CN102439158A - 强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物。所述组合物可用于在体内或体外转染细胞，并且尤其可用于转染粘膜上皮细胞。

Description

强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物

相关申请的交叉引用

本申请案要求2009年3月31日提交的U.S.S.N.61/165,442的权益，其全文以引用的方式明确并入本文。

技术领域

本发明涉及强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物，及其制备和使用方法。

背景技术

壳聚糖为N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖的无毒阳离子共聚物。壳聚糖可与核酸形成复合物并且已用作转染细胞的DNA运输载体。

壳聚糖的许多生物应用已经涉及高分子壳聚糖聚合物的使用。大约数十万至数百万道尔顿的高分子壳聚糖聚合物仅可溶于酸性溶液。稀醋酸常用作这种高分子壳聚糖的溶剂。

最初认为大约数万道尔顿或更低的低分子量壳聚糖太小而不能有效包裹和保护DNA，并且不能用作DNA运输载体。然而，若干小组最近已确认低分子量壳聚糖可用于有效包裹和保护DNA，并且可用作DNA运输载体。因为低分子量壳聚糖在生理pH下表现出较高可溶性，所以已被认为可用作理想的DNA运输载体，并且据了解低pH环境促进核酸的降解。

虽然对于许多用途而言高浓度核酸是理想的，但难以生产同质壳聚糖-核酸复合物的浓缩稳定分散体。提高混合液中壳聚糖和核酸的浓度导致聚集、不稳定、粒度变化和沉淀。

已描述使用并流混合以生产包含DNA和凝聚剂的颗粒(U.S.6,537,813)。为了生产这种颗粒，可同时和单独将DNA溶液和凝聚剂溶液引入顺流混合器中，该顺流混合器包括用于混合和颗粒形成的静态或动态混合器。该技术使人们认识到在引入和混合过程中维持DNA和凝聚剂的适当摩尔比很重要，并且电中性的显著偏离可导致该过程中不完全凝聚或颗粒聚集。

发明概述

本发明的发明人已发现pH低于通常用于使壳聚糖溶解的pH很多的强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物表现出比更接近生理pH的复合物组合物更高的粘膜上皮体内转染效率。本发明组合物的pH低于4.5，但仍表现出对稳定性和核酸完整性的保持，和粘膜上皮运输的适合性。矛盾的是，已经在比高分子量壳聚糖更低的酸性pH下部分研究其可溶性的低分子量壳聚糖尤其适合用于本发明。

本发明的发明人还克服了复合物聚集和沉淀问题，以生产稳定的浓缩强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物。另外，发明人已经能够生产等渗的浓缩制剂，这些制剂对于制药和治疗应用十分理想。

因此，一方面，本发明提供包含壳聚糖-核酸复合物的强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的pH低于4.5，更优选低于4.2，更优选低于4.0，更优选低于3.8。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物包含治疗性核酸。在一个实施方案中，所述治疗性核酸为治疗性RNA。在另一个实施方案中，所述治疗性核酸为编码治疗性蛋白的治疗性核酸构建体。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物是等渗的。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物是稳定的。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物是同质的。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的平均多分散性指数(“PDI”)低于0.5，更优选低于0.4，更优选低于0.3，并且最优选低于0.2。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物不含沉淀的复合物。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的核酸浓度高于0.5mg/ml，并且不含沉淀的复合物。更优选地，本发明组合物的核酸浓度为至少0.6mg/ml，更优选地为至少0.75mg/ml，更优选地为至少1.0mg/ml，更优选地为至少1.2mg/ml，并且最优选为至少1.5mg/ml，并且不含沉淀的复合物。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物另外包含聚集抑制剂。在一个优选的实施方案中，所述聚集抑制剂为糖，优选为蔗糖。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物包含具有平均少于3000个、更优选少于2000个、更优选少于1500个、更优选少于1000个、更优选少于500个、更优选少于300个、更优选少于150个、更优选少于100个、更优选少于50个，并且最优选少于30个氨基葡萄糖单体单元的壳聚糖分子。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物的N∶P比为至少2∶1、更优选为至少5∶1、更优选为至少10∶1、更优选为至少15∶1，并且最优选为至少20∶1。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物包含具有以下平均分子量的壳聚糖：低于500kDa、更优选低于300kDa、更优选低于250kDa、更优选低于150kDa、更优选低于100kDa、更优选低于50kDa、更优选低于25kDa、更优选低于16kDa、更优选低于8kDa，并且最优选低于5kDa。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物的平均直径小于750nm，更优选小于500nm，更优选小于250nm，更优选小于200nm，并且最优选小于150nm。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物主要由壳聚糖-核酸复合物和聚集抑制剂组成。

在另一个优选的实施方案中，本发明组合物主要由壳聚糖-核酸复合物组成。

一方面，本发明提供包含本发明的强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物的药物组合物。

在一个优选的实施方案中，所述药物组合物是等渗的。在其它实施方案中，所述药物组合物可为高渗或低渗的。

一方面，本发明提供一种转染粘膜上皮细胞的方法，所述方法包括使粘膜上皮细胞与本发明的强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物接触。

在一个优选的实施方案中，所述粘膜上皮存在于选自以下各项的组织中：胃肠道组织、呼吸道组织、肺组织、窦洞组织、口腔组织、尿道组织、膀胱组织、阴道组织、子宫组织、子宫颈组织、眼组织、食道组织、唾液腺组织、鼻咽组织、肾组织和喉/咽组织。

一方面，本发明提供一种治疗涉及粘膜上皮炎症的疾病的方法，所述方法包括对患有涉及粘膜上皮炎症的疾病的患者施用治疗有效量的本发明药物组合物。优选将所述受试药物组合物局部施用至所述粘膜上皮。

在一个优选的实施方案中，所述受试药物组合物包含编码抗炎蛋白的治疗性核酸构建体。在一个实施方案中，所述抗炎蛋白为TNFα抑制剂。在另一个实施方案中，所述抗炎蛋白为IL-1抑制剂。在另一个实施方案中，所述抗炎蛋白为IL-10。

在一个优选的实施方案中，涉及粘膜上皮炎症的所述疾病为炎症性肠病(IBD)。在另一个优选的实施方案中，涉及粘膜上皮炎症的所述疾病为间质性膀胱炎。在另一个优选的实施方案中，涉及粘膜上皮炎症的所述疾病为慢性阻塞性肺病(COPD)。在另一个优选的实施方案中，涉及粘膜上皮炎症的所述疾病为哮喘。

附图简述

图1：响应施用含gWIZ-SEAP质粒DNA的c150壳聚糖-核酸颗粒所检测的猪血浆SEAP。pH为4时的药品配方为C(24，98)-N20-c150-Ac25-Suc9-pH4.0。pH为4.8时的药品配方为C(24，98)-N20-c150-Ac25-Suc9-pH4.8。

图2：1L在线批量混合和TFF浓缩＞透滤＞浓缩的示例性过程框图

图3：小规模在线混合示意图。注射器不含聚丙烯(PP)橡胶，并且每个注射器的容量可调整至高达60mL。两个精密注射泵驱动所述注射器。管材为1/16″铂金硫化硅胶(Pt-cured silicone)。所示混合连接处为Y。构建体的混合连接材料为PP。

图4：10L中等规模的在线混合示意图。所示示意图适于10L批量。对更小或更大批量规模，所有容器均做相应调整。铂金硫化管材的直径为0.48cm(3/16″)。显示了DNA∶壳聚糖体积混合比为2∶1的泵流量。

图5：TFF浓缩&透滤示意图。显示了TFF透滤示意图。TFF浓缩期间，从渗余物容器断开透析缓冲液管线并用排气口过滤器代替。

图6：对TFF浓缩期的pH变化建模。各个点表示所述复合物相对体积减少倍数(＝升高的DNA浓度)。例如，标有2X的点为约c1200。

图7：第二TFF浓缩步骤后复合物的稳定性。在25℃下温育TFF后未稀释样品并每2h监测一次粒度。

图8：过程中的pH数据。X轴上的TFF分数符号如下：C1：TFF浓缩步骤#1；D：TFF透滤，用洗液体积(WV)#表示；C2：TFF浓缩步骤#2。

图9：小鼠膀胱的体内转染。向自然C57BL/6小鼠输送载有EF1a-SEAP或对照载体的壳聚糖-DNA复合物C(24，98)-c1000-pH4。2天后，处死小鼠并获取组织。示出了经治疗小鼠膀胱组织中SEAPmRNA超过自然小鼠(未转染)的相对增量。

图10：EG-10(hlL-10)强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物对慢性IBD小鼠体重的影响。每隔7天施用各剂量的强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物。整个实验期间每周监测一次这些小鼠的体重，并且观察到每周治疗之后与EG-10治疗组相关的增重明显增加。

图11：EG-10(hlL-10)强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物对3种前炎性细胞因子的影响。在末次治疗5天后，处死两组的小鼠并且除去其结肠并测定前炎性细胞因子水平。与SEAP治疗的小鼠相比，EG-10治疗的小鼠导致IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA的水平降低。

图12：360天后在-80℃下对两批来自中等规模生产的最终复合产物(DP-0089和DP-0090)进行的琼脂凝胶电泳。示出了复合物和DNA(超螺旋和带缺口)的位置。药品配方为C(24，98)-N10-c1000-Ac70-Suc9-pH4.0。

发明详述

所谓“壳聚糖-核酸复合物”、“壳聚糖-核酸复合物颗粒”、“壳聚糖-核酸复合物”、“复合物”或同义语是指包含若干壳聚糖分子和若干核酸分子的复合物。壳聚糖单体包括衍生物，所述衍生物包括附有配体的壳聚糖。“衍生物”应理解为包括广泛的包含共价修饰的N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖单元的壳聚糖基聚合物，以及结合其它单元或连接其它部分的壳聚糖基聚合物。衍生物往往基于对氨基葡萄糖的羟基或氨基的修饰。壳聚糖衍生物的实例包括但不限于三甲基化壳聚糖、聚乙二醇化壳聚糖、巯基化壳聚糖、半乳糖苷化壳聚糖、烷基化壳聚糖、结合PEI的壳聚糖、精氨酸修饰的壳聚糖、糖醛酸修饰的壳聚糖等。有关壳聚糖衍生物的进一步教导，参见例如，“Non-viral Gene Therapy(非病毒基因疗法)”第63-74页，K.Taira，K.Kataoka，T.Niidome(编辑)，Springer-Verlag Tokyo，2005，ISBN4-431-25122-7；Zhu等，Chinese Science Bulletin，2007年12月，第52卷(23)，第3207-3215页；WO 2008/082282；和Varma等，Carbohydrate Polymers(糖类聚合物)55(2004)77-93，其各自的全部内容以引用的方式明确并入本文。

分散体系由被称为分散相、分布遍及连续介质的颗粒物质组成。壳聚糖-核酸复合物的“分散体”为包含含水壳聚糖-核酸复合物的组合物，其中所述复合物分布遍及所述介质。

本文所使用的壳聚糖聚合物“平均重量”指平均分子量。

所谓“平衡阴离子”是指能够与带有电荷的壳聚糖胺或在此处的其它阳离子产生静电相互作用的阴离子。优选的平衡阴离子包括醋酸根离子和氯离子。

本文所使用的“预浓缩”分散体是未经浓缩过程而形成如本文所述的浓缩分散体。

本文所使用的“不含”复合物沉淀指所述组合物基本上不含可目视观察到的颗粒。

壳聚糖可按照2007年3月30日提交的U.S.S.N.11/694,852所公开的方法制备，该申请的全文以引用的方式明确并入本文。

强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物

一方面，本发明提供强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物，所述组合物包含壳聚糖-核酸复合物。所述壳聚糖-核酸复合物的核酸组分被封装在壳聚糖-核酸复合物内。在一个优选的实施方案中，本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物是同质的并且在所述组合物中是稳定的。

包含多种“同质”壳聚糖-核酸复合物的组合物指复合物大小分布范围狭窄的组合物。例如，可通过所述组合物的“多分散性指数”(PDI)测定分布范围狭窄的复合物大小。本发明组合物的优选PDI低于0.5、更优选低于0.4、更优选低于0.3，并且最优选低于0.2。

包含多种“稳定”壳聚糖-核酸复合物的组合物指其中复合物保持大小稳定，即，不倾向于随时间增加尺寸或聚集。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含在室温下至少6h、更优选至少12h、更优选至少24h，并且最优选至少48h，平均直径增加少于100％、更优选少于50％，并且最优选少于25％的复合物。

本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物优选在冷却状态下稳定。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含在2-8℃下至少6h、更优选至少12h、更优选至少24h，并且最优选至少48h，平均直径增加少于100％、更优选少于50％，并且最优选少于25％的复合物。

本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物优选在冻融状态下稳定。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含在-20℃至-80℃下冻融之后，在室温下至少6h、更优选至少12h、更优选至少24h，并且最优选至少48h，平均直径增加少于100％、更优选少于50％，并且最优选少于25％的复合物。

例如，可用凝胶电泳中核酸的延迟表示本发明壳聚糖-核酸复合物中核酸的封装作用。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的pH低于4.5、更优选低于4.2、更优选低于4.0、更优选低于3.8。

在一个实施方案中，本发明组合物的pH在3.5-4.5范围内。在一个实施方案中，本发明组合物的pH在3.6-4.2范围内。在一个实施方案中，本发明组合物的pH在3.8-4.2范围内。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物包含具有平均少于3000个、更优选少于2000个、更优选少于1500个、更优选少于1000个、更优选少于500个、更优选少于300个、更优选少于150个、更优选少于100个、更优选少于50个，并且最优选少于30个氨基葡萄糖单体单元的壳聚糖分子。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物包含具有以下平均分子量的壳聚糖：低于500kDa、更优选低于300kDa、更优选低于250kDa、更优选低于150kDa、更优选低于100kDa、更优选低于50kDa、更优选低于25kDa、更优选低于16kDa、更优选低于8kDa，并且最优选低于5kDa。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的壳聚糖组分具有在3kDa和250kDa之间的平均分子量。

在一个实施方案中，本发明组合物的壳聚糖组分具有高于或等于250kDa的平均分子量。

在一个实施方案中，本发明组合物的壳聚糖组分具有低于或等于3kDa的平均分子量。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的复合物的平均直径小于750nm、更优选小于500nm、更优选小于250nm、更优选小于200nm，并且最优选小于150nm。

在一个实施方案中，本发明组合物的复合物的平均直径大于100nm。

在一个实施方案中，本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物的N∶P比在2∶1和100∶1之间，更优选在5∶1和90∶1之间，更优选在10∶1和90∶1之间，并且最优选在20∶1和90∶1之间。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物的平均ζ电势在+20mV和+60mV之间。

在一个实施方案中，本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物的平均ζ电势低于或等于+20mV。

在一个实施方案中，本发明组合物的壳聚糖-核酸复合物的平均ζ电势高于或等于+60mV。

在一个优选的实施方案中，所述复合物的壳聚糖分子的脱乙酰程度高于70％、更优选高于75％、更优选高于80％、更优选高于85％、更优选高于90％、更优选高于95％，并且最优选为至少98％。

在一个实施方案中，所述复合物的壳聚糖分子的脱乙酰程度低于或等于70％。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物主要由壳聚糖-核酸复合物和聚集抑制剂组成。除本发明的复合物和聚集抑制剂外，这种组合物可包括平衡阴离子和其它赋形剂，但不包括显著影响本发明组合物活性的其它物质。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物主要由壳聚糖-核酸复合物组成。除本发明复合物外，这种组合物可包括平衡阴离子和其它赋形剂，但不包括显著影响本发明组合物活性的其它物质。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物不包括对羟基苯甲酸酯。这在组合物的核酸浓度高于0.5mg/ml时尤其需要。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的平衡阴离子浓度在10-200mM之间，特别优选为60-100mM。在一个优选的实施方案中，所述平衡阴离子为醋酸根离子。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的核酸浓度高于0.5mg/ml，并且不含沉淀的复合物。更优选地，所述组合物的核酸浓度为至少0.6mg/ml、更优选为至少0.75mg/ml、更优选为至少1.0mg/ml、更优选为至少1.2mg/ml，并且最优选为至少1.5mg/ml，并且不含沉淀的复合物。在一个优选的实施方案中，所述组合物含水。在一个优选的实施方案中，所述组合物基本上不含未复合的核酸。

在一个优选的实施方案中，所述壳聚糖-核酸复合物组合物另外包含聚集抑制剂。所述聚集抑制剂为部分或完全减少复合物聚集和/或沉淀的试剂并且通过浓缩方法，优选通过使用切向流过滤(″TFF″)来浓缩壳聚糖-核酸复合物。尽管可使用其它聚集抑制剂，例如能够减少复合物沉淀和能够浓缩壳聚糖-核酸复合物的其它糖类，但特别优选的聚集抑制剂为蔗糖。聚集抑制剂的实例包括但不限于海藻糖、甘油、果糖、葡萄糖和其它还原和非还原性糖类。

在一个优选的实施方案中，所用聚集抑制剂为蔗糖。壳聚糖-核酸复合物分散体中蔗糖的浓度优选为按重量计在约3％-20％之间。最优选地，蔗糖浓度提供等渗组合物。

在一个优选的实施方案中，所述强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物是等渗的。在配制药物组合物期间，在维持复合物稳定性的同时实现等渗性是非常需要的，并且这些优选的组合物非常适于制药和治疗应用。

在其它实施方案中，所述组合物可为高渗或低渗的。

核酸

所述强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物包含核酸组分和壳聚糖组分。本发明的核酸通常含有磷酸二酯键，尽管某些情况下出于任一多种目的(例如，稳定性和保护)包括可具有替代骨架或其它修饰或部分的核酸类似物。所考虑的其它核酸类似物包括带非核糖主链的类似物。另外，可制备天然存在的核酸、类似物及二者的混合物。所述核酸可为单链或双链或含有部分双链和单链序列。核酸包括但不限于DNA、RNA和杂合体，其中所述核酸含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基的任何组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。核酸包括任何形式的DNA、任何形式的RNA，包括三链体、双链体或单链体、反义、siRNA、核酶、脱氧核酶、多聚核苷酸、寡核苷酸、嵌合体、微RNA及其衍生物。

在一个实施方案中，核酸组分包含治疗性核酸。治疗性核酸包括治疗性RNA，这是能够在哺乳动物细胞中发挥治疗作用的RNA分子。治疗性RNA包括反义RNA、siRNA、短发夹RNA、微RNA和酶性RNA。治疗性核酸包括用于形成三链体分子的核酸、蛋白结合核酸、核酶、脱氧核酶和小核苷酸分子。

治疗性核酸还包括编码治疗性蛋白的核酸。

在一个优选的实施方案中，所述核酸组分包含治疗性核酸构建体。所述治疗性核酸构建体为能够发挥治疗作用的核酸构建体。治疗性核酸优选包含编码治疗性蛋白的核酸，但可替代生成治疗性RNA的转录产物。治疗性核酸可通过用作缺陷基因的替代物或增强物来用于实现基因治疗，或通过编码治疗性产物来补偿特定基因产物的缺乏。治疗性核酸也可抑制内源基因的表达。治疗性核酸可编码全部或部分翻译产物，并且可通过与细胞中已经存在的DNA重组来发挥作用，从而替代缺陷基因或其部分。治疗性核酸还可编码蛋白的一部分。治疗性蛋白可通过抑制基因产物发挥其作用。在一个优选的实施方案中，治疗性核酸选自U.S.S.N.11/694,852中公开的核酸，该申请的全文以引用的方式明确并入本文。同样见全文以引用的方式明确并入本文的WO2008020318。

所考虑的供本发明使用的治疗性蛋白包括但不限于激素、酶、细胞因子、趋化因子、抗体、生长因子、分化因子、影响血块形成的因子、影响血糖含量的因子、影响葡萄糖代射的因子、影响脂类代谢的因子、影响血胆固醇水平的因子、影响血LDL或HDL水平的因子、影响细胞凋亡的因子、影响食物摄取的因子、影响能量消耗的因子、影响食欲的因子、影响营养吸收的因子、影响发炎的因子和影响骨生成的因子。尤其优选的是编码以下各项的治疗性核酸：胰岛素、瘦素、胰高血糖素拮抗剂、GLP-1、GLP-2、Ghrelin、肠促胰酶肽、生长激素、凝血因子、PYY、促红细胞生成素、炎症抑制剂、IL-10、IL-17拮抗剂、TNFα拮抗剂、IL-1拮抗剂、生长激素释放激素或甲状旁腺激素。

本发明中所考虑的特别优选的治疗性蛋白为抗炎蛋白。考虑用于本发明的抗炎蛋白包括但不限于抗炎细胞因子以及前炎性分子(例如前炎性细胞因子)的蛋白质拮抗剂。示例性抗炎蛋白包括IL-10(例如，Fedorak等，2000，Gastroenterology.2000年12月；119(6)：1473-82.；Whalen等，1999，J Immunol.1999年3月15日；162(6)：3625-32)、IL-1Ra(例如，Arend等，1998，Annu Rev Immunol.1998；16：27-55；Makarov等，1996，Proc Natl Acad Sci USA.1996年1月9日；93(1)：402-6)、IL-1Ra-Ig(例如，Ghivizzani等，1998，Proc Natl Acad SciUSA.1998年4月14日；95(8)：4613-8)、IL-4(例如，Hogaboam等，1997，J Clin Invest.1997年12月1日；100(11)：2766-76)、IL-17可溶性受体(例如，Zhang等，2006，Inflamm Bowel Dis.2006年5月；12(5)：382-8；Ye等，2001，The Journal of Experimental Medicine，第194卷，第4期，2001年8月20日，519-528)、IL-6(例如，Xing等，1998，J Clin Invest.1998年1月15日；101(2)：311-20)、IL-11(例如，Trepicchio等，1997，JImmunol.1997年12月1日；159(11)：5661-70)、IL-13(例如，Mulligan等，1997，J Immunol.1997年10月1日；159(7)：3483-9；Muchamuel等，1997，J Immunol.1997年3月15日；158(6)：2898-903)、IL-18可溶性受体(例如，Aizawa等，1999，FEBS Lett.1999年2月26日；445(2-3)：338-42)、TNF-α可溶性受体(例如，Watts等，1999，J Leukoc Biol.1999年12月；66(6)：1005-13)、TNF-α受体Ig(例如，Ghivizzani等，1998，Proc Natl Acad Sci USA.1998年4月14日；95(8)：4613-8)；TGF-β(例如，Song等，1998，J Clin Invest.1998年6月15日；101(12)：2615-21；Giladi等，1994)、IL-12(例如，Hogan等，1998，Eur J Immunol.1998年2月；28(2)：413-23)、IFN-γ(例如，Dow等，1999，Hum Gene Ther.1999年8月10日；10(12)：1905-14)、IL-4可溶性受体(例如，Steinke等，2001，RespirRes.2001；2(2)：66-70.Epub 2001年2月19日)。

用于本发明的特别优选的抗炎蛋白包括IL-10、TNFα的蛋白质拮抗剂和IL-1的蛋白质拮抗剂。

表达控制区

在一个优选的实施方案中，本发明的复合物包含治疗性核酸，所述治疗性核酸是包含与编码区可操作连接的表达控制区的治疗性构建体。所述治疗性构建体生成本身具有治疗性或者可编码治疗性蛋白的治疗性核酸。

在一些实施方案中，治疗性构建体的表达控制区具有构成活性。在多个优选的实施方案中，治疗性构建体的表达控制区没有构成活性。这提供了治疗性核酸的动态表达。所谓“动态”表达是指随时间变化的表达。动态表达可包括若干这种被可检表达期分开的低表达或不表达期。在多个优选的实施方案中，所述治疗性核酸可操作地连接至可调启动子。这提供了治疗性核酸的可调表达。

表达控制区包含影响可操作连接的治疗性核酸表达的调节性多聚核苷酸(本文有时称为元件)，例如启动子和增强子。

本文中包括的表达控制元件可来自于细菌、酵母、植物或动物(哺乳动物或非哺乳动物)。表达控制区包括全长启动子序列(例如天然启动子和增强子元件)以及保留全部或部分全长或非变异体功能(例如，保留一定量的营养调节或细胞/组织特异性表达)的子序列或多聚核苷酸。本文所使用的术语“功能性”及其语法变型，用于核酸序列或片段时是指具有天然氨基酸序列(例如，非变异或未修饰序列)的一种或多种功能的序列。本文所使用的术语“变异”指序列取代、缺失或添加或其它修饰(例如，化学衍生物(如耐核酸酶的修饰形式))。

本文所使用的术语“可操作连接”是指如所述使组分按其预期的方式作用的物理并列。在与核酸可操作连接的表达控制元件的实例中，该关系是便于控制元件调节核酸的表达。通常，调节转录的表达控制区并列于转录核酸的5′末端(即，“上游”)附近。表达控制区也可位于转录序列的3′末端(即，“下游”)或在转录产物内(例如，内含子内)。表达控制元件可距转录序列一定距离(例如，来自核酸的100至500个、500至1000个、2000至5000个或更多个核苷酸)。表达控制元件的特殊实例是通常位于转录序列5′的启动子。表达控制元件的另一个实例是可位于转录序列的5′或3′或位于转录序列内的增强子。

一些表达控制区为可操作连接的治疗性核酸赋予可调表达。信号(有时称为刺激)可增强或降低与这种表达控制区可操作连接的治疗性核酸的表达。此类响应于信号增强表达的表达控制区常常被称为诱导型表达控制区。这种响应于信号降低表达的表达控制区常常被称为抑制型表达控制区。通常，这种元件赋予的增强或降低的量与存在的信号量成正比；信号量越多，表达增强或降低越多。

本领域已知许多可调启动子。优选的诱导型表达控制区包括包含用小分子化合物刺激的诱导型启动子的那些表达控制区。在一个实施方案中，表达控制区对可口服但在血液中一般不存在的化学药品起反应。例如，可在美国专利第5,989,910、5,935,934、6,015,709和6,004,941号中找到具体实例。

在一个实施方案中，所述治疗性构建体还包含整合序列。在一个实施方案中，所述治疗性构建体包含单条整合序列。在另一个实施方案中，所述治疗性构建体包含用于将治疗性核酸或其部分整合至靶细胞的基因组中的第一和第二整合序列。在一个优选的实施方案中，整合序列功能在于结合选自以下各项的整合元件：mariner整合元件、sleeping beauty整合元件、FLP整合元件、Cre整合元件、ΦC31整合元件、R整合元件、λ整合元件和来自整合病毒(例如AAV、逆转录酶病毒和慢病毒)的整合元件。

在一个实施方案中，除治疗性构建体外，本发明组合物还包含非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码与第二表达控制区可操作连接的整合元件的核酸序列。该第二表达控制区和与所述治疗性核酸可操作连接的表达控制区可相同或不同。编码的整合元件优选选自mariner整合元件、sleeping beauty整合元件、FLP整合元件、Cre整合元件、ΦC31整合元件、R整合元件、λ整合元件和来自整合病毒(例如AAV、逆转录酶病毒和慢病毒)的整合元件。

关于进一步教导，参见全文以引用的方式明确并入本文的WO2008020318。

制备强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物的方法

尽管可使用其它方法，例如通过将核酸或壳聚糖溶液滴入另一种溶液中以形成混合溶液的方法，但优选通过在线混合制备强酸性壳聚糖-核酸复合物的组合物。然而，在线混合有利于大量同质壳聚糖-核酸复合物的制备，所述同质壳聚糖-核酸复合物的平均PDI优选小于0.5、更优选小于0.4、更优选小于0.3，并且最优选小于0.2。在一个优选的实施方案中，所述分散体的pH在3.5-5.5之间。

在线混合是一种已知方法，其中两股(或更多股)液体被汇聚成单股。2008年9月26日提交的PCT/CA2008/001714(公开为WO2009/039657)中有壳聚糖-核酸复合物在线混合和浓缩的附加说明，该申请的全文以引用的方式明确并入本文。在线混合的附加公开，参见例如各自的全文以引用的方式明确并入本文的U.S.6,251,599和6,537,813。

所述组合物可在所需低pH下复合，或可在较高pH和复合后调节的pH下复合，以形成所需强酸性分散体。

虽然可使用诸如静态混合器和动态混合器的混合器，但此类装置导致使用本方法形成的复合物的PDI升高。因此，在本发明优选的实施方案中，不使用此类混合器进行在线混合。

在一个优选的实施方案中，通过浓缩壳聚糖-核酸复合物的预浓缩分散体生产本发明的强酸性高浓度壳聚糖-核酸复合物组合物。在一个实施方案中，预浓缩分散体的pH低于4.8，优选pH在3.5-4.5之间。在另一个实施方案中，预浓缩分散体的pH高于4.5。可将浓缩产物的pH调节至低于4.5。预浓缩分散体的浓度优选低于0.5mg/ml。

在本发明中，切向流过滤(″TFF″)是浓缩壳聚糖-核酸复合物的预浓缩分散体的优选方式。在TFF操作中，泵送壳聚糖-核酸复合物分散体通过半透膜的表面，同时向所述膜施压以促使部分液体通过所述膜。比膜孔小的分子被运输通过所述膜孔并作为透过物收集。渗透溶质包括但不限于盐、离子、糖和微生物防腐剂。太大而不能通过所述膜孔的分子实体(包括壳聚糖-核酸复合物)留在流中并作为渗余物再循环。在TFF浓缩操作中，当渗余物通向大气压的时候除去所述透过物，导致渗余物的体积减少。使用TFF，复合物浓度可升高很多倍，产物是高度浓缩的复合物分散体。在一个优选的实施方案中，所述浓缩的复合物分散体是等渗的。

在一个优选的实施方案中，浓缩过程还包括一步或多步透滤操作。尽管可对pH高于4.8的组合物使用透滤法，但在使用pH低于4.8的预浓缩壳聚糖-核酸复合物组合物时尤其优选。

在TFF透滤操作中，通过向渗余物添加新缓冲液不断补给透过物，导致渗余物中缓冲液的调换。使用TFF透滤法，在维持复合物浓度的同时可调换复合物的缓冲液，产物是有新缓冲液的复合物分散体。

在一个实施方案中，在对浓缩复合物分散体进行TFF浓缩之前，对壳聚糖-核酸复合物的预浓缩分散体进行TFF透滤操作。在一个优选的实施方案中，在对浓缩复合物分散体进行TFF浓缩之后，对壳聚糖-核酸复合物的预浓缩分散体进行TFF透滤操作。在一个十分优选的实施方案中，在TFF浓缩操作期间进行TFF透滤操作。在该操作中，通过TFF浓缩部分浓缩壳聚糖-核酸复合物的预浓缩分散体，然后进行TFF透滤，然后进一步通过TFF浓缩进行浓缩。这产生有新缓冲液的浓缩复合物分散体，该分散体进一步促进壳聚糖-核酸复合物的稳定性。

在一个实施方案中，TFF透滤的洗液体积量优选少于40。在一个优选的实施方案中，TFF透滤的洗液体积量优选少于20。在一个更优选的实施方案中，TFF透滤的洗液体积量优选少于10。在一个十分优选的实施方案中，TFF透滤的洗液体积量优选少于6。

在一个实施方案中，浓缩操作期间进行的TFF透滤操作次数少于5次而大于1次。在一个优选的实施方案中，进行的TFF透滤操作次数为1次。

在一个优选的实施方案中，TFF透滤缓冲液包含壳聚糖。

在一个优选的实施方案中，TFF透滤缓冲液包含壳聚糖和平衡阴离子(优选醋酸根离子)。

在一个优选的实施方案中，TFF透滤缓冲液包含壳聚糖、平衡阴离子(优选醋酸根离子)和聚集抑制剂(优选蔗糖)。

在一个优选的实施方案中，通过加pH调节缓冲液将浓缩壳聚糖-核酸复合物分散体的pH调节至更低的pH。

在一个优选的实施方案中，所述pH调节缓冲液包含壳聚糖。

在一个优选的实施方案中，所述pH调节缓冲液包含壳聚糖和平衡阴离子(优选醋酸根离子)。

在一个优选的实施方案中，所述pH调节缓冲液稍微稀释浓缩的壳聚糖-核酸复合物，优选低于5％。

在一个优选的实施方案中，在完成TFF浓缩操作的1h之内将所述pH调节缓冲液加入浓缩的壳聚糖-核酸复合物中。

在一个优选的实施方案中，预浓缩壳聚糖-核酸复合物分散体包含糖，优选蔗糖。如下文所述，发现蔗糖是防止颗粒在浓缩过程中聚集的聚集抑制剂。

使用方法

一方面，本发明提供转染粘膜上皮细胞的方法。所述方法包括使所述粘膜上皮细胞与本发明的强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物接触。在一个实施方案中，在体外进行转染。在另一个实施方案中，在体内进行转染。本发明组合物适于向粘膜上皮施用并表现出粘膜上皮细胞高转染效率，尽管所述组合物具有强酸性。

在一个优选的实施方案中，所述粘膜上皮存在于选自以下各项的组织中：胃肠道组织、呼吸道组织、肺组织、窦洞组织、口腔组织、尿道组织、膀胱组织、阴道组织、子宫组织、子宫颈组织、眼组织、食道组织、唾液腺组织、鼻咽组织、肾组织和喉/咽组织。

一方面，本发明提供治疗涉及粘膜上皮炎症的疾病的方法。所述方法包括对患有涉及粘膜上皮炎症的疾病的患者施用治疗有效量的本发明药物组合物。所述受试药物组合物优选局部施用至所述粘膜上皮。所述受试药物组合物包含有抗炎活性的治疗性核酸。

在一个优选的实施方案中，所述受试药物组合物包含编码抗炎蛋白的治疗性核酸构建体。在一个实施方案中，所述抗炎蛋白为TNFα抑制剂。在另一个优选的实施方案中，所述抗炎蛋白为IL-10。

在一个实施方案中，所述治疗性核酸为靶向前炎性细胞因子的治疗性RNA。特别优选的是靶向前炎性细胞因子的siRNA。

在一个优选的实施方案中，所述涉及粘膜上皮炎症的疾病为IBD。在另一个优选的实施方案中，所述涉及粘膜上皮炎症的疾病为间质性膀胱炎。在另一个优选的实施方案中，所述涉及粘膜上皮炎症的疾病为慢性阻塞性肺病(COPD)。在另一个优选的实施方案中，所述涉及粘膜上皮炎症的疾病为哮喘。

本发明组合物非常适合用于治疗可通过粘膜上皮细胞转染治疗的疾病或病状。这种疾病包括但不限于涉及粘膜上皮组织的疾病。本发明组合物也可用于治疗不涉及可施用所述组合物的粘膜上皮组织的疾病和病状。这种病状和疾病仍然可通过这样的粘膜上皮组织转染进行治疗。例如，见全文以引用的方式明确并入本文的WO2008020318。例如，可使用向肠粘膜上皮细胞施用本发明组合物以向全身输送编码的治疗性蛋白。

治疗性核酸可通过用作缺陷基因的替代物或增强物来用于实现基因治疗，或通过编码治疗性产物来补偿特定基因产物的缺乏。治疗性核酸也可抑制内源基因的表达。治疗性核酸可编码全部或部分翻译产物，并且可通过与细胞中已经存在的DNA重组来发挥作用，从而替代缺陷基因或其部分。治疗性核酸还可编码蛋白的一部分。治疗性蛋白可通过抑制基因产物发挥其作用。

可治疗的疾病或病状包括但不限于糖尿病、肥胖症激素缺乏症、炎症性肠病、腹泻、过敏性肠综合征、Gl传染病、胃溃疡、胃食管反流、胃轻瘫、痔疮、营养吸收障碍、胰腺炎、血色素沉积症、乳糜泻、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、葡萄膜炎、色素性视网膜炎、虹膜炎、巩膜炎、青光眼、角膜炎、视网膜病、眼感染症(例如，角膜真菌病)、传染病、子宫内膜异位、子宫颈炎、泌尿疼痛、息肉、纤维瘤、子宫内膜增生、尿失禁、膀胱和尿路感染、膀胱过动症、勃起功能障碍、糖尿病性神经病、糖尿病性肾、膜性肾病、高血压、食物过敏、哮喘、多囊肾病、肾小球性肾炎、血脂异常/高胆固醇血症、代谢综合征、牛皮癣、痤疮、红斑痤疮、肉芽肿性皮炎、皱纹、色素脱失、慢性阻塞性肺病、呼吸道感染、囊肿性纤维化、肺血管疾病、纤维症、亨廷顿氏舞蹈病(Huntington′s disease)、阿尔茨海默症(Alzheimer disease)、帕金森氏症(Parkinson′s disease)、神经障碍、自身免疫性疾病、代谢综合征、动脉粥样硬化和炎症。所述方法包括向患者施用治疗有效量的本发明药物组合物。

可用包含编码治疗性蛋白的治疗性核酸的本发明组合物生产本发明的治疗性蛋白。以下所述治疗性蛋白的用途指使用本发明组合物实现这种治疗性蛋白的用途。

考虑用于本发明的治疗性蛋白具有多种活性并且可用于多种病症的治疗。以下对治疗性蛋白活性和可用本发明治疗性蛋白治疗的适应症的描述是示例性的而非旨在进行详尽说明。术语“受试者”指动物，优选哺乳动物，而人尤其优选。在所述治疗性蛋白为靶蛋白的拮抗剂的实施方案中，替代性治疗实施方案可采用靶向相同靶蛋白的治疗性RNA。

下表中示出了一部分治疗性蛋白和目标疾病。

炎性病症

在一个优选的实施方案中，本发明的治疗性多肽用于调节炎症。例如，所述治疗性多肽可抑制参与炎症反应的细胞的增殖和分化。这些细胞可用于治疗慢性和急性炎症性病状，包括与传染病有关的炎症(例如，败血病性休克、脓毒病或全身炎症反应综合征(SIRS))、缺血再灌注损、内毒素致死、关节炎、胰腺炎、补体介导的超急性排斥、肾炎、细胞因子或趋化因子诱导的肺损伤、炎症性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、间质性膀胱炎、克罗恩氏病(Crohn′s disease)或由前炎性细胞因子(例如TNFα和IL-1)过度生成引起的其它疾病。

在一个特别优选的实施方案中，本发明提供治疗涉及粘膜上皮炎症的疾病的方法。所述方法包括对患有涉及粘膜上皮炎症的疾病的患者施用治疗有效量的本发明药物组合物。优选将所述受试药物组合物局部施用至所述粘膜上皮。在一个实施方案中，所述受试药物组合物包含编码抗炎蛋白的治疗性核酸构建体。考虑用于本发明的抗炎蛋白包括但不限于抗炎细胞因子以及前炎性分子的蛋白质拮抗剂，例如前炎性细胞因子。示例性抗炎蛋白包括IL-10(例如，Fedorak等，2000，Gastroenterology.2000年12月；119(6)：1473-82.；Whalen等，1999，JImmunol.1999年3月15日；162(6)：3625-32)、IL-1Ra(例如，Arend等，1998，Annu Rev Immunol.1998；16：27-55；Makarov等，1996，ProcNatl Acad Sci USA.1996年1月9日；93(1)：402-6)、IL-1Ra-Ig(例如，Ghivizzani等，1998，Proc Natl Acad Sci USA.1998年4月14日；95(8)：4613-8)、IL-4(例如，Hogaboam等，1997，J Clin Invest.1997年12月1日；100(11)：2766-76)、IL-17可溶性受体(例如，Zhang等，2006，Inflamm Bowel Dis.2006年5月；12(5)：382-8；Ye等，2001，The Journalof Experimental Medicine，第194卷，第4期，2001年8月20日，519-528)、IL-6(例如，Xing等，1998，J Clin Invest.1998年1月15日；101(2)：311-20)、IL-11(例如，Trepicchio等，1997，J Immunol.1997年12月1日；159(11)：5661-70)、IL-13(例如，Mulligan等，1997，J Immunol.1997年10月1日；159(7)：3483-9；Muchamuel等，1997，J Immunol.1997年3月15日；158(6)：2898-903)、IL-18可溶性受体(例如，Aizawa等，1999，FEBS Lett.1999年2月26日；445(2-3)：338-42)、TNF-α可溶性受体(例如，Watts等，1999，J Leukoc Biol.1999年12月；66(6)：1005-13)、TNF-α受体Ig(例如，Ghivizzani等，1998，Proc Natl Acad Sci USA.1998年4月14日；95(8)：4613-8)；TGF-β(例如，Song等，1998，J Clin Invest.1998年6月15日；101(12)：2615-21；Giladi等，1994)、IL-12(例如，Hogan等，1998，Eur J Immunol.1998年2月；28(2)：413-23)、IFN-γ(例如，Dow等，1999，Hum Gene Ther.1999年8月10日；10(12)：1905-14)、IL-4可溶性受体(例如，Steinke等，2001，RespirRes.2001；2(2)：66-70.Epub 2001年2月19日)。

在一个优选的实施方案中，所述抗炎蛋白为TNFα抑制剂。在另一个优选的实施方案中，所述抗炎蛋白为IL-1抑制剂。在另一个优选的实施方案中，所述抗炎蛋白为IL-10。

在一个优选的实施方案中，涉及粘膜上皮炎症的所述疾病为炎症性肠病(IBD)。在另一个优选的实施方案中，涉及粘膜上皮炎症的所述疾病为间质性膀胱炎。在另一个优选的实施方案中，涉及粘膜上皮炎症的所述疾病为慢性阻塞性肺病(COPD)。在另一个优选的实施方案中，涉及粘膜上皮炎症的所述疾病为哮喘。

高血糖和体重

治疗性蛋白包括胰岛素和胰岛素类似物。糖尿病是一种因胰腺β细胞不生成胰岛素(1型)或生成胰岛素不足(2型)引起的衰弱代谢性疾病(Unger，R.H.等，Williams Textbook of Endocrinology Saunders，Philadelphia(1998))。β细胞是生成并储存胰岛素以在饭后释放的特化内分泌细胞(Rhodes等，J.Cell Biol.105：145(1987))，而胰岛素是促进葡萄糖从血液转移到需要葡萄糖的组织中的激素。糖尿病患者必须经常监测血糖含量，并且许多患者需要每日多次胰岛素注射而得以生存。然而，这类患者通过胰岛素注射难以达到理想的葡萄糖水平(Turner，R.C.等，JAMA 281：2005(1999))。而且，胰岛素水平的长期升高可导致有害副作用，例如低血糖休克和身体对胰岛素反应的脱敏。因此，糖尿病患者仍产生长期并发症，例如心血管疾病、肾病、失明、神经损伤和伤口愈合异常(UK Prospective Diabetes Study(UKPDS)Group，Lancet 352，837(1998))。

可通过本发明的方法治疗的病症包括高血糖症，例如胰岛素依赖性(1型)或非依赖性(2型)糖尿病，以及与高血糖症相关或由高血糖症引起的生理性疾病或病症。因此，可通过本发明的方法治疗的高血糖症还包括于慢性或急性高血糖(例如，糖尿病)有关的组织病理学变化。特殊实例包括胰腺变性(β细胞破坏)、肾小管钙化、眼损伤(糖尿病性视网膜病)、糖尿病足、例如口和牙龈等粘膜中的溃疡、失血过多、延迟凝血或伤口愈合和冠心病、中风、周围性血管疾病、血脂异常、高血压和肥胖症风险升高。

本发明组合物用于减少葡萄糖，提高葡萄糖耐受性，治疗高血糖症(例如，糖尿病)或用于治疗与高血糖症有关或由高血糖症引起的生理性病症。此类病症包括(例如)糖尿病性神经病(自发性)、肾病(肾损伤)、皮肤感染和其它皮肤病、损伤或伤口愈合缓慢或延迟(例如，导致糖尿病并发痛)、可导致失明的眼损伤(视网膜病、白内障)、糖尿病足和加速牙周炎。此类病症还包括产生冠心病、中风、周围性血管疾病、血脂异常、高血压和肥胖症风险升高。

本文所使用的术语“高血糖的”或“高血糖”，用于受试者的病状时是指受试者血液内短暂或慢性异常高的葡萄糖水平。所述病状可由葡萄糖代谢或吸收延迟以致受试者表现出葡萄糖耐受不良或在正常受试者中(例如，在有产生糖尿病风险的葡萄糖耐受不良亚型糖尿病受试者中，或在糖尿病受试者中)通常不存在的高葡萄糖状态引起。空腹血糖(FPG)含量对于血糖量正常的低于约110mg/dl，对于葡萄糖代谢受损的在约110和126mg/dl之间，和对于糖尿病患者高于约126mg/dl。

可通过在肠粘膜组织生成蛋白质治疗的病症还包括肥胖症或体重不理想。瘦素、肠促胰酶肽、PYY和GLP-1减少饥饿，增加能量消费，诱发体重减轻或提供正常的葡萄糖稳态。因此，在多个实施方案中，本发明用于治疗肥胖症或体重不理想或高血糖的方法包括使用编码瘦素、肠促胰酶肽、PYY或GLP-1的治疗性核酸。可治疗病症还包括通常与肥胖症有关的病症，例如，血清/血浆LDL、VLDL、甘油三酯、胆固醇升高异常，导致血管收缩或堵塞的斑块形成，高血压/中风、冠心病等风险升高。饥饿素(ghrelin)增加食欲和饥饿感。因此，在多个实施方案中，本发明用于治疗肥胖症或体重不理想或高血糖的方法包括使用饥饿素拮抗剂。在一个实施方案中，所述拮抗剂为治疗性RNA靶向饥饿素。

本文所使用的术语“肥胖的”或“肥胖症”指与年龄和性别匹配的正常受试者相比体重增加至少30％的受试者。“体重不理想”指体重与匹配的正常受试者相比重1％-29％的受试者以及就体重而言正常但希望减轻体重或预防体重增加的受试者。

在一个实施方案中，本发明的治疗性蛋白质为胰高血糖素拮抗剂。胰高血糖素是一种由胰岛中的α细胞生成的肽激素并且是葡萄糖代谢的主要调节剂(Unger R.H.& Orci L.N.Eng.J.Med.304：1518(1981)；Unger R.H.Diabetes 25：136(1976))。如同胰岛素一样，血糖浓度介导胰高血糖素分泌。然而，和胰岛素不同的是响应于血糖降低而分泌胰高血糖素。因此，胰高血糖素的循环浓度在禁食期间最高而在进食时最低。胰高血糖素水平升高以限制胰岛素促进葡萄糖储存并且刺激肝脏向血液中释放葡萄糖。胰高血糖素拮抗剂的特定实例为[des-His¹，des-Phe⁶，Glu⁹]胰高血糖素-NH₂。在链脲菌素糖尿病鼠体内，静脉注射该胰高血糖素拮抗剂(0.75ng/g体重)的15分钟内使血糖含量降低37％(Van Tine B.A.等，Endocrinology 137：3316(1996))。另外，在多个实施方案中，本发明用于治疗糖尿病或高血糖的方法包括使用治疗性RNA以降低胰腺的胰高血糖素生成水平。

在另一个实施方案中，本发明用于治疗高血糖症或体重不理想(例如，肥胖症)的治疗性蛋白为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。GLP-1是进食期间从肠内L细胞释放的刺激胰腺β细胞增加胰岛素分泌的激素。GLP-1具有附加活性，这些活性使其作为治疗肥胖症和糖尿病的有吸引力的治疗性试剂。例如，GLP-1减少胃排空，抑制食欲，降低胰高血糖素浓度，增加β细胞量，以葡萄糖依赖方式刺激胰岛素生物合成和分泌，并且很可能增加组织对胰岛素的敏感性(KiefferT.J.，Habener J.F.Endocrin.Rev.20：876(2000))。因此，调节肠内GLP-1的释放以配合进食可对治疗高血糖症或体重不理想有利。抗二肽基肽酶(DPP IV)的GLP-1类似物提供更长的作用持续时间和更高的治疗价值。因此，GLP-1类似物为优选的治疗性多肽。另外，在多个实施方案中，本发明用于治疗糖尿病或高血糖的方法包括使用DPP IV拮抗剂。在一个实施方案中，所述拮抗剂为治疗性RNA靶向DPP IV。

在另一个实施方案中，本发明用于治疗高血糖症的治疗性蛋白是激素抵抗素的拮抗剂。抵抗素是一种在饮食引起和遗传型肥胖症中表达增加的脂肪细胞源性因子。中和循环抵抗素使肥胖小鼠中血糖和胰岛素作用增强。相反地，在正常小鼠中施用抵抗素减弱葡萄糖耐受性和胰岛素作用(Steppan CM等，Nature 409：307(2001))。因此在肠内生成拮抗抵抗素生物效应的蛋白质可提供对肥胖症相关胰岛素抗性和高血糖症的有效治疗。另外，在多个实施方案中，本发明用于治疗糖尿病或高血糖的方法涉及使用治疗性RNA来降低脂肪组织中抵抗素表达的水平。

在另一个实施方案中，本发明用于治疗高血糖症或体重不理想(例如，肥胖症)的治疗性多肽为瘦素。虽然主要由脂肪细胞产生瘦素，但在胃中也以膳食依赖方式产生较少量的瘦素。瘦素向大脑中的食欲中枢传达有关脂肪细胞代谢和体重的信息，其在大脑中发出减少食物摄取(增进饱腹感)的信号并增加身体的能量消耗。

在另一个实施方案中，本发明用于治疗高血糖症或体重不理想(例如，肥胖症)的治疗性多肽为脂肪细胞补体相关蛋白(Acrp30)的C端球状头部区。Acrp30是一种由分化的脂肪细胞生成的蛋白质。向小鼠施用由球状头部区组成的Acrp30蛋白水解分裂产物导致体重明显降低(Fruebis J.等，Proc.NatLAcad.Sci USA 98：2005(2001))。

在另一个实施方案中，本发明用于治疗高血糖症或体重不理想(例如，肥胖症)的治疗性多肽为肠促胰酶肽(CCK)。CCK是响应于肠道内的特殊营养物质从肠内分泌的胃肠肽。CCK释放与消耗的食物量成比例并且被认为是向大脑发送信号终止进食(Schwartz M.W.等，Nature 404：661-71(2000))。因此，CCK增加可降低进食量并促进体重减轻或体重稳定(即，预防或抑制增重增加)。

至于PYY，参见例如le Roux等，Proc Nutr Soc.2005年5月；64(2)：213-6。

免疫障碍

在一个实施方案中，本发明的治疗性蛋白具有免疫调节活性。例如，本发明的治疗性多肽可用于通过激活或抑制免疫细胞增殖、分化或动化(趋化性)治疗免疫系统缺陷或障碍。免疫细胞出现在整个造血过程中，从而由多能干细胞生成骨髓细胞(血小板、红细胞、嗜中性白细胞和巨噬细胞)和淋巴样细胞(B淋巴细胞和T淋巴细胞)。这些免疫缺陷或障碍的病因可能是遗传、体细胞、感染或其它原因。

本发明的治疗性多肽可用于治疗造血细胞缺陷或障碍。本发明的治疗性多肽可用于增强包括多能干细胞在内的造血细胞的分化或增殖，以治疗那些与某些(或多种)类型造血细胞减少相关的病症。免疫缺陷综合征的实例包括但不限于：血液蛋白障碍(例如丙种球蛋白缺乏症、异常丙种球蛋白血症)、共济失调毛细血管扩张、常见多种免疫缺陷、迪格奥尔格综合征(Digeorge Syndrome)、HIV传染病、HTLV-BLV传染病、白细胞粘附缺陷综合征、淋巴细胞减少、吞噬细胞杀菌功能障碍、重症联合免疫缺陷(SCID)、Wiskott-Aldrich症(Wiskott-Aldrich Disorder)、贫血、血小板减少或血红蛋白尿。

本发明的治疗性多肽还可用于治疗自身免疫疾病。许多自身免疫疾病因免疫细胞将自身不适当识别为外来物质引起。这种不适当识别引起导致宿主组织破坏的免疫反应。因此，施用本发明抑制免疫反应，尤其抑制T细胞增殖、分化或趋化的治疗性多肽可为预防自身免疫疾病的有效疗法。

可通过本发明治疗的自身免疫疾病的实例包括但不限于：艾迪生氏病(Addison′s Disease)、溶血性贫血、抗磷脂综合征、风湿性关节炎、皮炎、变应性脑脊髓炎、肾小球性肾炎、古德帕斯丘综合征(Goodpasture′s Syndrome)、格雷夫斯氏病(Graves′Disease)、多发性硬化、神经炎、眼炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、多内分泌腺病、紫癜、Reiter氏病(Reiter′s Disease)、全身肌强直综合征、自身免疫性甲状腺炎、全身性红斑狼疮、自身免疫性肺部炎症、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre Syndrome)、胰岛素依赖性糖尿病、克罗恩氏病(Crohn′sdisease)、溃疡性结肠炎和自身免疫性炎症眼病。

同样地，过敏反应和病状，例如哮喘(尤其是过敏性哮喘)或其它呼吸道问题也可通过本发明的治疗性多肽治疗。而且，这些分子可用于治疗对抗原分子的过敏反应、超敏反应或血型不合。

本发明的治疗性多肽还可用于治疗和/或预防器官排斥或移植物抗宿主病(GVHD)。随免疫反应中移植组织的宿主细胞破坏发生器官排斥。同样地，GVHD也涉及免疫反应，但在这种情况下，外来移植免疫细胞破坏宿主组织。施用本发明抑制免疫反应，尤其抑制T细胞增殖、分化或趋化的治疗性多肽可能是预防GVHD的有效疗法。

凝血障碍

在一些实施方案中，本发明的治疗性多肽还用于调节止血(阻止出血)或溶血(血块形成)活性。例如，通过增强止血或溶血活性，本发明的治疗性多肽可用于治疗凝血障碍(例如无纤维蛋白原血症、因子缺乏)、血小板异常(例如血小板减少)或由外伤、手术或其它原因引起的伤口。或者，本发明可降低止血或溶血活性的治疗性多肽可用于抑制或溶解凝块。这些分子在治疗心脏病发作(梗死形成)、中风或瘢疤形成中很重要。在一个实施方案中，本发明的治疗性多肽为用于治疗血友病或其它凝固/凝血障碍的凝血因子(例如，因子VIII、IX或X)。

传染病

在一个实施方案中，本发明的治疗性多肽可用于治疗传染病。例如，可通过增强免疫反应，尤其可通过增强B和/或T西部的增殖和分化治疗传染病。可通过加强现有免疫反应或引发新的免疫反应增强免疫反应。或者，本发明的治疗性多肽也可直接抑制传染物，而不必引起免疫反应。

病毒是可引起可通过本发明的治疗性多肽治疗的疾病或症状的传染物实例之一。病毒的实例包括但不限于以下DNA和RNA病毒家族：虫媒病毒、腺病毒、沙粒病毒、动脉炎病毒、双核糖核酸病毒、本雅病毒、杯状病毒、圆环病毒、冠状病毒、黄病毒、疱疹病毒(例如，细胞巨化病毒、单纯性疱疹、带状疱疹)、单股负链病毒(例如副粘病毒、麻疹病毒、棒状病毒)、正粘病毒(例如流感)、乳多泡病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒(例如天花或牛痘)、呼肠孤病毒(例如轮状病毒)、逆转录酶病毒(HTLV-I、HTLV-II、慢病毒)和外衣病毒(例如风疹病毒)。这些家族中的病毒可一起各种疾病或症状，包括：关节炎、支气管炎、脑炎、眼感染症(例如结膜炎、角膜炎)、慢性疲劳综合症、脑膜炎、机会性感染(例如AIDS)、肺炎、水痘、出血热、麻疹、腮腺炎、副流感、狂犬病、感冒、脊髓灰质炎、风疹、性传播疾病、皮肤病(例如卡波西氏肉瘤)和病毒血症。本发明的治疗性多肽可用于治疗这些症状或疾病的任一种。

同样地，可引起疾病或症状并且可通过本发明的治疗性多肽治疗或检测的细菌或真菌试剂包括但不限于以下革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌家族和真菌：放线菌(例如棒状杆菌、分支杆菌、诺卡氏菌)、曲霉、芽孢杆菌(例如炭疽、梭状芽胞杆菌)、类杆菌、芽生菌、博尔德氏杆菌、包柔氏螺旋体菌、布鲁氏菌、念珠菌、弯曲杆菌、球孢子菌、隐球菌、皮膚真菌、肠杆菌(克氏杆菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、耶尔森氏菌)、丹毒丝菌、螺杆菌、军团菌、钩端螺旋体菌、李斯特氏菌、支原体、奈瑟氏菌(例如不动杆菌、淋球菌、脑膜炎球菌)、巴斯德氏菌感染(例如放线杆菌、嗜血杆菌、巴斯德菌)、假单胞菌、立克次氏体菌、衣原体、梅毒和葡萄球菌。这些细菌或真菌家族可引起以下疾病或症状：菌血症、心内膜炎、眼感染症(结膜炎、肺结核、葡萄膜炎)、齿龈炎、机会性感染(例如AIDS相关感染)、甲沟炎、假肢相关感染、Reiter氏病、呼吸道感染(例如百日咳或积脓症)、脓毒症、莱姆病(Lyme Disease)、猫抓病、痢疾、副伤寒、食物中毒、伤寒、肺炎、淋病、脑膜炎、衣原体疾病、梅毒、白喉、麻风、类结核、肺结核、狼疮、肉毒中毒、坏疽、破伤风、脓疱病、风湿热、猩红热、性传播疾病、皮肤病(例如蜂窝织炎、皮囊肿)、血毒症、尿路感染、伤口感染。本发明的治疗性多肽可用于治疗这些症状或疾病的任一种。

而且，引起可通过本发明治疗性多肽治疗的疾病或症状的寄生物包括但不限于以下家族：变形虫、巴贝西虫、球虫、隐孢子虫、双核阿米巴虫、马类锥虫、外寄生物、贾第虫、蠕虫、利什曼虫、泰勒尔梨浆虫、弓形虫、锥体虫和毛滴虫。这些寄生物可引起各种疾病或症状，包括：疥疮、恙螨病、眼感染症、肠病(例如痢疾、贾第虫病)、肺病、机会性感染(例如AIDS相关感染)、疟疾、妊娠并发症和弓形体病。本发明的治疗性多肽可用于治疗这些症状或疾病的任一种。

再生

本发明的治疗性多肽可用于分化、增殖和吸引细胞，从而促进组织再生。(参见Science 276：59-87(1997))组织再生可用于修复、替代或保护因先天性缺陷、外伤(创伤、烧伤、切口或溃疡)、年龄、疾病(例如骨质疏松症、骨关节炎、牙周病)、手术(包括整容手术)、纤维化、再灌注损伤或全身性细胞因子损伤而受损的组织。

可通过本发明的治疗性蛋白的作用再生的组织包括器官(例如胰腺、肠、肾、皮肤、内皮)、血管组织(包括血管内皮)、神经组织、造血组织和骨骼组织(骨、软骨、腱和韧带)。优选地，再生招致少量瘢疤形成或无瘢疤形成。再生还可能包括血管生成。

而且，本发明的治疗性多肽可增加难以愈合组织的再生。例如，腱/韧带再生增加会加速损伤的愎复时间。本发明的治疗性多肽还可预防性使用以避免损伤。可治疗的特定疾病包括腱炎、腕管综合征和其它腱或韧带缺陷。不愈合伤口组织再生的另一个实例包括压力性溃疡、与血管功能不足有关的溃疡、手术伤口和外伤伤口。

同样地，也可通过使用本发明的治疗性多肽再生神经和脑组织以增殖和分化神经细胞。可使用这种方法治疗的疾病包括中枢和外周神经系统疾病、神经病或机械与创伤失调(例如脊髓损伤、头部外伤、脑血管疾病和中风)。特别地，与周围神经损伤、周围神经病、局限性神经病和中枢神经系统疾病(例如阿尔茨海默症、帕金森氏症、亨廷顿氏舞蹈病、肌肉萎缩性一侧硬化和夏伊-德雷格综合征(Shy-Drager syndrome))有关的疾病均可使用本发明的治疗性蛋白治疗。至于中枢神经系统(CNS)紊乱，本领域已知多种促进治疗剂进入脑组织的方法，包括破坏血脑屏障的方法和将治疗剂结合至利于转运中枢神经系统的部分的方法。在一个实施方案中，治疗性核酸设计为编码融合蛋白，所述融合蛋白包含转运部分和治疗性蛋白。

趋化性

在一个实施方案中，本发明的治疗性多肽具有趋化性活性。趋化分子将细胞(例如单核细胞、成纤维细胞、嗜中性白细胞、T细胞、肥大细胞、嗜曙红细胞、上皮细胞和/或内皮细胞)吸引或聚集到体内特定部位，例如炎症或感染。然后聚集的细胞可治好和/或愈合特定外伤或异常。

本发明的治疗性多肽可提高特定细胞的趋化活性。然后可使用这些趋化分子通过增加靶向体内特定位置的细胞数量而治疗炎症、感染或任何免疫系统疾病。例如，趋化分子可用于通过将免疫细胞吸引到受伤位置而治疗对组织的创伤和其它外伤。本发明的趋化分子还可吸引可用于治疗创伤的成纤维细胞。

还考虑本发明的治疗性多肽可抑制趋化活性。这些分子还可用于治疗病症。因此，本发明的治疗性多肽可用作趋化性的抑制剂。

特别优选使用的是邻近靶组织被激活的前治疗性蛋白。

另外考虑使用的治疗性多肽包括但不限于治疗生长障碍或消耗综合征的生长因子(例如，生长激素、胰岛素样生长因子-1、血小板源生长因子、表皮生长因子、酸性和碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β等)和提供被动免疫或保护受试者免受外来抗原或病原体(例如H.Pylori)或提供关节炎或心血管病治疗的抗体(例如，人抗体或人源抗体)、细胞因子、干扰素(例如，干扰素(INF)、INF-α2b和2a、INF-αN1、INF-β1b、INF-γ)、白细胞间素(例如，IL-1至IL-10)、肿瘤坏死因子(TNF-αTNF-β)、趋化因子、粒细胞巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)、多肽激素、抗菌多肽(例如，抗菌、抗真菌、抗病毒和/或抗寄生物多肽)、酶(例如，腺苷脱氨酶)、促性腺激素、趋化素、脂质结合蛋白、非格司亭(优保津)、血色素、促红细胞生成素、胰岛素调理素、伊米苷酶、sarbramostim、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶、链激酶、苯丙氨酸氨裂解酶、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、血栓形成素(TPO)、过氧化物歧化酶(SOD)、腺苷脱酰胺酶、过氧化氢酶降钙素、内皮素、L天冬酰胺酶胃蛋白酶、尿酸酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶、羧肽酶乳糖酶、蔗糖酶内在因子、降钙素甲状旁腺激素(PTH)样、激素、可溶性CD4和抗体和/或其抗原结合片段(例如，FAbs)(例如，orthoclone OKT-e(抗CD3)、GPIIb/lla单克隆抗体)。

接种疫苗

在一个实施方案中，本发明提供为患者接种疫苗的方法。所述方法包括施用能够产生所需抗原决定部位的本发明组合物。在一个优选的实施方案中，所述组合物包含能够表达包含所述抗原决定部位的蛋白质的治疗性核酸构建体。

化妆品应用

在一个实施方案中，本发明提供了供化妆品使用的组合物。所述化妆品包含呈适于美容使用的剂型的本发明壳聚糖-核酸复合物组合物。

粉剂

本发明的壳聚糖-核酸复合物组合物包括粉剂。在一个优选的实施方案中，本发明提供了干粉状壳聚糖-核酸复合物组合物。在一个优选的实施方案中，通过脱水本发明的壳聚糖-核酸复合物分散体制备所述干粉状壳聚糖-核酸复合物组合物。脱水方法包括但不限于冻干法和喷雾干燥。

在一个实施方案中，使浓缩分散体脱水，然后接着在需要再水化时调节pH。例如，在一个实施方案中，首先使pH高于4.5的浓缩分散体，然后在再水化时将pH调至3.5-4.5之间。在另一个实施方案中，不需要调节pH，并且再水化的组合物的pH低于4.5。

药物制剂

本发明还提供了包含本发明的强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物的“药学上可接受的”或“生理上可接受的”制剂。这种制剂可体内施予受试者以实施治疗方法。

本文所使用的术语“药学上可接受的”和“生理上可接受的”指在优选不产生过度不良副作用(例如，恶心、腹痛、头痛等)的情况下可对受试者施用的载体、稀释剂、赋形剂等。这种供施用的试剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮剂和乳剂。

药物制剂可包括适于对受试者施用的载体、稀释剂、赋形剂、溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。这种制剂可包含于片剂(有包衣或无包衣)、胶囊(硬或软)、微珠、乳剂、粉剂、颗粒、晶体、悬浮剂、糖浆或酏剂中。除了其它添加剂以外，还可存在辅助性活性化合物和防腐剂，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

药物制剂也可配制为与其预期施用途径相适。本发明组合物非常适于粘膜上皮组织的转染。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物为适于向粘膜上皮组织施用的制剂。

对于口服，可将组合物与赋形剂混合并且以片剂、锭剂或胶囊(例如，明胶胶囊)的形式使用。口服制剂中可包括药学上相容的结合剂和/或辅料。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含以下成分的任一种或类似性质的化合物：粘合剂(例如，微晶纤维素、黄蓍胶或明胶)、赋形剂(例如，淀粉或乳糖)、崩解剂(例如，褐藻酸、Primogel或玉米淀粉)、滑润剂(例如，硬脂酸镁或Sterotes)、助流剂(例如，胶体二氧化硅)、甜味剂(例如蔗糖或糖精)或调味剂(例如薄荷、水杨酸甲酯或调味剂)。

制剂还可包括载体以防止组合物快速降解或从体内排除，例如包括移植物和微胶囊输送系统的控释制剂。例如，可采用延时材料，例如单独的或与蜡组合的单硬脂酸甘油酯或甘油硬脂酸盐。

还考虑了栓剂和其它可经直肠施用的制剂(例如，可通过灌肠施用的制剂)。进一步有关直肠给药，参见例如，Song等，Mucosal drugdelivery：membranes，methodologies，and applications(粘膜给药：膜、方法和应用)，Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.，21：195-256，2004；Wearley，Recent progress in protein and peptide delivery by noninvasiveroutes(蛋白质和肽经非侵害途径给药的新进展)，Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.，8：331-394，1991。

本领域已知另外适于施用的药物制剂并且可适用于本发明的方法和组合物中(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(1990)第18版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.；The Merck Index(1996)第12版，Merck Publishing Group，Whitehouse，N.J.；和PharmaceuticalPrinciples of Solid Dosage Forms，Technonic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，Pa.，(1993))。

施用

若干施用途径的任一种均可能并且具体途径的选择部分取决于靶组织。优选向上皮组织施用。特别优选向选自以下各项的上皮组织施用：胃肠道、呼吸道、肺、窦洞、口腔、泌尿道、膀胱、阴道、子宫、子宫颈、眼、食道、唾液腺、鼻咽组织、肾脏、喉/咽组织和皮肤。

注射器、内窥镜、套管、插管、灌肠试剂盒、导尿管、喷雾器、吸入器和其它物品可用于施用。

治疗受试者的剂量或“有效量”优选足以将所述病症的一种、若干或全部症状改善至可测量或可检测的程度，尽管满意的结果是防止或抑制所述病症或病状或症状进展或恶化。因此，在可通过在靶组织中表达治疗性核酸治疗的病状或病症的情况下，生成改善可通过本发明的方法治疗的病状的治疗性蛋白的量取决于所述病状和预期结果，并且技术人员易于确定。适当的量取决于所治疗的病状、预期疗效以及个体受试者(例如，受试者的生物利用率、性别、年龄等)。可通过测定相关生理效应确定有效量。

本发明还考虑到了兽医应用。因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗非人类哺乳动物的方法，其中涉及向需要治疗的非人类哺乳动物施用本发明的组合物。

口服

本发明的化合物也可口服。口服可包括吞咽，以便所述化合物进入胃肠道。还可将本发明的组合物直接施用至胃肠道。

适于口服的制剂包括固体制剂(例如片剂、含微粒的胶囊)、液体或粉剂、糖锭(包括液体充填的糖锭)、咀嚼剂、多粒子和纳米颗粒、明胶、膜、栓剂和喷雾剂。

液体制剂包括悬浮剂、溶液、糖浆和酏剂。可通过固体复水制备液体制剂。

片剂剂型通常含有崩解剂。崩解剂的实例包括羟基乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、微晶纤维素、低烷基取代的羟丙基纤维素、淀粉、预胶化淀粉和海草酸钠。通常，崩解剂占剂型的1％至25％重量，优选5％至20％重量。

粘合剂通常用于赋予片剂给粘合性。适合的粘合剂包括微晶纤维素、明胶、糖、聚乙二醇、天然和合成胶、聚乙烯吡咯烷酮、预糊化淀粉、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。片剂还可含有稀释剂，例如乳糖(一水合物、喷干一水合物、无水乳糖等)、甘露醇、木糖醇、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、微晶纤维素、淀粉和二水合双磷酸氢钙。

片剂也可任选包含表面活性剂(例如，硫酸月桂酯钠和聚山梨醇酯80)和助流剂(例如，二氧化硅和滑石)。当存在时，表面活性剂可占片剂的0.2％至5％重量，并且助流剂可占片剂的0.2％至1％重量。

片剂通常还含有润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂富马酸钠和硬脂酸镁与十二烷基硫酸钠的混合物。润滑剂通常占片剂的0.25％至10％重量，优选0.5％至3％重量。

其它可能成分包括抗氧化剂、着色剂、调味剂和香味增强剂、防腐剂、唾液刺激剂、冷却剂、共溶剂(包括油类)、软化剂、填充剂、消泡剂、表面活性剂和掩味剂。

可直接压缩或通过滚筒压缩片剂混合物形成片剂。或者可在压片之前湿、干或熔化造粒、熔化凝固或挤压片剂混合物或部分混合物。最终制剂可包含一层或多层并且可有包衣或无包衣；最终制剂甚至可封装。

Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，第1卷，H.Lieberman和L.Lachman(Marcel Dekker，New York，1980)中讨论了片剂制剂。

供人用或兽用的口腔溶解薄膜(consumable oral film)通常为柔软的水溶性或水膨胀性薄膜剂型，该剂型可快速溶解或具有粘膜粘着性，并且通常包含成膜聚合物、粘合剂、溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂或乳化剂、粘度改性剂和溶剂。所述制剂的一些组分可发挥一种以上的功能。

本发明还包括包含本发明的组合物的多颗粒珠。

根通常可通过蒸干可剥背衬支撑或纸上涂覆的薄水膜制备据本发明所述的膜。这可在烘箱或烘道中进行，通常可在组合包衣干燥器中进行或通过冻干或真空处理进行。

口服的固体剂型可配制为即释型和/或调释型。调释型制剂包括延迟释放、缓释、脉冲释放、控释、靶向释放和程序化释放。

已知其它适当的释放技术，例如高能分散剂与渗透和包衣颗粒。

肠胃外施用

适合的肠胃外施用方式包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内和皮下。适合的肠胃外施用装置包括针(包括显微针)注射器、无针注射器和输注技术。

肠胃外制剂通常为可含有赋形剂，例如盐、碳水化合物和缓冲剂的水溶液，但是，对于一些应用而言，肠胃外制剂可能更适合配制为无菌的非水溶液或配制为与适合的媒介物(例如无菌、无热原水)一起使用的干燥形式。

例如使用本领域技术人员熟知的标准制药技术可易于实现在无菌条件下(例如通过无菌过滤)制备肠胃外制剂。

可通过使用适当的配制技术(例如掺入增溶剂)增加用于制备肠胃外溶液的化合物的溶解性。

供肠胃外施用的制剂可配制为即释型和/或调释型。即释型制剂包括延迟释放、缓释、脉冲释放、控释、靶向释放和程序化释放。因此，本发明的化合物可配制为固体、半固体或触变性液体，以作为提供所述活性化合物的调控释放的植入库施用。

局部施用

通常也可向皮肤或粘膜，即经皮或透皮施用本发明的化合物。用于此目的的典型制剂包括明胶、水凝胶、洗剂、溶液、乳膏、软膏、撒粉剂(dusting powder)、敷料、泡沫、膜、皮肤贴片、干胶片、植入物、海绵、纤维、绷带和微乳剂。

其它局部施用方式包括通过电穿孔输送、电离子透入、超声透入疗法、超音波导入和显微针或无针(例如Powderject^TM、Bioject^TM等)注射。

供局部施用的制剂给配制为即释型和/或调释型。调释型制剂包括延迟释放、缓释、脉冲释放、控释、靶向释放和程序化释放。

吸入/鼻内施用

本发明的化合物还可经鼻内或通过吸入施用，通常以来自干粉吸入器的干粉形式(单独或以混合物施用，例如与乳糖的干燥共混物，或以混合组分颗粒施用)或在使用或不使用适合的推进剂的情况下作为来自加压容器、泵、喷雾器、雾化器、喷酒器的气溶胶喷雾来施用。

用于吸入器或吹入器的胶囊、发泡药和药筒可配制为含有本发明化合物、适合的粉末基质(例如乳糖或淀粉)和改性剂(例如L-亮氨酸、甘露醇或硬脂酸镁)的粉末混合物。

供吸入/鼻内施用的制剂可配制为即释型和/或调释型。调释型制剂包括延迟释放、缓释、脉冲释放、控释、靶向释放和程序化释放。

直肠/阴道内施用

本发明的化合物可(例如)以栓剂、阴道环或灌肠剂形式经直肠或阴道施用。可可油是常规的栓剂基质，但可视情况使用各种替代物。

供直肠/阴道施用的制剂可配制为即释型和/或调释型。调释型制剂包括延迟释放、缓释、脉冲释放、控释、靶向释放和程序化释放。

经眼/耳施用

本发明的化合物通常也可以滴剂的形式直接向眼或耳施用。其它适合经眼和耳施用的制剂包括软膏、生物可降解(例如可吸收凝胶海棉、胶原)和非生物降解(例如硅树脂)植入物、干胶片、晶状体和颗粒系统。还可通过离子透入法输送制剂。

供眼/耳施用的制剂可配制为即释型和/或调释型。调释型制剂包括延迟释放、缓释、脉冲释放、控释、靶向释放和程序化释放。

实验

表1材料和设备

有关在线混合和浓缩复合物组合物的材料和方法的附加描述，参见WO 2009/039657，其全文以引用的方式明确并入本文。

复合物制剂命名规定

图2示出制造1L批次以及随后TFF浓缩的典型过程的框图。

小规模在线混合

使用注射泵、内径为1/16英寸的硅树脂管材和内径为3/32英寸的Y构型聚丙烯接头来测试简易小型在线混合装置。图3示出了带3mL容量的注射器和Y接头的装置的示意图。注意该装置的最大注射器体积为60mL。此过程用于使用24mer/98％DDA壳聚糖以20的NP比制备最终DNA浓度为150μg/mL的复合物。按2∶1的体积比混合DNA和壳聚糖原料以生产同质复合物制剂。

中等规模在线混合

使用蠕动泵、内径为3/16英寸的硅树脂管材和内径为3/16英寸的Y构型聚丙烯接头来测试简易中型在线混合装置。图4示出了带Y接头的装置的示意图。注意该装置的最大输出体积仅受原料容器的体积限制。此过程用于使用24mer/98％DDA壳聚糖以20的NP比制备最终DNA浓度为150μg/mL的复合物。按2∶1的体积比混合DNA和壳聚糖原料以生产同质复合物制剂。

TFF过程(浓缩)

进行TFF研究之前，根据制造商的说明冲洗并清洁中空纤维过滤器

TFF浓缩#1

为了进行浓缩，如示意图(图5)所示装配TFF系统并清除剩余水。关闭渗透阀并完全打开背压阀之后，向产物贮存器加DNA-壳聚糖复合物。通过接通泵，完全打开渗透阀(和启动任选泵)，然后调节背压阀至目标过滤入口压力，从而启动浓缩。浓缩过程中，在天平上监测收集到的透过物的质量，并用于确定何时达到目标DNA浓度。达到目标体积缩减量之后，通过关闭渗透阀并完全打开背压阀以停止浓缩过程。见以下方程式：

[DNA]渗余物＝[DNA]初始X(质量初始/(质量初始-质量透过物))

TFF透滤

在一些批次中，在浓缩过程中插入透滤步骤(缓冲液调换)。例如，由0.15mg/mL的DNA开始，将复合物浓缩至0.60mg/mL，然后在保持0.60mg/mL浓度的同时透滤一定数量的洗液体积，然后进一步浓缩至1.20mg/mL。

为进行透滤，将透过物输出管线改为涂焦油的新收集容器，然后通过排气孔将缓冲液管线连接至渗余物容器。这样形成了无大气排气的密封系统。接着，打开渗透阀和/或启动渗透泵(流量同上)。这样在收回透过物时在渗余物容器中形成了真空，以依次将透析缓冲液引入渗余物容器。以这种方式，当放出透过物时通过不断补充将渗余物液体保持在恒定水平。这就是透滤过程。在一些情况下(因系统大气泄漏引起真空不足时)，以与透过物相同的速率将透析缓冲液泵入渗余物中。为目标量的洗液体积进行透滤(1洗液体积＝渗余物体积)。为停止透析，关闭渗透(阀并停止渗透泵)，并且使渗余物容器与大气相通并断开与缓冲液管线的连接。

TFF浓缩#2

透滤之后，再继续TFF浓缩。达到目标体积缩减量之后，通过关闭渗透阀并完全打开背压阀停止浓缩过程。清洗渗余物液体管线并收集最终产品之后，将该TFF后产物送交进行分析试验并通过picogreen测定检测DNA浓度。立即将残余物储存在-80℃下或4℃下直到分析试验完成，然后及时使用或冷冻储存。

TFF后的pH调节

除非另有说明，通过加入pH调节缓冲液即时调节TFF后的最终产品的pH。缓冲液组合物通常由于蔗糖溶液中的醋酸和/或壳聚糖组成。按4.5∶95.5的体积比向TFF后的最终产品加入该溶液。该附加体积将使TFF后产物的浓度降低4.5％。

分析试验

粒子筛选

使用Zetasizer Nano光散射仪器进行粒度测量。除非另有说明，将样品在10mM NaCI(最少0.4mL)中稀释20倍并装入一次性比色皿中。Zetasizer的程序设为在重复三次3分钟测量之前，在25℃下温育样品3分钟。据报道Z-平均值和多分散性(PDI)具有标准偏差(n＝3)。对于稀释的样品而言，Zetasizer的程序设为使用10mM NaCI的粘度和折射率。

ζ电势

使用Zetasizer Nano光散射仪器进行ζ电势测量。通常，将未稀释样品装入Zetasizer折叠毛细管池(最少0.8mL)。Zetasizer的程序设为在重复测量之前(重复次数由Zetasizer软件自动确定)，在25℃下温育样品3分钟。据报道ζ电势值具有标准偏差(n＝3)。Zetasizer的程序也可就粘度和介电常数解析最终样品的组成。

冷冻的短期稳定性

为进行短期稳定性研究，将最终复合物产物冷冻并在适当温度下(-20℃、-30℃或-80℃)储存过夜。在一些情况下，将样品在干冰/乙醇浴中迅速冷冻，然后储存在适当温度下。在适当的时候，将样品解冻至室温并如所述进行分析。

壳聚糖酶消化

在37℃下用50μL的4.44U/mL壳聚糖酶消化50μL复合物2小时(原料壳聚糖酶浓度为62U/m并且在37℃下用50mM的冷NaOAc稀释)。对于C(24，98)-N40-c75颗粒而言，最好消化0.909-1.818mM壳聚糖释放全部DNA，所以在37℃下用150mMNaOAc稀释所述颗粒1/10和1/5。

用PicoGreen进行DNA定量

在使用PicoGreen检测进行DNA测量之前，必须用壳聚糖酶将全部DNA从复合物释放出。释放之后，用适合的限制酶进行DNA消化以线性化超螺旋DNA质粒。

EcoR1消化

温育后，将XμL经壳聚糖酶消化的样品加入5μL EcoR1和5μLEcoR1缓冲液中并用MilliQ水定容至50μL的最终体积(调节相同体积XμL，以致最终DNA浓度为4ng/μL)。然后在37℃下温育EcoR1样品30分钟。

PicoGreen检测

PicoGreen Quant-iT ds DNA HS检测试剂盒提供了两种缓冲液(A和B)和两种标准液(1和2)。按1∶20将缓冲液A稀释至缓冲液B中以制备溶液“A/B”。用溶液A/B将标准液1和2稀释20倍(10μL稀释成200μL)。标准液1和2的最终浓度分别为0和10ng/μL。

用溶液A/B将10至20μL的EcoR1消化样品定容至200μL的最终体积，简单涡流，在室温下温育2分钟，然后根据制造商说明用Qubit荧光计测定荧光性。

凝胶电泳

为确认DNA捕获至复合物中，对样品进行凝胶电泳。1-5μL的样品等分试样(目标为800ng DNA)与2μL的Tracklt上样缓冲液混合结合并且用水定容至10μL的最终体积。标准泳道加入超螺旋DNA梯带。于120V下将样品溶解于0.8％含溴化乙锭(50μg/mL)的琼脂糖凝胶45分钟。用FluorChem成像系统对凝胶成像。

SEAP检测

使用SEAP化学发光检测试剂盒进行SEAP检测。使用前在25℃下将用于检测的所有试剂均衡30分钟。通过将胎盘碱性磷酸酯酶溶解于来自掺加0.1％牛血清蛋白和50％甘油的试剂盒的1X稀释缓冲液中至1mg/mL，然后用DMEM连续稀释10倍至0.01pg/μL而制备用于检测的标准液。然后用稀释缓冲液按1∶4稀释标准液和解冻样品，在65℃下热灭活30分钟，于冰上温育2分钟，离心(室温下16100×rcf离心2分钟)并将上清液转移到新管中。在25℃下均衡5分钟之后，向Microlite-1板的每个孔加入50μL样品和标准液，一式两份。然后向每个孔加入灭活缓冲液(50μL)并在不产生气泡的情况下轻轻上下吸移以便混合，并温育5分钟。在5分钟温育期间按底物∶增强剂1∶19的比例制备底物/增强剂。然后将底物/增强剂加入每个孔中，温育20分钟，然后在光度计中以1秒的整合时间对平板进行读数。

Ninhydrin检测(全部壳聚糖)

使用ninhydrin检测确定复合物中的总壳聚糖浓度。简单而言，将复合物稀释为含有具醋酸钠的1-2mM氨基葡萄糖，在pH 5.5时最终浓度为150mM。用pH 5.5、70mM醋酸钠稀释相同链长的壳聚糖至浓度为0.5-7.5mM氨基葡萄糖制备标准曲线。然后在37℃下用相等体积的于pH 5.5、50mM醋酸钠中的5U/ml壳聚糖酶消化稀释的复合物和标准液2小时。温育2小时后，然后将100μL消化的复合物和标准液加入含400μl、pH 5.5、70mM醋酸钠的玻璃管中。然后向各样品加入Ninhydrin试剂(250μL)，然后将所述管简单涡流并煮沸10分钟。于室温冷却15分钟后，加入1.25mL乙醇并于550nm下测定吸收度值。由直线标准曲线的斜率和y截距计算复合物中的壳聚糖浓度并用初始稀释因子调整。

实施例1：首次小规模透滤试验

表2描述了透滤试验的批量参数。c150-pH4.0制剂用作起始原料。增加pH/醋酸根调节步骤作为填充&完成之前的最后步骤。

表2参数和结果

1.于室温下17小时后测得

2.于室温下6小时后测得

透滤法实施例2：第二次小规模透滤试验

第二次透滤试验(表3)为3倍较大批量并且将c150-pH4.0制剂用作起始原料。增加pH/醋酸根调节步骤作为填充&完成之前的最后步骤。

表3参数和结果

实施例3：小批量

进行第三次透滤试验(表4)。该批量也用c150-pH4.0制剂作为起始原料。

表4参数和结果

实施例4：中等批量

表5参数和结果

TFF浓缩步骤期间的pH变化

在若干批次中，已注意到利用TFF浓缩过程，pH通常按0.2-0.5个单位上升。这是由于进行TFF时制剂中总醋酸根与壳聚糖的相对浓度变化；即pH是[壳聚糖]/[醋酸根]的函数。对其建模。当DNA从0.60mg/mL升至2.0mg/mL时在透滤步骤之后精密监测pH。对于所述模型，进行了以下假定：

假定透析后[醋酸根]恒为10mM。

假定在浓缩步骤开始时任意[Chitosan]为1mM。

假定[Chitosan]随体积减少呈比例增加。

假定制剂pH遵守Henderson-Hasselbach缓冲理论。

为对此类pH变化建模，绘制(图6)pH：Log(^[壳聚糖]/_[醋酸根])并确定所得到的曲线：

pH＝0.6664×Log(^[壳聚糖]/_[醋酸根])+4.7208

图6模型化TFF浓缩期的pH变化。各个点表示所述复合物相对体积减少倍数(＝升高DNA浓度)。例如，标有2X的点约为c1200。

我们可使用这个模型预测掺加醋酸根至80mM后的c1200制剂的pH。假定c1200中壳聚糖为2X(即2×1mM＝2mM)。假定总醋酸根为80mM。pH＝0.6664×Log(2/80)+4.7208＝3.65。结果非常接近3.7的经验结果。

此模型还显示为了实现80mM最终所需醋酸根浓度的pH 4.0，壳聚糖浓度必须比该批次的起始量高6.6倍。因此，如果我们用无壳聚糖的缓冲液进行透滤，这样将除去几乎所有的游离壳聚糖，然而不能同时达到pH(4.0)和醋酸根(80mM)的目标。优选用含壳聚糖的缓冲液进行透滤。

TFF后的稳定性

关键过程参数在完成第二TFF浓缩步骤之后。与先前其它步骤不同，浓缩至c1100之后复合物不稳定并且必须在停止TFF后1小时内调节至更低pH。一旦调节pH，颗粒在室温下就稳定。

图7：第二TFF浓缩步骤后复合物的稳定性。在25℃下温育TFF后的未稀释样品并每2小时监测一次粒度。

实施例5：用含壳聚糖的缓冲液进行中等规模透滤试验

表6参数

表7分析结果

图8：过程中的pH数据。X轴上的TFF分数符号如下：C1：TFF浓缩步骤#1；D：TFF透滤，用洗液体积(WV)#表示；C2：TFF浓缩步骤#2。

实施例6：pH 4透析缓冲液的小批量

为在TFF期间更好地控制产物的pH，将透滤缓冲液调节至较低的pH。下表总结了实验和结果。

表8参数

表9分析结果

实施例7：pH 4透析缓冲液的中等批量

生产3批中等规模批量。下表总结了实验和结果。

表10参数

表11分析结果

	直径(nm)	PDI	ζ电势(mV)	pH
					预TFF	89.7±0.4	0.14±0.01	35±3	4.82±0.02
TFF#1后	91.5±0.8	0.132±0.003	30±2	5.04±0.01
					透滤后	93±1	0.135±0.005	30±1	4.85±0.02
TFF#2后	93.5±0.5	0.148±0.002	25±5	5.12±0.08
					调节后	94±1	0.15±0.01	31.1±0.1	3.99±0.02

结果为3批的平均。

进行DNA和壳聚糖的在线混合、TFF浓缩、TFF透滤和pH调节以生产最终pH为4.0的c1000复合物。最终制剂的缓冲量也为70-80mM醋酸根并且生理性等渗。另外，纳米颗粒分散体-80℃冷冻并在室温下解冻，解冻之后可稳定至少8小时。

实施例8：-80℃下的长期稳定性

中等规模生产、在-80℃下储存1年后的最终产品任选地为半透明并且不含可见颗粒(数据未示出)。

来自中等批量的壳聚糖-DNA纳米颗粒在-80℃下物理性稳定长达1年。颗粒直径、多分散性和导出计数率的变化可以忽略(表12)。小批量在4个月的较短试验期也稳定。

表12：-80℃下的稳定性：颗粒直径、PDI和DCR

来自中等批量的壳聚糖-DNA纳米颗粒在-80℃下导电性稳定长达1年。导电性和pH的变化可以忽略并且在分析误差范围内(表13)。尽管对于该检测10％的波动被认为是正常的，但在这1年Z电势似乎升高了15-30％(Malvern Instruments Technical Note MRK1031-01)。然而，1年之后电学性质仍在产品放行标准范围内。小批量在4个月的较短试验期稳定。

表13：-80℃下的稳定性：ζ电势、导电性和pH

通过琼脂凝胶电泳显示了保持的DNA质粒包装。通过琼脂凝胶电泳分析两中等批量的、在-80℃下储存1年后的复合物。DNA保持封装在复合物内并留在样品孔中不会向阴极移动(图12)。

实施例9：向猪十二指肠输送药品

通过内窥镜检查向禁食一夜的猪的十二指肠输送药品。简单地，将结肠镜插入经麻痹猪的口中，直到所述镜的尖端得以通过幽门括约肌进入十二指肠。静脉内施用0.3mg/kg的Buscopan(减少蠕动)之后，将所述镜进一步插入超过胆管20cm。此时，通过所述镜的输送管将定制双气囊导管送入十二指肠，然后用15至20mL盐水使远近两个气囊充气，从而确保近侧气囊离胆管至少5cm。然后通过在气囊之间的中间组织充入和排出后来通过所述导管内的输送口输送的液体。液体冲洗的顺序为：45mL盐水洗3次，然后用0.5％于盐水中的乙酰半胱氨酸(Mucomyst)洗1次，然后用pH为5.5于7.5％蔗糖中的25mM醋酸钠缓冲液洗1次。确保十二指肠中间段完全排空之后，通过导管输送口将药品(强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物)送至该段并温育60分钟。温育之后，为远侧和近侧气囊抽去空气，然后除去所述镜和导管。

猪血浆采集

按以下步骤采集猪血浆。从镇静状态下的动物的耳、隐静脉或颈静脉处采集5mL血至先前用50pi抑肽酶(4.7单位/mg蛋白质，6.6单位/ml)标记的真空采血管(Vacutainer)中，然后立即置于冰上并送到实验室进行试验。通过在1000×g下离心血样10分钟并收集上清液而采集血浆。采集的血浆储存在-80℃下直到准备分析。

结果

响应施用含gWIZ-SEAP质粒DNA的c150壳聚糖-核酸颗粒检测猪血浆SEAP。pH为4的药品配方为C(24，98)-N20-c150-Ac25-Suc9-pH4.0。pH为4.8的药品配方为C(24，98)-N20-c150-Ac25-Suc9-pH4.8。

pH为4.0的强酸性壳聚糖-核酸复合物组合物在体内表现出大体上比pH为4.8的组合物更高的转染效率，通过血浆中较高水平的SEAP证实。(图1)

实施例10：小鼠膀胱的体内转染

向自然C57BL/6小鼠输送载有EF1a-SEAP或对照载体的壳聚糖-DNA复合物C(24，98)-c1000-pH4。2天后，处死小鼠并获取组织。图9中示出了经治疗小鼠膀胱组织中SEAPmRNA超过自然小鼠(未转染)的相对增量。

方法

通过剖腹手术在C57BL/6雌性小鼠的腹部产生手术切口以暴露和分离膀胱。输送100μL、pH为4、载有EF1a-SEAP或对照质粒的c1000C(24，98)壳聚糖复合物后排尿。给药两天之后，采集膀胱组织进行RNA提取，然后对SEAP mRNA表达进行RT-qPCR分析。

结果

强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物能够在体内有效转染膀胱细胞。

实施例11：慢性IBD模型下重复给药功效

我们使用天生发展慢性结肠炎的IL-10缺陷小鼠发起重复给药研究。每周一次监测这些小鼠结肠炎发展的症状。确定结肠炎发展(即咳痰和血便)后，我们通过灌肠法向这些小鼠施用3剂量的EG-10或SEAP(对照)纳米颗粒。各剂量的纳米颗粒每隔7天施用1次。整个实验期间每周监测一次这些小鼠的体重，并且观察到每周治疗后与EG-10治疗组有关的增重明显增加(图10)。在末次治疗5天后，处死两组的小鼠并且除去其结肠和测定前炎性细胞因子水平。与SEAP治疗的小鼠相比，EG-10治疗的小鼠导致IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA的水平降低(图11)。这些组合数据清楚地说明慢性IBD小鼠模型中多次给药的可行性和EG-10的疗效提高。

图10：EG-10(hlL-10)对慢性IBD小鼠体重的影响。每隔7天通过灌肠术给予3剂量的EG-10或SEAP(对照)纳米颗粒治疗自然发展结肠炎的IL-10-缺陷小鼠(～30周龄)。每周测一次各小鼠的体重并与其自身在首次治疗之前的体重相对比(以％体重变化表示)。两种纳米颗粒的药品配方均为C(24，98)-N10-c1000-Ac70-Suc9-pH4.0。EG-10纳米颗粒包含具有受延长因子1-α启动子(EF1α)控制的人白细胞间素-10基因(hlL-10)的DNA质粒。SEAP(对照)纳米颗粒包含具有受延长因子1-α启动子(EF1α)控制的可分泌胚胎碱性磷酸酶基因的DNA质粒。

图11：EG-10(hlL-10)纳米颗粒对3种前炎性细胞因子的影响。每隔7天通过灌肠术给予3剂量的EG-10或SEAP(对照)纳米颗粒治疗自然发展结肠炎的IL-10-缺陷小鼠(～30周龄)。在末次治疗5天后，测定处死小鼠结肠中的前炎性细胞因子水平：IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA。两种纳米颗粒的药品配方均为C(24，98)-N10-c1000-Ac70-Suc9-pH4.0。EG-10纳米颗粒包含具有受延长因子1-α启动子(EF1α)控制的人白细胞间素-10基因(hlL-10)的DNA质粒。SEAP(对照)纳米颗粒包含具有受延长因子1-α启动子(EF1α)控制的可分泌胚胎碱性磷酸酶基因的DNA质粒。

实施例12：体内小鼠转染治疗COPD或哮喘：向肺部输送复合物

为建立小鼠COPD模型，如先前所述通过仅有鼻子的暴露系统或通过烟腔将小鼠暴露于烟气中，为期4至5天建立亚急性暴露，或为期6个月建立慢性暴露(参见例如Fortin等，2009，A multi-targetantisense approach against PDE4and PDE7reduces smoke-induced lunginflammation in mice(针对PDE4和PDE7的多目标反义方法减少小鼠烟诱导的炎症)，RespirRes.2009年5月20日；10：39.；Miller等，2009，Adiponectin and functional adiponectin receptor 1 are expressed by airwayepithelial cells in chronic obstructive pulmonary disease(慢性阻塞性肺病中气道上皮细胞表达脂联素和功能性脂联素受体1)，J Immunol.2009年1月1日；182(1)：684-91；Bonneau等，2006，Effect of adenosine A2Areceptor activation in murine models of respiratory disorders(鼠呼吸障碍模型中腺苷A2A受体活化的作用)，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2006年5月；290(5)：L1036-43.Epub 2005年12月9日.；Brusselle等，Murine models of COPD(鼠COPD模型)，Pulm Pharmacol Ther.2006；19(3)：155-65.Epub 2005年8月3日；和D′hulst等，2005，Time courseof cigarette smoke-induced pulmonary inflammation in mice(香烟烟气诱导的小鼠肺部炎症的时间过程)，Eur Respir J.2005年8月；26(2)：204-13)。如先前所述通过将气管暴露于猪胰弹性蛋白酶，为期4至5周也可建立小鼠COPD模型(参见例如Cheng等，2009，Prevention of elastase-induced emphysema in placenta growth factorknock-out mice(对胎盘生长因子敲除小鼠中弹性蛋白酶诱导的肺气肿的预防)，Respir Res.2009年11月23日；10：115；和Pang等，2008，Diminished 1CAM-1 expression and impaired pulmonary clearance ofnontypeable Haemophilus influenzae in a mouse model of chronicobstructive pulmonary disease/emphysema(慢性阻塞性肺病肺气肿小鼠模型中不可分型流感嗜血杆菌的1CAM-1表达减少和肺清除受损)，Infect Immun.2008年11月；76(11)：4959-67.Epub 2008年9月15日)。

为建立小鼠哮喘模型，经腹膜内向小鼠注射混有氢氧化铝的鸡卵清蛋白。最初注射后数天，如先前所述经鼻内用卵清蛋白激发小鼠(Bonneau等，2006，如上；和Boulares等，2003，Gene Knockout orPharmacological Inhibition of Poly(ADP-Ribose)Polymerase-1PreventsLung Inflammation in a Murine Model of asthma(基因敲除或药物抑制聚(ADP-核糖)聚合酶-1预防鼠哮喘模型的肺部炎症)，AmericanJournal of Respiratory Cell and Molecular Biology，第28卷，第322-329页)。

为治疗COPD或哮喘模型，使用包含编码抗炎蛋白的治疗性核酸的强酸性壳聚糖-DNA复合物组合物。本领域已知抗炎蛋白。表14的参考文献中报导了示例性抗炎蛋白。所有参考均全文以引用的方式明确并入本文。在麻醉下经鼻内或气管内向肺部施用强酸性的壳聚糖-DNA复合物(例如，见Dow等，1999，如下；和Hogan等，1998，如下)。在各个时间点，处死小鼠并且收集和处理其肺部组织以便转基因mRNA表达和各种细胞因子表达(例如，见Dow等，如下；和Hogan等，1998，如下)。单独注射DNA作为对照。鼻内或气管内输送强酸性的壳聚糖-DNA复合物组合物导致在体内肺部细胞中抗炎基因的表达显著增加并介导前炎性细胞因子减少。

实施例13：体内小鼠转染：向膀胱输送复合物治疗膀胱炎

为建立膀胱炎模型，可使用小鼠或大鼠。例如，将小鼠置于醉药状态并向尿道插入聚乙烯导管。抽吸尿液之后，如先前所述向膀胱逐渐灌入酸以诱导膀胱炎(参见例如Kirimoto等2007，Beneficial effectsof suplatast tosilate(IPD-1151T)in a rat cystitis model induced byintravesical hydrochloric acid(甲磺司特(IPD-1151T)对膀胱内盐酸诱导的大鼠膀胱炎模型的有益影响)，BJUInt.2007年10月；100(4)：935-9.Epub 2007年8月20日；和Chuang等，2003，Gene therapy for bladderpain with gene gun particle encoding pro-opiomelanocortin cDNA(用编码素原cDNA的基因枪颗粒对膀胱疼痛进行基因治疗)，J Urol.2003年11月；170(5)：2044-8)。

为治疗膀胱炎，麻醉小鼠并通过尿道导管经囊内向膀胱施用包含编码抗炎蛋白的治疗性核酸的强酸性壳聚糖-DNA复合物组合物(参见例如Kirimoto等，2007，如上；和Chuang等，2003，如上)。表14的参考文献中报导了示例性抗炎蛋白。所有参考均全文以引用的方式明确并入本文。在各个时间点，处死小鼠并且收集和处理其肺部组织以进行组织学和转基因mRNA表达。另外，检查各种细胞因子的表达。单独注射DNA作为对照。囊内输送强酸性的壳聚糖-DNA复合物导致在体内膀胱组织中抗炎基因mRNA的表达显著增加并介导前炎性细胞因子减少。

表14：示例性抗炎蛋白

所有引文用均全文以引用的方式明确并入本文。

Claims (25)

1.一种强酸性的壳聚糖-核酸复合物组合物，所述组合物包含稳定的壳聚糖-核酸复合物，其中所述组合物的pH低于4.5。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的pH低于4.2。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的pH低于4.0。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的pH低于3.8。

5.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物具有10-200mM之间的平衡阴离子浓度。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述平衡阴离子为醋酸根离子。

7.根据权利要求1所述的组合物，其具有至少0.5mg/ml的核酸浓度。

8.根据权利要求1所述的组合物，其具有至少1.0mg/ml的核酸浓度。

9.根据权利要求1所述的组合物，其具有至少1.5mg/ml的核酸浓度。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物不含复合物沉淀。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述壳聚糖-核酸复合物包含治疗性核酸构建体。

12.一种转染粘膜上皮细胞的方法，所述方法包括使所述粘膜上皮细胞与根据权利要求1所述的组合物接触。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述粘膜上皮存在于选自以下各项的组织中：胃肠道组织、呼吸道组织、肺组织、窦洞组织、口腔组织、尿道组织、膀胱组织、阴道组织、子宫组织、子宫颈组织、眼组织、食道组织、唾液腺组织、鼻咽组织、肾组织和喉/咽组织。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述粘膜上皮存在于胃肠道组织中。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述粘膜上皮存在于膀胱组织中。

16.根据权利要求12所述的方法，其中所述粘膜上皮存在于肺组织中。

17.一种药物组合物，其包含根据权利要求13所述的组合物，其中所述药物组合物的pH低于4.5。

18.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述药物组合物是等渗的。

19.一种治疗涉及粘膜上皮炎症的疾病的方法，所述方法包括对患有涉及粘膜上皮炎症的疾病的患者施用治疗有效量的根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述治疗性核酸构建体编码抗炎蛋白，并且其中将所述药物组合物局部施用至所述粘膜上皮。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗炎蛋白选自TNFα抑制剂、IL-1抑制剂和IL-10。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗炎蛋白为IL-10。

22.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病为IBD。

23.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病为间质性膀胱炎。

24.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病为COPD。

25.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病为哮喘。

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