CN117919207A - 一种寡核苷酸口服制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN117919207A CN202311863737.1A CN202311863737A CN117919207A CN 117919207 A CN117919207 A CN 117919207A CN 202311863737 A CN202311863737 A CN 202311863737A CN 117919207 A CN117919207 A CN 117919207A
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张峻峰
董磊
黄振
陈江宁
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Nanjing University
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Abstract

本申请提供了一种寡核苷酸口服制剂，所述口服制剂包括有改良鱼精蛋白和寡核苷酸；并提供了其制备方法和应用。与现有技术相对比，本申请具有以下优点：本发明提供了一种寡核苷酸口服制剂及其制备方法，将具有抗炎作用的反义寡聚核苷酸序列制作为口服制剂，口服制剂可与肠道组织充分接触。此外，本发明将口服制剂中的组分鱼精蛋白，通过化学反应合成改良鱼精蛋白，使其具有巨噬细胞的靶向性配基，肠道吸收后可特异性的作用于巨噬细胞，避免了注射给药造成的全身性免疫抑制，为溃疡性结肠炎及其相关并发症治疗提供了一种新的治疗途径。

Description

一种寡核苷酸口服制剂及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及生物制药技术领域，具体涉及一种寡核苷酸口服制剂及其制备方法和应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)作为炎症性肠病的亚型之一，是一种慢性的，易复发的胃肠道炎症性疾病。我国现有的流行病学资料统计数据显示，溃疡性结肠炎患病率、发病率均呈上升趋势，已成为我国的常见病和多发病。UC病因和发病机制比较复杂，其诊断和治疗都相当棘手，现有治疗手段很难将其完全治愈，同时也增加了患者罹患结直肠癌的风险，严重危害患者的生命健康。
在肠道炎症期间，巨噬细胞表现出促炎表型并分泌趋化因子和促炎细胞因子，包括肿瘤坏死因子(TNF)α、白细胞介素(IL)-6、IL-12和IL-23等，在肠道部位阻断炎症因子的功能可以缓解UC患者肠道炎症。目前，针对炎症因子的小分子抑制剂和抗体等已经被广泛用于溃疡性结肠炎的治疗。已经上市的药物托法替尼已被投入到炎症性肠病的治疗中。但是使用炎症因子抑制剂治疗存在一些安全隐患，包括白细胞数量减少，从而导致严重感染、恶性肿瘤的风险增加。主要是由于抑制炎症因子的同时也抑制了宿主防御功能而引起全身性免疫抑制。
核酸药物包括反义核酸(ASO)，干扰RNA和微小RNA等，作为一种新型的抑制基因表达的技术，给肠炎、肠癌等疾病治疗带来了新的契机和全新的治疗理念。核酸药物已被广泛用于肠炎、肠癌及其并发症的模型治疗研究，并取得了较好的效果，但目前临床尚无获批案例，限制核酸药物应用于肠炎治疗的关键瓶颈是其体内输送问题。
近年来，基于不同种类的生物材料制备的给药系统为核酸药物的体内传输提供了新的方式和途径，比如脂质体，聚乙烯亚胺，聚乳酸-羟基乙酸共聚物等。但是，传统的给药系统存在着制备过程复杂，制备条件要求较高，制备要求仪器较为昂贵，从而导致生产成本较高的缺点。
发明内容
针对上述存在的技术局限性，本申请提出了一种寡核苷酸口服制剂及其制备方法和应用；其克服了背景技术中提到的不足和缺陷。
为实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的发明点是提供一种寡核苷酸口服制剂，所述口服制剂包括有改良鱼精蛋白和寡核苷酸。
可选地，上述的一种寡核苷酸口服制剂，所述改良鱼精蛋白是通过物理作用或通过化学反应将配体与鱼精蛋白连接得到的。
可选地，上述的一种寡核苷酸口服制剂，所述物理作用包括但不限于电荷相互作用(静电作用)、配位相互作用；所述化学反应包括但不限于使用以连接为目的的化学试剂分别与鱼精蛋白和配体进行反应。
改良鱼精蛋白与寡核苷酸能够通过静电作用自发组装形成纳米粒，纳米粒粒径为80nm-500nm；改良鱼精蛋白为巨噬细胞靶向性配基(配体)修饰的鱼精蛋白。
可选地，上述的一种寡核苷酸口服制剂，所述鱼精蛋白来源于鱼类成熟精子；优选为鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼、三文鱼。
鱼精蛋白为鱼类精子的组蛋白，其结构序列稳定。
可选地，上述的一种寡核苷酸口服制剂，所述鱼精蛋白和寡核苷酸，未经过化学修饰，或经过至少一种化学修饰；所述化学修饰优选为硫代修饰、甲基化修饰、乙酰化修饰中的至少一种。
可选地，上述的一种寡核苷酸口服制剂，所述鱼精蛋白上未与配体连接，或与至少一种配体连接；所述配体优选为磷脂、单糖、糖醛酸、寡糖、多糖、适配子、抗体分子、抗体片段、嵌合抗体、多肽、天然产生的受体表面结合物、小分子化合物中的至少一种。
可选地，上述的一种寡核苷酸口服制剂，所述口服制剂的改良鱼精蛋白中，配体与鱼精蛋白的质量比为(8-16)：1；优选为9：1。
可选地，上述的一种寡核苷酸口服制剂，所述口服制剂中，改良鱼精蛋白与寡核苷酸的质量比为(0.5-8)：1；优选为4：1。
可选地，上述的一种寡核苷酸口服制剂，所述寡核苷酸选自一种或多种具有抗炎作用的寡核苷酸；优选为TNF-α反义核酸，其序列如SEQ ID NO：1-3任意一项所示。
SEQ ID NO：1：AGGGAGATGTGGCGCCTTGG；
SEQ ID NO：2：GGGAGGCCATTTGGGAACTT；
SEQ ID NO：3：CTACAGGCTTGTCGTGAGGGT。
本申请的第二个发明点是提供了前述一种寡核苷酸口服制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.合成/制备改良鱼精蛋白，并将其制备成水溶液；
S2.在寡核苷酸水溶液中边搅拌边逐滴加入改良鱼精蛋白水溶液，静置反应后真空冷冻干燥，得到纳米粒粉末；
S3.将纳米粒粉末装载于肠溶衣胶囊，得到寡核苷酸口服制剂。
与现有技术相对比，本申请具有以下优点：
本发明提供了一种寡核苷酸口服制剂及其制备方法和应用，将具有抗炎作用的反义寡聚核苷酸序列制作为口服制剂，口服制剂可与肠道组织充分接触。此外，本发明将口服制剂中的组分鱼精蛋白，通过化学反应合成改良鱼精蛋白，使其具有巨噬细胞的靶向性配基，肠道吸收后可特异性的作用于巨噬细胞，避免了注射给药造成的全身性免疫抑制，为溃疡性结肠炎及其相关并发症治疗提供了一种新的治疗途径。
附图说明
图1显示为以TNFαmRNA相对表达量体现出的改良鱼精蛋白与TNFα核酸复合纳米粒对炎症状态巨噬细胞的治疗效果。
图2显示为本申请一实施例中，以马尔文粒径仪表征复合物粒径，确定了改良鱼精蛋白(免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白)与反义核酸(SEQ ID NO：1)采用不同质量比情况下的粒径差别。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本申请进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本申请，并不用于限制本申请的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本申请。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。
为了进一步了解本申请，下面结合最佳实施例对本申请作进一步的详细说明。
实施例1
一种寡核苷酸口服制剂，包括有改良鱼精蛋白和寡核苷酸。
改良鱼精蛋白是通过物理作用或通过化学反应将配体与鱼精蛋白连接得到的。
物理作用包括但不限于电荷相互作用(静电作用)、配位相互作用；化学反应包括但不限于使用以连接为目的的化学试剂分别与鱼精蛋白和配体进行反应。
改良鱼精蛋白与寡核苷酸能够通过静电作用自发组装形成纳米粒，纳米粒粒径为80nm-500nm；改良鱼精蛋白为巨噬细胞靶向性配基(配体)修饰的鱼精蛋白。
鱼精蛋白来源于鱼类成熟精子；优选为鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼、三文鱼。
鱼精蛋白为鱼类精子的组蛋白，其结构序列稳定。
鱼精蛋白和寡核苷酸，未经过化学修饰，或经过至少一种化学修饰；化学修饰优选为硫代修饰、甲基化修饰、乙酰化修饰中的至少一种。
鱼精蛋白上未与配体连接，或与至少一种配体连接；配体优选为磷脂、单糖、糖醛酸、寡糖、多糖、适配子、抗体分子、抗体片段、嵌合抗体、多肽、天然产生的受体表面结合物、小分子化合物中的至少一种。
寡核苷酸口服制剂的改良鱼精蛋白中，配体与鱼精蛋白的质量比为(8-16)：1；优选为9：1。
寡核苷酸口服制剂中，改良鱼精蛋白与寡核苷酸的质量比为(0.5-8)：1；优选为4：1。
寡核苷酸口服制剂中所使用的寡核苷酸选自一种或多种具有抗炎作用的寡核苷酸；优选为TNF-α反义核酸，其序列如SEQ ID NO：1-3任意一项所示。
SEQ ID NO：1：AGGGAGATGTGGCGCCTTGG；
SEQ ID NO：2：GGGAGGCCATTTGGGAACTT；
SEQ ID NO：3：CTACAGGCTTGTCGTGAGGGT。
本申请还提供了前述一种寡核苷酸口服制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.合成/制备改良鱼精蛋白，并将其制备成水溶液；
S2.在寡核苷酸水溶液中边搅拌边逐滴加入改良鱼精蛋白水溶液，静置反应后真空冷冻干燥，得到纳米粒粉末；
S3.将纳米粒粉末装载于肠溶衣胶囊，得到寡核苷酸口服制剂。
制备方法具体为，胶囊芯材为改良鱼精蛋白和核酸通过静电作用自发组装形成的纳米粒，纳米粒的粒径范围在80纳米至500纳米之间，改良鱼精蛋白与核酸的质量比为0.5：1至8：1，优选质量比为4：1。改良鱼精蛋白为巨噬细胞靶向性配基修饰的鱼精蛋白，鱼精蛋白来源于鱼类成熟精子，核酸为TNF-α反义寡核苷酸，由DNA合成仪按照序列合成。将改良鱼精蛋白与核酸在水溶液中自发组装形成的纳米粒经冷冻干燥后包装于肠溶衣胶囊壳即得口服结肠靶向胶囊，可用于炎症性肠病的治疗，在结肠部位定点释放药物，经肠道吸收后特异性作用于肠道巨噬细胞，阻断肠道部位TNF-α的合成，治疗肠道炎症。
药物在结肠部位的定点释放依赖于结肠肠溶衣壳，肠溶衣壳保护药物避免胃酸以及在无病变部位，即胃部到结肠之间的肠道中被破坏，当肠溶衣壳到达结肠后将溶解释放出其中包裹的药物，药物本身的靶向配基并不影响肠溶衣壳的特性，靶向配基的作用在于，当装载了靶向配基的鱼精蛋白和核酸的复合物在肠道释放后，这一靶向性配基能提高巨噬细胞对复合物的摄取，从而提高了药物进入巨噬细胞的效率。
实施例2
改良鱼精蛋白根据所复合的靶向性配基，各自具有其合成途径，下述实现靶向性配基与鱼精蛋白复合方式仅为合成示例，不代表所有的合成方式，但不应被视作对这项发明的制备途径的限定。
一、当靶向性配基为糖类时，采用如下反应制备糖类靶向性配基(Biomacromolecules 2008，9，1146-1154)：
1、在一些实施方式中，糖类可以是与CD44结合的透明质酸，透明质酸可靶向巨噬细胞表面β7-整合素受体(β7-integrin receptor)。
糖类也可以是β-葡聚糖，可以与巨噬细胞表面模式识别受体Dectin-1特异性结合。
糖类还可以是半乳糖，可以与巨噬细胞表面半乳糖受体靶向性结合。
2、透明质酸化鱼精蛋白的合成：
将200mg透明质酸在2ml蒸馏水中搅拌下溶于10mL的圆底烧瓶中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)27.1mg，搅拌10min混匀后加入羧基活化剂N-羟基丁二酰亚胺(NHS)30.7mg，混合搅拌40min。随后，加入25mg的鱼精蛋白，氢氧化钠(NaOH)调PH至8.0，25℃搅拌18h。反应完全后将溶液装入透析袋(截留分子量MWCO：5000-6000)于去离子水中4℃透析48h，然后冷冻干燥除去溶剂，得终产物透明质酸化鱼精蛋白。
3、β-葡聚糖化鱼精蛋白的合成：
将250mgβ-葡聚糖在2ml蒸馏水中搅拌下溶于10mL的圆底烧瓶中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)27.1mg，搅拌10min混匀后加入羧基活化剂N-羟基丁二酰亚胺(NHS)30.7mg，混合搅拌40min。随后，加入25mg的鱼精蛋白，氢氧化钠(NaOH)调PH至8.0，25℃搅拌18h。反应完全后将溶液装入透析袋(截留分子量MWCO：5000-6000)于去离子水中4℃透析48h，然后冷冻干燥除去溶剂，得终产物β-葡聚糖化鱼精蛋白。
4、半乳糖化鱼精蛋白的合成：
取鱼精蛋白100mg、乳糖700mg和氰基硼氢化钠500mg放于烧杯中，加入三蒸水200ml，置于37℃恒温水箱中，2小时后，取PH＝8.0的磷酸缓冲溶液将鱼精蛋白乳糖液调至PH为7.4，继续恒温水育120小时，将鱼精蛋白半乳糖液装入透析袋(截留分子量MWCO：5000-6000)，放入三蒸水中透析三天，其间每天更换三蒸水，将透析后液体经葡聚糖凝胶SephedaxG-25柱层析分离，纯化出产品溶液，经冰冻干燥得粉末，即为半乳糖化鱼精蛋白。
二、当靶向性配基为肽类时，采用SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)交联法制备：
1、在一些实施方式中，
肽类可以是人源化抗体、嵌合抗体、多价抗体、多肽或其片段。
肽类也可以是CD163靶向结合短肽(CTHRSSVVC)(中国专利申请号202010367277.3)，GGPNLTGRW(GGP-肽)(A.Singh等人，Journal of Controlled Release190(2014)515-530)，Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Jain S等人，International Journal ofPharmaceutics.2003；261(1-2)：43-55)。
肽类还可以是免疫球蛋白Fc段，Fc段是指免疫球蛋白重链恒定区，可以来源于IgA、IgD、IgE、IgG及IgM的各免疫球蛋白类别的抗体。此外，免疫球蛋白重链恒定区可以来源于任一IgA、IgD、IgE、IgG及IgM抗体子类，如IgG子类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
2、CD163靶向肽化鱼精蛋白的合成：
1)取适量CD163靶向结合短肽，溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，以摩尔比1：15的比例加入20mmol/L的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯)-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propio-nat e，SPDP)溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入超滤管中离心洗涤3次(6000r/min，8min/次)以除去过量的SPDP，在得到的带吡啶二硫基的CD163靶向结合短肽的溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(pH4.5)，置于4℃冰箱中反应30min后再次经超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到带巯基的CD163靶向结合短肽溶液。
2)配置1mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液，该溶液与适量的C3F8氟烷气体混合后，应用声振仪(Level5，输出功率20kHz)连续声振60S，声振结束后，获取的微气泡悬液经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗涤，取下层乳白色溶液置于1.5ml无酶离心管中备用。
3)取硫酸鱼精蛋白微气泡悬液适量，加入20mmoI/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mol/LPBS洗涤，得到带吡啶二硫基的微气泡悬液，立即与步骤1中的溶液混合，4℃冰箱中反应过夜，再次用0.01mol/LPBS洗涤，最终得到CD163靶向短肽结合的鱼精蛋白微气泡悬液，冷冻干燥得CD163靶向短肽化鱼精蛋白。
3、GGP-肽化鱼精蛋白的合成：
1)取适量GGP-肽，溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，以摩尔比1：15的比例加入20mmol/L的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯)-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propio-nate，SPDP)溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入超滤管中离心洗涤3次(6000r/min，8min/次)以除去过量的SPDP，在得到的带吡啶二硫基的CD163靶向结合短肽的溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(pH4.5)，置于4℃冰箱中反应30min后再次经超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到带巯基的GGP-肽溶液。
2)配置1mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液，该溶液与适量的C3F8氟烷气体混合后，应用声振仪(Level5，输出功率20kHz)连续声振60S，声振结束后，获取的微气泡悬液经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗涤，取下层乳白色溶液置于1.5ml无酶离心管中备用。
3)取硫酸鱼精蛋白微气泡悬液适量，加入20mmoI/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mol/LPBS洗涤，得到带吡啶二硫基的微气泡悬液，立即与步骤1)中的溶液分别混合，4℃冰箱中反应过夜，再次用0.01mol/LPBS洗涤，最终得到靶向肽结合的鱼精蛋白微气泡悬液，冷冻干燥得GGP-肽化鱼精蛋白。
4、RGD肽化鱼精蛋白的合成：
1)取适量RGD肽，溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，以摩尔比1：15的比例加入20mmol/L的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯)-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propio-nate，SPDP)溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入超滤管中离心洗涤3次(6000r/min，8min/次)以除去过量的SPDP，在得到的带吡啶二硫基的CD163靶向结合短肽的溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(pH4.5)，置于4℃冰箱中反应30min后再次经超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到带巯基的RGD肽溶液。
2)配置1mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液，该溶液与适量的C3F8氟烷气体混合后，应用声振仪(Level5，输出功率20kHz)连续声振60S，声振结束后，获取的微气泡悬液经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗涤，取下层乳白色溶液置于1.5ml无酶离心管中备用。
3)取硫酸鱼精蛋白微气泡悬液适量，加入20mmoI/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mol/LPBS洗涤，得到带吡啶二硫基的微气泡悬液，立即与步骤1)中的溶液分别混合，4℃冰箱中反应过夜，再次用0.01mol/LPBS洗涤，最终得到靶向肽结合的鱼精蛋白微气泡悬液，冷冻干燥得RGD肽化鱼精蛋白。
5、免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白的合成：
1)取适量化学合成的免疫球蛋白Fc段肽，溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，以摩尔比1：15的比例加入20mmol/L的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯)-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propio-nate，SPDP)溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入超滤管中离心洗涤3次(6000r/min，8min/次)以除去过量的SPDP，在得到的带吡啶二硫基的CD163靶向结合短肽的溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(pH4.5)，置于4℃冰箱中反应30min后再次经超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到带巯基的免疫球蛋白Fc段肽溶液。
2)配置1mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液，该溶液与适量的C3F8氟烷气体混合后，应用声振仪(Level5，输出功率20kHz)连续声振60S，声振结束后，获取的微气泡悬液经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗涤，取下层乳白色溶液置于1.5ml无酶离心管中备用。
3)取硫酸鱼精蛋白微气泡悬液适量，加入20mmoI/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mol/LPBS洗涤，得到带吡啶二硫基的微气泡悬液，立即与步骤1)中的溶液分别混合，4℃冰箱中反应过夜，再次用0.01mol/LPBS洗涤，最终得到靶向肽结合的鱼精蛋白微气泡悬液，冷冻干燥得免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白。
三、天然表面受体结合物化鱼精蛋白：
1、在一些实施方式中，天然表面受体结合物可以是与叶酸受体结合的天然化合物叶酸或叶酸缀合物。
2、叶酸化鱼精蛋白的制备：
将叶酸100mg溶于二甲基亚砜(DMSO)5mL中，加入缩水剂乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDAC)80mg和羧基活化剂N-羟基丁二酰亚胺(NHS)50mg，冰浴下搅拌反应2h，然后取出于室温下继续搅拌反应8h，将DMSO溶液缓慢加入到硫酸鱼精蛋白水溶液(1mg/mL，20mL，pH＝8.0)中，室温下搅拌反应10h。将反应产物取出装入透析袋(MWCO：5000-6000)于去离子水中透析2d。将透析后的反应产物冷冻离心(10000r/min，5min，4℃)，取上清液，冻干保存。反应全程严格避光。
3、叶酸缀合物叶酸-聚乙二醇化鱼精蛋白的制备：
将叶酸-聚乙二醇-活性酯500mg和鱼精蛋白100mg溶于5ml PH 9.0的硼砂缓冲液中，25℃反应40min，产物先通过凝胶过滤柱子脱盐，柱层析填料为Sephadex-G75。将脱盐后的第一个峰搜集，并用透析袋和PEG6000进行浓缩，浓缩后的蛋白质溶液上样于阳离子树脂CM-sepharose CL-6B，收集第二个峰的样品，冷冻干燥即得叶酸-聚乙二醇化鱼精蛋白。
四、当靶向性配基为磷脂，通过酯化反应制备改良鱼精蛋白。
1、在一些实施方式中，磷脂可以是与磷脂酰丝氨酸受体(PSR)结合的磷脂酰丝氨酸或其衍生物。
2、磷脂酰丝氨酸化鱼精蛋白的制备：
将1ml磷脂酰丝氨酸(10mg/ml)与1ml硫酸鱼精蛋白(100mg/ml)加入到13ml蒸馏水中，室温搅拌混匀，95℃恒温水浴搅拌24h。反应完全后将溶液装入透析袋(MWCO：5000-6000)于去离子水中4℃透析48h，然后冷冻干燥除去溶剂，得终产物磷脂酰丝氨酸化鱼精蛋白。
3、二硬酯酰磷脂酰丝氨酸化鱼精蛋白的制备：
将1ml二硬酯酰磷脂酰丝氨酸(15mg/ml)与1ml硫酸鱼精蛋白(100mg/ml)加入到13ml蒸馏水中，室温搅拌混匀，95℃恒温水浴搅拌24h。反应完全后将溶液装入透析袋(MWCO：5000-6000)于去离子水中4℃透析48h，然后冷冻干燥除去溶剂，得终产物二硬酯酰磷脂酰丝氨酸化鱼精蛋白。
五、改良鱼精蛋白和核酸药物的复合纳米粒：
1)称取TNF-α反义寡核苷酸(由上海赛百盛基因技术有限公司合成)1mg加入到1mL纯净水中，轻微搅拌溶解得1mg/mL TNF-α反义寡核苷酸水溶液；称取改良鱼精蛋白1mg加入到1mL纯净水中搅拌溶解得1mg/mL改良鱼精蛋白水溶液。在搅拌下往TNF-α反义寡核苷酸水溶液中逐滴加入3倍体积的改良鱼精蛋白水溶液，25℃下静置2小时，以形成质量比为3:1的纳米粒溶液。
2)将上述纳米粒溶液置于真空冷冻干燥机抽干，得到改良鱼精蛋白和核酸自组装的纳米粒粉末。
六、装载有改良鱼精蛋白和核酸药物的口服结肠靶向给药胶囊的制备：
称取改良鱼精蛋白和核酸药物的复合纳米粒粉末0.75mg打包成肠溶包衣胶囊(微型胶囊，每个大约5×2.5毫米)。
本实施例所提供的口服结肠靶向给药胶囊用于治疗炎症性肠病，可以输送TNF-α反义寡核苷酸进入结肠部位，经过实验证明，该口服胶囊对炎症性肠病有良好的功效，无不良反应，可减缓葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎，在治疗、缓解或改善炎症性肠病方面具有良好的应用前景。
实施例3
改良鱼精蛋白与TNFα核酸复合纳米粒的对炎症状态巨噬细胞的治疗效果：
使用LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)作为阳性对照试剂，在24孔板培养细胞用于转染ASO。选用序列SEQ ID NO：1作为模式TNFα的ASO，配置A液：用100μl不含血清的Opi-MEM培养基(gibco)稀释TNFα反义寡聚核苷酸，终浓度为50nM和200nM，混匀，每组设置三孔。配置B液：取2μl LipofectamineTM2000稀释到100μl的Opi-MEM培养基中，轻轻混匀后在室温下孵育5min后按每孔200μl加入到预先加入300μl Opi-MEM培养基的孔板中。37℃，5％CO2培养箱孵育6h，更换含10％胎牛血清的培养基继续培养24h。提取细胞的RNA使用反转录聚合酶链式反应测定mRNA表达量。
评价实施例2中合成的鱼精蛋白制备的改良鱼精蛋白与核酸复合纳米粒对于炎症状态巨噬细胞中TNFα的抑制作用，以未经化学修饰的鱼精蛋白作为阴性对照，如图1所示，以未处理细胞、仅核酸组(图中ASO)、未修饰鱼精蛋白作为对照组，未修饰鱼精蛋白也有一定作用，但是修饰之后效果会大幅提升。
配置A液：用100μl不含血清的Opi-MEM培养基(gibco)稀释TNFα反义寡聚核苷酸，终浓度为50nM和200nM，混匀，每组设置三孔。配置B液：取2μl 1mg/ml改良鱼精蛋白或未经修饰的预警蛋白稀释到100μl的Opi-MEM培养基中，轻轻混匀后在室温下孵育5min后按每孔200μl加入到预先加入300μl Opi-MEM培养基的孔板中。37℃，5％CO2培养箱孵育6h，更换含10％胎牛血清的培养基继续培养24h。提取细胞的RNA使用反转录聚合酶链式反应测定mRNA表达量。
结果如图1所示，表明改良鱼精蛋白可以显著提高ASO对炎症状态噬细胞中TNFα的抑制作用，其中以免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白为最优。
实施例4
TNF-α反义核酸的体外治疗效果：
1)从集萃药康公司获得10只5周龄、体重14-19g的正常雄性C57BL6/J小鼠。以每笼5只圈养，把小鼠安置在南京大学的动物中心。并在进入研究前适应环境至少三天。动物室设置为每小时保持最少12至15次换气，自动计时器开启/关闭12小时的明/暗循环，给小鼠饮用正常无菌水。
2)小鼠脱颈处死后浸泡于装有75％酒精的烧杯内，约5分钟。用眼科剪在脚踝处环形切开，剪断跟腱，分离出胫骨末端。向上剪开至大腿根部，摸到髋关节，快速分开股骨和胫骨，并去除肌肉、筋膜，完成粗分离，浸泡于装有5％双抗的PBS的培养皿中，合上盖子，置于冰上。转移至超净台。在含有3％双抗PBS的培养皿内细分离骨头，基本去净骨膜。转移至1％双抗PBS培养皿中浸泡，并吸取充足含1％双抗的DMEM，剪开干骺端，冲洗骨髓腔，冲入新的培养皿中。收集冲洗出来的培养基悬液，1000rpm，5min离心，丢弃上清液，换含20％ FBS、1％双抗、10ng/mL MCSF的高糖DMEM重悬，以1×106个/ml的细胞密度接种于细胞培养皿中，5％ CO2 37℃培养7天得到骨髓源性巨噬细胞(BMDM)。
3)以终浓度为100ng/ml的脂多糖(LPS)处理BMDM得到炎性巨噬细胞，加入合成的免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白核酸复合物孵育20h，鱼精蛋白：核酸质量比为4:1，最终加入的药物量以核酸计算，核酸终浓度为1μg/ml。分别提取细胞的RNA和上清检测TNF-α的mRNA表达量和蛋白表达量。分别使用反转录聚合酶链式反应和酶联免疫吸附剂测定。
鱼精蛋白与TNF-α反义核酸不同配比形成的复合物体外治疗效果如表1和表2所示。
表1显示为TNF-αmRNA相对表达量统计结果。
表1
组别(细胞培养条件) 1 2 3 平均值
0ng/ml LPS 1.12 1.05 0.98 1.05
100ng/ml LPS 4.32 3.87 4.13 4.11
100ng/ml LPS+药物(0.5:1) 3.7 3.64 3.75 3.70*
100ng/ml LPS+药物(1:1) 2.62 2.73 2.65 2.67*
100ng/ml LPS+药物(2:1) 2.14 2.23 2.37 2.25*
100ng/ml LPS+药物(3:1) 1.81 1.84 1.76 1.80*
100ng/ml LPS+药物(4:1) 1.78 1.85 1.77 1.80*
100ng/ml LPS+药物(5:1) 1.82 1.79 1.81 1.81*
100ng/ml LPS+药物(6:1) 1.79 1.83 1.83 1.82*
100ng/ml LPS+药物(7:1) 1.82 1.8 1.81 1.81*
100ng/ml LPS+药物(8:1) 1.76 1.89 1.79 1.81*
表1中，TNF-αmRNA表达量数值为经归一化处理后的相对表达量，以β-actin为内参照。显著性差异通过Student's t-test加以确定。*代表P≤0.05，与100ng/ml LPS组比较。
表2显示为TNF-α蛋白表达量统计结果。
表2
表2中，单位为pg/ml。TNF-αmRNA蛋白表达量显著性差异通过Student'st-test加以确定。*代表P≤0.05，与100ng/ml LPS组比较。
实施例5
改良鱼精蛋白与TNF-α基因反义核酸配比的筛选
称取免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白，以超纯水制备为1 mg/ml的溶液；JAK1基因反义核酸以超纯水制备为1 mg/ml的溶液；取1μl TNF-α基因反义核酸，分别取0.5μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl以配置质量比范围0.5-8:1的溶液。37℃孵育30 min，以120 V电压进行核酸电泳，表征复合物的结合状态；以马尔文粒径仪表征复合物粒径。
基于现有研究中核酸药物的粒径对其最终效果会产生较大影响，申请人选择以最终产品复合物的粒径对比表征出不同质量比之间的差别。现有技术已经有多篇相关文献记载过粒径对于核酸药物作用的影响，例如《Size-dependentintracellularimmunotargeting of therapeutic cargoes into endothelial cells》(RainerWiewrodt等)以及《Endocytosis at the nanoscale》(Irene Canton，GiuseppeBattaglia)等，其中公开了粒径对于核酸药物的发挥作用起到了至关重要的作用。故此，本实施例中选择测定不同质量比制备的核酸药物的粒径，并以粒径最接近100nm为最优标准，判定最优选的质量比，最终结果呈现如图2所示。
图2显示，当质量比4：1时尺寸最小，效果达到最佳。
实施例6
制备改良鱼精蛋白与核酸复合纳米粒的肠溶包衣胶囊剂型：
称取实施例2中纳米粒粉末0.75 mg打包成肠溶包衣胶囊(微型胶囊，每个大约5×2.5毫米)。
实施例7
改良鱼精蛋白与核酸复合纳米粒的肠溶包衣胶囊的释放度分析：
将胶囊浸泡在pH值为1.0的模拟胃液内低速搅拌两小时，然后放入到pH值6.8的磷酸盐缓冲液内45分钟以释放胶囊的内容物。使用HPLC定量核酸的含量。
胶囊药物的释放度结果如表3所示。
表3
制备批次序号 释放度(％)
1 95.7
2 96.0
3 97.8
4 95.9
5 96.9
6 95.7
平均释放度 96.3
实施例8
肠炎动物模型的治疗效果：
1)从集萃药康公司获得36只6-8周龄、体重20-24g的正常雄性BALB/c小鼠。将小鼠随机分成3组(每组12只动物)，并以每笼6-8只圈养，把小鼠安置在南京大学的动物中心。并在进入研究前适应环境至少三天。动物室设置为每小时保持最少12至15次换气，自动计时器开启/关闭12小时的明/暗循环，给小鼠饮用正常无菌水。
2)在雄性Balb/c小鼠中通过从第0天到第5天暴露于3％葡聚糖硫酸钠盐DSS饮用水(MP Biomedicals#0260110)诱导结肠炎。在第3天再次制备新鲜的DSS/水溶液，并丢弃任何剩余的原始DSS溶液。
3)结肠炎的评估：
每天称重所有动物并在给药时目测评估腹泻和/或血便的存在。小鼠接受两次视频内窥镜检查，一次在第5天，一次在第10天，以评估结肠炎的严重程度。从每只动物中在内窥镜检查期间识别的最严重的疾病区域捕获图像，并量规评估(0＝正常，形成良好的颗粒，1＝血管分布损失，2＝血管分布和脆性的损失，3＝脆性和糜烂，4＝溃疡和出血)。此外，在使用该量规的内窥镜检查期间对粪便稠度进行评分(0＝正常，形成良好的颗粒，1＝粪便松散，柔软，保持形状，2＝粪便松散，水分过多的异常形态，3＝水样或腹泻，4＝血性腹泻)。在尸检时，收集肠内容物、外周血和组织以及盲肠/结肠内容物用于分析。
4)结肠炎治疗：
在结肠炎的急性期期间用本发明制备的口服结肠靶向胶囊治疗小鼠，包括未修饰鱼精蛋白、β-葡聚糖化修饰鱼精蛋白、CD163靶向肽化修饰鱼精蛋白、叶酸化修饰鱼精蛋白、磷脂酰丝氨酸化修饰鱼精蛋白制备的的鱼精蛋白药物。从第0天到第10天，给予小鼠一粒本发明制备的口服结肠靶向胶囊，测试品的剂量为0.75mg/20g，以核酸的剂量计算。对照组未给予药物，并且每天施用一粒空胶囊作为安慰剂药物。
5)样品收集：
在第10天在处死时收集肠内容物和组织，如下：在每个研究期结束时，在第10天内窥镜检查后立即通过CO2吸入使小鼠安乐死。
从每只动物中取出盲肠、结肠和直肠，收集内容物并测量结直肠长度，切开结直肠，冲洗。将最近端1cm的结肠快速冷冻，用于随后对测试品水平的生物分析。在剩余的结肠中，将最远端和近端1cm切片置于福尔马林中24小时，然后转移至70％乙醇中用于随后的组织学评估。将中间部分纵向切成两半并放入两个单独的冷冻管中，称重，并在液氮中快速冷冻。
6)结果：
服用本发明制备的口服结肠靶向胶囊显著缓解小鼠结肠炎症状，挽救了小鼠患结肠炎导致的体重减轻，服药小鼠结肠长度更长，疾病活动指数低，表明本发明制备的口服结肠靶向胶囊对于DSS诱导的小鼠结肠炎具有治疗作用。
未修饰和靶向修饰的鱼精蛋白与核酸形成的复合物用于小鼠结肠炎效果如表4和表5所示。
表4显示为未修饰靶向配基鱼精蛋白与核酸复合药物小鼠治疗效果。
表4
正常组 DSS组 DSS+胶囊组
体重变化(g) 20.2±1.5 17.0±1.2 18.7±0.8*
DAI评分 0 5.8±0.7 3.2±0.5*
结直肠长度(cm) 6.2±0.4 3±0.4 4.3±0.3*
肠组织评分 0 5.2±0.4 2.3±0.3*
表4中，数据均以平均值±标准差的形式加以显示，显著性差异通过ANOVA检验加以确定。*代表P≤0.05，与DSS组比较。
表5显示为靶向修饰鱼精蛋白与核酸复合药物小鼠治疗效果。
表5
表5中，数据均以平均值±标准差的形式加以显示，显著性差异通过ANOVA检验加以确定。*代表P≤0.05，均与DSS组比较。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种寡核苷酸口服制剂，其特征在于，所述口服制剂包括有改良鱼精蛋白和寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸口服制剂，其特征在于，所述改良鱼精蛋白是通过物理作用或通过化学反应将配体与鱼精蛋白连接得到的。
3.根据权利要求2所述的一种寡核苷酸口服制剂，其特征在于，所述物理作用包括但不限于电荷相互作用、配位相互作用；所述化学反应包括但不限于使用以连接为目的的化学试剂分别与鱼精蛋白和配体进行反应。
4.根据权利要求3所述的一种寡核苷酸口服制剂，其特征在于，所述鱼精蛋白来源于鱼类成熟精子；优选为鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼、三文鱼。
5.根据权利要求4所述的一种寡核苷酸口服制剂，其特征在于，所述鱼精蛋白和寡核苷酸，未经过化学修饰，或经过至少一种化学修饰；所述化学修饰优选为硫代修饰、甲基化修饰、乙酰化修饰中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的一种寡核苷酸口服制剂，其特征在于，所述鱼精蛋白上未与配体连接，或与至少一种配体连接；所述配体优选为磷脂、单糖、糖醛酸、寡糖、多糖、适配子、抗体分子、抗体片段、嵌合抗体、多肽、天然产生的受体表面结合物、小分子化合物中的至少一种。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种寡核苷酸口服制剂，其特征在于，所述口服制剂的改良鱼精蛋白中，配体与鱼精蛋白的质量比为(8-16)：1；优选为9：1。
8.根据权利要求7所述的一种寡核苷酸口服制剂，其特征在于，所述口服制剂中，改良鱼精蛋白与寡核苷酸的质量比为(0.5-8)：1；优选为4：1。
9.根据权利要求8所述的一种寡核苷酸口服制剂，其特征在于，所述寡核苷酸选自一种或多种具有抗炎作用的寡核苷酸；优选为TNF-α反义核酸。
10.权利要求1-9任意一项所述的一种寡核苷酸口服制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.合成/制备改良鱼精蛋白，并将其制备成水溶液；
S2.在寡核苷酸水溶液中边搅拌边逐滴加入改良鱼精蛋白水溶液，静置反应后真空冷冻干燥，得到纳米粒粉末；
S3.将纳米粒粉末装载于肠溶衣胶囊，得到寡核苷酸口服制剂。
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