CN101873867B - 高浓度脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了高浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物和分散体系，以及产生这种组合物和分散体系的方法。混合脱乙酰壳多糖-核酸复合物的方法包括，在线混合脱乙酰壳多糖溶液和核酸溶液，随后任选地用聚集抑制剂进一步浓缩脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系。还提供了改变脱乙酰壳多糖-核酸复合物直径的方法。

Description

高浓度脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年9月28日提交的USSN60/976,376号的优先权，该在此通过引用将其全文并入。
技术领域
本发明涉及均一的脱乙酰壳多糖-核酸复合物。本发明还涉及浓缩溶液中脱乙酰壳多糖-核酸复合物的方法，以及高浓缩的均一的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的制品。
背景技术
脱乙酰壳多糖是一种N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖的无毒的阳离子聚合物。脱乙酰壳多糖可以与核酸形成复合物并用做转染细胞的DNA运输载体。
生产脱乙酰壳多糖-核酸复合物的浓缩溶液存在困难。增加混合溶液中脱乙酰壳多糖和核酸的浓度会导致沉淀以及因此产生的脱乙酰壳多糖-核酸复合物大小上的非期望的变化。此外，增加制备的溶液中脱乙酰壳多糖-核酸复合物的浓度会导致复合物聚集以及从溶液中沉淀。
使用顺流混合器产生包含DNA和凝聚剂(例如，聚阳离子碳水化合物)的均一颗粒，已经有报道(U.S.6,537,813)。为产生此类颗粒，可将DNA和凝聚剂溶液同时和单独通过混合器引入流体，混合器包括提供混合和颗粒形成的静态或动态混合器。据报道在引入和混合过程中，保持DNA和冷凝剂的适当比例很重要，而且电中性的显著偏离可导致过程中不完全凝聚或颗粒聚集。
发明简述
本发明的发明人克服了本领域产生在科研和医学中有多种应用的含高浓缩脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物的障碍。在优选的实施方案中，组合物包含大小均一的复合物，所述复合物即使在高浓度下也不聚集或沉淀，并在各种条件下表现出稳定性。此外，如同形成时，优选的本发明的组合物是等渗的。在保持复合物稳定性的同时实现等渗，对于药学和治疗领域的应用是非常理想的。此外，发明人还发现了通过不需要、不包含静态或动态混合器的在线混合(in line mixing)过程产生脱乙酰壳多糖-核酸复合物的方法。此外，可以使用这些方法制备具有明显背离中性的电荷(即ζ电位)的稳定的复合物。令人惊讶的是，发明人还发现可以通过改变在线混合的原料体积来控制粒度(particle size)和颗粒均匀性，而不需改变DNA和脱乙酰壳多糖的比例或基本上不改变混合溶液中DNA和脱乙酰壳多糖的浓度。
因此，一方面，本发明提供了包含水合的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物。组合物中脱乙酰壳多糖-核酸复合物被高度浓缩，其该组合物的核酸浓度大于约0.5mg/ml，其中，该组合物基本上不含沉淀的复合物。
在优选的实施方案中，组合物是包含脱乙酰壳多糖-核酸复合物颗粒的分散体系。
在优选的实施方案中，组合物是等渗的。在其他实施方案中，组合物可以是高渗或低渗的。
在优选的实施方案中，组合物具有浓度为至少约0.6mg/ml，优选至少约0.75mg/ml，更优选至少约1.0mg/ml，再优选至少约1.2mg/ml，最优选至少约1.5mg/ml的核酸。
在优选的实施方案中，组合物还包含聚集抑制剂，优选的实施方案聚集抑制剂为糖，优选蔗糖。
在优选的实施方案中，组合物包含浓度小于约80mM，更优选小于约60mM，更优选小于约40mM，再优选小于约20mM的平衡阴离子(counter anion)的。优选的，平衡阴离子为醋酸离子。
在优选的实施方案中，组合物中脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均多分散性指数(average polydispersity index，“PDI”)小于约0.5，更优选小于约0.4，更优选小于约0.3，再优选小于约0.2。
在优选的实施方案中，复合物的N∶P比例为至少约2∶1，更优选至少约5∶1，更优选至少约10∶1，再优选至少约15∶1，更优选至少约20∶1。
在优选的实施方案中，复合物包含具有平均小于约3000个，更优选小于约2000个，更优选小于约1500个，再优选小于约1000个，进一步优选小于约500个，更进一步优选小于约100个，再进一步优选小于约50个氨基葡萄糖单体单元的脱乙酰壳多糖分子。
在优选的实施方案中，复合物包含平均分子量小于约500kDa，更优选小于约250kDa，更优选小于约150kDa，再优选小于约100kDa，进一步优选小于约50kDa，更进一步优选小于约25kDa的脱乙酰壳多糖。
在优选的实施方案中，组合物中复合物的平均直径小于约750nm，更优选小于约500nm，更优选小于约250nm，再优选小于约200nm，进一步优选小于约150nm。
在优选的实施方案中，组合物主要由脱乙酰壳多糖-核酸复合物和聚集抑制剂组成。
在另外一个优选的实施方案中，组合物主要由脱乙酰壳多糖-核酸复合物组成。
一方面，本发明提供了浓缩脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系的方法。该方法包括提供未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系，并使用浓缩方法，优选切向流动过滤，浓缩脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系，以产生浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系。优选地，未浓缩的分散体系包含聚集抑制剂。这种浓缩过程在基本上保持小分子(如聚集抑制剂)的浓度的同时大大提高了脱乙酰壳多糖-核酸复合物的浓度，从而得到浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物。
在优选的实施方案中，浓缩意味着使分散体系浓缩至少2倍，更优选至少5倍，更优选至少6倍，再优选至少7倍，进一步优选至少8倍，更进一步优选至少9倍，最优选至少10倍。
在优选的实施方案中，聚集抑制剂为糖，优选蔗糖。
在优选的实施方案中，未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系包含平衡阴离子，优选醋酸离子，且浓缩方法不选择性浓缩平衡阴离子。在浓缩的分散体系中，平衡阴离子的富集程度不如核酸的富集程度大。优选的，浓缩的分散体系中平衡阴离子的浓度基本上不大于未浓缩的分散体系中的浓度。
在优选的实施方案中，浓缩的分散体系中核酸的浓度为至少约0.5mg/ml，更优选至少约0.6mg/ml，更优选至少约0.75mg/ml，再优选至少约1.0mg/ml，进一步优选至少约1.2mg/ml，最优选至少约1.5mg/ml。
在优选的实施方案中，使用在线混合来制备未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系。
在优选的实施方案中，未浓缩的分散体系的体积为至少10mL，更优选至少约50mL，更优选至少约500mL，再优选至少约1L，进一步优选至少约2L，更进一步优选至少约3L，再进一步优选至少约4L，又进一步优选至少约5L，继续进一步优选至少约10L。
在优选的实施方案中，未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系的平均PDI小于约0.5，更优选小于约0.4，更优选小于约0.3，再优选小于约0.2。
在优选的实施方案中，浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系的平均PDI小于约0.5，更优选小于约0.4，更优选小于约0.3，再优选小于约0.2。
在优选的实施方案中，复合物的N∶P比例为至少约2∶1，更优选至少约5∶1，更优选至少约10∶1，再优选至少约15∶1，进一步优选至少约20∶1。
在优选的实施方案中，复合物包含具有平均小于约3000个，更优选小于约2000个，更优选小于约1500个，再优选小于约1000个，进一步优选小于约500个，更进一步优选小于约100个，再进一步优选小于约50个氨基葡萄糖单体单元的脱乙酰壳多糖分子。
在优选的实施方案中，复合物包含平均分子量小于约500kDa，更优选小于约250kDa，更优选小于约150kDa，再优选小于约100kDa，进一步优选小于约50kDa，更进一步优选小于约25kDa的脱乙酰壳多糖。
在优选的实施方案中，组合物中复合物的平均直径小于约750nm，更优选小于约500nm，更优选小于约250nm，再优选小于约200nm，进一步优选小于约150nm。
一方面，本发明提供了本文公开的方法所产生的浓缩的脱乙酰壳多糖核酸复合物。
一方面，本发明提供了调整通过混合脱乙酰壳多糖和核酸溶液形成的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的特性的方法。在一个实施方案中，本发明提供了调整脱乙酰壳多糖-核酸复合物直径的方法。在另一个实施例中，本发明提供了调整脱乙酰壳多糖-核酸复合物ζ电位的方法。该方法包括改变用于产生复合物的脱乙酰壳多糖或核酸溶液的体积，而不改变核酸与脱乙酰壳多糖的比例或混合溶液中核酸和脱乙酰壳多糖的浓度。在优选的是实施方案中，该方法包括在线混合脱乙酰壳多糖和核酸原料溶液。
一方面，本发明提供了包含水合的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的药物组合物，组合物中核酸的浓度大于约0.5mg/ml，其中脱乙酰壳多糖-核酸复合物包含治疗性核酸构建体。
在优选的实施方案中，药物组合物的核酸的浓度为至少约0.6mg/ml，更优选至少约0.75mg/ml，更优选至少约1.0mg/ml，再优选至少约1.2mg/ml，最优选至少约1.5mg/ml。
在优选的实施方案中，药物组合物包含聚集抑制剂。在优选的实施方案中，聚集抑制剂为糖，优选蔗糖。
在优选的实施方案中，药物组合物具有浓度小于约80mM，更优选小于约60mM，更优选小于约40mM，再优选小于约20mM的平衡阴离子。优选地，平衡阴离子为醋酸离子。
在优选的实施方案中，药物组合物是等渗的。在其他实施方案中，组合物可以是高渗或低渗的。
一方面，本发明提供了制备浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系的方法，包括在线混合脱乙酰壳多糖和核酸溶液以形成未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系，随后使用TFF浓缩未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系以产生浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系。
在优选的实施方案中，TFF使分散体系浓缩至少2倍，更优选至少5倍，更优选至少6倍，再优选至少7倍，进一步优选至少8倍，更进一步优选至少9倍，最优选至少10倍。
在优选的实施方案中，浓缩的分散体系中核酸的浓度为至少约0.5mg/ml，更优选至少约0.6mg/ml，更优选至少约0.75mg/ml，再优选至少约1.0mg/ml，进一步优选至少约1.2mg/ml，最优选至少约1.5mg/ml。
在优选的实施方案中，浓缩的分散体系具有浓度小于约80mM，更优选小于约60mM，更优选小于约40mM，再优选小于约20mM的平衡阴离子。优选地，平衡阴离子为醋酸离子。
优选地，浓缩的分散体系包含聚集抑制剂。聚集抑制剂优选为糖，更优选为蔗糖。
优选地，浓缩的分散体系是等渗的，在另外的实施方案中，浓缩的分散体系可以是高渗或低渗的。
附图简述
图1表示制造1L批次的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系以及随后进行TFF浓缩的典型过程示意图
图2是小规模在线混合过程的示意图。注射器不含聚丙烯乳胶，且每个容量可调整至高达60mL。两个精密注射泵驱动注射器。管为内径(ID)1/16英寸的铂金硫化硅胶(platinum cured silicone)。混合连接处显示为Y，但也可以是T。结构的混合连接材料为聚丙烯。
图3是制备10L脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系的中等规模在线混合过程示意图。对于更小的批次规模，对所有的管道均进行相应调整。管道直径为0.48cm(3/16英寸)。显示了以2∶1的体积比混合的DNA∶脱乙酰壳多糖的泵流量(pump flow rate)。
图是4TFF浓缩过程的示意图。
图5是中等规模过程产生的且以不同比例混合的复合物体外转染的结果图。
图6是通过与10％蔗糖小规模混合和快速TFF制备的复合物在室温下的稳定性图。
图7表示改变DNA和脱乙酰壳多糖原料的体积对复合物直径和PDI的影响。控制体积比例可以控制粒度。组合物在表10中有描述。所有的最终产品是N40-c75。
发明详述
“脱乙酰壳多糖-核酸复合物”、“脱乙酰壳多糖-核酸复合物颗粒”或“复合物”意指包含多个脱乙酰壳多糖分子(每个分子为氨基葡萄糖单体的聚合物)和多个核酸分子的复合物。脱乙酰壳多糖单体包括衍生物，衍生物包括与配体相连的脱乙酰壳多糖。“衍生物”可以应当理解为包括以脱乙酰壳多糖为基础的种类宽泛的聚合物，这类聚合物包括共价修饰的N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖单元，以及结合其他单元或连接于其他部分的以脱乙酰壳多糖为基础的聚合物。衍生物往往基于对氨基葡萄糖的羟基或氨基的修饰。脱乙酰壳多糖衍生物的例子包括但不限于，三甲基化脱乙酰壳多糖、聚乙二醇化脱乙酰壳多糖(PEGylatedchitosan)、巯基化脱乙酰壳多糖(thiolated chitosan)、半乳糖化脱乙酰壳多糖、烷基化脱乙酰壳多糖、结合PEI的脱乙酰壳多糖、精氨酸修饰的脱乙酰壳多糖、糖醛酸修饰的脱乙酰壳多糖等。有关脱乙酰壳多糖衍生物的进一步教导，参见，例如″Non-viral Gene Therapy(非病毒基因疗法)″，K.Taira，K.Kataoka，T.Niidome(editors)，Springer-Verlag Tokyo，2005，ISBN4-431-25122-7的63-74页；Zhu et al.，Chinese Science Bulletin，December2007，vol.52(23)，pp.3207-3215；以及Varma et al.，Carbohydrate Polymers55(2004)77-93。
本文所用的脱乙酰壳多糖聚合物的“平均重量”是指平均分子量。
“平衡阴离子”是指能与带有电荷的脱乙酰壳多糖胺产生静电相互作用的阴离子。优选的平衡阴离子包括醋酸离子和氯离子。
脱乙酰壳多糖可以按照2007年3月30日提交的U.S.S.N.11/694,852所描述的方法制备，该将申请的全部能容通过引用明确并入。也可以使用脱乙酰壳多糖衍生物，脱乙酰壳多糖衍生物包括包含配体部分的衍生物。
脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物
一方面，本发明提供了脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物，该组合物包含水合的脱乙酰壳多糖-核酸复合物。组合物中的脱乙酰壳多糖-核酸复合物被高度浓缩，核酸浓度大于约0.5mg/ml。组合物基本上不含复合物沉淀。本文所用的“基本上不含”复合物沉淀是指组合物中基本上不含目视可见的颗粒。
在优选的实施方案中，脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物具有浓度为至少约0.6mg/ml，更优选至少约0.75mg/ml，更优选至少约1.0mg/ml，再优选至少约1.2mg/ml，最优选至少约1.5mg/ml的核酸。在优选的实施方案中，组合物中基本上不含未复合的核酸。
在优选的实施方案中，脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物是分散体系。在优选的实施方案中，分散体系是等渗的。在保持复合物稳定性的同时获得等渗性，在配制药物组合物中是非常理想的，因此这些优选的组合物非常适于药物配制和治疗应用。
在其他实施方案中，组合物可以是高渗或低渗的。
在优选的实施方案中，脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物还包含聚集抑制剂。聚集抑制剂是能部分或全部减少复合物聚集和/或沉淀，并能通过浓缩方法，优选通过切向流动过滤(“TFF”)，浓缩脱乙酰壳多糖-核酸复合物的试剂。尽管其他聚集抑制剂，例如能够减少复合物沉淀以及能浓缩脱乙酰壳多糖-核酸复合物的其他糖也可以使用，但高度优选的聚集抑制剂是蔗糖。其他聚集抑制剂的实例包括但不限于海藻糖、甘油、果糖、葡萄糖、以及其他还原糖和非还原糖。
在优选的实施方案中，所用的聚集抑制剂为蔗糖。脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系中蔗糖的浓度优选按重量计为约3％-20％。最优选蔗糖的浓度提供等渗组合物。
脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物中复合物的分子大小优选是均一的。因此，在优选的实施方案中，组合物的脱乙酰壳多糖-核酸复合物具有低的平均多分散性指数(“PDI”)。在特别优化的实施方案中，脱乙酰壳多糖-核酸复合物的分散体系的PDI小于约0.5，更优选小于约0.4，更优选小于约0.3，再优选小于约0.2。
优选地，组合物中脱乙酰壳多糖-核酸复合物的大小基本上稳定。在优选的实施方案中，本发明的组合物包含这样的复合物，其在室温下6小时(hr)，更优选12小时，更优选24小时，再优选48小时，平均直径增加小于100％，更优选小于50％，更优选小于25％。
优选地，在冷环境中，脱乙酰壳多糖-核酸复合物的大小基本上稳定。在优选的实施方案中，本发明包含这样的复合物，其在2-8摄氏度下6小时，更优选12小时，更优选24小时，再优选48小时，平均直径增加小于100％，更优选小于50％，更优选小于25％。
优选地，在冷冻-解冻条件下，组合物的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的大小基本上稳定。在优选的实施方案中，本发明包含这样的组合物，其在-20到-80摄氏度的冷冻中解冻后，在室温下6小时，更优选12小时，更优选24小时，再优选48小时，平均直径增加小于100％，更优选小于50％，更优选小于25％。
脱乙酰壳多糖-核酸复合物包含核酸成分和脱乙酰壳多糖成分。本发明的核酸通常含有磷酸二酯键，尽管某些情况下为了多种目的，如稳定性和保护，包括有替代骨架或其它修饰或部分的核酸类似物。所考虑的其他核酸类似物包括带有非核主链的类似物。此外，可以制备天然存在的核酸、类似物以及它们两者的混合物。核酸可以是单链的或双链的，或含有部分双链或单链序列。核酸包括但不限于DNA、RNA以及杂合体，其中核酸含有各种脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸的任何组合，以及碱基的任何组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤。核酸包括任何形式的DNA、任何形式的RNA，包括三链体、双链体或单链体、反义、siRNA、核酶、脱氧核酶、多核苷酸、寡核苷酸、嵌合体及其衍生物。
在一个实施方案中，核酸成分包含治疗性核酸。治疗性核酸包含治疗性RNA，它是能在哺乳动物细胞中发挥治疗效果的RNA分子。治疗性RNA包括反义RNA、siRNA、短的发夹RNA、酶性RNA。治疗性核酸包括用于形成三链体分子的核酸、蛋白结合核酸、核酶、脱氧核酶和小核苷酸分子。
治疗性核酸也包括编码治疗性蛋白质的核酸，包括细胞毒性蛋白和前体药物；核酶；它们的反义或互补物；或其他此类分子。
在优选的实施方案中，核酸成分包括治疗性核酸构建体。治疗性核酸构建体是能够发挥治疗效果的核酸构建体。治疗性核酸构建体可以包含编码治疗性蛋白质的核酸以及产生治疗性RNA转录物的核酸。治疗性RNA是能在哺乳动物细胞中发挥治疗效果的RNA分子。治疗性RNA包括反义RNA、siRNA、短的发夹RNA、酶性RNA。治疗性核酸包括用于形成三链体分子的核酸、蛋白结合核酸、核酶、脱氧核酶和小核苷酸分子。治疗性核酸可以实现用于基因治疗，作为有缺陷的基因的替代物或增强剂或者通过编码治疗性产物补偿特定基因产物的缺乏。治疗性核酸也可以抑制内源基因的表达。治疗性核酸可以编码全部或部分翻译产物，或者通过与细胞内已经存在的DNA重组发挥作用，由此取代有缺陷的部分基因。它也可以编码蛋白的一部分并通过基因产物的共同抑制来发挥其效果。在优选的实施方案中，治疗性核酸选自U.S.S.N 11/694,852所公开的核酸。
在优选的实施方案中，复合物包含具有平均小于约3000个，更优选小于约2000个，更优选小于约1500个，再优选小于约1000个，进一步优选小于约500个，更进一步优选小于约100个，再进一步优选小于约50个氨基葡萄糖单体单元的脱乙酰壳多糖。
在优选的实施方案中，复合物包含平均重量小于约500kDa，更优选小于约250kDa，更优选小于约150kDa，再优选小于约100kDa，进一步优选小于约50kDa，更进一步优选小于约25kDa的脱乙酰壳多糖。
在优选的实施方案中，组合物中复合物的平均直径小于750nm，更优选小于500nm，更优选小于约250nm，再优选小于约200nm，进一步优选小于约150nm。
在一个实施方案中，脱乙酰壳多糖成分的平均分子量在3kDa和250kDa之间。
在一个实施方案中，脱乙酰壳多糖成分的平均分子量大于或等于250kDa。
在一个实施方案中，脱乙酰壳多糖成分的平均分子量小于或等于3kDa。
在一个实施方案中，脱乙酰壳多糖-核酸复合物的N∶P比例在约2∶1和约100∶1之间，更优选在约5∶1和约90∶1之间，更优选在约10∶1和约90∶1之间。
在一个实施方案中，脱乙酰壳多糖-核酸复合物的N∶P比例大于或等于90∶1。
在一个实施方案中，脱乙酰壳多糖-核酸复合物的N∶P比例小于或等于10∶1。
在一个实施方案中，在pH为5时，脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均ζ电位在+30mV和+50mV之间。
在一个实施方案中，在pH值为5时，脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均ζ电位小于或等于+30mV。
在一个实施方案中，在pH值为5时，脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均ζ电位大于或等于+50mV。
在一个实施方案中，脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均直径小于225nm。
在一个实施方案中，脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均直径大于或等于225nm。
在一个实施方案中，组合物的pH值小于6.5，更优选小于6.0，最优选在约4.5和约5.5之间。
在一个实施方案中，组合物的pH值大于或等于6.5。
在一个实施方案中，组合物的pH值小于或等于4.5。
在一个实施方案中，复合物中脱乙酰壳多糖分子的脱乙酰程度大于约70％，更优选大于约75％，更优选大于约80％，再优选大于约85％，进一步优选大于约90％，更进一步优选大于约95％，最优选至少98％。
在一个实施方案中，复合物中脱乙酰壳多糖的脱乙酰程度小于或等于70％。
在一个优选的实施方案中，组合物基本上由脱乙酰壳多糖-核酸复合物和聚集抑制剂组成。这样的组合物可以包括平衡阴离子和其他赋形剂，如对羟基苯甲酸甲酯。
在另一个优选的实施方案中，组合物基本上由脱乙酰壳多糖-核酸复合物组成。这样的组合物可以包括平衡阴离子和其他赋形剂，如对羟基苯甲酸甲酯。
在一个特别优选的实施方案中，脱乙酰壳多糖-核酸复合物选自U.S.S.N 11/694,852所公开的复合物。
制备方法
在一个优选的实施方案中，本发明的高浓度脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物，通过浓缩未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系制备。
未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物的核酸浓度优选小于0.5mg/ml。
尽管其他的方法，如将核酸或脱乙酰壳多糖溶液滴人另一种溶液中以形成混合溶液的方法，也可以使用，但未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系优选通过在线混合方法制备。然而，在线混合方法适于制备大体积均一的脱乙酰壳多糖-核酸复合物，该复合物的平均PDI优选小于0.5，更优选小于约0.4，再优选小于约0.3，进一步优选小于约0.2。
在线混合是一个公知的过程，其中两股(或更多股)流体被汇聚成单股。在线混合在下面进行了示例。有关在线混合的其他公开内容，可参见，例如U.S.6,251,599和6,537,813，在此将每一篇都通过引用全文并入。
尽管可以使用如静态混合器和动态混合器的混合器，但此类装置会导致本发明方法所形成的复合物的PDI增加。因此，在本发明优选的实施方案中，不使用此类混合器进行在线混合。
在本发明中，切向流动过滤(“TFF”)是浓缩未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系的优选方法。在TFF操作中，脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系在泵的驱动下通过半渗透膜的表面，同时向膜的方向施加压力以驱使一部分流体穿过膜。小于膜孔的分子穿过膜并被作为渗透液收集。渗透溶质包括但不限于盐、离子、糖和微生物防腐剂。体太大而不能穿过膜的分子实体，包括脱乙酰壳多糖-核酸复合物，被保留在流体中，作为保留物被再循环。使用TFF，复合物浓度可以被增加许多倍，得到高浓缩的复合物分散体系。在优选的实施方案中，高浓缩的复合物分散体系是等渗的。
在优选的实施方案中，未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系包括糖，优选蔗糖。如下文所述，发现蔗糖是防止浓缩过程中颗粒聚集的聚集抑制剂。此外，蔗糖是有效的防冻剂，DNA浓度为约1mg/mL并含有多达15％的蔗糖的示例性冷冻复合物分散体系稳定可长达至少1个月。
使用TFF浓缩未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物在下文进行了示例。
通过操作原料体积改变脱乙酰壳多糖-核酸复合物的特性
令人惊讶的发现是，在保持脱乙酰壳多糖∶核酸比例基本上不变并保持脱乙酰壳多糖和核酸的混合浓度基本上不变的情况下，可以调整通过混合核酸和脱乙酰壳多糖形成的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的特性。特别是，发现通过改变脱乙酰壳多糖和核酸原料溶液的体积比，可以改变通过混合这两种溶液形成的复合物的特性。
因此，一方面，本发明提供了调整通过混合核酸和脱乙酰壳多糖形成的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的特性的方法。在一个实施方案中，本发明提供了调整脱乙酰壳多糖-核酸复合物直径的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了调整脱乙酰壳多糖-核酸复合物ζ电位的方法。该方法包括改变用于产生复合物的脱乙酰壳多糖和核酸溶液的体积，而基本上不改变核酸与脱乙酰壳多糖的比例或混合溶液中核酸和脱乙酰壳多糖的浓度。在优选的实施例中，该方法包括在线混合脱乙酰壳多糖和核酸的原料溶液。
粉末制剂
本发明的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物包括粉末。在优选的实施方案中，本发明提供了干粉形式的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物。在优选的实施例里，干粉形式的的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物通过使本发明的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系脱水产生。
使用方法
除了治疗性应用外，本发明在期望稳定核酸或期望增加核酸浓度的任何时候通常都是有用的。在实验室环境下，在程序进行中的任何时候，核酸的稳定性都很重要，该程序危机核酸结构的完整性和功能性。
药物制剂
本发明也提供了“药学上可接受的”或“生理上可接受”的包含本发明的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的组合物的制剂。此类制剂可以体内给予个体以实施治疗方法。
本文所用的术语“药学上可接受的”和“生理上可接受”的是指优选在不产生过度的不良副作用(如恶心、腹部疼痛、头痛等)的情况下，可以给予个体的载体、稀释剂、赋形剂等。此类给药制品包括无菌水性或非水性溶液、悬液以及乳剂。
药物制剂可以由与向个体给药相容的载体、稀释剂、赋形剂、溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等制成。此类制剂可以包含在片剂(包衣或不包衣)、胶囊剂(硬的或软的)、微球、乳剂、粉剂、颗粒、晶体、悬液、糖浆或酏剂中。也可以存在辅助性活性化合物和防腐剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体等。
药物制剂经配制，可以与其既定的给药途径相容。例如，对于口服给药而言，组合物可以与赋形剂混合，以片剂、锭剂或胶囊如明胶胶囊的形式使用。药学上相容的粘合剂，和/或佐剂材料也可以包括于口服制剂中。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有下列任何一种成分，或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如褐藻酸、羧甲基淀粉(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精或调味剂如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或调味料。
制剂也可以包括载体以保护组合物避免快速降解或从体内排出，例如控释制剂，包括植入和微胶囊送递系统。例如，可以使用延时材料，如单独使用单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯，或使用其与蜡的组合。
也可考虑栓剂和其他直肠给药制剂(如通过灌肠给药的制剂)。其他有关直肠给药方式，参见，例如，Song et al.，Mucosal drug delivery：membranes，methodologies，and applications，Crit.Rev.Ther.Drug.CarrierSyst.，21：195-256，2004；Wearley，Recent progress in protein and peptidedelivery by noninvasive routes，Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.，8：331-394，1991。
适于给药的其他药物制剂在本领域内是已知的，也可以用于本发明的组合物和方法中(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物学)(1990)18th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.；The MerckIndex(默克索引)(1996)12th ed.，Merck Publishing Group，Whitehouse，N.J.；以及Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms(固体剂型的制药学原理)，Technonic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，Pa.，(1993))。
给药
许多种给药途径中的任何途径都是可能的，并且具体给药途径的选择部分取决于目标组织。注射器、内窥镜、瘘管、插管、导管和其他器械都可用于给药。
尽管预防或抑制病症、疾病或状况的进展或恶化是满意的结果，但治疗个体的剂量或“有效量”优选足以以可测量或检测的程度改善状况的一个、几个个或全部症状。因此，在通过在目标组织中表达治疗性核酸可治疗的状况或病症的情况下，所产生的用以改善本发明的方法可治疗的状况的治疗性RNA或蛋白质的量，取决于状况和期望的结果，并且可以由技术人员很容易地确定。适宜的用量取决于所治疗的状况、期望的治疗效果以及单个个体(如，个体、性别、年龄等带来的生物利用度差异)。有效量可以通过测量相关的生理效果来确定。
本发明也考虑了兽医应用。因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗非人类哺乳动物的方法，其包括将本发明的以脱乙酰壳多糖为基础的纳米颗粒给予需要治疗的非人类哺乳动物。
口服给药
本发明的复合物可以口服给药。口服给药包括吞服，使组合物进入胃肠道。本发明的组合物也可以直接向胃肠道给药。
适于口服给药的制剂包括固体制剂如片剂、包含颗粒的胶囊、液体或粉剂、锭剂(包括液体填充的)、咀嚼剂(chew)、多粒子和纳米颗粒、凝胶、薄膜、栓剂和喷雾剂。
液体制剂包括悬液、溶液、糖浆和酏剂。液体制剂可以通过固体加水复原制备。
片剂剂型通常含有崩解剂，崩解剂的例子包括乙醇钠淀粉、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、微晶纤维素、低烷基取代羟丙基纤维素、淀粉、预糊化淀粉和海藻酸钠。通常，崩解剂含量为药剂重量的1％-25％，优选为药剂重量的5％-20％。
粘合剂通常用于赋予片剂制剂粘合性能。适宜的粘合剂包括微晶纤维素、明胶、糖、聚乙二醇、天然及合成树胶、聚乙烯吡咯烷酮、预糊化淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素。片剂还可以含有稀释剂，如乳糖(一水合、喷雾干燥一水合、无水等)、甘露醇、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、微晶纤维素、淀粉和二水合双磷酸钙。
片剂也可任选地包含表面活性剂，如十二烷基硫酸钠和吐温80(polysorbate 80)，以及助流剂如二氧化硅和滑石。当存在时，表面活性剂含量可以为片剂重量的0.2％-5％，助流剂含量可以为片剂重量的0.2％-1％。
片剂通常含有润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂富马酸钠和硬脂酸镁与十二烷基硫酸钠的混和物。润滑剂含量通常为片剂重量的0.25％-10％，优选为片剂重量的0.2％-3％。
其他可能含有的成分包括抗氧化剂、着色剂、调味剂、防腐剂和味道掩蔽剂。
片剂混和物可以直接或者通过辊子压成片剂。可选地，片剂混和物或部分混和物在制成片剂前可以进行湿、干或熔化制粒、熔化凝结或挤压。最终的制剂可以包含一层或多层，可以是包衣的或者不包衣的，也可以是封装的。
片剂制剂在Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets(药物剂型：片剂)，Vol.1，by H.Lieberman and L.Lachman(Marcel Dekker，New York，1980)中做了讨论。
人用或兽用口腔溶解薄膜(consumable oral film)通常是柔韧的水溶性或水膨胀性薄膜剂型，其可以快速溶解或粘膜粘附，通常包含成膜聚合物、粘合剂、溶剂、保湿剂、增塑剂、稳定剂或乳化剂、粘度改性剂和溶剂。制剂中的某些成分可以履行一种以上的功能。
本发明也包括包含本发明组合物的多颗粒珠(multiparticulate bead)。
其他可能含有的成分包括抗氧化剂、着色剂、调味剂和增味剂、防腐剂、唾液刺激剂、冷却剂、共溶剂(包括油)、润肤剂、膨化剂、抗泡剂、表面活性剂和味道掩蔽剂。
本发明的薄膜通常通过蒸发干燥覆盖在可剥离的背面支持物或纸上的含水薄膜制备。此过程可以在烘箱或烘道内完成，通常在组合的包衣干燥器中完成，或通过冷冻干燥或真空干燥完成。
口服给药固体制剂经配制，可以成为即释型和/或调释型，调释型制剂包括，延迟释放、缓释、脉动释放、控释、靶向释放和程序化释放。
其他的释放技术，如高能分散体系、渗透和包衣颗粒是公知的。
非肠道给药
本发明的复合物也可以直接给药进入血流、进入肌肉、进入内脏器官。适宜的非肠道给药方法包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、脑室内、尿道内、胸骨内、颅骨内、肌肉和皮下。适宜的非肠道给药装置包括针(包括微针)注射器，无针注射器和输注技术。
非肠道制剂通常为可以含有赋形剂如盐、碳水化合物和缓冲剂的水性溶液，但对于某些应用而言，更适宜配制成无菌非水性溶液或者配制成与适合的载体如无菌、无热源水结合使用的干燥形式。
在无菌条件下制备非肠道制剂，如，通过冻干可以，很容易使用本领域技术人员熟知的标准制药技术完成。
可以通过使用适当的配制技术比如加入增溶剂，增加在制备非肠道用溶液时所用的复合物的溶解性。
非肠道给药制剂可以制成即释型和/或调释型，调释型制剂包括，延迟释放、缓释、脉动释放、控释、靶向释放和程序化释放。本发明的复合物可以制成固体、半固体或触变液体，用于作为提供活性复合物的调控释放的植入库给药。
局部给药
本发明的复合物也可以对皮肤或粘膜局部给药，即皮肤给药或透皮给药。这种给药方式的典型制剂包括凝胶、水凝胶、洗液、溶液、乳剂、药膏、撒粉剂(dusting powder)、敷料剂、泡沫剂、薄膜、皮肤贴剂、晶片(wafer)、植入物、海绵、纤维、绷带和微乳液。
局部给药的其他方式包括通过电穿孔送递、电离子透入、超声波透入、超声波导入和微针或无针(如PowderjectTM，BiojectTM等)注射。
局部给药制剂可以制成即释型和/或调释型。调释型制剂包括，延迟释放、缓释、脉动释放、控释、靶向释放和程序化释放。
吸入/鼻腔给药
本发明的复合物也可以通过鼻腔内或者吸入给药，通常是以来自干粉吸入器的干粉形式(单独或以组合物形式使用，如与乳糖组成干的混合物，或者作为混合的颗粒成分)，或在使用或不使用适宜的推进剂的情况下作为来自加压的容器、泵、喷雾器、雾化器或喷气器的气溶胶喷雾。
用于吸入器或吹药器内的药囊、气泡、药筒可以被制成含有本发明的复合物的粉末、适宜的粉末基质如乳糖或淀粉和改性剂如L-亮氨酸、甘露醇或硬脂酸镁组合物。
吸入/鼻腔内给药制剂可以制成即释型和/或调释型。调释型制剂包括，延迟释放、缓释、脉动释放、控释、靶向释放和程序化释放。
直肠/阴道内给药
本发明的复合物也可以直肠或阴道给药，例如，以栓剂、阴道栓剂(pressary)或灌肠剂的形式。可可油是一种传统的栓剂基质，但多种替代物也可以酌情使用。
直肠/阴道给药制剂可以制成即释型和/或调释型。调释型制剂包括，延迟释放、缓释、脉动释放、控释、靶向释放和程序化释放。
眼部/耳部给药
本发明的复合物也可以向眼或耳直接给药，通常是以滴剂的形式。其他适于眼部或耳部给药的制剂包括药膏、可生物降解(如可吸收凝胶海绵，胶原蛋白)和非生物降解(如硅)的植入物、晶片、镜片和颗粒系统。制剂也可以使用离子透入法送递。
眼部/耳部给药可以制成即释型和/或调释型，调释型制剂包括，延迟释放、缓释、脉动释放、控释、靶向释放和程序化释放。
实施例
实施例1：制备浓度高达250μg/mL的复合物随后浓缩至大于1mg/mL
示例性的试剂、浓度和比例说明见图1和下文的描述。
使用注射泵和高速蠕动泵、硅胶管和聚丙烯T型接头测试简单的小规模在线混合设备。这个过程使用23mer/98％DDA脱乙酰壳多糖(即平均有23个单体(氨基葡萄糖)的脱乙酰壳多糖聚合物，98％脱乙酰)，在20的N/P比例下，制备DNA终浓度高达250μg/mL的复合物。结果表明，复合物的粒度和PDI可以通过控制原料的浓度、体积混合比以及DNA和脱乙酰壳多糖溶液的流速来紧密控制。另外，发现在DNA和脱乙酰壳多糖原料中加入蔗糖通过降低粒度和PDI而有助于制造过程。加入蔗糖也防止了浓缩过程颗粒聚集。DNA浓度为约1mg/mL且含有高达15％的蔗糖的冷冻复合物可以保持稳定长达至少一个月。此外，在线混合过程可以容易的从50mL调整至高达2L，并保持低的相对标准偏差(RSD)值：粒度＝±9％，PDI＝±6％。
  材料   供应商   目录编号
  脱乙酰壳多糖(23mer，98％DDA)   Biosyntech   N/A
  pDNA(pCHS4-3xFLAG-CMV-SEAP-attB)   enGene Inc.   N/A
  pDNA(pCMV-INT)   enGene Inc.   N/A
  pDNA(gWIZ-SEAP)   Aldevron LLC   5005
  pDNA(gWIZ-荧光素酶)   Aldevron LLC   5001
  蔗糖，ACS级   Fisher Scientific   S5-3
  铂金硫化硅胶管，内径1/16”   Cole-Parmer   95802-02
  PP三通接头，内径3/32”   Cole-Parmer   30623-57
  PP注射器，3mL   B-D   309585
  PP注射器，10mL   B-D   309604
  PP注射器，20mL   B-D   309661
  PP注射器，30mL   B-D   309650
  PP鲁尔接头，内径1/8”   Cole-Parmer   45500-04
  针式过滤器mm，0.2μm滤膜   Pall   4612
  针式过滤器32-mm，0.2μm滤膜   Pall   4652
  一次性杯(cuvettes)，PS，1.5mL半微量   Plastibrand   759075D
  折叠的毛细管ζ细胞   Malvern Instruments   DTS 1060
  TFF料筒，73cm2，内径1mm，100K MWCO   GE Healthcare   56-4101-14
  TFF料筒，850cm2，内径1mm，100KMWCO GE Healthcare 56-4102-15
  TFF料筒，73cm2，内径1mm ID，500KMWCO GE Healthcare 56-4101-18
  PicoGreen Quant-iT ds DNA HS测定试剂盒   Invitrogen   Q32854
  EcoR1酶，20,000U/mL   New England BioLabs   R0101S
  EcoR1缓冲液，10×   New England BioLabs   B0101S
  脱乙酰壳多糖酶，62U/mL   Sigma   C0794
  超螺旋DNA序列梯   Invitrogen   15622-012
  TrackIt青/黄色加样缓冲液，6×   Invitrogen   10482-035
  溴化乙锭   EM Science   4410
  琼脂糖，超纯   Invitrogen   15510-027
  293T-K细胞系   UBC的Kieffer博士   N/A
  Dulbecco改良Eagle培养基   VWR   X16777-128
  胎牛血清   Wisent   080150
  清明上/链霉素   Invitrogen   15140-122
  磷酸盐缓冲液   Invitrogen   21600-010
  胰蛋白酶   Invitrogen   25300-062
  Opti-mem   Invitrogen   31985-070
  SEAP化学发光测定   Roche   1779842
  胎盘碱性磷酸酶   Sigma   P-3895
  牛血清白蛋白(BSA)   Sigma   A9418
  甘油   Sigma   G5516
  微晶(Microlite)-1白色平底96-孔板   VWR   7417
仪器   制造商
注射泵，NE-1000   New Era Pump Systems Inc.
注射泵，NE-1000   New Era Pump Systems Inc.
蠕动泵，Materflex L/S泵，由L/S Easy-LoadII水泵泵头(pumpheal)驱动   Cole Parmer
粒径仪，马尔文纳米(ZEN 3600)   Malvern Instruments
pH计，Accumet AB15   Fisher Scientific
  UV分光光度计，Ultrospec 2100pro   Biochrom Ltd.
  量子荧光计，目录号Q32857 Invitrogen
  FluorChem成像系统，包括AlphaEaseFC软件v3.1   Alpha Inotech Corp
  照度计(LmaxII384)包括Softmax Pro软件v4.7.1   Molecular Devices
  小规模TFF系统(MidGee)   GE Healthcare
  中等规模TFF系统(QuixStand)   GE-Healthcare
复合物命名规定
各项目指的是脱乙酰壳多糖的类型、N/P比例、乙酸含量、pH值和DNA浓度。有详细描述的示例在表1中给出。
表1：复合制剂命名规定实例
在线混合流程
图1中表示制造1L批次以及随后TFF浓缩的典型过程的方框图。
小规模在线混合
测试简单的小规模在线混合设备，该设备使用注射泵、内径1/16英寸的硅胶管、内径3/32英寸的T形聚丙烯接头。带有容量为3mL的注射器的设备的示意图如图2所示。注意此设备的最大注射器容积为60mL。此过程用于在20的N/P比例下，使用24mer/98％DDA脱乙酰壳多糖制备DNA终浓度为150μg/mL的复合物。DNA和脱乙酰壳多糖原料以2∶1的体积比混合以产生均一的复合物制剂。
中等规模在线混合
测试简单的中等规模在线混合设备，该设备使用蠕动泵、内径3/16英寸的硅胶管、内径3/16英寸的聚丙烯接头。带有Y型接头的设备示意图如图3所示。注意此设备的最大输出体积仅受原料管体积的限制。此过程用于在20的N/P比例下，使用24mer/98％DDA脱乙酰壳多糖制造DNA终浓度为150μg/mL的复合物。DNA和脱乙酰壳多糖原料以2∶1的体积比混合以产生均一的复合物制剂。
TFF过程
进行TFF研究之前，根据制造商的说明书冲洗和清理中空纤维过滤器。按照示意图(图4)所示，安装TFF系统并清除残留的水以进行浓缩。在关闭渗透阀并完全打开背压阀之后，将DNA-脱乙酰壳多糖复合物添加到产品贮液器中。通过打开泵、完全打开渗透阀并随后调整背压阀以适应滤器进口压，启动浓缩。在浓缩过程中，在天平上观察收集到的渗透液的量，以用于确定何时达到DNA浓度目标。参见下面的公式：
  [DNA]滞留＝[DNA]初始×Mass初始÷(质量初始-质量渗透)
当体积减少目标达到以后，关闭渗透阀并完全打开背压阀，以停止浓缩过程。清洗管中残留的液体并收集终产品后，这种TFF浓缩后的产品的样品被送交分析测试并通过PicoGreen测定检测DNA浓度。剩余产品储存在4℃下，直至检测分析测试完成，然后及时使用或冷冻保存。
分析测试
颗粒分级
使用马尔文纳米光散射仪(Zetasizer Nano light scattering instrument)测量粒度。通常，样品不稀释或在10mM NaCl(最少0.4mL)中稀释20倍并装入一次性比色皿。马尔文纳米光散射仪的程序设为在三次3分钟(min)测量之前，在25℃下将样品温育3分钟。将Z-平均直径和多分散性(PDI)报告为标准偏差(n＝3)。马尔文纳米光散射仪的程序也可以设为就粘度和折射率解析样品的组成。
ζ电位
使用马尔文纳米光散射仪测量ζ电位。通常，将未稀释的样品装进马尔文纳米光散射仪的折叠的毛细管池(最小0.8mL)。马尔文纳米光散射仪的程序设为在重复测量(重复次数由马尔文纳米光散射仪软件自动确定)之前，在25℃下将样品温育3分钟。将ζ电位值报告为标准偏差(n＝3)。马尔文纳米光散射仪的程序也可以就粘度和介电常数解析最终样品的组成。
冷冻的短期稳定性
为研究短期稳定性，最终复合物产品被冷冻并保藏在适合的温度下(-20℃、-30℃或-80℃)。在一些情况下，将样品在干冰或乙醇浴中快速冷冻，并保藏在适合的温度下。在适当的时候，将样品解冻至室温，按所述进行分析。
使用PicoGreen定量DNA
在使用PicoGreen测定测量DNA之前，必须使用脱乙酰壳多糖酶使全部的DNA从复合物释放。释放之后，使用合适的DNA限制性进行DNA消化，使超螺旋DNA质粒线性化。
脱乙酰壳多糖酶消化
为确保DNA的完全释放，复合物在37℃下、pH 5.5的150mM
NaOAc中稀释至50μl以获得浓度为0.909-1.818mM的脱乙酰壳多糖(对于C(24，98)-N20-c1000颗粒，样品通常稀释1/70和1/35以获得目标脱乙酰壳多糖浓度)。50μl稀释的复合物使用50μl 4.44U/mL的脱乙酰壳多糖酶37℃下消化2小时。
EcoR1消化
温育之后，将*χμL脱乙酰壳多糖酶消化的产物添加到5μLEcoR1和5μLEcoR1缓冲液中，并使用MilliQ水使终体积至50μL。(调整样品体积*χμL，以使DNA终浓度为4ng/μL，通常，对C(24，98)-N20-c1000的颗粒样品，样品体积χ为25μL)。EcoR1样品随后在37℃下温育30分钟。
PicoGreen测定
PicoGreen Quant-iT ds DNA HS检测试剂盒提供了两种缓冲液(A和B)和两个标准品(1和2)。缓冲液A在缓冲液B中1∶20稀释以制备溶液“A/B”。标准品1和2使用溶液A/B稀释20倍(10μL加入200μL)。标准品1和2的终浓度分别为0和10ng/μL。
用溶液A/B使10-20μL EcoR1消化产物的终体积至200μL，简单涡旋，在室温(RT)下温育2分钟然后按照制造商的说明书在Qubit荧光计上测量荧光。
凝胶电泳
为了检验捕获到复合物中的DNA，对样品进行凝胶电泳。将1-5μL样品等分试样(目标为800ng DNA)与2μL Tracklt加样缓冲液混合并用水使终体积至10μL。标准泳道加入超螺旋DNA序列梯(DNA ladder)。将样品在120V电压下、在含有溴化乙锭(50μg/ml)的0.8％脂糖凝胶中解析45分钟。凝胶使用FluorChem成像系统成像。
体外转染
通常，293T-K细胞与复合物制剂的体外转染包括两个步骤：制备细胞以及随后的转染。
293T-K细胞的维持
293T-K细胞承蒙在UBC的Dr.Kieffer′s实验室赠送，按以下方法制备。使用SV40T抗体转化人类肾细胞，在含有10％胎牛血清(FBS)以及青霉素/链霉素的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco′sModified Eagle Medium，DMEM)中培养，并维持汇合率在80％以下。
用于转染的细胞的制备
按以下方法制备用于转染的细胞。在转染的前一天，将293T-K细胞添加到6孔组织培养板(3×105细胞/孔)中的3mL完全培养基(高葡萄糖DMEM+10％FBS+青霉素/链霉素)中。在转染当天，通过使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞一次，用1mL0.05％胰蛋白酶使细胞胰蛋白酶化，添加1mL完全培养基并使用血球计数器对10μL进行计数来确定两个选定孔的细胞计数。
细胞转染
转染按以下方法进行。首先去除每个孔中的培养基然后往每个孔中添加1mL Opti-men(使用HCl将pH调至5.0，并用0.2um过滤器过滤)，轻轻搅拌然后去除(一次洗涤6个孔以防止细胞移动)。往每个孔中再小心的添加1mL Opti-men，不要使细胞移动。接下来，向每个孔中添加复合物样品(目标为2μg DNA)，搅拌并在37℃下温育2小时。温育后，去除培养基并用2mL完全培养基取代，在37℃下重新温育。在规定的时间点后，去除上清并储存在-20℃，用于随后的SEAP测定。
SEAP测定
使用SEAP化学发光测定试剂盒进行SEAP测定，所有用于测定的试剂在使用前在25℃下平衡30分钟。在加入了0.1％牛血清白蛋白和50％的甘油的1×试剂盒的稀释缓冲液中将胎盘碱性磷酸酶溶解至1mg/mL，然后使用DMEM通过10倍连续稀释至0.01pg/uL。稀释标准品和解冻的样品1份在4份稀释缓冲液中，在65℃热灭活30分钟，冰上温育2分钟，离心(室温下16100×rcf2分钟)并将上清转移到新管中。25℃平衡5分钟后，一式两份，向Microlite-1板的每个孔中添加50μL样品和标准品。随后向每个孔中添加灭活缓冲液(50μL)并在不产生气泡的情况下轻轻地吹吸混合，并温育5分钟。在5分钟的温浴过程中，准备底物/增强剂，比例为底物∶增强剂1∶19。将底物/增强剂添加到每个孔中，温育20分钟，然后在光度计中以1秒钟的整合时间对平板进行读数。
结果
快速在线混合C(23，98)-N40-c75+TFF
使用中等规模在线混合系统以不同的流速90、210、270和420mL/min制备复合物。该混合系统也使用了在线静态混合装置以评估装置的效用。该系统不含有任何赋形剂。在本研究中复合物的起始DNA浓度为0.075mg/mL，随后用TFF浓缩至0.25mg/mL。
根据计算出的在线静态混合装置的雷诺值选择流速(表2)，雷诺值决定了在给定的流速下实现溶液最优混合的最小要素数。下面的公式基于制造商的说明书。
Re = 3157 · Q · S μ · D
Re＝雷诺值，Q＝流速(加仑/分钟)，
S＝比重，μ＝粘度，D＝管内径
计算出的在线静态混合装置的雷诺值
表3表示混合终流速的增加导致Z-平均粒度和PDI的增加。使用TFF浓缩对粒度、PDI、ζ电位、粘度(表3)或体外转染(图3)没有明显影响。
表3：以不同速率混合的中等规模制备的复合物的大小、PDI、ζ电位
  流速(mL/min)   直径(nm)   PDI   ζ电位(mV)   粘度(cp)
  90   混合后   84.7±1.2   0.163±0.013   32.4±0.9   1.03
  “   最终   86.5±0.6   0.161±0.004   33±1   1.06
  210   混合后   87.1±0.7   0.170±0.003   36±2   n.d.
  “   最终   91.4±0.7   0.178±0.011   n.d.   n.d.
  270   混合后   91.5±0.7   0.199±0.010   37±1   n.d.
  “   最终   95.9±1.6   0.189±0.015   36.9±0.5   1.07
  420   混合后   98.2±0.4   0.214±0.005   38±2   1.03
  “   最终   99.9±1.0   0.214±0.009   36.2±0.5   1.07
在线混合和TFF沉淀
为得到至少1mg/mL的DNA浓度，我们试图在0.15mg/mL的DNA浓度下混合复合物然后TFF浓缩至1mg/mL。然而，在这些研究过程中，浓缩步骤之后观察到了明显的沉淀(数据未显示)。这发生在小规模混合(3mL/分钟和23mL/分钟)和中等规模混合(210mL/分钟和420mL/分钟)中。
在复合物形成过程中加入蔗糖以防止沉淀
为除去TFF过程中的沉淀问题，我们在混合形成复合物前，向脱乙酰壳多糖和DNA原料中加入了各种赋形剂(10wt％蔗糖、0.09wt％甲基苯甲酸酯、0.01wt％羟基苯甲酸丙酯)。没有使用静态混合装置。发现加入赋形剂防止了TFF浓缩过程中颗粒的聚集和沉淀。此外，发现不使用静态混合装置使PDI和颗粒稳定性得到了改善。
过程更新的小规模批次
在混合前，使用含10％蔗糖的DNA和脱乙酰壳多糖原料制备小规模批次，使用90mL/分钟(剪切速率7200S-1)的再循环速率进行TFF浓缩。TFF后，粒度小于200nm，而且没有沉淀。粒度列于表4。
表4
  TFF倍数增加   直径(nm)   PDI   [DNA]
  混合(预-TFF)   100±0.8   0.134   0.16
  1.5×   102±1   0.150   0.23
  3×   107±0.6   0.146   0.40
  7.5×   117±2   0.160   1.01
在室温下18小时后，大小趋于约140nm而且在室温下3天后仍没有观察到沉淀(图6)。此外，TFF后的样品在-20℃或-80℃冷冻/解冻后也没有沉淀。在室温下24小时后，从-20℃和-80℃解冻的颗粒分别趋于约160nm和150nm(表5)。此外，体外转染测定显示，该批次具有生物效能(数据未显示)。
表5使用了10％蔗糖的小规模混合以及快速TFF：冷冻-解冻
过程更新的中等规模批次
使用所有上面所述的过程变化：在与蔗糖溶液混合前过滤DNA原料；在混合前DNA和脱乙酰壳多糖原料就含10％蔗糖；使用90mL/分钟(剪切速率7200S-1)的再循环速率进行TFF浓缩，来制备验证性中等规模批次。此外，制备了不含蔗糖和对羟基苯甲酸酯的对照批次。
在非赋形剂(对照)批次中，TFF过程中和过程后很容易观察到沉淀(数据未显示)。而在赋形剂批次中，直到DNA浓度超过约1.5mg/mL也没有观察到沉淀。
表6：包括赋形剂的复合物批次的参数
  TFF倍数增加   直径(nm)   PDI   直径(nm)+24hr   PDI+24hr   [DNA]
  混合(预-TFF)   96±0.5   0.201   0.14
  2×   101±0.5   0.207   106±0.6   0.194   0.29
  3.3×   125±0.6   0.188   0.50
  5×   147±1   0.205   0.72
  6×   139±0.6   0.193   187±2   0.210   0.90
  8×   154±0.6   0.208   232±2   0.238   0.92
  10×   ppt
中等规模0.8L示范批次
我们测试在线混合过程和TFF过程到达0.8L批次规模的可扩缩性(scalability)。混合复合物至体积达到0.8L，然后通过TFF浓缩至1.1mg/mL。该研究通过在混合过程的最初、中间、结尾取多份5mL混合的复合物的等分试样来检测混合过程的均一性。TFF过程使用850cm2的料筒(cartridge，而以前的小规模TFF研究使用73cm2的料筒)且包括了在装瓶和-30℃冷冻前浓缩产品在4℃的保存时间测试。
测试在线混合过程的均一性
在混合过程的最初、中间、结尾的25ml中收集多份5mL的样品，以测定混合过程中的均一性。结果表明最初的混合样品在120nm左右开始，并且在混合15mL后，稳定至80nm。
表7：中等规模在线混合的均一性
  样品   DNA浓度(mg/mL)   Z-平均直径(nm)   PDI
  混合B1   0.154   118±2   0.283
  混合B3   N/A   95±2   0.270
  混合B4   N/A   81±2   0.186
  混合B5   0.153   80±0.7   0.189
  混合M1   0.137   79±1   0.177
  混合E1   0.139   83±1   0.181
  混合E3   0.136   82±1   0.183
之前所有样品都在-30℃下冷冻、解冻然后进行分析。“B”表示混合过程开始(最初的25mL)的5mL样品，顺序为从1到5。“M”表示混合过程中间(在约400mL时开始)的5mL样品，顺序为从1到5。“E”表示混合过程结尾(在约750mL时开始)的5mL样品，顺序为从1到5。
测试TFF终产品的保存时间
在TFF过程完成之后，将TFF终产品等分成9×l0mL的等分试样(在20mL褐色玻璃瓶中)并密封。这些瓶随后经历各种保存时间，以模拟典型的生产保存条件：
  (a)3瓶   立即储存-30℃
  (b)3瓶   储存4℃×4小时，后储存-30℃
  (c)3瓶   储存4℃×24小时，后储存-30℃
解冻产品的结果显示，产品在4℃下经过24小时保存时间仍具有良好的稳定性。另外，对于“4h4℃，然后-30℃”的样品，解冻后经过7小时的稳定性也表明，相比起始材料，颗粒稳定性增加不到10％。
表8
  样品   DNA浓度(mg/mL)   Z-平均直径(nm)   PDI
  0h4℃，随后-30℃   N/A   110±0.7   0.211
  4h4℃，随后-30℃   1.139   112±0.2   0.217
  24h4℃，随后-30℃   N/A   114±1   0.214
  4h4℃，随后-30℃，随后7hrsRT N/A 122±0.2 0.198
之前所有样品都在-30℃下冷冻、解冻然后进行分析。
中等规模2L工程运行(Mid-Scale 2L Engineering Run)
我们测试在线混合过程和TFF过程到达2L批次大小的可扩缩性。混合复合物至体积达到2L，然后通过TFF浓缩至1.1mg/mL。本研究也通过在混合过程的最初(25ml丢弃)、中间、结尾取多份5mL混合的复合物的等分试样物来重复检测混合过程的均一性。TFF过程使用850cm2的料筒且包括在装瓶和-30℃冷冻前终浓缩产品在4℃的过夜保存测试。
通常，复合物的物理特性很好地落入预期范围和限度内。
表9
  样品   Z-平均直径(nm)   PDI   ζ电位(mV)   电导率(mS/cm)
  预TFF(新鲜)   83±0.5   0.167   N/A   N/A
  TFF后(新鲜)   118±0.6   0.207   +38±3   0.525±0.007
  TFF后(解冻)   137±0.5   0.217   +34±2   0.527±0.008
所有的样品是新鲜的或先前冷冻于-30℃(如所示)，将其解冻然后进行分析
带有赋形剂的在线混合的可扩缩性
下文是在两种规模四种批次体积(表10)下通过在线混合制造的复合物批次的物理特性的概要。所有的批次为C(24，98)-N20-c150-pH4.8-Suc15％-Pbn0.1％。混合比例为DNA∶脱乙酰壳多糖2∶1。小规模和中等规模混合的总流速分别为23.3mL/分钟和210mL/分钟(在这些速度下，两种规模混合通过管的线性流速是相等的)。
表10：经调整的混合批次的物理特性
通过凝胶电泳测试DNA捕获
测试了多种复合物制剂的游离的DNA存在情况，以确定是否所有DNA都被脱乙酰壳多糖捕获。总的来说，在任何测试的制剂中没有观察到游离的DNA(数据未显示)。
复合物的体外转染
对两种制剂进行体外转染，以比较滴注法(drip method，如U.S.S.N.11/694,852)和在线混合方法制备的复合物。在线混合法的平均转染效率比滴注法高约11％。
  混合方法   平均转染效率(ng SEAP/mL)
  滴注   2810±16
  在线混合   3112±150
最终的复合物制剂为C(23，98)-N40-Ac10.5-pH4.8-c75。对于在线混合批次来说，DNA∶脱乙酰壳多糖的体积混合比例为2∶1，输出流速为3mL/min。
变动原料体积比例改变复合物大小和PDI
使用本文描述的方法，根据表11，制备组合物。
表11
按本文所述分析制品的粒度和PDI。结果显示在图7中，并证实了在基本上保持脱乙酰壳多糖和DNA混合比例并基本上保持脱乙酰壳多糖和DNA的混合浓度的同时，可以通过改变原料体积控制粒度。
在此通过引用将所有参考文献全文并入。

Claims (36)

1.组合物，包含水合的和稳定的脱乙酰壳多糖-核酸复合物，其中所述组合物的核酸的浓度大于或等于0.5mg/mL，还包含聚集抑制剂，其中所述组合物基本上不含复合物沉淀，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均多分散性指数小于0.5。
2.如权利要求1所述的组合物，包含浓度大于0.75mg/mL的核酸。
3.如权利要求1所述的组合物，包含浓度大于1.0mg/mL的核酸。
4.如权利要求1所述的组合物，包含浓度大于1.2mg/mL的核酸。
5.如权利要求1所述的组合物，包含浓度大于1.5mg/mL的核酸。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚集抑制剂为糖。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述糖为海藻糖、甘油、果糖、葡萄糖或蔗糖。
8.如权利要求6所述的组合物，其中所述糖为蔗糖。
9.如权利要求1所述的组合物，包含浓度小于80mM的平衡阴离子。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物平均直径小于750nm。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物平均直径小于500nm。
12.如权利要求1所述的组合物，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物平均直径小于250nm。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物平均直径小于200nm。
14.如权利要求1所述的组合物，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物N:P比例大于或等于2:1。
15.如权利要求1所述的组合物，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物包含平均分子量小于500kDa的脱乙酰壳多糖分子。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物包含具有小于3000个氨基葡萄糖单体单元的脱乙酰壳多糖分子。
17.如权利要求1所述的组合物，基本上由所述的水合的脱乙酰壳多糖-核酸复合物和聚集抑制剂组成。
18.如权利要求1所述的组合物，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均多分散性指数小于0.4。
19.如权利要求1所述的组合物，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均多分散性指数小于0.3。
20.如权利要求1所述的组合物，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均多分散性指数小于0.2。
21.如权利要求1所述的组合物，所述组合物是等渗的。
22.浓缩脱乙酰壳多糖-核酸复合物的方法，包括提供未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系，其包含聚集抑制剂，并使用切向流动过滤浓缩未经浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系以形成浓缩的稳定的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系，其中所述浓缩的分散体系的核酸的浓度大于或等于0.5mg/mL，且其中所述浓缩的分散体系基本上不含复合物沉淀。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述聚集抑制剂为糖。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述糖海藻糖、甘油、果糖、葡萄糖或蔗糖。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述糖为蔗糖。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述浓缩步骤之后，在所述的浓缩的分散体系中所述聚集抑制剂的浓度基本上与其在未浓缩的分散体系中的相似。
27.如权利要求22所述的方法，其中使用在线混合制备所述未浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物分散体系。
28.如权利要求22所述的方法，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均直径小于750nm，平均多分散性指数小于0.5。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物平均直径小于500nm。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均多分散性指数小于0.3。
31.如权利要求22所述的方法，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均多分散性指数小于0.2。
32.如权利要求22所述的方法，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物平均直径的增加在室温下小于50％。
33.使用权利要求22所述的方法产生的浓缩的脱乙酰壳多糖-核酸复合物的分散体系。
34.药物组合物，包含水合的和稳定的脱乙酰壳多糖-核酸复合物，其中所述组合物的核酸的浓度大于或等于0.5mg/mL，并含有聚集抑制剂，所述组合物基本上不含复合物沉淀，且其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物包含治疗性核酸构建体，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物的平均多分散性指数小于0.5。
35.如权利要求34所述的药物组合物，其中所述药物组合物是等渗的。
36.如权利要求34所述的组合物，其中所述脱乙酰壳多糖-核酸复合物平均直径的增加在室温下小于50％。
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