CN118005759A - 一种含有改良鱼精蛋白与反义核酸的复合体系及其制备方法和应用 - Google Patents
一种含有改良鱼精蛋白与反义核酸的复合体系及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供了一种含有改良鱼精蛋白与反义核酸的复合体系，改良鱼精蛋白是以来源于鱼类成熟精子的鱼精蛋白为原料，未经过化学修饰或经一种或多种化学修饰的方式制备或合成的；反义核酸包括一种或多种具有治疗作用的反义核酸；并提供了其制备方法和应用。与现有技术相对比，本申请具有以下优点：本申请提供的改良鱼精蛋白与反义核酸形成复合体系，可以有效提高核酸药物的稳定性和细胞摄取效率，增强核酸药物治疗效果。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及一种含有改良鱼精蛋白与反义核酸的复合体系及其制备方法和应用。
背景技术
核酸药物包括反义核酸(ASO)，干扰RNA和微小RNA等，作为一种新型的抑制基因表达的技术，给疾病治疗带来了新的契机和全新的治疗理念。核酸药物已被广泛用于炎症、癌症及其并发症的模型治疗研究，并取得了较好的效果，但目前临床尚无获批案例，限制核酸药物应用于疾病治疗的关键瓶颈是其体内输送问题。
近年来，基于不同种类的生物材料制备的给药系统为核酸药物的体内传输提供了新的方式和途径，比如脂质体，聚乙烯亚胺，聚乳酸-羟基乙酸共聚物等。但是，传统的给药系统存在着制备过程复杂，制备条件要求较高，制备要求仪器较为昂贵，从而导致生产成本较高的缺点。
发明内容
针对上述存在的技术局限性，本申请提出了一种含有改良鱼精蛋白与反义核酸的复合体系及其制备方法和应用；能够更好的提高反义核酸在核酸药物制备过程中的稳定性和靶向性，进而能够开发出以更低用量抑制疾病基因的表达、且能够安全广泛地在疾病治疗中使用的新的核酸药物，其克服了背景技术中提到的不足和缺陷。
为实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的发明点是提供一种复合体系，所述复合体系中包含有改良鱼精蛋白与反义核酸；所述改良鱼精蛋白是以来源于鱼类成熟精子的鱼精蛋白为原料，未经过化学修饰或经一种或多种化学修饰的方式制备或合成的；所述反义核酸包括一种或多种具有治疗作用的反义核酸。
可选地，上述的一种复合体系，所述鱼精蛋白来源于鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼、三文鱼的成熟精子。
鱼精蛋白为鱼类精子的组蛋白，其结构序列稳定。
可选地，上述的一种复合体系，所述化学修饰选自硫代修饰、甲基化修饰、乙酰化修饰中的至少一种。
可选地，上述的一种复合体系，所述鱼精蛋白上未与配体连接，或与至少一种配体连接；所述配体优选为磷脂、单糖、糖醛酸、寡糖、多糖、适配子、抗体分子、抗体片段、嵌合抗体、多肽、天然产生的受体表面结合物、小分子化合物中的至少一种。
可选地，上述的一种复合体系，所述改良鱼精蛋白的结构为：配体通过物理作用和/或化学反应与鱼精蛋白连接，其中物理作用包括但不限于电荷相互作用、配位相互作用；化学反应包括但不限于使用以连接为目的的化学试剂分别与鱼精蛋白和配体进行反应。
可选地，上述的一种复合体系，所述物理作用包括但不限于电荷相互作用、配位相互作用；所述化学反应包括但不限于使用以连接为目的的化学试剂分别与鱼精蛋白和配体进行反应。
可选地，上述的一种复合体系，所述反义核酸包括核糖核酸序列、脱氧核糖核酸序列、核糖核酸与脱氧核糖核酸的嵌合体序列中的一种或多种。
可选地，上述的一种复合体系，所述反义核酸的序列中，至少一个核苷酸的核糖部分和/或磷酸酯键部分上进行了化学修饰；所述核苷酸上磷酸酯键部分的化学修饰为硫代修饰；所述核苷酸上核糖部分的化学修饰为2-OMe、2’-OCHCHOMe或2’-F修饰；所述核苷酸的5’末端和/或3’末端含有或不含有化学修饰，所述化学修饰包括氨基化修饰、羧基化修饰、巯基化修饰或N-乙酰半乳糖胺修饰。
本申请的第二个发明点是提供了上述复合体系的制备方法，包括以下步骤：
S1.合成/制备改良鱼精蛋白，并将其制备成水溶液；
S2.在反义核酸水溶液中边搅拌边逐滴加入改良鱼精蛋白水溶液，静置反应后真空冷冻干燥，得到纳米粒粉末复合体系。
本申请的第三个发明点是提供了上述的一种复合体系、上述制备方法制备得到的复合体系在制备具有治疗作用的核酸药物中的应用。
复合体系还可以由改良鱼精蛋白与反义核酸通过电荷相互作用组成；其中，反义核酸与改良鱼精蛋白的质量比为1：(0.5-30)，优选为1：4；电荷相互作用即为静电作用自发组装，采用此方法能够形成纳米粒，其粒径范围为20-40nm。
改良鱼精蛋白为巨噬细胞靶向性配基修饰的鱼精蛋白，鱼精蛋白来源于鱼类成熟精子，核酸可以TNF-α反义寡核苷酸为代表性核酸，由DNA合成仪按照序列合成。将改良鱼精蛋白与核酸在水溶液中自发组装形成的纳米粒经冷冻干燥后保存，使用前重悬于生理盐水中即得灌肠剂，可用于贮袋炎的治疗，经肠道吸收后特异性作用于肠道巨噬细胞，阻断肠道部位TNF-α的合成，治疗肠道炎症。
与现有技术相对比，本申请具有以下优点：本申请提供的一种含有改良鱼精蛋白与反义核酸的复合体系及其制备方法和应用，核酸药物包括反义核酸(ASO)、干扰RNA、微小RNA等，作为一种新型的抑制基因表达的技术，给疾病治疗带来了新的契机和全新的治疗理念。核酸药物已被广泛用于疾病治疗与研究，并取得了较好的效果，然而核酸药物不稳定性、免疫原性、细胞摄取效率低、内吞体逃逸难等缺陷都限制了核酸药物作为一种新的治疗模式的有效性。本发明的改良鱼精蛋白与反义核酸形成复合体系可以有效提高核酸药物的稳定性和细胞摄取效率，增强核酸药物治疗效果。
附图说明
图1显示为化学修饰鱼精蛋白转染反义核酸降低炎症巨噬细胞内TNFα水平的效果图。
图2显示为本发明一实施例中，以此模式TNFα的ASO(SEQ ID NO：1)作用后，提取细胞的RNA使用反转录聚合酶链式反应测定mRNA表达量的结果。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本申请进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本申请，并不用于限制本申请的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本申请。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。
为了进一步了解本申请，下面结合最佳实施例对本申请作进一步的详细说明。
实施例1
一种复合体系，包含有改良鱼精蛋白与反义核酸；改良鱼精蛋白是以来源于鱼类成熟精子的鱼精蛋白为原料，未经过化学修饰或经一种或多种化学修饰的方式制备或合成的；反义核酸包括一种或多种具有治疗作用的反义核酸。
鱼精蛋白来源于鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼、三文鱼的成熟精子。
化学修饰选自硫代修饰、甲基化修饰、乙酰化修饰中的至少一种。
鱼精蛋白上未与配体连接，或与至少一种配体连接；配体优选为磷脂、单糖、糖醛酸、寡糖、多糖、适配子、抗体分子、抗体片段、嵌合抗体、多肽、天然产生的受体表面结合物、小分子化合物中的至少一种。
改良鱼精蛋白的结构为：配体通过物理作用和/或化学反应与鱼精蛋白连接，其中物理作用包括但不限于电荷相互作用、配位相互作用；化学反应包括但不限于使用以连接为目的的化学试剂分别与鱼精蛋白和配体进行反应。
物理作用包括但不限于电荷相互作用、配位相互作用；化学反应包括但不限于使用以连接为目的的化学试剂分别与鱼精蛋白和配体进行反应。
反义核酸包括核糖核酸序列、脱氧核糖核酸序列、核糖核酸中的一种或多种，模式TNFα的ASO序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1：5’-TGTTGTTAAATTCCT-3’。
反义核酸的序列中，至少一个核苷酸的核糖部分和/或磷酸酯键部分上进行了化学修饰；所述核苷酸上磷酸酯键部分的化学修饰为硫代修饰；所述核苷酸上核糖部分的化学修饰为2-OMe、2’-OCHCHOMe或2’-F修饰；所述核苷酸的5’末端和/或3’末端含有或不含有化学修饰，所述化学修饰包括氨基化修饰、羧基化修饰、巯基化修饰或N-乙酰半乳糖胺修饰。
本申请还提供了上述复合体系的制备方法，包括以下步骤：
S1.合成/制备改良鱼精蛋白，并将其制备成水溶液；
S2.在反义核酸水溶液中边搅拌边逐滴加入改良鱼精蛋白水溶液，静置反应后真空冷冻干燥，得到纳米粒粉末复合体系。
本申请还提供了上述的一种复合体系、上述制备方法制备得到的复合体系在制备具有治疗作用的核酸药物中的应用。
复合体系还可以由改良鱼精蛋白与反义核酸通过电荷相互作用组成；其中，反义核酸与改良鱼精蛋白的质量比为1：(0.5-30)，优选为1：4；电荷相互作用即为静电作用自发组装，采用此方法能够形成纳米粒，其粒径范围为20-40nm。
改良鱼精蛋白为巨噬细胞靶向性配基修饰的鱼精蛋白，鱼精蛋白来源于鱼类成熟精子，核酸可以TNF-α反义寡核苷酸为代表性核酸，由DNA合成仪按照序列合成。将改良鱼精蛋白与核酸在水溶液中自发组装形成的纳米粒经冷冻干燥后保存，使用前重悬于生理盐水中即得灌肠剂，可用于贮袋炎的治疗，经肠道吸收后特异性作用于肠道巨噬细胞，阻断肠道部位TNF-α的合成，治疗肠道炎症。
实施例2
糖类靶向性配基鱼精蛋白的合成：
1)透明质酸化鱼精蛋白的合成：
将200mg透明质酸在2ml蒸馏水中搅拌下溶于10ml的圆底烧瓶中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)27.1mg，搅拌10min混匀后加入羧基活化剂N-羟基丁二酰亚胺(NHS)30.7mg，混合搅拌40min。随后，加入25mg的鱼精蛋白，氢氧化钠(NaOH)调pH至8.0，25℃搅拌18h。反应完全后将溶液装入透析袋(MWCO：5000-6000)于去离子中4℃透析48h，然后冷冻干燥除去溶剂，得终产物透明质酸化鱼精蛋白。
2)β-葡聚糖化鱼精蛋白的合成：
将250mgβ-葡聚糖在2ml蒸馏水中搅拌下溶于10ml的圆底烧瓶中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)27.1mg，搅拌10min混匀后加入羧基活化剂N-羟基丁二酰亚胺(NHS)30.7mg，混合搅拌40min。随后，加入25mg的鱼精蛋白，氢氧化钠(NaOH)调PH至8.0，25℃搅拌18h。反应完全后将溶液装入透析袋(截留分子量MWCO：5000-6000)于去离子水中4℃透析48h，然后冷冻干燥除去溶剂，得终产物β-葡聚糖化鱼精蛋白。3)半乳糖化鱼精蛋白的合成：
取鱼精蛋白100mg、乳糖700mg和氰基硼氢化钠500mg放于烧杯中，加入三蒸水200ml，置于37℃恒温水箱中，2小时后，取pH＝8.0的磷酸缓冲溶液将鱼精蛋白乳糖液调至pH为7.4，继续恒温水育120小时，将鱼精蛋白半乳糖液装入透析袋(截留分子量MWCO：5000-6000)，放入三蒸水中透析三天，其间每天更换三蒸水，将透析后液体经葡聚糖凝胶SephedaxG-25柱层析分离，纯化出产品溶液，经冰冻干燥得粉末，即为半乳糖化鱼精蛋白。
实施例3
肽类靶向性配基鱼精蛋白的合成
1)CD163靶向肽化鱼精蛋白的合成：
取适量CD163靶向结合短肽，溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，以摩尔比1：15的比例加入20mmol/L的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯)-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propio-nate，SPDP)溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入超滤管中离心洗涤3次(6000r/min，8min/次)以除去过量的SPDP，在得到的带吡啶二硫基的CD163靶向结合短肽溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(pH 4.5)，置于4℃冰箱中反应30min后再次经超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到带巯基的CD163靶向结合短肽溶液。
配置1mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液，该溶液与适量的C3F8氟烷气体混合后，应用声振仪(Level5，输出功率20kHz)连续声振60s，声振结束后，获取的微气泡悬液经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗涤，取下层乳白色溶液置于1.5ml无酶离心管中备用。
取硫酸鱼精蛋白微气泡悬液适量，加入20mmoI/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mol/L PBS洗涤，得到带吡啶二硫基的微气泡悬液，立即与步骤1中的溶液混合，4℃冰箱中反应过夜，再次用0.01mol/L PBS洗涤，最终得到CD163靶向短肽结合的鱼精蛋白微气泡悬液，冷冻干燥得CD163靶向短肽化鱼精蛋白。
2)GGP-肽化鱼精蛋白的合成：
取适量GGP-肽，溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，以摩尔比1：15的比例加入20mmol/L的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯)-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propio-nat e，SPDP)溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入超滤管中离心洗涤3次(6000r/min，8min/次)以除去过量的SPDP，在得到的带吡啶二硫基的CD163靶向结合短肽的溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(pH4.5)，置于4℃冰箱中反应30min后再次经超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到带巯基的GGP-肽溶液。
配置1mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液，该溶液与适量的C3F8氟烷气体混合后，应用声振仪(Level5，输出功率20kHz)连续声振60s，声振结束后，获取的微气泡悬液经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗涤，取下层乳白色溶液置于1.5ml无酶离心管中备用。
取硫酸鱼精蛋白微气泡悬液适量，加入20mmoI/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mol/L PBS洗涤，得到带吡啶二硫基的微气泡悬液，立即与步骤1)中的溶液分别混合，4℃冰箱中反应过夜，再次用0.01mol/L PBS洗涤，最终得到靶向肽结合的鱼精蛋白微气泡悬液，冷冻干燥得GGP-肽化鱼精蛋白。
3)RGD肽化鱼精蛋白的合成：
取适量RGD肽，溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，以摩尔比1：15的比例加入20mmol/L的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯)-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propio-nat e，SPDP)溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入超滤管中离心洗涤3次(6000r/min，8min/次)以除去过量的SPDP，在得到的带吡啶二硫基的CD163靶向结合短肽的溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(pH4.5)，置于4℃冰箱中反应30min后再次经超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到带巯基的RGD肽溶液。
配置1mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液，该溶液与适量的C3F8氟烷气体混合后，应用声振仪(Level5，输出功率20kHz)连续声振60s，声振结束后，获取的微气泡悬液经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗涤，取下层乳白色溶液置于1.5ml无酶离心管中备用。
取硫酸鱼精蛋白微气泡悬液适量，加入20mmoI/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mol/LPBS洗涤，得到带吡啶二硫基的微气泡悬液，立即与步骤1)中的溶液分别混合，4℃冰箱中反应过夜，再次用0.01mol/LPBS洗涤，最终得到靶向肽结合的鱼精蛋白微气泡悬液，冷冻干燥得RGD肽化鱼精蛋白。
4)免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白的合成
取适量化学合成的免疫球蛋白Fc段肽，溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，以摩尔比1：15的比例加入20mmol/L的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯)-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propio-nate，SPDP)溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入超滤管中离心洗涤3次(6000r/min，8min/次)以除去过量的SPDP，在得到的带吡啶二硫基的CD163靶向结合短肽的溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(pH4.5)，置于4℃冰箱中反应30min后再次经超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到带巯基的免疫球蛋白Fc段肽溶液。
配置1mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液，该溶液与适量的C3F8氟烷气体混合后，应用声振仪(Level5，输出功率20kHz)连续声振60s，声振结束后，获取的微气泡悬液经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗涤，取下层乳白色溶液置于1.5ml无酶离心管中备用。
取硫酸鱼精蛋白微气泡悬液适量，加入20mmoI/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mol/LPBS洗涤，得到带吡啶二硫基的微气泡悬液，立即与步骤1)中的溶液分别混合，4℃冰箱中反应过夜，再次用0.01mol/LPBS洗涤，最终得到靶向肽结合的鱼精蛋白微气泡悬液，冷冻干燥得免疫球蛋白Fc段肽化鱼精蛋白。
实施例4
天然表面受体结合物化鱼精蛋白：
1)叶酸化鱼精蛋白的制备：
将叶酸100mg溶于二甲基亚砜(DMSO)5mL中，加入缩水剂乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDAC)80mg和羧基活化剂N-羟基丁二酰亚胺(NHS)50mg，冰浴下搅拌反应2h，然后取出于室温下继续搅拌反应8h，将DMSO溶液缓慢加入到硫酸鱼精蛋白水溶液(1mg/mL，20ml，pH＝8.0)中，室温下搅拌反应10h。将反应产物取出装入透析袋(MWCO：5000-6000)于去离子水中透析2d。将透析后的反应产物冷冻离心(10000r/min，5min，4℃)，取上清液，冻干保存。反应全程严格避光。
2)叶酸缀合物叶酸-聚乙二醇-活性酯化鱼精蛋白的制备
将叶酸-聚乙二醇-活性酯500mg和鱼精蛋白100mg溶于5ml pH 9.0的硼砂缓冲液中，25摄氏度反应40min，产物先通过凝胶过滤柱子脱盐，柱层析填料为Sephadex-G75。将脱盐后的第一个峰搜集，并用透析袋和PEG6000进行浓缩，浓缩后的蛋白质溶液上样于阳离子树脂CM-sepharose CL-6B，收集第二个峰的样品，冷冻干燥即得叶酸-聚乙二醇-活性酯化鱼精蛋白。
实施例5
磷酯化鱼精蛋白的制备：
1)磷脂酰丝氨酸化鱼精蛋白的制备：
将1ml磷脂酰丝氨酸(10mg/ml)与1ml硫酸鱼精蛋白(100mg/ml)加入到13ml蒸馏水中，室温搅拌混匀，95℃恒温水浴搅拌24h。反应完全后将溶液装入透析袋(MWCO：5000-6000)于去离子中4℃透析48h，然后冷冻干燥除去溶剂，得终产物磷脂酰丝氨酸化鱼精蛋白。
2)磷脂酰丝氨酸衍生物二硬酯酰磷脂酰丝氨酸化鱼精蛋白的制备：
将1ml二硬酯酰磷脂酰丝氨酸(15mg/ml)与1ml硫酸鱼精蛋白(100mg/ml)加入到13ml蒸馏水中，室温搅拌混匀，95℃恒温水浴搅拌24h。反应完全后将溶液装入透析袋(MWCO：5000-6000)于去离子水中4℃透析48h，然后冷冻干燥除去溶剂，得终产物二硬酯酰磷脂酰丝氨酸化鱼精蛋白。
实施例6
改良鱼精蛋白与核酸复合纳米粒的制备：
在寡核苷酸水溶液(1mg/mL)(由上海生工生物工程股份有限公司合成)在搅拌下逐滴加入4倍体积的实施例2至实施例5中合成的改良鱼精蛋白水溶液(1mg/ml)，25℃下静置2小时，以形成质量比为2：1的纳米粒溶液。将上述纳米粒溶液置于真空冷冻干燥机抽干，得到改良鱼精蛋白和寡核苷酸自组装的纳米粒粉末。
实施例7
小鼠巨噬细胞的提取以及炎症状态巨噬细胞的制备：
从集萃药康公司获得9只体重35-45g的正常雄性C57BL/6J小鼠。以每笼3只圈养，把小鼠安置在南京大学的动物中心。并在进入研究前适应环境至少三天。动物室设置为每小时保持最少12至15次换气，自动计时器开启/关闭12小时的明/暗循环，给小鼠饮用正常无菌水。
小鼠脱颈处死后浸泡于装有75％酒精的烧杯内，约5分钟，用剪刀从腹部中线剪开，并斜向下剪开腿部皮肤，分离双腿，剔除腿部肌肉组织及其他软组织，并去掉腓骨；用2mL注射器吸取无血清的1640培养基，将针头刺入骨髓腔，反复冲骨髓至骨髓变白，将骨髓冲洗液加入到50mL离心管中，1000rpm离心5min；将离心得到的骨髓巨噬细胞用含M-CSF(10ng/mL)和含10％血清的1640培养基重悬后分装到细胞培养瓶中，置于5％ CO2 37℃培养3天；弃上清，换含M-CSF(10ng/mL)和含10％血清的1640培养基继续培养4天。向培养体系中加入终浓度为500ng/ml的LPS刺激24小时，即得炎症状态巨噬细胞。
实施例8
改良鱼精蛋白与核酸复合纳米粒的治疗效果：
使用LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)作为阳性对照试剂，在24孔板培养细胞用于转染ASO。选用序列5’-TGTTGTTAAATTCCT-3’作为模式TNFα的ASO，配置A液：用100μl不含血清的Opi-MEM培养基(gibco)稀释TNFα反义寡聚核苷酸，终浓度为50nM和200nM，混匀，每组设置三孔。配置B液：取2μl LipofectamineTM2000稀释到100μl的Opi-MEM培养基中，轻轻混匀后在室温下孵育5min后按每孔200μl加入到预先加入300μl Opi-MEM培养基的孔板中。37℃，5％CO2培养箱孵育6h，更换含10％胎牛血清的培养基继续培养24h。提取细胞的RNA使用反转录聚合酶链式反应测定mRNA表达量。
评价实施例2-5中合成的鱼精蛋白制备的改良鱼精蛋白与核酸复合纳米粒对于炎症状态巨噬细胞中TNFα的抑制作用，以未经化学修饰的鱼精蛋白作为阴性对照，如图1所示，以未处理细胞、仅核酸组(图中ASO)、未修饰鱼精蛋白作为对照组，未修饰鱼精蛋白也有一定作用，但是修饰之后效果会大幅提升。
配置A液：用100μl不含血清的Opi-MEM培养基(gibco)稀释TNFα反义寡聚核苷酸，终浓度为50nM和200nM，混匀，每组设置三孔。配置B液：取2μl 1mg/ml改良鱼精蛋白或未经修饰的预警蛋白稀释到100μl的Opi-MEM培养基中，轻轻混匀后在室温下孵育5min后按每孔200μl加入到预先加入300μl Opi-MEM培养基的孔板中。37℃，5％CO2培养箱孵育6h，更换含10％胎牛血清的培养基继续培养24h。提取细胞的RNA使用反转录聚合酶链式反应测定mRNA表达量。
结果结果如图1所示，表明改良鱼精蛋白可以显著提高ASO对炎症状态噬细胞中TNFα的抑制作用。
实施例9
改良鱼精蛋白与其他核酸复合纳米粒的治疗效果：
选用序列5’-TGTTGTTAAATTCCT-3’作为模式TNFα的ASO，以及该序列对应的siRNA和miRNA作为实验对照，配置A液：用100μl不含血清的Opi-MEM培养基(gibco)稀释TNFα核酸，终浓度为50nM和200nM，混匀，每组设置三孔。配置B液：取2μl 1mg/ml透明质酸化鱼精蛋白稀释到100μl的Opi-MEM培养基中，轻轻混匀后在室温下孵育5min后按每孔200μl加入到预先加入300μl Opi-MEM培养基的孔板中。37℃，5％CO2培养箱孵育6h，更换含10％胎牛血清的培养基继续培养24h。以此模式TNFα的ASO作用后，提取细胞的RNA使用反转录聚合酶链式反应测定mRNA表达量，结果如图2所示。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种复合体系，其特征在于，所述复合体系中包含有改良鱼精蛋白与反义核酸；所述改良鱼精蛋白是以来源于鱼类成熟精子的鱼精蛋白为原料，未经过化学修饰或经一种或多种化学修饰的方式制备或合成的；所述反义核酸包括一种或多种具有治疗作用的反义核酸。
2.根据权利要求1所述的一种复合体系，其特征在于，所述鱼精蛋白来源于鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼、三文鱼的成熟精子。
3.根据权利要求2所述的一种复合体系，其特征在于，所述反义核酸的化学修饰选自硫代修饰、甲基化修饰、乙酰化修饰中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的一种复合体系，其特征在于，所述鱼精蛋白上未与配体连接，或与至少一种配体连接；所述配体优选为磷脂、单糖、糖醛酸、寡糖、多糖、适配子、抗体分子、抗体片段、嵌合抗体、多肽、天然产生的受体表面结合物、小分子化合物中的至少一种。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种复合体系，其特征在于，所述改良鱼精蛋白的结构为：配体通过物理作用和/或化学反应与鱼精蛋白连接，其中物理作用包括但不限于电荷相互作用、配位相互作用；化学反应包括但不限于使用以连接为目的的化学试剂分别与鱼精蛋白和配体进行反应。
6.根据权利要求5所述的一种复合体系，其特征在于，所述物理作用包括但不限于电荷相互作用、配位相互作用；所述化学反应包括但不限于使用以连接为目的的化学试剂分别与鱼精蛋白和配体进行反应。
7.根据权利要求6所述的一种复合体系，其特征在于，所述反义核酸包括核糖核酸序列、脱氧核糖核酸序列中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的一种复合体系，其特征在于，所述反义核酸的序列中，至少一个核苷酸的核糖部分和/或磷酸酯键部分上进行了化学修饰；所述核苷酸上磷酸酯键部分的化学修饰为硫代修饰；所述核苷酸上核糖部分的化学修饰为2-OMe、2’-OCHCHOMe或2’-F修饰；所述核苷酸的5’末端和/或3’末端含有或不含有化学修饰，所述化学修饰包括氨基化修饰、羧基化修饰、巯基化修饰或N-乙酰半乳糖胺修饰。
9.权利要求1-8任意一项所述的一种复合体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.合成/制备改良鱼精蛋白，并将其制备成水溶液；
S2.在反义核酸水溶液中边搅拌边逐滴加入改良鱼精蛋白水溶液，静置反应后真空冷冻干燥，得到纳米粒粉末复合体系。
10.权利要求1-8任意一项所述的一种复合体系、权利要求9所述的制备方法制备得到的复合体系在制备具有治疗作用的核酸药物中的应用。
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| CN202311868624.0A CN118005759A (zh) | 2023-12-29 | 2023-12-29 | 一种含有改良鱼精蛋白与反义核酸的复合体系及其制备方法和应用 |
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2023
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