CN117919168A - 一种寡核苷酸灌肠剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本申请提供了一种寡核苷酸灌肠剂，所述灌肠剂包括有改良鱼精蛋白和寡核苷酸；并提供了其制备方法和应用。与现有技术相对比，本申请具有以下优点：本发明提供了一种寡核苷酸灌肠剂及其制备方法，将具有抗炎作用的反义寡聚核苷酸序列制作为灌肠剂，灌肠剂可与肠道组织充分接触。此外，本发明将灌肠剂中的组分鱼精蛋白，通过化学反应合成改良鱼精蛋白，使其具有巨噬细胞的靶向性配基，肠道吸收后可特异性的作用于巨噬细胞，避免了注射给药造成的全身性免疫抑制，为溃疡性结肠炎及其相关并发症治疗提供了一种新的治疗途径。
Description
技术领域
本申请涉及生物制药技术领域，具体涉及一种寡核苷酸灌肠剂及其制备方法和应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)作为炎症性肠病的亚型之一，是一种慢性的，易复发的胃肠道炎症性疾病。我国现有的流行病学资料统计数据显示，溃疡性结肠炎患病率、发病率均呈上升趋势，已成为我国的常见病和多发病。UC病因和发病机制比较复杂，其诊断和治疗都相当棘手，现有治疗手段很难将其完全治愈，同时也增加了患者罹患结直肠癌的风险，严重危害患者的生命健康。
在肠道炎症期间，巨噬细胞表现出促炎表型并分泌趋化因子和促炎细胞因子，包括肿瘤坏死因子(TNF)α、白细胞介素(IL)-6、IL-12和IL-23等，在肠道部位阻断炎症因子的功能可以缓解UC患者肠道炎症。目前，针对炎症因子的小分子抑制剂和抗体等已经被广泛用于溃疡性结肠炎的治疗。已经上市的药物托法替尼已被投入到炎症性肠病的治疗中。但是使用炎症因子抑制剂治疗存在一些安全隐患，包括白细胞数量减少，从而导致严重感染、恶性肿瘤的风险增加。主要是由于抑制炎症因子的同时也抑制了宿主防御功能而引起全身性免疫抑制。
核酸药物包括反义核酸(ASO)，干扰RNA和微小RNA等，作为一种新型的抑制基因表达的技术，给肠炎、肠癌等疾病治疗带来了新的契机和全新的治疗理念。核酸药物已被广泛用于肠炎、肠癌及其并发症的模型治疗研究，并取得了较好的效果，但目前临床尚无获批案例，限制核酸药物应用于肠炎治疗的关键瓶颈是其体内输送问题。
近年来，基于不同种类的生物材料制备的给药系统为核酸药物的体内传输提供了新的方式和途径，比如脂质体，聚乙烯亚胺，聚乳酸-羟基乙酸共聚物等。但是，传统的给药系统存在着制备过程复杂，制备条件要求较高，制备要求仪器较为昂贵，从而导致生产成本较高的缺点。
发明内容
针对上述存在的技术局限性，本申请提出了一种寡核苷酸灌肠剂及其制备方法和应用；其克服了背景技术中提到的不足和缺陷。
为实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的发明点是提供一种寡核苷酸灌肠剂，所述灌肠剂包括有改良鱼精蛋白和寡核苷酸。
可选地，上述的一种寡核苷酸灌肠剂，所述改良鱼精蛋白是通过物理作用或通过化学反应将配体与鱼精蛋白连接得到的。
可选地，上述的一种寡核苷酸灌肠剂，所述物理作用包括但不限于电荷相互作用(静电作用)、配位相互作用；所述化学反应包括但不限于使用以连接为目的的化学试剂分别与鱼精蛋白和配体进行反应。
改良鱼精蛋白与寡核苷酸能够通过静电作用自发组装形成纳米粒，纳米粒粒径为80nm-500nm；改良鱼精蛋白为巨噬细胞靶向性配基(配体)修饰的鱼精蛋白。
可选地，上述的一种寡核苷酸灌肠剂，所述鱼精蛋白来源于鱼类成熟精子；优选为鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼、三文鱼。
鱼精蛋白为鱼类精子的组蛋白，其结构序列稳定。
可选地，上述的一种寡核苷酸灌肠剂，所述鱼精蛋白和寡核苷酸，未经过化学修饰，或经过至少一种化学修饰；所述化学修饰优选为硫代修饰、甲基化修饰、乙酰化修饰中的至少一种。
可选地，上述的一种寡核苷酸灌肠剂，所述鱼精蛋白上未与配体连接，或与至少一种配体连接；所述配体优选为磷脂、单糖、糖醛酸、寡糖、多糖、适配子、抗体分子、抗体片段、嵌合抗体、多肽、天然产生的受体表面结合物、小分子化合物中的至少一种。
可选地，上述的一种寡核苷酸灌肠剂，所述灌肠剂的改良鱼精蛋白中，配体与鱼精蛋白的质量比为(8-16)：1；优选为9：1。
可选地，上述的一种寡核苷酸灌肠剂，所述灌肠剂中，改良鱼精蛋白与寡核苷酸的质量比为(0.5-8)：1；优选为4：1。
可选地，上述的一种寡核苷酸灌肠剂，所述寡核苷酸选自一种或多种具有抗炎作用的寡核苷酸；优选为JAK1反义核酸，其序列如SEQ ID NO：1-3任一所示。
SEQ ID NO：1：CGCCACTGGATCCCGAGATT；
SEQ ID NO：2：TTGTTCCACTCTTCCCGGAG；
SEQ ID NO：3：CGTCTTGGGGTCCCGAATGG。
本申请的第二个发明点是提供了前述一种寡核苷酸灌肠剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.合成/制备改良鱼精蛋白，并将其制备成水溶液；
S2.在寡核苷酸水溶液中边搅拌边逐滴加入改良鱼精蛋白水溶液，静置反应后真空冷冻干燥，得到纳米粒粉末；
S3.将纳米粒粉末溶于生理盐水，得到寡核苷酸灌肠剂。
与现有技术相对比，本申请具有以下优点：
本发明提供了一种寡核苷酸灌肠剂及其制备方法和应用，将具有抗炎作用的反义寡聚核苷酸序列制作为灌肠剂，灌肠剂可与肠道组织充分接触。此外，本发明将灌肠剂中的组分鱼精蛋白，通过化学反应合成改良鱼精蛋白，使其具有巨噬细胞的靶向性配基，肠道吸收后可特异性的作用于巨噬细胞，避免了注射给药造成的全身性免疫抑制，为溃疡性结肠炎及其相关并发症治疗提供了一种新的治疗途径。
附图说明
图1为本申请一实施例中，改良鱼精蛋白与JAK1反义核酸以不同质量比形成的复合物进行琼脂糖凝胶电泳的结果图。
图2显示为以JAK1 mRNA相对表达量体现出的改良鱼精蛋白与JAK1核酸复合纳米粒对炎症状态巨噬细胞的治疗效果。
图3显示为本申请一实施例中，以马尔文粒径仪表征复合物粒径，确定了改良鱼精蛋白(免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白)与反义核酸(SEQ ID NO：1)采用不同质量比情况下的粒径差别。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本申请进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本申请，并不用于限制本申请的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本申请。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。
为了进一步了解本申请，下面结合最佳实施例对本申请作进一步的详细说明。
实施例1
一种寡核苷酸灌肠剂，包括有改良鱼精蛋白和寡核苷酸。
改良鱼精蛋白是通过物理作用或通过化学反应将配体与鱼精蛋白连接得到的。
物理作用包括但不限于电荷相互作用(静电作用)、配位相互作用；化学反应包括但不限于使用以连接为目的的化学试剂分别与鱼精蛋白和配体进行反应。
改良鱼精蛋白与寡核苷酸能够通过静电作用自发组装形成纳米粒，纳米粒粒径为80nm-500nm；改良鱼精蛋白为巨噬细胞靶向性配基(配体)修饰的鱼精蛋白。
鱼精蛋白来源于鱼类成熟精子；优选为鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼、三文鱼。
鱼精蛋白为鱼类精子的组蛋白，其结构序列稳定。
鱼精蛋白和寡核苷酸，未经过化学修饰，或经过至少一种化学修饰；化学修饰优选为硫代修饰、甲基化修饰、乙酰化修饰中的至少一种。
鱼精蛋白上未与配体连接，或与至少一种配体连接；配体优选为磷脂、单糖、糖醛酸、寡糖、多糖、适配子、抗体分子、抗体片段、嵌合抗体、多肽、天然产生的受体表面结合物、小分子化合物中的至少一种。
寡核苷酸灌肠剂的改良鱼精蛋白中，配体与鱼精蛋白的质量比为(8-16)：1；优选为9：1。
寡核苷酸灌肠剂中，改良鱼精蛋白与寡核苷酸的质量比为(0.5-8)：1；优选为4：1。
寡核苷酸灌肠剂中所使用的寡核苷酸选自一种或多种具有抗炎作用的寡核苷酸；优选为JAK1反义核酸，其序列如SEQ ID NO：1-3任一所示。
SEQ ID NO：1：CGCCACTGGATCCCGAGATT；
SEQ ID NO：2：TTGTTCCACTCTTCCCGGAG；
SEQ ID NO：3：CGTCTTGGGGTCCCGAATGG。
本申请还提供了前述一种寡核苷酸灌肠剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.合成/制备改良鱼精蛋白，并将其制备成水溶液；
S2.在寡核苷酸水溶液中边搅拌边逐滴加入改良鱼精蛋白水溶液，静置反应后真空冷冻干燥，得到纳米粒粉末；
S3.将纳米粒粉末溶于生理盐水，得到寡核苷酸灌肠剂。
实施例2
糖类靶向性配基鱼精蛋白的合成
1)透明质酸化鱼精蛋白的合成：
将200mg透明质酸在2ml蒸馏水中搅拌下溶于10ml的圆底烧瓶中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)27.1mg，搅拌10min混匀后加入羧基活化剂N-羟基丁二酰亚胺(NHS)30.7mg，混合搅拌40min。随后，加入25mg的鱼精蛋白，氢氧化钠(NaOH)调pH至8.0，25℃搅拌18h。反应完全后将溶液装入透析袋(MWCO：5000-6000)于去离子中4℃透析48h，然后冷冻干燥除去溶剂，得终产物透明质酸化鱼精蛋白。
2)β-葡聚糖化鱼精蛋白的合成：
将250mgβ-葡聚糖在2ml蒸馏水中搅拌下溶于10ml的圆底烧瓶中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)27.1mg，搅拌10min混匀后加入羧基活化剂N-羟基丁二酰亚胺(NHS)30.7mg，混合搅拌40min。随后，加入25mg的鱼精蛋白，氢氧化钠(NaOH)调PH至8.0，25℃搅拌18h。反应完全后将溶液装入透析袋(截留分子量MWCO：5000-6000)于去离子水中4℃透析48h，然后冷冻干燥除去溶剂，得终产物β-葡聚糖化鱼精蛋白。3)半乳糖化鱼精蛋白的合成：
取鱼精蛋白100mg、乳糖700mg和氰基硼氢化钠500mg放于烧杯中，加入三蒸水200ml，置于37℃恒温水箱中，2小时后，取pH＝8.0的磷酸缓冲溶液将鱼精蛋白乳糖液调至pH为7.4，继续恒温水育120小时，将鱼精蛋白半乳糖液装入透析袋(截留分子量MWCO：5000-6000)，放入三蒸水中透析三天，其间每天更换三蒸水，将透析后液体经葡聚糖凝胶SephedaxG-25柱层析分离，纯化出产品溶液，经冰冻干燥得粉末，即为半乳糖化鱼精蛋白。
实施例3
肽类靶向性配基鱼精蛋白的合成：
1)CD163靶向肽化鱼精蛋白的合成：
取适量CD163靶向结合短肽，溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，以摩尔比1：15的比例加入20mmol/L的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯)-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propio-nate，SPDP)溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入超滤管中离心洗涤3次(6000r/min，8min/次)以除去过量的SPDP，在得到的带吡啶二硫基的CD163靶向结合短肽溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(pH 4.5)，置于4℃冰箱中反应30min后再次经超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到带巯基的CD163靶向结合短肽溶液。
配置1mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液，该溶液与适量的C3F8氟烷气体混合后，应用声振仪(Level5，输出功率20kHz)连续声振60s，声振结束后，获取的微气泡悬液经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗涤，取下层乳白色溶液置于1.5ml无酶离心管中备用。
取硫酸鱼精蛋白微气泡悬液适量，加入20mmoI/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mol/L PBS洗涤，得到带吡啶二硫基的微气泡悬液，立即与步骤1中的溶液混合，4℃冰箱中反应过夜，再次用0.01mol/L PBS洗涤，最终得到CD163靶向短肽结合的鱼精蛋白微气泡悬液，冷冻干燥得CD163靶向短肽化鱼精蛋白。
2)GGP-肽化鱼精蛋白的合成：
取适量GGP-肽，溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，以摩尔比1：15的比例加入20mmol/L的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯)-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propio-nat e，SPDP)溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入超滤管中离心洗涤3次(6000r/min，8min/次)以除去过量的SPDP，在得到的带吡啶二硫基的CD163靶向结合短肽的溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(pH4.5)，置于4℃冰箱中反应30min后再次经超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到带巯基的GGP-肽溶液。
配置1mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液，该溶液与适量的C3F8氟烷气体混合后，应用声振仪(Level5，输出功率20kHz)连续声振60s，声振结束后，获取的微气泡悬液经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗涤，取下层乳白色溶液置于1.5ml无酶离心管中备用。
取硫酸鱼精蛋白微气泡悬液适量，加入20mmoI/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mol/L PBS洗涤，得到带吡啶二硫基的微气泡悬液，立即与步骤1)中的溶液分别混合，4℃冰箱中反应过夜，再次用0.01mol/L PBS洗涤，最终得到靶向肽结合的鱼精蛋白微气泡悬液，冷冻干燥得GGP-肽化鱼精蛋白。
3)RGD肽化鱼精蛋白的合成：
取适量RGD肽，溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，以摩尔比1：15的比例加入20mmol/L的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯)-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propio-nate，SPDP)溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入超滤管中离心洗涤3次(6000r/min，8min/次)以除去过量的SPDP，在得到的带吡啶二硫基的CD163靶向结合短肽的溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(pH4.5)，置于4℃冰箱中反应30min后再次经超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到带巯基的RGD肽溶液。
配置1mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液，该溶液与适量的C3F8氟烷气体混合后，应用声振仪(Level5，输出功率20kHz)连续声振60s，声振结束后，获取的微气泡悬液经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗涤，取下层乳白色溶液置于1.5ml无酶离心管中备用。
取硫酸鱼精蛋白微气泡悬液适量，加入20mmoI/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mol/LPBS洗涤，得到带吡啶二硫基的微气泡悬液，立即与步骤1)中的溶液分别混合，4℃冰箱中反应过夜，再次用0.01mol/LPBS洗涤，最终得到靶向肽结合的鱼精蛋白微气泡悬液，冷冻干燥得RGD肽化鱼精蛋白。
4)免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白的合成：
取适量化学合成的免疫球蛋白Fc段肽，溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，以摩尔比1：15的比例加入20mmol/L的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯)-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propio-nat e，SPDP)溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入超滤管中离心洗涤3次(6000r/min，8min/次)以除去过量的SPDP，在得到的带吡啶二硫基的CD163靶向结合短肽的溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(pH4.5)，置于4℃冰箱中反应30min后再次经超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到带巯基的免疫球蛋白Fc段肽溶液。
配置1mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液，该溶液与适量的C3F8氟烷气体混合后，应用声振仪(Level5，输出功率20kHz)连续声振60s，声振结束后，获取的微气泡悬液经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗涤，取下层乳白色溶液置于1.5ml无酶离心管中备用。
取硫酸鱼精蛋白微气泡悬液适量，加入20mmoI/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mol/LPBS洗涤，得到带吡啶二硫基的微气泡悬液，立即与步骤1)中的溶液分别混合，4℃冰箱中反应过夜，再次用0.01mol/LPBS洗涤，最终得到靶向肽结合的鱼精蛋白微气泡悬液，冷冻干燥得免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白。
实施例4
天然表面受体结合物化鱼精蛋白：
1)叶酸化鱼精蛋白的制备：
将叶酸100mg溶于二甲基亚砜(DMSO)5mL中，加入缩水剂乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDAC)80mg和羧基活化剂N-羟基丁二酰亚胺(NHS)50mg，冰浴下搅拌反应2h，然后取出于室温下继续搅拌反应8h，将DMSO溶液缓慢加入到硫酸鱼精蛋白水溶液(1mg/mL，20ml，pH＝8.0)中，室温下搅拌反应10h。将反应产物取出装入透析袋(MWCO：5000-6000)于去离子水中透析2d。将透析后的反应产物冷冻离心(10000r/min，5min，4℃)，取上清液，冻干保存。反应全程严格避光。
2)叶酸缀合物叶酸-聚乙二醇-活性酯化鱼精蛋白的制备：
将叶酸-聚乙二醇-活性酯500mg和鱼精蛋白100mg溶于5ml pH 9.0的硼砂缓冲液中，25摄氏度反应40min，产物先通过凝胶过滤柱子脱盐，柱层析填料为Sephadex-G75。将脱盐后的第一个峰搜集，并用透析袋和PEG6000进行浓缩，浓缩后的蛋白质溶液上样于阳离子树脂CM-sepharose CL-6B，收集第二个峰的样品，冷冻干燥即得叶酸-聚乙二醇-活性酯化鱼精蛋白。
实施例5
磷酯化鱼精蛋白的制备：
1)磷脂酰丝氨酸化鱼精蛋白的制备：
将1ml磷脂酰丝氨酸(10mg/ml)与1ml硫酸鱼精蛋白(100mg/ml)加入到13ml蒸馏水中，室温搅拌混匀，95℃恒温水浴搅拌24h。反应完全后将溶液装入透析袋(MWCO：5000-6000)于去离子中4℃透析48h，然后冷冻干燥除去溶剂，得终产物磷脂酰丝氨酸化鱼精蛋白。
2)磷脂酰丝氨酸衍生物二硬酯酰磷脂酰丝氨酸化鱼精蛋白的制备：
将1ml二硬酯酰磷脂酰丝氨酸(15mg/ml)与1ml硫酸鱼精蛋白(100mg/ml)加入到13ml蒸馏水中，室温搅拌混匀，95℃恒温水浴搅拌24h。反应完全后将溶液装入透析袋(MWCO：5000-6000)于去离子水中4℃透析48h，然后冷冻干燥除去溶剂，得终产物二硬酯酰磷脂酰丝氨酸化鱼精蛋白。
实施例6
改良鱼精蛋白与核酸复合纳米粒的制备：
以具有抗炎作用的寡核苷酸——JAK1反义核酸为例进行复合纳米粒的制备，反义核酸的序列如SEQ ID NO：1所示(考虑到篇幅限制，只是以此序列为例，并不代表限制其它具有类似功能的反义核酸的保护，如实施例1中的SEQ ID NO：2-3等序列具有同样或相近的操作和效果)。
SEQ ID NO：1：CGCCACTGGATCCCGAGATT。
将寡核苷酸水溶液(1mg/mL)(由上海生工生物工程股份有限公司合成)在搅拌下逐滴加入4倍体积的实施例2至实施例5中合成的改良鱼精蛋白水溶液(1mg/ml)，25℃下静置2小时，以形成改良鱼精蛋白与寡核苷酸的质量比为4：1的纳米粒溶液。将上述纳米粒溶液置于真空冷冻干燥机抽干，得到改良鱼精蛋白和寡核苷酸自组装的纳米粒粉末。
实施例7
制备改良鱼精蛋白与寡核苷酸复合纳米粒的灌肠剂：
称取实施例6中纳米粒粉末溶于生理盐水，制备得到灌肠剂(核酸药物浓度1mg/ml)。
实施例8
改良鱼精蛋白与JAK1核酸复合纳米粒的对炎症状态巨噬细胞的治疗效果：
使用LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)作为阳性对照试剂，在24孔板培养细胞用于转染ASO。选用序列SEQ ID NO：1作为模式JAK1的ASO，配置A液：用100μl不含血清的Opi-MEM培养基(gibco)稀释JAK1反义寡聚核苷酸，终浓度为50nM和200nM，混匀，每组设置三孔。配置B液：取2μl LipofectamineTM2000稀释到100μl的Opi-MEM培养基中，轻轻混匀后在室温下孵育5min后按每孔200μl加入到预先加入300μl Opi-MEM培养基的孔板中。37℃，5％CO2培养箱孵育6h，更换含10％胎牛血清的培养基继续培养24h。提取细胞的RNA使用反转录聚合酶链式反应测定mRNA表达量。
评价实施例2-5中合成的鱼精蛋白制备的改良鱼精蛋白与核酸复合纳米粒对于炎症状态巨噬细胞中JAK1的抑制作用，以未经化学修饰的鱼精蛋白作为阴性对照，如图2所示，以未处理细胞、仅核酸组(图中ASO)、未修饰鱼精蛋白作为对照组，未修饰鱼精蛋白也有一定作用，但是修饰之后效果会大幅提升。
配置A液：用100μl不含血清的Opi-MEM培养基(gibco)稀释JAK1反义寡聚核苷酸，终浓度为50nM和200nM，混匀，每组设置三孔。配置B液：取2μl 1mg/ml改良鱼精蛋白或未经修饰的鱼精蛋白稀释到100μl的Opi-MEM培养基中，轻轻混匀后在室温下孵育5min后按每孔200μl加入到预先加入300μl Opi-MEM培养基的孔板中。37℃，5％CO2培养箱孵育6h，更换含10％胎牛血清的培养基继续培养24h。提取细胞的RNA使用反转录聚合酶链式反应测定mRNA表达量。
结果如图2所示，表明改良鱼精蛋白可以显著提高ASO对炎症状态噬细胞中JAK1的抑制作用，其中以免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白为最优。
实施例9
小鼠肠炎模型的构建和寡核苷酸灌肠剂的治疗效果：
1)从集萃药康获得36只10-12周龄、体重35-45g的正常雄性C57BL/6J雄性小鼠。将小鼠随机分成3组(每组12只动物)，并以每笼2-3只圈养，把小鼠安置在南京大学的动物中心。并在进入研究前适应环境至少三天。动物室设置为每小时保持最少12至15次换气，自动计时器开启/关闭12小时的明/暗循环，给小鼠饮用正常无菌水。
2)模型建立：采用回肠储袋肛管吻合手术(IPAA)，术前禁食24h，并给予0.9％氯化钠与5％葡萄糖(1：1)的溶液自由饮用，使用300mg/kg剂量10％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，腹正中切口3cm，用自备消毒干净的小拉钩暴露肠管。寻找回盲部，游离回肠末端血管，用8-0缝合线结扎并剪断血管，随后结扎末端回肠并剪断。在回盲部系膜内寻找右半结肠血管，结扎后剪断血管，之后沿着结肠走向由近端向远端依次结扎血管，剪断系膜，在分离到直肠处距离肛缘1cm切断肠管，牵引残留直肠。无菌剪剪开末段回肠对系膜缘3cm切口，行锁边缝合进行后壁缝合。完全缝合后壁后，再用浸润生理盐水的棉签对合前壁缝合，最终留8-10mm肠壁用于与直肠残端的吻合，以此方法制成J形结肠。将残留的直肠两侧壁对准至结肠开口两侧壁，均以8-0显微线锁边缝，先吻合后壁再吻合前壁。结肠吻合结束后从肛门注水检查结肠是否缝合完整。之后用4-0丝线分两层进行逐层关腹腹肌筋膜和皮肤，伤口再次消毒后放入鼠笼，术后恢复30日后，分为3组：IPAA组、IPAA+DSS组、IPAA+DSS+灌肠剂组，其中IPAA组给予纯净水、IPAA+DSS组给予每日4％ DSS溶液100ml饮用，IPAA+DSS+灌肠剂组给予：每日4％ DSS溶液100ml饮用以及灌肠剂2ml内含核酸药物(5mg/kg)每日处理。在分组第5天处死小鼠，DSS为葡聚糖硫酸钠。
3)样本获取及炎症评估：
模型建立过程中称取小鼠体重，观察小鼠粪便情况，评分指标如下：正常的粪便评分为5分，大便松散不成形评分4分，粪便呈糊状稀便为3分，表现为腹泻样稀便为2分，1分为少量稀便。
取结肠组织，4％多聚甲醛固定，进行HE染色并进行组织病理学评分，评分标注如下：
糜烂情况：0分-无糜烂，1分-灶性糜烂，2分-多处糜烂，3分-广泛糜烂；
溃疡范围：0分-无溃疡，1分-灶性溃疡，2分-多处溃疡，3分-广泛溃疡；
溃疡深度：1分-浸润到黏膜上层1/2，2分-全黏膜层，3分侵及肌层或超出肌层；绒毛萎缩程度：0分-无萎缩，1分-轻度萎缩，2分-中度萎缩，3分-重度萎缩；固有层水肿情况：0分-不存在，1分-存在。
4)结果：
服用本发明中免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白制备的寡核苷酸灌肠剂显著缓解小鼠结肠炎症状，挽救了小鼠结肠炎导致的体重减轻，服药小鼠结肠粪便和组织病理学评分显著降低，表明本发明制备的灌肠剂对于小鼠结肠炎具有良好的治疗效果。
采用实施例方法制备得到的免疫球蛋白Fc段肽化改良鱼精蛋白与JAK1反义核酸不同配比形成的复合物体外治疗效果如下表1-表2所示。
表1显示为改良鱼精蛋白与JAK1反义核酸不同配比形成的复合物体外治疗后的JAK1 mRNA相对表达量。
表1
| 细胞培养条件 | 组别1 | 组别2 | 组别3 | 平均值 |
| 0ng/ml LPS | 1.02 | 1.03 | 0.99 | 1.01 |
| 100ng/ml LPS | 3.98 | 3.79 | 3.83 | 3.87 |
| 100ng/ml LPS+药物(0.5：1) | 2.56 | 2.66 | 2.58 | 2.6 |
| 100ng/ml LPS+药物(1：1) | 2.34 | 2.41 | 2.23 | 2.33 |
| 100ng/ml LPS+药物(2：1) | 1.96 | 1.78 | 2.02 | 1.92 |
| 100ng/ml LPS+药物(3：1) | 2.01 | 2.31 | 2.24 | 2.19 |
| 100ng/ml LPS+药物(4：1) | 1.83 | 1.67 | 2.54 | 2.01 |
| 100ng/ml LPS+药物(5：1) | 1.92 | 1.86 | 1.99 | 1.92 |
| 100ng/ml LPS+药物(6：1) | 2.03 | 2.04 | 1.98 | 2.02 |
| 100ng/ml LPS+药物(7：1) | 2.01 | 1.97 | 1.95 | 1.98 |
| 100ng/ml LPS+药物(8：1) | 2.12 | 1.96 | 1.99 | 2.02 |
表1中，JAK1 mRNA表达量数值为经归一化处理后的相对表达量，以β-actin为内参照。显著性差异通过Student's t-test加以确定。*代表P≤0.05，与100ng/ml LPS组比较。
表2显示为改良鱼精蛋白与JAK1反义核酸不同配比形成的复合物体外治疗后的JAK1蛋白表达量。
表2
| 组别 | 1 | 2 | 3 | 平均值 |
| 0ng/ml LPS | 3.98 | 3.79 | 3.83 | 3.87 |
| 100ng/ml LPS | 875.56 | 862.66 | 894.58 | 877.60* |
| 100ng/ml LPS+药物(0.5：1) | 657.34 | 689.41 | 698.23 | 681.66* |
| 100ng/ml LPS+药物(1：1) | 578.96 | 534.78 | 524.02 | 545.92* |
| 100ng/ml LPS+药物(2：1) | 412.01 | 437.31 | 423.24 | 424.19* |
| 100ng/ml LPS+药物(3：1) | 457.83 | 486.67 | 491.54 | 478.68* |
| 100ng/ml LPS+药物(4：1) | 465.92 | 477.86 | 493.99 | 479.26* |
| 100ng/ml LPS+药物(5：1) | 422.03 | 437.04 | 418.98 | 426.02* |
| 100ng/ml LPS+药物(6：1) | 496.01 | 454.97 | 433.95 | 461.64* |
| 100ng/ml LPS+药物(7：1) | 476.12 | 457.96 | 437.99 | 457.36* |
| 100ng/ml LPS+药物(8：1) | 436.12 | 459.96 | 467.99 | 454.69 |
表2中，单位为pg/ml。其中，JAK1 mRNA蛋白表达量显著性差异通过Student's t-test加以确定。*代表P≤0.05，与100ng/ml LPS组比较。
表3显示为三个试验组的小鼠体重变化。
表3
| IPAA组 | IPAA+DSS组 | IPAA+DSS+灌肠剂组 | |
| 体重变化(g) | 36.4±7.2 | 32.59±10.2 | 35.5±6.3* |
表3中，数据均以平均值±标准差的形式加以显示，显著性差异通过ANOVA检验加以确定。*代表P≤0.05，与IPAA+DSS组比较。
表4显示为三个试验组的小鼠粪便评分。
表4
| IPAA组 | IPAA+DSS组 | IPAA+DSS+灌肠剂组 | |
| 粪便评分 | 3.2±0.5 | 1.7±0.4 | 2.5±0.3* |
表4中，数据均以平均值±标准差的形式加以显示，显著性差异通过ANOVA检验加以确定。*代表P≤0.05，与IPAA+DSS组比较。
表5显示为三个试验组小鼠组织病理评分。
表5
| IPAA组 | IPAA+DSS组 | IPAA+DSS+灌肠剂组 | |
| 组织学评分 | 1.3±0.4 | 6.3±0.5 | 3.5±0.5* |
表5中，数据均以平均值±标准差的形式加以显示，显著性差异通过ANOVA检验加以确定。*代表P≤0.05，与IPAA+DSS组比较。
表6显示为靶向JAK1基因反义核酸与改良鱼精蛋白复合药物灌肠剂用于小鼠结肠炎治疗的效果。
表6
| 体重变化(g) | 粪便评分 | 组织学评分 | |
| IPAA组 | 36.0±5.4 | 3.2±0.6 | 1.5±0.3 |
| IPAA+DSS组 | 31.2±9.3 | 1.2±0.5 | 6.4±0.5 |
| IPAA+DSS+灌肠剂组(β-葡聚糖化修饰) | 35.3±5.3* | 2.9±0.3* | 4.1±0.3* |
| IPAA+DSS+灌肠剂组(CD163靶向肽化修饰) | 35.6±4.6* | 2.3±0.6* | 4.3±0.3* |
| IPAA+DSS+灌肠剂组(叶酸化修饰) | 35.0±3.1* | 3.1±0.2* | 4.2±0.3* |
| IPAA+DSS+灌肠剂组(磷脂酰丝氨酸化修饰) | 35.3±3.2* | 2.0±0.3* | 3.6±0.2* |
表6中，数据均以平均值±标准差的形式加以显示，显著性差异通过ANOVA检验加以确定。*代表P≤0.05，均与IPAA+DSS组比较。
实施例10
改良鱼精蛋白与JAK1基因反义核酸配比的筛选：
称取免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白，以超纯水制备为1mg/ml的溶液；JAK1基因反义核酸以超纯水制备为1mg/ml的溶液；取1μl JAK1基因反义核酸，分别取0.5μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl以配置质量比范围0.5-8:1的溶液。37℃孵育30min，以120V电压进行核酸电泳，表征复合物的结合状态；以马尔文粒径仪表征复合物粒径。
基于现有研究中核酸药物的粒径对其最终效果会产生较大影响，申请人选择以最终产品复合物的粒径对比表征出不同质量比之间的差别。现有技术已经有多篇相关文献记载过粒径对于核酸药物作用的影响，例如《Size-dependent intracellularimmunotargeting of therapeutic cargoes into endothelial cells》(RainerWiewrodt等)以及《Endocytosis at the nanoscale》(Irene Canton，GiuseppeBattaglia)等，其中公开了粒径对于核酸药物的发挥作用起到了至关重要的作用。故此，本实施例中选择测定不同质量比制备的核酸药物的粒径，并以粒径最接近100nm为最优标准，判定最优选的质量比，最终结果呈现如图3所示。
图3显示，当质量比4：1时尺寸最小，效果达到最佳。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种寡核苷酸灌肠剂，其特征在于，所述灌肠剂包括有改良鱼精蛋白和寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸灌肠剂，其特征在于，所述改良鱼精蛋白是通过物理作用或通过化学反应将配体与鱼精蛋白连接得到的。
3.根据权利要求2所述的一种寡核苷酸灌肠剂，其特征在于，所述物理作用包括但不限于电荷相互作用、配位相互作用；所述化学反应包括但不限于使用以连接为目的的化学试剂分别与鱼精蛋白和配体进行反应。
4.根据权利要求3所述的一种寡核苷酸灌肠剂，其特征在于，所述鱼精蛋白来源于鱼类成熟精子；优选为鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼、三文鱼。
5.根据权利要求4所述的一种寡核苷酸灌肠剂，其特征在于，所述鱼精蛋白和寡核苷酸，未经过化学修饰，或经过至少一种化学修饰；所述化学修饰优选为硫代修饰、甲基化修饰、乙酰化修饰中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的一种寡核苷酸灌肠剂，其特征在于，所述鱼精蛋白上未与配体连接，或与至少一种配体连接；所述配体优选为磷脂、单糖、糖醛酸、寡糖、多糖、适配子、抗体分子、抗体片段、嵌合抗体、多肽、天然产生的受体表面结合物、小分子化合物中的至少一种。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种寡核苷酸灌肠剂，其特征在于，所述灌肠剂的改良鱼精蛋白中，配体与鱼精蛋白的质量比为(8-16)：1；优选为9：1。
8.根据权利要求7所述的一种寡核苷酸灌肠剂，其特征在于，所述灌肠剂中，改良鱼精蛋白与寡核苷酸的质量比为(0.5-8)：1；优选为4：1。
9.根据权利要求8所述的一种寡核苷酸灌肠剂，其特征在于，所述寡核苷酸选自一种或多种具有抗炎作用的寡核苷酸；优选为JAK1反义核酸。
10.权利要求1-9任意一项所述的一种寡核苷酸灌肠剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.合成/制备改良鱼精蛋白，并将其制备成水溶液；
S2.在寡核苷酸水溶液中边搅拌边逐滴加入改良鱼精蛋白水溶液，静置反应后真空冷冻干燥，得到纳米粒粉末；
S3.将纳米粒粉末溶于生理盐水，得到寡核苷酸灌肠剂。
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