CN111575329B - 一种具有c5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用 - Google Patents

一种具有c5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111575329B
CN111575329B CN202010454657.0A CN202010454657A CN111575329B CN 111575329 B CN111575329 B CN 111575329B CN 202010454657 A CN202010454657 A CN 202010454657A CN 111575329 B CN111575329 B CN 111575329B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chondroitin sulfate
oligosaccharide
disaccharide
enzymolysis
osteoarthritis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010454657.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111575329A (zh
Inventor
李连
于宸
权爽
臧恒昌
李妍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN202010454657.0A priority Critical patent/CN111575329B/zh
Publication of CN111575329A publication Critical patent/CN111575329A/zh
Priority to PCT/CN2021/075082 priority patent/WO2021238296A1/zh
Priority to US17/772,359 priority patent/US20220403432A1/en
Application granted granted Critical
Publication of CN111575329B publication Critical patent/CN111575329B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/34—Size selective separation, e.g. size exclusion chromatography, gel filtration, permeation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

本发明提供一种具有C5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用，属于生物医药技术领域。本发明以鱿鱼硫酸软骨素为原料，通过酶解法制备硫酸软骨素寡糖后，利用本方法对各种类型寡糖的活性进行筛选，得到活性最好的片段，方法科学性高、可行性强。本发明进一步利用筛选出的硫酸软骨素二糖，通过体外、体内实验探究并揭示了硫酸软骨素二糖通过调节补体系统治疗骨性关节炎的机制，最终为骨性关节炎的治疗提供一种新的途径，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种具有C5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有C5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一种由于关节软骨机械和生物地降解而形成的尤其是针对老年人的关节退行性疾病，目前其发病率正日益增高且发病群体有着年轻化的趋势，严重影响着患者的健康与生活质量，因此对OA的预防和治疗显得尤为重要。OA的发病机理很复杂，一般认为OA是由于遗传的、代谢的、生化的、生物力学的因素和轻度到中度的炎症共同导致的软骨损害，然而到目前为止，人类尚未找到完全治愈OA的方法。临床使用非甾体类抗炎药(NSAIDs)来减轻患者疼痛，但并不能帮助治愈疾病，反而一些患者使用NSAIDs后会产生胃肠道出血、心血管疾病等强烈的不良反应。随着研究的深入，越来越多的结果表明免疫系统包含在整个OA的发病过程中，并且补体系统在该过程中起到了中心作用。研究表明，OA的发病过程中，初始的软骨损伤导致软骨细胞外基质的成分如软骨寡聚基质蛋白等的释放，激活了补体系统。补体系统主要由经典途径(classical pathway,CP)、替代途径(alternative pathway,AP)和凝集素途径(Lectin pathway,LP)组成。一方面三条途径在形成补体蛋白C3以及C5的时候汇合，分别生成C3转化酶和C5转化酶，两种转化酶分别诱导C3a和C5a产生，从而产生促炎性细胞因子；另一方面补体激活后导致膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC)在软骨细胞表面形成，MAC既能插入细胞中形成空腔促使软骨细胞裂解死亡，也能促进IL-1β和TNF-α等因子的分泌，从而激活NF-κB、MAPK等信号通路，使MMPs、ADAMTSs等释放，导致软骨损伤，形成OA。此外，补体系统的激活发生在IL-1β、TNF-α等炎症因子的水平提高之前，进一步表明了补体的重要性。这些研究结果进一步证明补体系统的激活是OA发病的中心因素。综上，补体系统可能是治疗OA的新的药物靶点，对补体系统的调节可能为治疗OA提供一种新的策略。
硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺组成的双糖单位交替连接组成的一类没有分支的线性阴离子糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)。CS在临床上有很多的应用，例如抗凝血、抗肿瘤、抗炎以及抗补体活性等。在欧洲，CS被欧洲抗风湿病联盟(European league against rheumatism,EULAR)推荐为治疗OA的慢作用药物。多数研究表明CS可以通过对炎症系统的干预实现对OA的治疗，是一种良好的多靶点天然多糖潜在药物。但是，CS通过对补体系统的调节实现OA治疗的机理尚未报道，其与一系列补体成分相互作用的机制尚不明确。这是因为CS相对于肝素等GAGs来说结构更加的复杂，并且CS的结构被软骨来源、年龄等一系列的因素影响。此外，发明人发现，完整链长的CS很难穿过胃和肠道粘膜，低分子量硫酸软骨素(Lowmolecular weight chondroitin sulfate，LMWCS)可以穿过肠道粘膜，而且相对于完整的CS，LMWCS具有更好的生物利用度和治疗II型胶原诱导的风湿性关节炎效果，但是不同大小的LMWCS的药效也不相同，因此，筛选具有特异性的抗补体活性及靶向性的CS片段及对其与补体系统的机制研究对于OA的治疗具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种具有C5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用，本发明以鱿鱼来源的硫酸软骨素为原料，通过酶解法制备硫酸软骨素寡糖后，利用本发明方法对各类型寡糖的活性及靶向性进行筛选，从而得到具有C5蛋白靶向性及活性最佳的片段，方法科学性高、可行性强。本发明进一步利用筛选出的硫酸软骨素二糖，通过体外、体内实验探究并揭示了鱿鱼来源的硫酸软骨素二糖具有较强的C5蛋白靶向性，及其通过调节补体系统治疗骨性关节炎的机制，最终为骨性关节炎的治疗提供一种新的途径，因此具有良好的实际应用之价值。
为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种具有C5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法，所述方法包括：
对硫酸软骨素进行酶解处理，对酶解产物进行分离，得到不同的寡糖组分；
使用溶血试验和促小鼠细胞增殖试验对各寡糖组分进行验证，对硫酸软骨素寡糖进行初步的考察与筛选。
具体的，所述硫酸软骨素选自鱿鱼硫酸软骨素。
所述酶解处理具体采用硫酸软骨素ABC酶；
所述酶解产物分离方法可采用过柱分离方式，如采用Bio-Gel P10柱，其分离寡糖组分效果更佳。
优选的，所述硫酸软骨素寡糖包括但不限于硫酸软骨素二糖、硫酸软骨素四糖、硫酸软骨素六糖、硫酸软骨素八糖和硫酸软骨素十糖；优选为硫酸软骨素二糖。经过试验验证，采用本发明制备筛选方法获得的硫酸软骨素二糖具有最佳的C5蛋白靶向性。
本发明的第二个方面，提供一种硫酸软骨素寡糖，所述硫酸软骨素寡糖通过上述制备方法获得。
本发明的第三个方面，提供上述硫酸软骨素寡糖在制备骨关节炎治疗药物中的应用。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
1.上述技术方案所提供的具有C5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖筛选方法，原理明确，实验操作简便，结果可信度高。
2.上述技术方案所提供的硫酸软骨素二糖，分子量低，穿透性好，口服生物利用度高，具有良好的C5蛋白靶向性，能够促进小鼠软骨细胞增殖，明显抑制补体途径中C3a、C4b、C5补体和MAC的形成及MAC诱导的相关蛋白表达，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中硫酸软骨素各寡糖组分的层析分离结果及质谱图，其中：a为硫酸软骨素层析分离结果图，b为组分A的质谱图，c为组分B的质谱图，d为组分C的质谱图，e为组分D的质谱图，f为组分E的质谱图。
图2为本发明实施例2中硫酸软骨素二糖、四糖、六糖、八糖不同浓度下的抗补体活性。
图3为本发明实施例3中不同浓度硫酸软骨素寡糖促进软骨细胞增殖活性，a为小鼠软骨细胞在不同浓度硫酸软骨素二糖条件下培养24h后的相对细胞数量。*P<0.05，ns无显著性差异；b为不同浓度硫酸软骨素二糖对小鼠软骨细胞的促增殖率曲线。
图4为本发明实施例4中硫酸软骨素二糖与补体途径中不同蛋白的相互作用。
图5为本发明实施例5中硫酸软骨素二糖对替代途径C3、C3a、C4b、C5补体形成的抑制活性，其中：a为CS二糖对补体替代途径中C3形成的抑制活性，b为CS二糖对补体替代途径中C3a形成的抑制活性，c为CS二糖对补体替代途径中C4b形成的抑制活性，d为CS二糖对补体替代途径中C5形成的抑制活性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns无显著性差异。
图6为本发明实施例6中硫酸软骨素二糖对补体途径MAC形成的抑制活性，其中：a为不同浓度CS二糖对NHS刺激后小鼠软骨细胞外乳酸脱氢酶水平的影响，***P<0.001,****P<0.0001；b1为空白组MAC水平,b2为10％NHS组MAC水平，b3为10％NHS+0.4mg/mL硫酸软骨素二糖组MAC水平，b4为10％NHS+0.8mg/mL硫酸软骨素二糖组MAC水平，b5为10％NHS+1.2mg/mL硫酸软骨素二糖组MAC水平。
图7为本发明实施例7中硫酸软骨素二糖对MAC诱导的相关蛋白表达的抑制活性，其中：a为不同浓度CS二糖对NHS刺激后小鼠软骨细胞MMP-13蛋白表达的影响，*P<0.05，**P<0.01；b为不同浓度CS二糖对NHS刺激后小鼠软骨细胞CCL2蛋白表达的影响，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；c1为空白组软骨细胞COX2成像结果，c2为对照组(10％NHS)软骨细胞COX2成像结果，c3为给药组(10％NHS+0.8mg/mL CS二糖)软骨细胞成像结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方式；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方式，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的常规方法和条件。
本发明的一个典型实施方式中，提供一种具有C5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法，所述方法包括：
对硫酸软骨素进行酶解处理，对酶解产物进行分离，得到不同的寡糖组分；
使用溶血试验和促小鼠细胞增殖试验对各寡糖组分进行验证，对硫酸软骨素寡糖进行初步考察与筛选。
本发明的又一具体实施方式中，所述硫酸软骨素为鱿鱼来源的硫酸软骨素。
本发明的又一具体实施方式中，所述酶解处理具体采用硫酸软骨素ABC酶；
本发明的又一具体实施方式中，所述酶解产物分离方法可采用过柱分离方式，如采用Bio-Gel P10柱，其分离寡糖组分效果更佳；
本发明的又一具体实施方式中，所述酶解产物分离方法具体为：以1M氯化钠，10％乙醇为流动相，采用Bio-Gel P10柱对酶解产物进行分离，流速为2.0mL/10min，将每10min流出的组分收集为一管，检测波长为210nm，合并相同的组分；离心浓缩，G25柱脱盐，冻干得到不同片段的寡糖组分。
本发明的又一具体实施方式中，所述方法还包括对寡糖组分进行表征，所述表征方法可采用电喷雾质谱法(ESI-MS)，表征其相对分子质量。
本发明的又一具体实施方式中，所述溶血试验和促小鼠细胞增殖试验均采用常规实验方法进行。
本发明的又一具体实施方式中，所述溶血试验包括：取兔红细胞悬液，用Mg2+-EGTA缓冲液将兔红细胞稀释；将不同浓度的CS寡糖溶液与NHS置于低温振摇孵育；反应结束后立即加入兔红细胞悬液，混匀，孵育。
本发明的又一具体实施方式中，所述促小鼠细胞增殖试验包括：提取原代小鼠软骨细胞，加入不同浓度的CS寡糖溶液，恒温培养，采用CCK-8试剂盒测定细胞数，计算促软骨细胞增殖率。
本发明的又一具体实施方式中，所述CS寡糖浓度为0.4～1.2mg/mL，进一步优选为0.4mg/mL,0.8mg/mL和1.2mg/mL。
本发明的又一具体实施方式中，所述硫酸软骨素寡糖包括但不限于硫酸软骨素二糖、硫酸软骨素四糖、硫酸软骨素六糖、硫酸软骨素八糖和硫酸软骨素十糖；优选为硫酸软骨素二糖。经过试验验证，采用本发明制备筛选方法获得的硫酸软骨素二糖具有最佳的C5蛋白靶向性，可通过调节补体系统治疗骨关节炎。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种硫酸软骨素寡糖，所述硫酸软骨素寡糖通过上述制备方法获得。
所述硫酸软骨素寡糖包括但不限于硫酸软骨素二糖、硫酸软骨素四糖、硫酸软骨素六糖、硫酸软骨素八糖和硫酸软骨素十糖；优选为硫酸软骨素二糖。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述硫酸软骨素寡糖在制备骨关节炎治疗药物中的应用。
所述硫酸软骨素寡糖包括但不限于硫酸软骨素二糖、硫酸软骨素四糖、硫酸软骨素六糖、硫酸软骨素八糖和硫酸软骨素十糖；优选为硫酸软骨素二糖。
所述骨关节炎治疗药物具体为通过调节补体系统治疗骨关节炎的药物。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1硫酸软骨素寡糖的制备及表征
配制80mg/mL的CS溶液，加硫酸软骨素ABC内切酶200μL，18h后，再补加酶150μL，继续酶解8h，反应结束后采用Sevage法将酶灭活，0.22μm的滤膜过滤除酶。然后以1mol/L氯化钠，10％乙醇为流动相，采用Bio-Gel P10柱对酶解产物进行分离，流速为2.0mL/10min，每10min流出的组分收集为一管，检测波长为210nm，合并相同的组分。离心浓缩，G25柱脱盐，冻干得到不同片段的寡糖组分。分别取上述得到的组分适量，加双蒸水溶解，0.22μm的滤膜过滤，通过电喷雾质谱法(ESI-MS)对得到的寡糖的相对分子质量进行表征。质谱条件为：流动相：20％水和80％乙醇，流速：0.2mL/min，电压：3kV，温度:200℃。结果表明，成功得到CS二糖、四糖、六糖、八糖以及十糖五种不同的寡糖组分。
实施例2融血法初步考察硫酸软骨素寡糖的抗补体活性
取适量的兔红细胞悬液，加入Mg2+-EGTA缓冲液洗涤3次，至上清液无色透明，再用Mg2+-EGTA缓冲液将兔红细胞稀释到合适浓度。将80μL不同浓度的CS寡糖溶液与10μL NHS加入V底96孔板中，置于冰上振摇孵育15min，同时设立空白组和阴性对照组。反应结束后立即加入兔红细胞悬液10μL，混匀，37℃孵育30min。反应结束后，2000r/min离心10min。取上清液90μL于96孔板中，测定405nm处的吸光度，计算CS寡糖对替代途径的抑制活性。结果表明，与其他寡糖相比，CS二糖的抗补体活性最好，而CS八糖的抗补体活性较差，总体上，各个浓度下CS二糖的抗补体活性大于CS四糖的抗补体活性大于CS六糖的抗补体活性大于CS八糖的抗补体活性。并且，各寡糖的抗补体活性基本呈现一定的浓度依赖性，随着浓度的增大，活性逐渐增强。经过初步考察，CS二糖的抗补体活性最好。
实施例3硫酸软骨素促进小鼠软骨细胞增殖活性的研究
提取原代的C57小鼠软骨细胞，用含有10％FBS的DMEM低糖培养基进行重悬，吹打成单细胞进行计数，按照3×103个/孔的细胞密度接种到96孔培养板当中，每孔的接种体积为100μL，然后加入不同浓度的CS二糖溶液，同时设立空白组和阴性对照组。将96孔板放入恒温培养箱(5％CO2，37℃)中培养24h，用CCK-8方法测定细胞数，计算软骨细胞增殖率。结果显示，CS二糖具有一定的促进小鼠软骨细胞增殖的活性，并且在一定浓度范围内随着浓度的升高促进增殖效果加强。
实施例4硫酸软骨素二糖与补体途径中不同蛋白的相互作用的研究
首先，将CS样品进行生物素酰化。将CS样品溶解于PBS缓冲液(pH 7.2)中，与Sulfo-NHS-LC-Biotin溶液(10mmol/L)在4℃反应2h，反应结束后使用脱盐柱除去未反应的生物素，HABA法测定生物素标记量。随后，将生物素化CS二糖固定在SA芯片上。在配体固定前，连续注射三次1M NaCl，50mmol/L NaOH溶液对芯片进行预处理，每次5μL，以去除任何非特异性结合的污染物，注射生物素化硫酸软骨素5μL(68nmol/mL,HBS-EP running buffer稀释，流速为5μL/min)，然后注射10μL 2mol/L NaCl，洗去未固定的配体。最后，将90μL一系列浓度的补体蛋白(C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9)以30μL/min的流速注入BIAcore 8000,每次不需再生即上更高浓度的补体蛋白，考察补体相关蛋白与CS二糖的动力学关系。结果表明，CS二糖与各种补体蛋白都有一定程度的结合，其中，CS二糖与C5的结合效果最好，Kd值为5.72×10-9M，属于强结合，进一步验证CS二糖具有强C5蛋白靶向性。
实施例5硫酸软骨素二糖抑制替代途径C3、C3a、C4b、C5补体形成的研究
用含20％NHS的HMEBN溶液配制的不同浓度的CS二糖溶液50μL，设3个浓度梯度(400μg/mL,800μg/mL,1200μg/mL)，并设置对照组(未加CS二糖)和空白组(未加CS二糖和NHS)，37℃孵育1h。在酶标包被板上先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)，用封板膜封板后置37℃温育30min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育30min，洗涤。每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min，每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。15min后，以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。结果表明，不同浓度的CS二糖均可在一定程度上抑制C3、C3a、C4b、C5的形成。从总体上，与对照组相比，几乎所有的剂量组都有明显的抑制作用，而且抑制活性与CS二糖浓度成正相关，进一步说明CS二糖具有很好的抑制替代途径补体形成的活性，并且具有较强的C5蛋白靶向性。
实施例6硫酸软骨素二糖抑制补体途径MAC形成的研究
ELISA方法检测上清液中乳酸脱氢酶水平的操作见实施例5。
将软骨细胞按照1.5×106个/孔的细胞密度接种到6孔培养板中，加不同浓度CS二糖后培养48h。用胰蛋白酶消化后刮下细胞，转移至避光的1.5mL ep管中。不含血清的PBS洗涤细胞2次，除去胰蛋白酶，每管加100μL含10％FBS的PBS重悬细胞。每管添加50μL一抗(Anti-C5b-9抗体(aE11))，使得一抗浓度在0.1μg/mL-10μg/mL之间。4℃避光孵育40min后洗涤3次，400g/min离心5min，在冰冷的PBS中重悬，每孔加50μL二抗(FITC标记山羊抗小鼠IgG)，4℃避光孵育20-30min，洗涤3次，400g/min离心5min，在冰冷的PBS中重悬后立即转移到4℃黑暗环境中保存，使用流式细胞仪(CytoFLEX S)进行分析。Anti-C5b-9抗体(aE11)购自Abcam公司，FITC标记山羊抗小鼠IgG购自上海翊圣生物科技有限公司。
上述两实验证明NHS能够诱导小鼠软骨细胞表面MAC的形成，这一过程可以被硫酸软骨素二糖抑制，抑制效果与二糖浓度呈正相关。
实施例7硫酸软骨素二糖抑制MAC诱导的相关蛋白表达的研究
此部分对CCL2和MMP13的研究采用ELISA的方法，实验操作见实施例5。
此部分对COX2的研究采用免疫细胞化学实验的方法。按照1×106个/孔的密度将小鼠软骨细胞接种到6孔培养板中，培养24h贴壁后给药。弃去培养基，随后在细胞上覆盖一层2-3mm用PBS稀释的4％甲醛，室温下固定细胞15min。弃去固定液，用PBS漂洗三次。在封闭缓冲液中封闭标本60min。弃去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗(COX2(D5H5)XP兔单克隆抗体)。4℃孵育过夜，用PBS漂洗三次，加入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光物质标记的二抗(生物素标记山羊抗兔IgG(H+L))，室温下避光孵育标本1-2h。用PBS漂洗三次，加入少量DAPI染色剂，(覆盖住样品即可)室温染色10min，用PBS缓冲液洗涤3次。用激光共聚焦高内涵成像分析系统(PerkinElmer)成像。COX2(D5H5)XP兔单克隆抗体购自Cell Signalingtechnology，生物素标记山羊抗兔IgG(H+L)购自上海翊圣生物科技有限公司。
结果表明硫酸软骨素二糖能够抑制补体途径，从而抑制MAC诱导的MMP-13、CCL2和COX2蛋白的表达。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种具有C5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
对硫酸软骨素进行酶解处理，对酶解产物进行分离，得到不同的寡糖组分；
使用溶血试验和促小鼠细胞增殖试验对各寡糖组分进行验证，对硫酸软骨素寡糖进行初步的考察与筛选；
所述溶血试验包括：取兔红细胞悬液，用Mg2+-EGTA 缓冲液将兔红细胞稀释；将不同浓度的CS寡糖溶液与NHS置于低温振摇孵育；反应结束后立即加入兔红细胞悬液，混匀，孵育；
所述促小鼠细胞增殖试验包括：提取原代小鼠软骨细胞，加入不同浓度的 CS 寡糖溶液，恒温培养，采用 CCK-8 试剂盒测定细胞数，计算促软骨细胞增殖率；
所述硫酸软骨素为鱿鱼来源的硫酸软骨素；
所述酶解处理具体采用硫酸软骨素ABC酶；具体为：配制80 mg/mL 的CS溶液，加硫酸软骨素ABC内切酶200 μL，18 h后，再补加酶150 μL，继续酶解8 h；
所述酶解产物分离方法采用过柱分离方式，所述酶解产物分离方法具体为：以1 mol/L氯化钠，10%乙醇为流动相，采用Bio-Gel P10柱对酶解产物进行分离，流速为2.0 mL/10min，将每10 min流出的组分收集为一管，检测波长为210 nm，合并相同的组分；离心浓缩，G25柱脱盐，冻干得到不同片段的寡糖组分；
所述硫酸软骨素寡糖为硫酸软骨素二糖。
2.如权利要求1所述的具有C5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法，其特征在于，所述方法还包括对寡糖组分进行表征，所述表征方法采用电喷雾质谱法，表征其相对分子质量。
3.一种硫酸软骨素寡糖，其特征在于，所述硫酸软骨素寡糖通过权利要求1或2所述制备方法获得，所述硫酸软骨素寡糖为硫酸软骨素二糖。
4.权利要求3所述硫酸软骨素寡糖在制备骨关节炎治疗药物中的应用。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述骨关节炎治疗药物具体为通过调节补体系统治疗骨关节炎的药物。
CN202010454657.0A 2020-05-26 2020-05-26 一种具有c5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用 Active CN111575329B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010454657.0A CN111575329B (zh) 2020-05-26 2020-05-26 一种具有c5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用
PCT/CN2021/075082 WO2021238296A1 (zh) 2020-05-26 2021-02-03 一种具有c5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用
US17/772,359 US20220403432A1 (en) 2020-05-26 2021-02-03 Method for preparing chondroitin sulfate oligosaccharides with c5 protein targeting property, and application thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010454657.0A CN111575329B (zh) 2020-05-26 2020-05-26 一种具有c5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111575329A CN111575329A (zh) 2020-08-25
CN111575329B true CN111575329B (zh) 2021-12-07

Family

ID=72114049

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010454657.0A Active CN111575329B (zh) 2020-05-26 2020-05-26 一种具有c5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220403432A1 (zh)
CN (1) CN111575329B (zh)
WO (1) WO2021238296A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111575329B (zh) * 2020-05-26 2021-12-07 山东大学 一种具有c5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676613A (zh) * 2012-05-22 2012-09-19 江南大学 一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法
CN105441471A (zh) * 2015-10-28 2016-03-30 北京电子科技职业学院 硫酸软骨素abc酶融合蛋白制备方法及其应用
CN107417809A (zh) * 2017-06-14 2017-12-01 南京佰泰克生物技术有限公司 硫酸软骨素用于扩增cik细胞、制备cik细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途
CN108070627A (zh) * 2017-11-28 2018-05-25 滨州医学院 一种硫酸软骨素d四糖的制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111575329B (zh) * 2020-05-26 2021-12-07 山东大学 一种具有c5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676613A (zh) * 2012-05-22 2012-09-19 江南大学 一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法
CN105441471A (zh) * 2015-10-28 2016-03-30 北京电子科技职业学院 硫酸软骨素abc酶融合蛋白制备方法及其应用
CN107417809A (zh) * 2017-06-14 2017-12-01 南京佰泰克生物技术有限公司 硫酸软骨素用于扩增cik细胞、制备cik细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途
CN108070627A (zh) * 2017-11-28 2018-05-25 滨州医学院 一种硫酸软骨素d四糖的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
低分子量硫酸软骨素的制备、抗补体活性构效关系及治疗骨性关节炎的实验研究;李连;《中国博士学位论文 医药卫生科技辑》;20170331;E079-9 *
李连.低分子量硫酸软骨素的制备、抗补体活性构效关系及治疗骨性关节炎的实验研究.《中国博士学位论文 医药卫生科技辑》.2017,E079-9. *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220403432A1 (en) 2022-12-22
WO2021238296A1 (zh) 2021-12-02
CN111575329A (zh) 2020-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Laurent et al. The properties and turnover of hyaluronan
US20080112955A1 (en) Method and composition for preventing pain in sickle cell patients
JP2752353B2 (ja) 抗炎症活性を有する硫酸化ポリサッカライド
CN1157567A (zh) 口服可溶性经调节柑桔果胶抑制癌症转移的方法
Cao et al. Cell-free osteoarthritis treatment with sustained-release of chondrocyte-targeting exosomes from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells to rejuvenate aging chondrocytes
JPH09510493A (ja) 新規なヘパリン様硫酸化多糖類
CA2107365A1 (en) New non-anticoagulant heparin derivatives
US20080214480A1 (en) Method for Treating Sickle Cell Disease and Sickle Cell Disease Sequalae
Mao et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease
JP2005532421A (ja) 生物学的活性を有するグリコデンドリマー
CN111575329B (zh) 一种具有c5蛋白靶向性的硫酸软骨素寡糖的制备方法与应用
JP2016193917A (ja) ヒストン阻害
Shinn et al. Antioxidative Hyaluronic Acid–Bilirubin Nanomedicine Targeting Activated Hepatic Stellate Cells for Anti-Hepatic-Fibrosis Therapy
NZ549989A (en) New therapeutic use for a group of sulphated polysaccharides
NZ309991A (en) Using pentonsan polysulphate to treat chronic progressive vascular diseases
JP6444399B2 (ja) 癌の処置に用いるための硫酸化多糖
US20130157303A1 (en) Sulfated polysaccharide capable of binding to growth factor and use thereof
JP2008273916A (ja) 抗β−１，６−グルカン・モノクローナル抗体
WO2021179047A1 (en) Treatment for coronavirus infection and associated cytokine toxicity
WO2020147350A1 (zh) 阿拉伯木聚糖磺酸盐在制备治疗骨关节炎的药物中的应用
Kirschbaum Glomerular basement membrane and anti-GBM antibody disease
US20230390324A1 (en) Treatment of fatty liver diseases
Zhang et al. D-mannose suppresses macrophage release of extracellular vesicles and ameliorates type 2 diabetes
CN114931629A (zh) 邻亚硝基苯甲醛基团修饰的生物明胶在制备预防或治疗炎症性肠病药物中的应用
CN117919207A (zh) 一种寡核苷酸口服制剂及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant