことができるものである特許請求の範囲第４項記
    載の組成物。
  6. 【請求項６】該組成物が上皮細胞の成長および分化を補
    助し得るものである特許請求の範囲第５項記載の組成
    物。
  7. 【請求項７】該組成物が神経軸索突起の成長および分化
    を補助し得るものである特許請求の範囲第５項記載の組
    成物。
  8. 【請求項８】該抽出物がエンゲルブレス−ホルム−スワ
    ルム腫（Engelbreth−Holm−Swarm）から下記の方法で
    得られるものである特許請求の範囲第２項記載の組成
    物： すなわち、４℃の温度下で、 （ａ）上記腫を適当な第１の緩衝液中で多数回均質化
    し、各均質化工程ののち可溶分画を廃棄して不要成分を
    除去する工程と； （ｂ）適当な尿素緩衝液中で残留する腫を抽出し、これ
    を16〜18時間撹拌する工程と； （ｃ）工程（ｂ）からの抽出物を分離し、貯え、これを
    工程（ｂ）を繰り返す毎におこなう工程と； （ｄ）工程（ｃ）からの抽出物を総て一緒にして適当な
    滅菌緩衝液を用いて、かつ、この緩衝液を何回も替えな
    がら透析する工程と； （ｅ）得られた透析液を培養されるべき細胞に接種する
    前又は後に、該透析液を重合して、細胞培養のための基
    層として利用する工程と； を具備してなる方法。
  9. 【請求項９】第１の緩衝液がpH＝7.4の3.4M NaCl緩衝
    液である特許請求の範囲第８項記載の組成物。
  10. 【請求項１０】尿素緩衝液がpH＝7.4の2M尿素緩衝液で
    ある特許請求の範囲第８項記載の組成物。
  11. 【請求項１１】滅菌緩衝液がクロロホルムを滅菌量含む
    イーグルの最少必須培地である特許請求の範囲第８項記
    載の組成物。
  12. 【請求項１２】透析液を24〜35℃で重合する特許請求の
    範囲第８項記載の組成物。
  13. 【請求項１３】該方法で得られた抽出物が上皮細胞の成
    長および分化を補助し得る特許請求の範囲第８項記載の
    組成物。
  14. 【請求項１４】該方法で得られた抽出物が神経軸索細胞
    の成長および分化を補助し得る特許請求の範囲第８項記
    載の組成物。
  15. 【請求項１５】該抽出物がヒト胎盤から下記の方法で得
    られるものである特許請求の範囲第３項記載の組成物； すなわち、４℃の温度下で、 （ａ）上記胎盤を適当な第１の緩衝液中で多数回均質化
    し、各均質化工程ののち可溶分画を廃棄して不要成分を
    除去する工程と； （ｂ）適当な尿素緩衝液中で残留する腫を抽出し、これ
    を16〜18時間撹拌する工程と； （ｃ）工程（ｂ）からの抽出物を分離し、貯え、これを
    工程（ｂ）を繰り返す毎におこなう工程と； （ｄ）工程（ｃ）からの抽出物を総て一緒にして、これ
    をヘパリンアフィニティ−コラムへ移し、吸着、ついで
    生理学的濃度より大きい濃度の塩溶液で結合物質を溶出
    する工程と； （ｅ）適当な滅菌緩衝液を用いて、かつ、この緩衝液を
    何回も替えながら透析する工程と； （ｆ）得られた透析液を培養されるべき細胞に接種する
    前又は後に、該透析液を重合して、細胞培養のための基
    層として利用する工程と； を具備してなる方法。
  16. 【請求項１６】腫細胞の転移性能を判定する方法であっ
    て、 （ａ）60〜85重量％のラミニン、５〜30重量％のコラー
    ゲンIV、１〜10重量％のニドゲン、１〜10重量％のヘパ
    ランスルフェートプロテオグリカンおよび１〜５重量％
    のエントアクチンを含む抽出物50μｌないし100μｌを
    懸濁させた核孔フィルタ上に載置させて、該抽出物を重
    合させる工程と； （ｂ）緩衝された媒体中で、検査されるべき腫細胞の懸
    濁された単一細胞層を上記重合層上に置き、該細胞を37
    ℃、５時間、上記の重合された抽出物に付着させ、かつ
    その中を移行させる工程と； （ｃ）核孔フィルタの反対側表面上に移行した細胞の存
    在を判定する工程と； からなる方法。
  17. 【請求項１７】移行性腫細胞を単離する方法であって、 （ａ）60〜85重量％のラミニン、５〜30重量％のコラー
    ゲンIV、１〜10重量％のニドゲン、１〜10重量％のヘパ
    ランスルフェートプロテオグリカンおよび１〜５重量％
    のエントアクチンを含む抽出物１〜2mlを組織培養皿上
    に載せ、該抽出物を重合化させる工程と； （ｂ）緩衝媒体中で、この重合された層上に懸濁腫細胞
    の単一細胞層を載せる工程と； （ｃ）この培養皿を37℃で48時間、培養に供する工程
    と； （ｄ）この培養皿から重合されたマトリックスを除去す
    る工程と； （ｅ）この培養皿に付着した細胞を成長媒体中で成長さ
    せる工程と； を具備してなる方法。
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JP2004500093A (ja) * 2000-01-27 2004-01-08 メディジェーン　アクチェンゲゼルシャフト ３次元マトリックス体、細胞組織の収縮を測定する装置および方法

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