CN116570615A - 一种用于胰腺癌治疗的siRNA药物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于胰腺癌治疗的siRNA药物制剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于胰腺癌治疗的siRNA药物制剂及其制备方法和应用。所述的siRNA药物制剂由靶标为KRASG12DmRNA的小干扰RNA(siRNA)、载体以及溶剂组成，其中，所述的载体由核苷脂材TPS、TPO、CPS、CPO或DNCA、阳离子脂材CLD及辅助脂材DSPE‑PEG或DSPE‑PEG‑cRGD组成。由此递送体系包载靶标为KRASG12DmRNA的小干扰RNA(siG12D)获得的新型制剂经尾静脉注射后可高效靶向小鼠原位胰腺肿瘤部位(～20％)，显著抑制肿瘤生长，且无肝肾毒性及免疫原性。本发明的提出为抗胰腺癌siRNA药物在临床的广泛应用奠定了基础，同时为攻克诸如KRAS等难成药靶点提供了技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于胰腺癌治疗的siRNA药物制剂及其制备方法，还涉及该制剂在胰腺癌靶向治疗方面的应用。本发明属于生物医药技术领域。
背景技术
生物体内源性核酸一方面承载着重要的遗传信息，另一方面通过编码功能蛋白或直接以寡核苷酸的形式参与着多种多样的生命过程，而外源性功能寡核苷酸的合理引入，可实现对某些生理或病理过程的特异性调控。目前研究较多的功能寡核苷酸包括小干扰RNA(small interfering RNAs,siRNA)、反义核酸(antisense oligonucleotides,AONs)、酶性核酸(Ribozyme)、微小RNA(microRNA,miRNA)、核酸适配体(Aptamer)、mRNA、质粒(plasmid)等，它们可序列特异性结合并沉默特定互补基因、或通过形成特定的三维空间构象特异性识别靶标、或在细胞质内表达序列编码的蛋白而发挥生物学作用。
核酸药物的靶标多位于胞内，因而安全、高效地将核酸药物递送至靶标组织、克服胞外和胞内环境障碍、实现核酸药物转染入胞并成功与靶标结合，是其应用中亟需解决的问题。siRNA作为代表性的核酸药物之一，通过结合mRNA并激活RISC切割mRNA，从而阻止疾病蛋白的表达以治疗疾病。近年来美国食品药品监督管理局和欧盟药品管理局共批准了4款siRNA药物，其中首款siRNA药物Onpattro使用了LNP递送策略，以可电离阳离子脂材DLin-MC3-DMA通过电性作用结合siRNA，制剂可以经静脉注射后到达肝脏并被肝细胞摄取。然而，阳离子脂质体由于具有过量的正电荷，易吸附血液中的多种血清蛋白，降低递送效率并引起免疫原性；其余3款药物均采用正义链3'端GalNAc缀合手段实现递送，但此递送策略仅适用于肝部靶向，应用局限性较大。
KRAS原癌基因编码的蛋白是一种小GTP酶，属于RAS超蛋白家族。在细胞内，KRAS蛋白在失活和激活状态之间转变，当KRAS与鸟嘌呤核苷二磷酸(GDP)结合时处于失活状态，当它与鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)结合时处于激活状态。大部分细胞中的KRAS处于失活状态，当它被激活后，可以激活多条下游信号通路，其中包括MAPK信号通路、PI3K信号通路和Ral-GEFs信号通路，这些信号通路在促进细胞生存、增殖和细胞因子释放方面具有重要作用，因而KRAS突变会导致下游通路过度激活，与癌症发生、发展密切相关。在人类癌症中，KRAS基因突变出现在约90％的胰腺癌中，30-40％的结肠癌中，15-20％的肺癌中(大多为非小细胞肺癌)，17％的子宫内膜癌中，此外，它也会在胆管癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌和乳腺癌等癌症类型中出现。在KRAS的基因突变中，97％是其第12号或者第13号氨基酸残基发生了突变，其中最主要的是G12D、G12V、G13D这三种突变，结构学研究表明，这些基因突变大多干扰KRAS水解GTP的能力。
美国得克萨斯州安德森癌症中心的科学家们使用iExosome外泌体(exosome)成功地将针对KRAS G12D突变mRNA的siRNA(ss 5'-GUU GGA GCU GAU GGC GUA Gtt-3',as 5'-CUA CGC CAU CAG CUC CAA Ctt-3',暂时命名为siG12D；Nature,2017,546(7659):498-503)递送至胰腺癌细胞中。目前此项研究已进入临床I期研究，但外泌体的工业化制备难度很大。
基于以上现状，新型递送策略的开发对于核酸药物的靶向递送(尤其是肝以外组织递送)具有重大意义，进而可以突破性使得诸如KRAS等的mRNA成为药物作用靶标。核苷(酸)脂材作为一类具有碱基、核苷或核苷酸头部的两亲性分子，可通过氢键和π-π堆积等次级键相互作用结合核酸，从而发挥包载作用，此类脂材应用潜力巨大，值得进行深入探索。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对可应用于胰腺癌靶向治疗的siRNA药物制剂及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的一种用于胰腺癌治疗的siRNA药物制剂，是由靶标为KRASG12D mRNA的小干扰RNA(siRNA)、载体以及溶剂组成，其中，所述的载体由核苷脂材TPS、TPO、CPS、CPO或DNCA、阳离子脂材CLD及辅助脂材DSPE-PEG或DSPE-PEG-cRGD组成，所述脂材TPS、CPS、CLDA、DSPE-PEG的结构式如下所示：
其中，B为胞嘧啶或胸腺嘧啶，X为硫或氧，R1为R2为C16H33，R3为C17H35。
其中，优选的，所述的小干扰RNA(siRNA)为siG12D，其序列为：ss 5'-GUU GGA GCUGAU GGC GUAGtt-3',as 5'-CUACGC CAU CAG CUC CAACtt-3'。
其中，优选的，所述的核苷脂材、阳离子脂材与小干扰RNA物质的量之比为21：31.5：1、10：5：1或30：7.5：1。
其中，优选的，辅助脂材的用量为核苷脂材与阳离子脂材摩尔数总和的0.7％-3％。
其中，优选的，所述的溶剂为GenOpti溶液。
进一步的，本发明还提出了一种制备所述的寡核苷酸药物制剂的方法，包括以下步骤：
(1)将靶标为KRASG12D mRNA的小干扰RNA(siRNA)药物用无酶水配制为0.05mM～10mM浓度的母液，核苷脂材TPS、TPO、CPS、CPO或DNCA以及阳离子脂材CLD用无水乙醇配制为1mM～100mM浓度的母液，辅助脂材DSPE-PEG或DSPE-PEG-cRGD用无水乙醇配制为0.1mM～50mM浓度的母液；
(2)向离心管中加入小干扰RNA药物的母液，然后加入一半体积的GenOpti溶液；
(3)紧贴液面依次加入核苷脂材TPS、TPO、CPS、CPO或DNCA、阳离子脂材CLD以及辅助脂材DSPE-PEG或DSPE-PEG-cRGD的无水乙醇母液；
(4)补全另一半体积的GenOpti溶液；
(5)70℃、4KHz超声10min。
更进一步的，本发明还提出了所述的siRNA药物制剂在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
相较于现有技术，本发明的优点在于：
1.本发明以靶标为KRASG12D mRNA的小干扰RNA(siG12D)为包载对象，以核苷(酸)脂材(TPS,TPO,CPS,CPO,DNCA)联合阳离子脂材(CLD)，辅以辅助脂材(DSPE-PEG或DSPE-PEG-cRGD)为载体，通过制剂组分优化、各脂材比例调整及肿瘤靶向性辅助脂材的扦插，突破性实现对小干扰核酸药物的高效肝外组织递送，靶向制剂经尾静脉注射后，在小鼠原位胰腺肿瘤部位蓄积量高达～20％，蓄积时间大于176小时，显著沉默肿瘤组织细胞内靶标mRNA，发挥出高效抑制肿瘤生长的作用，且制剂安全性高。此递送体系可作为平台技术，广泛应用于不同类型功能性寡核苷酸的肝外组织靶向递送。
2.此递送体系包载靶标为KRASG12D mRNA的小干扰RNA(siG12D)所获得的新型制剂在原位胰腺癌小鼠模型中显著抑制肿瘤生长，且无肝肾毒性及免疫原性,为抗胰腺癌siRNA药物的临床应用奠定了基础，同时为攻克诸如KRAS等难成药靶点提供了技术手段。
附图说明
图1为RT-qPCR实验考察不同脂材组分及配比条件下siG12D制剂对PANC-1细胞中靶标mRNA的沉默情况；
其中，A.不同制剂组给药后对靶标mRNA的沉默效果，Blank为空白溶剂对照组，siG12D为裸给siG12D组，其余6组分别为n(TPS/CLD/siG12D)＝30/7.5/1、21/31.5/1、10/5/1的3组制剂及n(TPS/CLD/DSPE-PEG2000/siG12D)＝30/7.5/0.263/1、21/31.5/0.368/1、10/5/0.105/1的3组制剂；B.不同制剂组给药后对靶标mRNA的沉默效果，Blank为空白溶剂对照组，其余8组分别为n(TPS or TPO or CPS or CPO/CLD/DSPE-PEG2000/siG12D)＝21/31.5/0.386/1的4组制剂及n(TPS or TPO or CPS or CPO/CLD/DSPE-PEG2000/siG12D)＝10/5/0.105/1的4组制剂。所用细胞：PANC-1；siG12D给药浓度：25nM；检测时间：给药后24h。
图2为流式细胞术考察不同脂材组分及配比条件下siG12D制剂在PANC-1细胞中的摄取情况；
其中，Blank：空白溶剂对照；siG12D：裸给siG12D；其余8组分别为n(TPS or TPOor CPS or CPO/CLD/DSPE-PEG2000/siG12D)＝21/31.5/0.386/1的4组制剂及n(TPS orTPO or CPS or CPO/CLD/DSPE-PEG2000/siG12D)＝10/5/0.105/1的4组制剂。A.不同制剂组给药后的细胞荧光强度；B.不同制剂组给药后的细胞摄取率；C.不同制剂组给药后的细胞流式峰形图。所用细胞：PANC-1；siG12D给药浓度：25nM；检测时间：给药后4h。
图3为Cy5.5-siG12D制剂在原位胰腺癌裸鼠模型中的活体成像及器官蓄积情况(10h)；
其中，四个给药组分别为n(DNCA/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/Cy5.5-siG12D)＝10/5/0.105/1、10/5/0.45/1及n(TPS/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/Cy5.5-siG12D)＝10/5/0.105/1、10/5/0.45/1的制剂。A.给药后不同时间点小鼠活体荧光成像图及总荧光值；B.给药后10h小鼠各器官平均荧光强度；C.给药后10h小鼠各器官荧光成像图；D给药后10h药物在小鼠各器官的蓄积比例。所用细胞：PANC-1；siG12D给药剂量：1mpk，单次；给药方式：尾静脉注射。
图4为Cy5.5-siG12D制剂在原位胰腺癌裸鼠模型中的活体成像及器官蓄积情况(176h)；
其中，A.给药后不同时间点小鼠活体荧光成像图及总荧光值；B.给药后176h小鼠各器官平均荧光强度；C.给药后176h小鼠各器官荧光成像图；D.给药后176h药物在小鼠各器官的蓄积比例。所用细胞：PANC-1；siG12D给药剂量：1mpk，单次；给药方式：尾静脉注射。组别与图3一致。
图5为siG12D裸给及制剂条件下在原位胰腺癌裸鼠模型中的肿瘤生长抑制情况；
其中，A.小鼠种瘤、给药信息及组别设置；B.不同时间点各组小鼠生物发光强度；C.不同时间点各组小鼠肿瘤增长倍数情况；D.解剖出的小鼠肿瘤组织照片；E解剖出的小鼠肿瘤组织重量。所用细胞：PANC1-luc；siG12D给药剂量：1mpk，day 0、1、2、3、6、9、12、15给药，共8次；给药方式：尾静脉注射。
图6为原位胰腺癌裸鼠模型药效学实验中Living Image成像图；
组别与图5一致。
图7为siG12D裸给及制剂条件给药后原位胰腺癌裸鼠胰腺组织切片HE染色结果及病理评分情况；
其中，A.Blank组及siG12D裸给组原位胰腺癌裸鼠胰腺组织切片HE染色图；B.各组原位胰腺癌裸鼠胰腺组织切片HE染色后病理评分情况(肿瘤浸润，炎症，坏死，出血，腺泡萎缩)。组别与图5一致。
图8为siG12D裸给及制剂条件下对原位胰腺癌裸鼠肿瘤组织细胞中KRASG12DmRNA的沉默效果；
组别与图5一致。
图9为siG12D裸给及制剂条件下对原位胰腺癌裸鼠体重及血生化的影响；
组别与图5一致。
图10为siG12D裸给及制剂条件下对原位胰腺癌裸鼠血清中炎症因子含量的影响；
组别与图5一致。
图11为siG12D裸给及制剂条件给药后原位胰腺癌裸鼠肝脏、肾脏组织切片HE染色结果；
其中，A.小鼠肝脏切片HE染色图；B.小鼠肾脏切片HE染色图。图片标尺:50μm。组别与图5一致。
图12为原位胰腺癌裸鼠药效学实验中各组siG12D制剂的粒径及电位情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
本实施例主要说明本发明药物制剂的制备方法。
材料与方法：
依据不同类型实验需要，siRNA用RNase-free水配制为合适浓度母液，各脂材用无水乙醇配制为合适浓度母液，具体操作如下：
(1)将靶标为KRASG12D mRNA的小干扰RNA siG12D(ss 5'-GUU GGA GCU GAU GGCGUAGtt-3',as 5'-CUACGC CAU CAG CUC CAACtt-3')药物用RNase-free水配制为0.05mM～10mM浓度的母液，核苷脂材TPS、TPO、CPS、CPO或DNCA以及阳离子脂材CLD用无水乙醇配制为1mM～100mM浓度的母液，辅助脂材DSPE-PEG或DSPE-PEG-cRGD用无水乙醇配制为0.1mM～50mM浓度的母液；
所述TPS、CPS、CLDA、DSPE-PEG结构式如下所示：
其中，B为胞嘧啶或胸腺嘧啶，X为硫或氧，R1为R2为C16H33，R3为C17H35。
(2)向离心管中加入小干扰RNA药物的母液，然后加入一半体积的GenOpti溶液；
(3)紧贴液面依次加入核苷脂材TPS、TPO、CPS、CPO或DNCA、阳离子脂材CLD以及辅助脂材DSPE-PEG或DSPE-PEG-cRGD的无水乙醇母液；
(4)补全另一半体积的GenOpti溶液；
(5)70℃、4KHz超声10min。
所述的核苷脂材、阳离子脂材与小干扰RNA物质的量之比为30-10：5-35：1。
所述的辅助脂材的用量为核苷脂材与阳离子脂材摩尔数总和的0.5％-3％。
实施例2
本实施例主要说明不同组分、不同配比的siG12D制剂对PANC-1细胞中KRASG12DmRNA的沉默效果。
材料与方法：
小干扰RNAsiG12D核酸序列订购自生工生物工程(上海)股份有限公司及通用生物(安徽)股份有限公司。
将PANC-1细胞按1.5×105cells/孔铺至12孔板，每孔900μL培养液，37℃培养16-24h后进行转染。按实施例1中方法配制各制剂，制剂中小干扰RNAsiG12D浓度为250nM(即给药终浓度为25nM)，制剂体积为100μL，滴加给药。
给药后24h后用Trizol法提取总RNA。12孔板细胞按500μL/孔的量加入Trizol混匀，室温静置5min转移至1.5mL RNase-Free EP管中，加入100μL三氯甲烷涡旋混匀后，在4℃条件下12000g离心15min，吸取水相上清液200μL，再加入200μL异丙醇，涡旋混匀后冰上静置15min，在4℃条件下12000g离心15min，弃上清，在管底可见RNA沉淀。随后每管加入1mL现配制的预冷70％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃条件下12000g离心15min，弃上清，晾沉淀至近干，加入DEPC水溶解，4℃备用或-80℃保存。
使用Nanodrop定量后，在0.2mLRNase-Free EP管中加入总RNA 1μg，无酶水补足10μL后，放入PCR仪，70℃，10min，取出后短暂离心，4℃放置；
按下表1配制反应液：
表1逆转录反应液配配制表
每管RNA均加入反应液，放入PCR仪，42℃，15min，95℃，5min；4℃5min。所得的cDNA放4℃备用或于-80℃保存。
将20μL上述cDNA用80μL无酶水稀释5倍，按下表2及程序，在八联管或专用96孔板中配制反应液，进行实时定量PCR。
表2实时定量PCR反应液配制表
PCR程序：
其中KRASG12DmRNA上下游引物分别为(5′-3′):ACT TGT GGT AGT TGG AGC AGA，TTG GAT CATATT CGT CCACAA。内参(18S)上下游引物分别为(5′-3′):GTA ACC CGT TGAACCCCATT，CCATCCAAT CGGTAG TAG CG。
结果：以TPS为核苷(酸)脂材代表，设置TPS/CLD/siRNA配比30/7.5/1、21/31.5/1的组别，另设较小脂材用量组，即TPS/CLD/siRNA配比10/5/1的组别；同时，设置TPS/CLD/DSPE-PEG2000/siRNA配比30/7.5/0.263/1、21/31.5/0.368/1、10/5/0.105/1的组别。RT-qPCR结果表明(图1A)，25nM siG12D裸给对PANC-1细胞中的靶标KRASG12DmRNA无显著沉默作用，而各siG12D制剂组均可显著沉默靶mRNA，TPS/CLD/siRNA配比为30/7.5/1、21/31.5/1、10/5/1的制剂分别沉默44％、80％、68％的靶mRNA，TPS/CLD/DSPE-PEG2000/siRNA配比为30/7.5/0.263/1、21/31.5/0.368/1、10/5/0.105/1的制剂分别沉默56％、81％、64％的靶mRNA。进一步，选取较优配比21/31.5/0.368/1、10/5/0.105/1，考察4种核苷磷脂TPS、TPO、CPS、CPO制剂对靶mRNA的沉默效果，RT-qPCR结果表明(图1B)，各组制剂均有显著药效，其中TPS制剂药效最优。
实施例3
本实施例主要说明不同组分、不同配比的Cy5.5-siG12D制剂在PANC-1细胞中的摄取情况。
材料与方法：
小干扰RNAsiG12D核酸序列订购自通用生物(安徽)股份有限公司。
将PANC-1细胞按1.5×105cells/孔铺至12孔板，每孔900μL培养液，37℃培养16-24h后进行转染。选取正义链5'端缀合Cy5.5的siG12D，按实施例1中方法配制各制剂，制剂中核酸浓度为250nM(即给药终浓度为25nM)，制剂体积为100μL，滴加给药。
给药后在培养箱中避光孵育4h，取出培养板，PBS洗涤1次，0.25％胰蛋白酶消化后收集细胞至1.5mL EP管中，4℃1000rpm离心3min，弃上清，使用PBS或无血清培养基洗细胞两次后，用适量无血清培养基重悬，过筛，CytoFLEX流式细胞分析仪(BECKMAN COULTER)检测给药后细胞荧光值变化。
结果：给药后4小时，裸给siG12D组细胞荧光值与Blank组无显著差异，表明未包载情况下，药物难以进入细胞；而制剂组细胞均有较强荧光，且峰形单一，说明制剂条件下，药物大量入胞，且入胞均一性较高，进一步分析阳性细胞比例可知，配比为21/31.5/0.368(DSPE-PEG2000)/1时，TPS、TPO、CPS、CPO的制剂在PANC-1细胞中的阳转率分别为89％、91％、93％、93％，配比为10/5/0.105(DSPE-PEG2000)/1时，TPS、TPO、CPS、CPO的制剂在PANC-1细胞中的阳转率分别为83％、86％、87％、86％(图2)。
实施例4
本实施例主要说明Cy5.5-siG12D靶向制剂在原位胰腺癌裸鼠模型体内分布、代谢情况。
材料与方法：
小干扰RNA siG12D核酸序列订购自通用生物(安徽)股份有限公司。
选取6周龄雌性BALB/c-nude小鼠，腹腔注射阿佛丁麻醉后，碘伏消毒腹部表皮，腹腔侧开小口，胰岛素针注射PANC-1细胞悬液10μL至胰腺尾部(5×106cells/只)，缝合。由于胰腺癌细胞系PANC-1高表达整合素αvβ3，而cRGD可靶向整合素αvβ3，为进一步增加制剂的肿瘤靶向性，将辅助脂材成分DSPE-PEG2000替换为DSPE-PEG2000-cRGD。选取正义链5'端缀合Cy5.5的siG12D，按照实施例1的方法共制得4组制剂：DNCA/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siRNA配比为10/5/0.105/1、10/5/0.45/1的2组制剂及TPS/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siRNA配比为10/5/0.105/1、10/5/0.45/1的2组制剂，为确定DSPE-PEG2000-cRGD的最优掺入量，设置了2个掺入比例，即核苷(酸)脂材与CLD总摩尔量的0.7％、3％。种瘤后第20天，将各组制剂分别尾静脉注射至小鼠体内，各组中核酸给药剂量均为1mpk，在给药后不同时间段，使用小动物活体成像仪(IVIS Spectrum)对小鼠进行活体荧光成像，实验终点时，异氟烷麻醉后脱颈椎处死小鼠，取脑、心脏、肺脏、肝脏、胃、肠、胰腺、脾脏、肾脏进行荧光成像，成像时激发波长为675nm，发射波长为720nm，荧光定量使用Living Image软件。
结果：活体成像结果表明，各组制剂单次给药后6小时、8小时、10小时在胰腺部位均有显著荧光蓄积，从小鼠的总荧光值来看，3％DSPE-PEG2000-cRGD掺入量的TPS组>0.7％DSPE-PEG2000-cRGD掺入量的TPS组>3％DSPE-PEG2000-cRGD掺入量的DNCA组>0.7％DSPE-PEG2000-cRGD掺入量的DNCA组，说明TPS制剂在小鼠体内的药物蓄积量总体优于DNCA制剂，且DSPE-PEG2000-cRGD掺入量为3％的制剂比掺入量为0.7％的制剂具有更优的长效循环作用(图3A)；给药后10小时，解剖脏器成像并定量荧光强度，从图片及平均荧光强度定量值来看，裸鼠脑及心脏无显著荧光，肺脏、肝脏及脾脏有一定程度荧光，胃、肠、胰腺及肾脏有较强荧光，其中胰腺的平均荧光强度最高(图3B、C)；根据总荧光值计算各脏器蓄积药物比例，结果表明DNCA/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siRNA配比为10/5/0.105/1、10/5/0.45/1的制剂在胰腺部位蓄积量为各器官药物蓄积总量的19.5％、23.8％，TPS/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siRNA配比为10/5/0.105/1、10/5/0.45/1的制剂在胰腺部位蓄积量为各器官药物蓄积总量的7.75％、17.6％，值得注意的是，小鼠的胰腺肿瘤组织生长较快，胃、肠有部分肿瘤浸润，因而胰腺、胃、肠的总药物蓄积比例也作为药物靶向性蓄积的重要指标，4个制剂组的胰腺、胃、肠总药物蓄积比例分别为69.9％、75.9％、78.5％、80.9％(图3D)。
进一步观察给药后较长时间段(176h)小鼠体内的药物分布及代谢情况，结果表明，各组小鼠的总荧光值均随时间呈下降趋势，4个制剂组中，TPS/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siRNA配比为10/5/0.45/1的制剂在小鼠体内一直具有最高的总荧光值，说明其具有最长效的体循环作用(图4A)；各组制剂单次给药后176小时，解剖脏器成像并定量荧光强度，从图片及平均荧光强度定量值来看，各脏器荧光强度与10小时解剖结果相比均有下降，此时胃、肠、胰腺仍有显著荧光，其余脏器均无显著荧光(图4B、C)；根据总荧光值计算各脏器蓄积药物比例，结果表明DNCA/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siRNA配比为10/5/0.105/1、10/5/0.45/1的制剂在胰腺部位蓄积量为各器官药物蓄积总量的17.4％、8.72％，TPS/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siRNA配比为10/5/0.105/1、10/5/0.45/1的制剂在胰腺部位蓄积量为各器官药物蓄积总量的21.3％、9.95％，4个制剂组的胰腺、胃、肠总药物蓄积比例分别为85.9％、86.5％、83.8％、86.4％(图4D)。
总体来说，TPS/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siRNA配比为10/5/0.45/1的制剂具有较长效的体循环，在给药后25小时内可以保持较优的体内药物蓄积量，在胰腺肿瘤部位及有肿瘤浸润的胃、肠部位蓄积比例理想，可考虑以此比例制剂开展原位胰腺癌裸鼠体内的药效学评价实验。
实施例5
本实施例主要说明不同组分、不同配比的siG12D靶向制剂在原位胰腺癌裸鼠模型体内的药效学作用及安全性情况。
材料与方法：
小干扰RNA siG12D核酸序列订购自通用生物(安徽)股份有限公司。
为方便观测活体小鼠的肿瘤进展情况，采用稳定表达荧光素酶的肿瘤细胞PANC1-luc构建原位胰腺癌裸鼠模型，此肿瘤细胞接种到实验动物体内后，经腹腔给予其底物荧光素luciferin后即可在数分钟至数十分钟内产生发光现象，且发光光强度与活细胞的数目线性相关。
选取6周龄雌性BALB/c-nude小鼠，腹腔注射阿佛丁麻醉后，碘伏消毒腹部表皮，腹腔侧开小口，胰岛素针注射PANC1-luc细胞悬液10μL至胰腺尾部(5×106cells/只)，缝合。种瘤后第8天，小鼠随机分为6组，各组小鼠的平均总生物发光强度Total Flux为1.7～2.6×108[p/s]，组间无显著差异，开始给药，记为day0。6组小鼠分别给药空白溶剂、siG12D、TPS/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siG12D＝10/5/0.45/1的1号制剂、TPS/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siG12D＝21/31.5/1.575/1的2号制剂、TPS/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siG12D＝21/31.5/0.368/1的3号制剂，DNCA/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siG12D＝10/5/0.45/1的4号制剂。各组中小干扰RNA siG12D核酸给药剂量均为1mpk，day 0、1、2、3、6、9、12、15分别进行尾静脉注射给药，共给药8次。整个实验周期中，隔日对小鼠进行体重称量，于day 0、5、11、19使用小动物活体成像仪(IVIS Spectrum)对小鼠进行活体生物发光成像，并使用LivingImage软件定量。
day 20达到实验终点，取血后处死小鼠，剖取出胰腺、肝脏、肾脏。剥取胰腺部位肿瘤组织称重、拍照后，将肿瘤组织放入EP管，加入1mL Trizol，研磨混匀，进行RT-qPCR实验(操作同实施例3)，剩余胰腺组织经4％多聚甲醛固定后，修剪、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、封片、镜检拍照，并进行病理评分(肿瘤浸润，炎症，坏死，出血，腺泡萎缩)，评分标准如下表3所示。
表3四级定级系统
血液在EP管中室温静置一小时以上，3500rpm离心10min，得到血清，进行血生化指标检测(ALT，AST，TBIL，UREA，CREA)及炎症因子elisa法检测(IL-6，IL-1β，IFN-γ)。血生化检测指标中，谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST、总胆红素TBIL表征肝损伤情况，ALT主要分布在肝细胞浆，ALT升高反映了肝细胞膜的损伤，AST主要分布在肝细胞浆和肝细胞线粒体中，当肝细胞严重损伤、危及线粒体时，AST也会进入血中，当肝损伤发生时，对胆红素的代谢效率降低，TBIL可能出现升高；尿素UREA、肌酐CREA表征肾损伤情况，当UREA及CREA同时升高，提示肾功能的显著降低。炎症因子中，IL-1β是IL-1家族中的重要成员，其具有较强的促炎活性，可诱导多种促炎介质，如细胞因子和趋化因子，且IL-1β具有多种功能，它对各种细胞有多种作用，并最终导致广泛的炎症事件，全身而言，IL-1β信号传导可导致急性期反应、低血压、血管扩张和发热；IL-6系统性地作用于肝脏产生急性期蛋白，如全C反应蛋白(CRP)、纤维蛋白原和纤溶酶原激活物抑制剂；IFN-γ是可溶性二聚体细胞因子，是II型干扰素的唯一成员，它主要由NK和NKT细胞分泌，在固有免疫中发挥作用，在抗原特异性免疫过程中，由CD4 Th1和CD8细胞毒性T细胞分泌。肝脏、肾脏组织经4％多聚甲醛固定后，修剪、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、封片、镜检，苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
结果:siG12D裸给组小鼠肿瘤生长未被显著抑制，瘤重均值17.6mg，与Blank组(瘤重均值16.6mg)无显著差别，day 19的Total Flux均值为8.4×108[p/s]，较day 0的1.9×108[p/s]增长了5.3倍，与Blank组(day 0的Total Flux均值为1.7×108[p/s]增长6.2倍至day 19的8.0×108[p/s])无显著差别，而各制剂组小鼠肿瘤生长均被显著抑制，1～4号制剂组小鼠瘤重均值分别为4.3、5.0、3.3、3.5mg，day 19的Total Flux均值分别为3.1、2.0、1.8、3.0×108[p/s]，肿瘤增长倍数分别为1.4、1.5、1.7、1.9倍(图5-6)。胰腺组织病理评分结果如图7所示，总体来说3号制剂组胰腺组织切片中关于肿瘤浸润、炎症、坏死、出血及腺泡萎缩的评分均最低，说明胰腺组织较健康。同时，RT-qPCR结果显示，siG12D裸给组小鼠肿瘤细胞中的靶标KRASG12D mRNA未被显著沉默，而1～4号制剂组小鼠肿瘤细胞中的靶mRNA均被显著沉默，沉默效率分别为78％、71％、93％、65％，3号制剂对靶mRNA的沉默效果最优(图8)。
各组小鼠在整个实验周期状态正常，体重稳定且各组间无统计学差异，血生化结果显示，各组小鼠血清中ALT、AST、TBIL、UREA及CREA水平无显著性差异(图9)，各组内小鼠炎症因子IL-6、IL-1β、IFN-γ水平波动较大，组间无统计学差异，但总体来说，3号制剂组小鼠的炎症因子维持在较低水平(图10)，肝脏、肾脏组织切片未见显著病理改变(图11)，表明siG12D制剂安全性良好，未造成显著肝、肾损伤。
综合药效及安全性，3号制剂，即TPS/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siG12D＝21/31.5/0.368/1的siG12D制剂，是优选的抗KRASG12D突变胰腺癌的体内靶向制剂。
实施例6
本实施例主要说明实施例5中各组制剂的粒径和Zeta电位情况。
材料与方法
小干扰RNAsiG12D核酸序列订购自通用生物(安徽)股份有限公司。
按实施例1制剂方法配置各制剂，制剂中小干扰RNAsiG12D核酸浓度为250nM，溶液体积为500μL，1号组为TPS/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siG12D＝10/5/0.45/1的制剂，2号组、3号组分别为TPS/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siG12D＝21/31.5/1.575/1、21/31.5/0.368/1的制剂，4号组为DNCA/CLD/DSPE-PEG2000-cRGD/siG12D＝10/5/0.45/1的制剂。使用Malvern ZetasizerNano-ZS型激光散射粒径测定仪进行电位粒径测定，数据利用ELS-8000软件分析处理。
结果：如图12所示，4组制剂粒径较为接近，均值分别为153.4nm、169.1nm、144.3nm、164.3nm；2号、3号制剂PDI较小，说明制剂的粒径均一性较好，而1号、4号制剂PDI较大；2号、3号制剂电位分别为-0.4mV、-1.3mV，较接近中性，1号制剂电位为-3.3mV，4号制剂电位为-8.3mV。综合来说，3号制剂粒径大小理想，粒径均一性较好，电位接近中性，是较为优选的制剂。
本文显示并详细描述的信息足以实现本发明的上述目的，因此本发明的优选实施方案代表本发明的主题，该主题为本发明所广泛涵盖。本发明的范围完全涵盖其它对本领域技术人员来说显而易见的实施方案，因此，本发明的范围不被除所附权利要求之外的任何内容所限制，其中除了明确说明外，所用元素的单数形式并不是指“一个和唯一”，而是指“一个或更多”。对本领域一般技术人员来说，所有公知的上述优选的实施方案和附加实施方案部分的结构、组成和功能上的等价物因此引入本文作参考，而且试图被本发明的权利要求所涵盖。
此外，不需要某种设备或方法来表达本发明所解决的每个问题，因为它们都已包括在本发明的权利要求之内。另外，无论本发明公开事实中的所有部分、成分，或者方法步骤是否在权利要求中被明确叙述，它们都没有贡献给公众。但是，对本领域普通技术人员来说，很明显在不背离如所附权利要求中所阐明的本发明的实质和范围的前提下，可以在形式、试剂和合成细节上做出各种改变和修饰。
Claims (7)
1.一种用于胰腺癌治疗的siRNA药物制剂，其特征在于，所述的siRNA药物制剂由靶标为KRASG12DmRNA的小干扰RNA(siRNA)、载体以及溶剂组成，其中，所述的载体由核苷脂材TPS、TPO、CPS、CPO或DNCA、阳离子脂材CLD及辅助脂材DSPE-PEG或DSPE-PEG-cRGD组成，所述脂材结构式如下所示：
其中，B为胞嘧啶或胸腺嘧啶，X为硫或氧，R1为R2为C16H33，R3为C17H35。
2.如权利要求1所述的siRNA药物制剂，其特征在于，所述的小干扰RNA(siRNA)为siG12D，其序列为：ss5'-GUUGGAGCUGAUGGCGUAGtt-3',as5'-CUACGC CAUCAGCUCCAACtt-3'。
3.如权利要求1所述的siRNA药物制剂，其特征在于，所述的核苷脂材、阳离子脂材与小干扰RNA物质的量之比为21：31.5：1、10：5：1或30：7.5：1。
4.如权利要求1所述的siRNA药物制剂，其特征在于，辅助脂材的用量为核苷脂材与阳离子脂材摩尔数总和的0.7％-3％。
5.如权利要求1所述的siRNA药物制剂，其特征在于，所述的溶剂为GenOpti溶液。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述的寡核苷酸药物制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将靶标为KRASG12DmRNA的小干扰RNA(siRNA)药物用无酶水配制为0.05mM～10mM浓度的母液，核苷脂材TPS、TPO、CPS、CPO或DNCA以及阳离子脂材CLD用无水乙醇配制为1mM～100mM浓度的母液，辅助脂材DSPE-PEG或DSPE-PEG-cRGD用无水乙醇配制为0.1mM～50mM浓度的母液；
(2)向离心管中加入小干扰RNA药物的母液，然后加入一半体积的GenOpti溶液；
(3)紧贴液面依次加入核苷脂材TPS、TPO、CPS、CPO或DNCA、阳离子脂材CLD以及辅助脂材DSPE-PEG或DSPE-PEG-cRGD的无水乙醇母液；
(4)补全另一半体积的GenOpti溶液；
(5)70℃、4KHz超声10min。
7.权利要求1-5中任一项所述的siRNA药物制剂在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
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| CN202310519477.XA CN116570615A (zh) | 2023-05-09 | 2023-05-09 | 一种用于胰腺癌治疗的siRNA药物制剂及其制备方法和应用 |
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