KR101507254B1 - 공급물 혼합 장치 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 명세서에서 세포 배양 용기에의 첨가 전 뿐만 아니라 그 사용 전에 공급물 용액들을 혼합하기 위한 챔버를 포함하는 세포 배양 용기에 비생리학적 pH 값을 가진 공급물 용액들을 첨가하기 위한 공급물 혼합 장치가 보고된다. 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 공급물 혼합 장치를 사용하면, 공급물 성분들은 이 성분들이 우수한 용해도 및/또는 우수한 안정성을 갖는 pH 값에서 용액 내에 제공될 수 있고, 이것에 의해 pH 값은 배양 매체의 pH 값, 즉 생리학적 pH 값과 명확하게 상이할 수 있다. 이것은 공급물 용액의 pH 값이 배양물의 pH 값의 전후의 작은 범위에 제한되는 배양에 비해 더 높은 유연성을 가진 배양을 수행하는 것을 가능하게 한다.

Description

공급물 혼합 장치 및 그 용도{FEED MIXING DEVICE AND ITS USE}
본 명세서에서는 배양 매체에 비생리학적 pH 값을 가진 2 종 이상의 공급 용액들을 동시에 공급할 수 있고, 그것에 의해 합성된 공급물 용액들의 pH 값은, 공급물 혼합 장치 내의 배양 매체에 첨가되기 전에, 예를 들면, 생리학적 pH 값으로 조절되는 공급물 혼합 장치가 보고된다.
포유동물 세포의 배양에서 생산율 또는 배양 시간을 증대시키기 위해, 필수적인 매체 성분들의 농도를 임계치 이상으로 유지하기 위해 배양 매체에 공급 용액이 첨가된다.
배양 매체와 상이한 물리적 특성을 가진 수용액의 공급은 삼투압성 또는 pH 값과 같은 배양 매체의 물리적 파라미터들에 영향을 준다. 상이한 성분들의 빈약한 용해도 또는 요구되는 안정화로 인해, 공급 용액의 pH 값은 때때로 비생리학적 값으로 변화되어야 한다.
Luan, Y.T. 등은 배양물 내에서 하이브리도마들의 수명을 연장하고 또한 단일 클론 항체들의 수율을 촉진하기 위한 방법을 보고하였다 (Biotechnol. lett. 9 (1987) 691-696). 인간 항체 및 글루타민 신테타제를 발현하는 NS0 세포주를 위한 개량된 발효 공정이 Dempsey, J. 등에 의해 보고되었다 (Biotechnol. Prog. 19 (2003) 175-178). Bibila, T.A. 등은 매체 농축물을 이용한 단일 클론 항체 공정 개발을 보고하였다 (Biotechnol. Prog. 10 (1994) 87-96).
WO 2008/013809에서 세포 배양 방법이 보고되었다. 건조 분말 세포와 세포 배양 시약 및 그 제조 방법이 US　2006/0003448에서 보고되었다. US 5,081,036에서 세포 배양을 위한 방법 및 기구가 보고되었다. 매체 농축 기법이 US 5,681,748에서 보고되었다. US　6,924,124에서 세포 배양을 위한 공급 방법이 보고되었다.
WO 2009/132616에서 보충 시스템이 보고되었다. 상업용 바이오리액터를 이용한 알코올 또는 당의 생산을 위한 방법 및 기구가 WO 2010/045168에서 보고되었다. US 2003/0092652에서 핵산 분자를 위한 보호된 원-바이얼 (one-vial) 제제, 인-라인 혼합에 의한 그 제조 방법, 및 관련된 생성물 및 방법이 보고되었다.
본 명세서에서 보고되는 공급물 혼합 장치를 이용하면, 공급물 성분들은, 예를 들면, 성분들이 우수한 용해도 및/또는 우수한 안정성을 갖는 pH 값을 가진 용액 내에 제공될 수 있고, 상기 pH 값은 배양 매체의 pH 값, 즉, pH 6.5 ~ pH 7.5 의 생리학적으로 허용될 수 있는 pH 값과 다를 수 있고/다르고, 즉, 상기 용액은 상호 독립적으로 pH 6.5 미만 또는 pH 7.5 초과의 다른 pH 값을 가진다. 이것은, 예를 들면, 공급물 용액의 pH 값이 배양 매체의 pH 값 전후의 작은 범위로 제한되는 배양에 비해 더 유연성이 있는 배양의 수행을 가능하게 한다.
본 명세서에서 보고되는 하나의 양태는 세포 배양 용기에의 첨가 전에 용액들을 혼합하기 위한 챔버를 포함하는 세포 배양 용기에 각각 비생리학적 pH 값을 가진 적어도 2 종의 용액들을 첨가하기 위한 장치이다.
하나의 실시형태에서, 용액들을 혼합하기 위한 챔버의 체적 대 배양 용기 내의 배양 매체의 체적의 비율은 0.8 ㎖/ℓ ~ 1.2 ㎖/ℓ 이다. 하나의 실시형태에서, 이 비율은 0.9 ㎖/ℓ ~ 1.1 ㎖/ℓ 이다. 하나의 실시형태에서, 이 비율은 약 1 ㎖/ℓ 이다. 하나의 실시형태에서, 이 비율은 0.95 ㎖/ℓ 이다. 하나의 실시형태에서, 배양 매체의 체적은 배양 용기 내에서 배양의 개시 시의 액체의 체적이다.
하나의 실시형태에서, 각각 비생리학적 pH 값을 가진 적어도 2 종의 용액들은 적어도 하나의 산성 용액 및 적어도 하나의 알칼리성 용액이다. 하나의 실시형태에서, 각각 비생리학적 pH 값을 가진 적어도 2 종의 용액들은 상호 독립적으로 pH 6.5 미만 또는 pH 7.5 초과의 pH 값을 가진다. 하나의 실시형태에서, 각각 비생리학적 pH 값을 가진 적어도 2 종의 용액들은 상호 독립적으로 pH 0 ~ pH 6.49 또는 pH 7.51 ~ pH 14 의 pH 값을 가진다.
하나의 실시형태에서, 산성 및 알칼리성 용액의 pH 값은 배양 매체의 pH 값으로부터 적어도 0.5 pH 단위 (unit) 만큼 상이하다. 하나의 실시형태에서, 이 산성 용액은 pH 6.5 이하의 pH 값을 가진다. 하나의 실시형태에서, 이 산성 용액은 pH 4.0 이하의 pH 값을 가진다. 하나의 실시형태에서, 이 알칼리성 용액은 pH 8.0 이상의 pH 값을 가진다. 하나의 실시형태에서, 이 알칼리성 용액은 pH 10.0 이상의 pH 값을 가진다.
하나의 실시형태에서, 이 장치는 비생리학적 pH 값을 가진 2 ~ 4 종의 별개의 용액들을 첨가하기 위한 것으로, 선택적으로 용액들 중 적어도 하나는 산성 용액이고, 또 적어도 하나는 알칼리성 용액이다.
하나의 실시형태에서, 용액들의 각각은 아미노산, 당, 비타민, 미량 원소, 젖산, 및 성장 인자로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 공급물 용액이다.
하나의 실시형태에서, 용액들을 혼합하기 위한 챔버는 배양 용기로부터 분리되어 있고, 배양 용기의 내측에 접속되는 유출구를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 이 챔버는 배양 용기의 외측 또는 배양 용기의 내측에 있다.
하나의 실시형태에서, 이 챔버는 0.1 ㎖ ~ 50,000 ㎖ 의 체적을 갖는다. 하나의 실시형태에서, 이 챔버는 0.25 ㎖ ~ 30,000 ㎖ 의 체적을 갖는다. 하나의 실시형태에서, 이 챔버는 0.5 ㎖ ~ 1,000 ㎖ 의 체적을 갖는다.
하나의 실시형태에서, 이 챔버는 약 1.15 ㎖, 또는 약 8 ㎖, 또는 약 80 ㎖, 또는 약 200 ㎖, 또는 약 400 ㎖, 또는 약 800 ㎖, 또는 약 1.6 ℓ, 또는 약 4 ℓ, 또는 약 8 ℓ, 또는 약 16 ℓ, 또는 약 40 ℓ 의 체적을 갖는다.
하나의 실시형태에서, 혼합은 배양 용기에 첨가 직전이다.
하나의 실시형태에서, 용액들을 혼합하기 위한 이 챔버는 용액들의 각각을 위한 개별 커넥터들을 가진 유입구를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 이 장치는 살균 가능하다
본 명세서에서 보고되는 바와 같은 다른 양태는 세포의 유가 배양 또는 연속 배양에서 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치의 용도이다.
또한 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 포함하는 배양 용기이다.
본 명세서에서 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 다음의 단계들을 포함하는 폴리펩티드의 제조를 위한 방법이다:
- 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 포함하는 배양 용기 내에서 유가 배양 또는 연속 배양으로 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 상기 배양 단계 중에 적어도 하나의 산성 공급물 용액 및 적어도 하나의 알칼리성 공급물 용액이 첨가되는, 배양 단계, 및
- 상기 배양 매체 또는 상기 세포로부터 폴리펩티드를 회수하여, 폴리펩티드를 제조하는 단계.
하나의 실시형태에서, 혼합된 공급물 용액들은 배양 용기에의 첨가 시에 pH 4.5 ~ pH 9.5 의 pH 값을 갖는다. 하나의 실시형태에서, 혼합된 공급물 용액들은 배양 매체에의 첨가 시에 pH 6.5 ~ pH 7.5 의 pH 값을 갖는다..
하나의 실시형태에서, 이 배양 용기는 약 2 ℓ, 또는 10 ℓ, 또는 20 ℓ, 또는 100 ℓ, 또는 250 ℓ, 또는 500 ℓ, 또는 1,000 ℓ, 또는 2,000 ℓ, 또는 5,000 ℓ, 또는 10,000 ℓ, 또는 20,000 ℓ, 또는 50,000 ℓ 의 체적을 갖는다.
하나의 실시형태에서, 배양 매체의 체적은 약 1.2 ℓ, 또는 약 8 ℓ, 또는 약 16 ℓ, 또는 약 80 ℓ, 또는 약 200 ℓ, 또는 약 400 ℓ, 또는 약 800 ℓ, 또는 약 1,600 ℓ, 또는 약 4,000 ℓ, 또는 약 8,000 ℓ, 또는 약 16,000 ℓ, 또는 약 40,000 ℓ 이다.
하나의 실시형태에서, 이 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치는 실온에서 작동된다.
또한 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 감소된 G(0) 글리코폼 (glycoform) 및/또는 증가된 G(1) 글리코폼을 얻기 위한 다음의 단계들을 포함하는 방법이다:
- 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 포함하는 배양 용기 내에서 유가 배양 또는 연속 배양으로 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 상기 배양 단계 중에 적어도 하나의 산성 공급물 용액 및 적어도 하나의 알칼리성 공급물 용액이 첨가되는, 배양 단계, 및
- 상기 배양 매체 또는 세포로부터 폴리펩티드를 회수하여, 감소된 G(0) 글리코폼 및/또는 증가된 G(1) 글리코폼을 가진 폴리펩티드를 얻는 단계로서,
혼합된 공급물 용액들은 이 배양 용기에의 첨가 시에 pH 4.0 ~ pH 6.0 의 pH 값을 갖는다.
하나의 실시형태에서, 이 폴리펩티드는 항체 또는 Fc-융합 폴리펩티드이다
치료적 폴리펩티드 또는 바이오매스의 제조를 위해 광범위하게 사용되는 형식은 유가 배양식 발효이다. 포유동물 세포 배양물의 세포 밀도는 유가 배양식 발효물 내에서 종종 100*105 세포/㎖를 초과하므로, 특정 물질들 또는 물질 종류들의 낮은 용해도 및/또는 손상된 안정성으로 인해 충분한 양의 요구되는 배양 기재를 제공하기 위한 난제가 발생한다.
그러므로, 공통적인 접근법은 이 물질들의 요구되는 양을 용해 또는 안정화하기 위해 비생리학적 pH 값을 가진 공급물 용액들을 사용하는 것이다. 예를 들면, 액체 공급물 용액을 통한 아미노산 티로신의 적절한 보충은 그것의 낮은 용해도로 인해 pH 7 전후의 pH 값으로 달성하기가 곤란하다. 그러나, 용해도는 이 경우에 높은 비생리학적 pH 값에서 증대되므로, 공급 방법은 비생리학적 pH 값의 공급물 용액들을 이용하는 유가 배양식 공정에서 전체적인 티로신 소비에 부합할 수 있다. 특히 연속 공급 방법은 안정한 공급물 용액들을 필요로 한다. 따라서, 공급물 성분들의 유효기간은 적어도 공급 기간을 초과해야 한다.
더욱이, 비생리학적 pH 값, 즉 알칼리성 또는 산성 pH 값을 가진 공급물 용액들의 첨가는 배양 장치의 pH 제어 메커니즘의 반응을 유발한다. 그 결과, 비생리학적 pH 값을 가진 공급물 용액들의 첨가에 의해 유도되는 pH 변화를 보상하기 위해 산 또는 염기의 증가된 원하지 않는 첨가를 초래한다.
높거나 낮은 pH 값과 같은 비생리학적 pH 값을 가진 공급물 용액들의 사용에 의해 발생되는 효과를 방지하기 위해, 배양 용기 내로 첨가 직전에 적어도 2 종의 공급물 용액들의 연속적 혼합을 가능하게 하는, 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 공급물 혼합 장치가 사용될 수 있다. 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 공급물 혼합 장치를 사용함으로써, 공급물 성분들은 이 공급물이 우수한 용해도 및/또는 우수한 안정성을 갖는 pH 값에서 용해될 수 있고, 상기 pH 값은 배양 매체의 pH 값, 즉 생리학적 pH 값과 명확하게 상이할 수 있다. 이것은 공급물 용액을 위한 더 유연한 pH 값을 가능하게 하는데, pH 값이 이제 배양 매체 및 세포 현탁액에의 첨가 직전에 조절되기 때문이다.
본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치는 유가 배양 또는 연속 배양에서와 같이 화합물이 첨가되어야 하는 세포의 배양에서 유용한 공급물 혼합 장치이다. 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 공급물 혼합 장치를 이용하면, 배양은 적어도 하나의 추가의 자유도로, 그리고 그 결과 더 높은 유연성으로 수행될 수 있다. 이 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 이용하면, 비생리학적 pH 값 및/또는 높은 화합물 농도를 갖는 공급물 용액들을 사용할 수 있다. 비생리학적 pH 값은, 예를 들면, pH 민감성 공급물 성분들을 안정화하기 위해 요구될 수 있다. 배양 용기에 그리고 또한 배양 매체에 첨가 전에 임의의 pH 값이 조절될 수 있다. 이것은 불연속적 또는 연속적 공급 공정에서 한정된 양의 화합물을 첨가하는 것을 가능하게 한다. 예를 들면, 한정된 양의 이온의 첨가에 의해, 소정의 삼투압성이 조절될 수 있다.
본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하여 가능한 공급물 용액들의 pH 값의 얻어지는 가변성에 의해, 임의의 pH 값, 즉 알칼리성, 중성 또는 산성 용액을 가진, 그리고 임의의 농도의 개별 성분을 가진 공급물 용액들이 사용될 수 있다. 또한 첨가된 공급물 내에서 pH 구배를 발휘할 수 있고, 이것에 의해 또한 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하지 않는 종래의 공급 방법에 비해 본질적으로 동일한 양의 물질이 첨가될 수 있다. 따라서, 심지어 성분들이 그것의 낮은 용해도 또는 손상된 안정성으로 인해 극단의 알칼리성 또는 산성으로, 즉 비생리학적 pH 값으로 제공되어야 하는 공급물 용액들도 사용될 수 있다.
공급물 혼합 장치로부터 배출되어 배양 매체에 첨가되는 혼합된 공급물 용액들의 pH 값은 개별 공급물의 체적 혼합 비율, 혼합 챔버 내에서의 체류 시간, 및 개별 공급물 용액들의 체적 유량에 의존한다.
하나의 실시형태에서, 공급물 혼합 장치를 통한 배양 용기 내로의 총 체적 유량은 1 ~ 1.5 g/h/ℓ 이다. 하나의 실시형태에서, 이 체적 유량은 1.15 g/h/ℓ ~ 1.35 g/h/ℓ 이다. 하나의 실시형태에서, 이 체적 유량은 약 1.25 g/h/ℓ 이다. 단위 g/h/ℓ 는 공급물의 질량/배양 시간/배양 체적을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 이 배양 체적은 배양의 개시 시에 배양 용기 내의 액체의 체적이다.
공급물 용액들의 혼합을 위해 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용함으로써, 배양된 세포의 생존능력이 소정의 수준을 초과하는 더 긴 시간 동안 유지될 수 있고, 또한 더 긴 전반적인 배양 시간을 가능하게 한다. 동시에, 젖산 농도 및 글루코스 소비가 감소될 수 있다.
세포 배양의 pH 값의 일반적 경과는 도 1 에 도시되어 있다. 접종 (도 1 의 "1") 후에 배양물의 pH 값은 감소하여 소정의 pH 범위의 하단 (도 1 의 "2") 에 접근한다. 이것은 배양 매체 내에서 젖산의 형성 및 이산화탄소의 축적에 기인한다. 관련되는 pH 제어 메커니즘은 pH 값이 염기의 첨가에 의해 사전 설정된 pH 범위의 하단에서 유지되는 것을 보장한다. 염기 첨가는 세포 대사작용이 변화하고 또한 배양 매체 내에서 젖산이 재대사되고 및/또는 축적된 이산화탄소가 제거될 때까지 계속된다 (도 1 의 "3"). 그 후, pH 값은 이 pH 값이 사전 설정된 pH 범위의 상단 (도 1 의 "4") 에 도달할 때까지 증가한다. 이 pH 제어 메커니즘은 산의 첨가에 의해 pH 값을 이 상단 값에 유지한다.
알칼리성 공급물 용액은, 예를 들면, pH 제어 메커니즘의 관여 없이, 배양 매체의 pH 값을 사전 설정된 pH 범위의 하단을 초과하여 유지할 수 있다. 따라서, 이 배양 용기 내에서 pH 값의 변화는 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 공급물 혼합 장치를 사용하여 배양 매체에 첨가되는 둘 이상의 공급물 용액들의 개별 체적 유량의 비율을 변화시키는 것에 의해 반대작용을 받을 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하면, pH 제어 메카니즘 또는 적어도 그 관여 시간 (그리고 또한 산 및 염기의 첨가량) 이 각각 사용되지 않거나 또는 감소될 수 있다.
개별 공급 속도를 가진 알칼리성 공급물 용액과 산성 공급물 용액 및 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 공급물 혼합 장치를 사용함으로써, 합성된 공급물 용액들의 pH 값은 임의의 목표 값으로 조절될 수 있다. 배양의 과정 중에 개별 공급 속도 및/또는 공급물 용액들을 변화시킴으로써, 합성된 공급물 용액들의 pH 값은 배양 중에 변화될 수 있다. 따라서, 배양된 세포의 대사작용에 따른 pH 값의 적응 (adaptation) 및/또는 제어가 가능하다. 합성된 공급물 용액들의 가변적 pH 값은 배양물의 pH 값을 조절하기 위한 다른 수단을 지지하거나 교체하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 보고되는 바와 같은 공급물 혼합 장치를 사용함으로써, 2 종 이상의 공급물 용액들이 연속적으로 합성될 수 있다. 이 공급물 용액들은 임의의 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 비타민과 같은 화합물은 (높은) 비생리학적 pH 값에서 안정화될 수 있다. 이 pH 값은 배양 매체에 첨가되기 전에 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 공급물 혼합 장치를 사용하여 생리학적 범위 내의 pH 값으로 조절될 수 있다. 따라서, 공급된 화합물이 안정성을 손상시키는 pH 값에 유지되는 시간이 감소된다.
하나 이상의 알칼리성 용액 및 하나 이상의 산성 용액을 사용함으로써, 가변적 pH 값의 조절이 가능하다. 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하면, 배양 매체 내의 pH 값은 공급물 용액들의 이 비율 및 개별 유량을 조절함으로써 온라인으로 제어될 수 있다 (도 1 의 "5").
상이한 특성을 가진 공급물 용액들을 사용함으로써, 예를 들면, 이온 농도, pH 값, 삼투압성, 화합물의 비율, 점성, 표면 장력, 전도성, 습윤성, 비저항, 및/또는 밀도의 시간 의존성 조절이 가능하다.
온라인 센서를 사용함으로써, 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하여 상이한 물리적 및/또는 화학적 특성을 가진 상이한 공급물 용액들을 합성하는 것이 가능하다. 이와 함께 상이한 파라미터들은 사전 설정된 스케쥴에 따라 변화될 수 있다.
본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용함으로써, 고체, 분산물 및 혼합이 곤란한 화합물/용액을 공급물 용액으로서 사용하는 것이 가능하다. 공급물 용액들의 화학적 및/또는 물리적 특성은 상이할 수 있다.
본 명세서에서 보고되는 바와 같은 공급물 혼합 장치를 사용함으로써, 배양 중에 첨가된 혼합된 공급물 용액의 pH 구배가 수행될 수 있다.
이 개별 공급물은 상호 독립적으로 분산체, 에멀전, 또는 용액일 수 있다. 용액들은 종래의 펌프 또는 임의의 다른 공지의 기계식 또는 유동-기계식 방법을 사용함으로써 공급물 혼합 장치로 수송될 수 있다. 공급물이 진용액 (true solution) 이 아닌 경우, 이 공급물은, 예를 들면, 기계식 수송 방법을 사용하여 첨가될 수 있다.
이 공급물 혼합 장치의 규모는 가변적이고, 따라서 이 장치는, 예를 들면, 배양 용기 (교반 탱크), 칩, 또는 유동 파이프 반응기와 같은 임의의 유형 및 크기의 배양 장치와 함께 사용될 수 있다.
본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하는 경우, 공급물 용액의 pH 값이 개별 공급물 용액들의 혼합 시에 배양 매체에 첨가 전에 현저하게 변화되더라도 혼합 챔버 내에서 석출물은 거의 형성되지 않는다.
본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하고 또한 이것에 의해 별개의 공급물을 합성된 (산성) 공급물로 조절함으로써, 제조된 폴리펩티드, 특히 제조된 면역글로불린의 G(0) 글리코폼은 단일의 알칼리성 공급물을 사용하는 그리고 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하지 않는 배양물에 비해 감소된다. 마찬가지로 G(1) 글리코폼은, 단일의 알칼리성 공급물을 사용하는 그리고 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하지 않는 배양물에 비해, 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용함으로써 그리고 별개의 공급물들을 혼합된 산성 공급물로 조절함으로써 증가시킬 수 있다.
세포 배양 조건들을 조절함으로써, 하류의 공정 전에 배양 매체 내에서 숙주 세포 단백질의 함유량이 변화될 수 있다. 이것은 특수 공급물 용액들을 사용함으로써 가능해야 한다. 따라서, 한정된 양자의 농도, 즉 한정된 pH 값을 가진 pH 조절된 공급물 용액들을 포함하는 조절된 공급 방법을 사용하면, 동일하거나 또는 적어도 유사한 양의 공급물 성분들이 첨가될 수 있고, 동시에 배양 매체의 pH 값을 수정하기 위해 요구되는 염기 또는 산의 양이 감소될 수 있고, 또한 동시에 배양물 부유물 내의 숙주 세포 단백질 함유량이 감소될 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 공급물 혼합 장치는, 하나의 실시형태에서, 세포 배양물 부유물 내에서 숙주 세포 단백질의 함유량을 감소시키기 위해 사용된다.
이하의 실시예들 및 도면들은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된 것이고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구항들에 기재되어 있다. 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 한도 내에서 설명된 과정에 대한 변형이 실행될 수 있다는 것이 이해된다.
도 1 은 세포 배양물의 pH 값의 일반적 경과의 개략도이다.
도 2 는 생존 세포 밀도의 경과도로서, 백색 원은 포타슘 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 원은 포타슘 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3), 백색 사각형은 소듐 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 사각형은 소듐 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3) 이다.
도 3 은 생존능력의 경과도로서, 백색 원은 포타슘 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 원은 포타슘 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3), 백색 사각형은 소듐 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 사각형은 소듐 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3) 이다. 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용함으로써, 생존능력은 90 % 를 초과하는 값으로 더 길게 유지된다는 것을 알 수 있다.
도 4 는 pH 값의 경과도로서, 백색 원은 포타슘 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 원은 포타슘 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3), 백색 사각형은 소듐 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 사각형은 소듐 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3) 이다. 이 경과는 (72 시간 후) 공급의 개시 전까지 비교할 수 있다.
도 5 는 글루코스 소비의 경과도로서, 백색 원은 포타슘 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 원은 포타슘 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3), 백색 사각형은 소듐 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 사각형은 소듐 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3) 이다. 이 글루코스 소비는 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 혼합 장치가 사용되는 경우에 감소된다.
도 6 은 젖산 형성의 경과도로서, 백색 원은 포타슘 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 원은 포타슘 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3), 백색 사각형은 소듐 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 사각형은 소듐 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3) 이다. 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 혼합 장치를 사용하면, 젖산 형성 및 재대사작용의 작용발현 (onset) 이 개선된다.
도 7 은 글루타민 소비의 경과도로서, 백색 원은 포타슘 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 원은 포타슘 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3), 백색 사각형은 소듐 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 사각형은 소듐 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3) 이다.
도 8 은 암모니아 축적의 경과도로서, 백색 원은 포타슘 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 원은 포타슘 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3), 백색 사각형은 소듐 클로라이드의 단일 공급물 (공급물 1), 흑색 사각형은 소듐 클로라이드의 별개의 공급물들 (공급물 2 및 공급물 3) 이다.
도 9 는 산성 피크 획분 (fraction) 도로서, 좌측은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용한 것이고, 우측의 짙은 부분은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하지 않은 것이다.
도 10 은 (14 일간의 배양 후) 첨가되는 염기의 요구량의 공급물 용액의 pH 값에 대한 의존성을 도시한다. 원은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하지 않은 것이고, 사각형은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용한 것이다.
도 11 은 (14 일간의 배양 후) 젖산 형성의 공급물 용액의 pH 값에 대한 의존성을 도시한다. 원은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하지 않은 것이고, 사각형은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용한 것이다.
도 12 는 (14 일간의 배양 후) 글루타민 농도의 공급물 용액의 pH 값에 대한 의존성을 도시한다. 원은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하지 않은 것이고, 사각형은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용한 것이다.
도 13 은 (14 일간의 배양 후) 배양 매체 내의 삼투압성의 공급물 용액의 pH 값에 대한 의존성을 도시한다. 원은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하지 않은 것이고, 사각형은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용한 것이다.
도 14 는 (14 일간의 배양 후) 용해된 이산화탄소의 공급물 용액의 pH 값에 대한 의존성을 도시한다. 원은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하지 않은 것이고, 사각형은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용한 것이다.
도 15 는 (14 일간의 배양 후) 생존 세포 밀도의 공급물 용액의 pH 값에 대한 의존성을 도시한다.
원은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하지 않은 것이고, 사각형은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용한 것이다.
도 16 은 공급물 용액의 pH 값에 대한 G(0) 획분의 의존성을 도시한다.
도 17 은 공급물 용액의 pH 값에 대한 G(1) 획분의 의존성을 도시한다.
도 18 및 도 19 는 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치의 예시적 개략도이다.
도 20 은 숙주 세포 단백질 함유량의 공급물 용액의 pH 값에 대한 의존성을 도시한다.
실시예들
물질들
항체
본 명세서에서 보고되는 바와 같은 방법 및 실시예들에서 사용되는 예시적인 항체는 WO 2010/034443 (참조에 의해 본 명세서에 도입됨) 에서 보고되는 바와 같은 항-IL17 항체이다.
공급물 용액들
공급물 1: 이 용액은 약 9.5 의 pH 값의 모든 공급물 성분들 (아미노산 및 피루빈산) 을 포함한다.
공급물 2: 이 용액은 약 pH 1.5 의 산성 pH 값에서 용해 가능한 성분들을 2 배의 농도로 포함한다.
공급물 3: 이 용액은 약 pH 10 의 염기성 pH 값에서 용해 가능한 성분들을 2 배의 농도로 포함한다.
이 구성에서, 첨가된 공급물 1 의 농도, 성분들의 수, 뿐만 아니라 체적은 공급물 2 와 공급물 3 의 합성 후의 것과 동일하다. 공급물 1 의 pH 값은 약 pH 9.5 이고, 합성된 공급물들 2 및 3은 약 pH 7.2 이다.
공급물 혼합 장치의 치수
공급물 용액들을 혼합하기 위한 챔버의 체적: 1.146 ㎖
2 ℓ-배양 용기를 사용하는 배양의 개시 시의 배양 매체의 체적: 1.2 ℓ
공급물 혼합 장치를 통한 공급 유량: 36 g/일
실시예 1
4 개의 2 ℓ-배양 용기들 (Sartorius Biostat B-DCU Quad, Sartorius, Goettingen, Germany) 이 동일한 쉐이커 플라스크 (shaker flask) 에서 사전 배양된 접종 용액을 이용하여 동시에 접종되었다. 2 개의 배양 용기들은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 포함하는 반면, 다른 2 개의 배양 용기들은 루어 피팅 (Luer fitting) 을 구비하지만, 혼합 챔버를 구비하지 않는 2 개의 개별적인 종래의 공급 장치를 포함하였다.
모든 배양은 그 전체 배양에 걸쳐 일정한 통기 속도, 일정한 온도 및 일정한 교반 속도로 수행되었다. 모든 공급 속도들은 출발 실시 (working) 체적에 기초하여 계산되고, 1일 당 발효 개시 체적 당 공급물 체적으로 주어진다.
공급물 혼합 장치를 포함하는 배양 용기들 내에서의 공급은 동일한 체적 유량으로 연속적 공급으로서 공급물 2 및 공급물 3을 이용하여 72 시간의 배양 시간 후에 개시되었다. 이 공급물들은 공급물 혼합 장치 내에서 합성되었고, 혼합 후에 배양 매체에 첨가되었다.
종래의 공급 장치를 포함하는 배양 용기들 내에서의 공급은 공급물 혼합 장치를 이용한 대응하는 배양물의 체적 유량의 2 배의 체적 유량으로 공급물 1을 이용하여 72 시간의 배양 시간 후에 개시되었다.
따라서, 첨가된 체적 뿐만 아니라 모든 공급물 성분들의 첨가된 양은 4 개의 배양물 내에서 모두 동일하다 (표 1 및 표 2 참조).
파라미터 공급물 용액 1 공급물 용액 2 공급물 용액 3
본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치의 사용 비사용 사용 사용
pH 값 알칼리성 알칼리성 산성
체적 유량 100 % 50 % 50 %
농도 1x 2x 2x
공급 속도 0.03 ℓ/일 0.015 ℓ/일 0.015 ℓ/일
총 공급물 체적 100 % 50 % 50 %
배양물 1 배양물 2 배양물 3 배양물 4
공급물 1 공급물 1 공급물 2 + 공급물 3 공급물 2 + 공급물 3
+ 소듐 클로라이드 + 포타슘 클로라이드 + 소듐 클로라이 + 포타슘 클로라이드
공급물 pH 값 9.5 공급물 pH 값 9.5 혼합된 공급물 pH 값 7.2 혼합된 공급물 pH 값 7.2
생존 세포 밀도의 배양 중의 경과는 도 2 에 도시되어 있고, 세포 생존능력의 경과는 도 3 에 도시되어 있고, 배양 매체 내의 pH 값의 경과는 도 4 에 도시되어 있고, 글루코스 소비의 경과는 도 5 에 도시되어 있다. 도 6 은 배양 중인 젖산 농도의 경과를 도시한다. 배양 중의 글루타민 농도의 경과는 도 7 에 도시되어 있다. 도 8 은 배양 중인 암모니아 농도의 경과를 도시한다. 제조된 면역글로불린의 산성 피크의 양은 도 9 에 도시되어 있다.
도면들로부터 알 수 있는 바와 같이, 생존능력은 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용함으로써, 연장된 시간 동안 90 % 를 초과하여 유지될 수 있다. pH 값의 경과는 최초의 72 시간 동안, 즉 공급의 개시 전에 비교할 수 있다. 그 후, 공급물 혼합 장치를 사용하는 배양물의 pH 값은 다른 배양물의 pH 값 미만이다. 글루코스 소비는 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용하는 배양물에서 감소된다. 공급물 혼합 장치를 이용한 배양의 경과 중에 최대 젖산 농도는 공급물 혼합 장치를 이용하지 않는 배양의 최대 젖산 농도에 비해 낮다.
실시예 2
이 실시예에서, 염기 소비, 젖산 형성, 성장 속도론 또는 생성물 형성과 같은 배양의 상이한 파라미터들에 대한 공급물 용액들의 pH 값의 영향 만이 분석된다. 모든 다른 파라미터들은 동등하게 유지되었다.
공급물 용액은, 혼합 후의 pH 값만은 상이하지만 공급물 성분들의 첨가량, 공급물 체적, 또는 삼투성과 같은 모든 다른 파라미터들이 동등하도록 구성되었다. 그러므로 공급물 용액들은 일정한 공급 속도로 첨가되지 않고, 중량식 공급 제어기에 의해 첨가되었다.
pO2 값은 35 % 공기 포화의 값으로 조절되었고, pO2 프로브 (Mettler-Toledo InPro 6820) 로 측정되었다. 이 pO2 프로브는 공인된 가스 분석법 (GA4, Dasgip) 으로 측정되는 평균 값에 기초하여 가스 도입 (gassing in) 의 72 시간 후의 공정 조건들에 조정되었다. 배양 중의 통기는 질소, 공기, 순 산소 및 이산화탄소의 혼합물의 75 ㎖/분 의 일정한 속도에 유지되었다. 총 가스 유량에서 이산화탄소의 획분은 총 가스 유량의 7 체적 % 로 일정하였고, pH 제어의 증대되는 요구에 의해서만 변화되었다.
배양 매체의 pH 값은 염기로서 1 몰/ℓ 의 소듐 카보네이트 용액 및 산으로서 이산화탄소를 이용하여 7.0 +/- 0.05 pH 단위의 설정점까지 조절되었다. 요구되는 이산화탄소는 75 ㎖/분 의 총 이산화탄소 유량에 첨가되었다. pH 프로브 (Mettler Toledo 405-DPAS-SC-K8S/200) 는 7.0 및 4.01 의 pH 값의 기준 버퍼 용액을 이용하여, 혈액 가스 분석기 (Bioprofile, PHOx BGA) 의 평균 값으로서 공정 조건들 하에서 적어도 72 시간 동안 배양 매체의 평형 후에 조정되었다.
배양은 약 230 rpm의 일정한 교반기 속도에서 수행되었다. 혼합기인 디쉬 (dish) 교반기가 사용되었다. 전력 입력은 약 80 W/㎥ 이었다. 이것과 동일한 전력 입력이 비교가능성을 보장하고 또한 조건들의 급격한 변화를 방지하기 위해 사전 배양에서 사용되었다.
소포 (anti-foam) 용액은 포말 형성에 기초하여 첨가되었다. 소포 프로브는 사용되지 않았다. 최대 포말 형성 상태의 배양 용기에 의해 요구되는 소포제의 양이 다른 배양 용기들에 또한 첨가되었다. 소포제로서, 1 % 의료 등급의 Dow가 사용되었다.
이 배양 매체는 화학적으로 한정된 매체였다. 각각의 발효에 대해 1 리터의 매체가 사용되었다. 접종 체적은 200 ㎖ 였다. 따라서, 배양은 1,200 ㎖ 의 출발 체적으로 수행되었다.
세포주로서 항-IL17 항체를 엔코딩하는 핵산으로 트랜스펙트된 CHO 세포가 사용되었다. 200 ㎖ 의 접종 체적 내의 세포 밀도는 배양물 내에서 약 3.5 x 105 세포/㎖ 의 세포 밀도를 보장하도록 조절되었다. 이 접종 배양에서 전력 입력은 그 후의 주 배양에서와 동일한 값으로 유지되었다. 이 접종 배양은 약 36.5　℃, 7　% 의 CO2, 및 85 % 의 상대 습도에서 수행되었다.
접종 매체의 주 배양물로의 이동 후에 샘플들이 매일 채취되었다. 주 배양은 유가 배양으로서 수행되었고, 여기서 공급은 주 배양의 개시 후 약 72 시간에 개시되었다.
5 개의 상이한 배양이 동시에 실행되었다. 그 파라미터들은 표 3에 제공되었다.
파라미터 배양물 1 배양물 2 배양물 3 배양물 4 배양물 5
본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치의 사용 사용 사용 비사용 사용 사용
공급물 1 알칼리성 알칼리성 완전한 공급물 알칼리성 알칼리성
공급물 2 산성 산성 - 산성 산성
공급물의 pH 세트 9.5 7.0 9.5 4.5 4.5
공급물의 pH 세트의 변화 무변화 무변화 무변화 변화, 더 낮은 pH 밴드 경계로 강하된 pH 값 후에 9.5 의 pH 세트로의 변화 무변화
결과:
공급물 용액을 사용함으로써 배양 매체의 pH 값이 직접적으로 영향을 받는다. 또한 pH 제어 메커니즘에 의해 배양 중에 첨가되어야 하는 산 및/또는 염기의 양은 간접적으로만 영향을 받는다.
도 10 내지 17 에, 첨가된 염기의 양, 첨가된 산의 양, 14 일간의 배양 시간 후의 배양 매체 내에서 얻어지는 pCO2와 같은 파라미터들에 대한 공급물 용액의 pH 값의 영향이 도시되어 있다.
도 10 으로부터 알 수 있는 바와 같이, 첨가된 염기의 양은 공급물 용액의 pH 값에 의존한다.
도 11 로부터 알 수 있는 바와 같이, 14 일간의 배양 후의 배양 매체 내의 젖산의 양은 공급물 용액의 pH 값에 의존하고, 이것에 의해 9.5 의 pH 값의 공급물 용액을 사용하면 최대량의 젖산이 얻어진다. 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 사용함으로써, 젖산의 총량은 합성된 공급물에 비해 약 30 % 만큼 감소된다.
도 12 로부터 알 수 있는 바와 같이, 14 일간의 배양 시간 후의 배양 매체 내의 글루타민의 양은 공급물 용액의 pH 값에 의존한다.
도 13 으로부터 알 수 있는 바와 같이, 14 일간의 배양 시간 후의 배양 매체 내의 삼투압성은 공급물 용액의 pH 값에 의존한다.
도 14 에 14 일간의 배양 시간 후의 배양 매체 내의 pCO2 값이 도시되어 있다. pCO2 값은 공급물 용액의 pH 값에 의존하는 것을 알 수 있고, 이것에 의해 최고 pCO2 값이 본 명세서에서 보고되는 바와 같은 장치를 이용하여 단일의 공급물로서 또는 혼합된 공급물로서의 알칼리성 공급물 용액들을 이용하여 얻어진다. 더 낮은 pH 값의 공급물을 사용함으로써, 14 일간의 배양 시간 후의 pCO2 값은 격감될 수 있으므로, 배양 매체 내에서 비생리학적으로 높은 pCO2 값을 방지할 수 있다는 것을 알 수 있다.
도 15 에 14 일간의 배양 시간 후의 생존 세포 밀도가 도시되어 있다. 배양물들의 생존 세포 밀도는 90 % 이상임을 알 수 있다.
도 16 에 공급물 용액의 pH 값에 의존하는 G(0) 글리코폼의 양이 도시되어 있다. 중성 및 알칼리성 공급물 용액을 이용하면 상당한 양의 G(0) 글리코폼이 얻어진다는 것을 알 수 있다. 산성 공급물 용액을 이용하면 G(0) 글리코폼의 양이 감소되었다.
도 17 에 공급물 용액의 pH 값에 의존하는 G(1) 글리코폼의 양이 도시되어 있다. 중성 및 알칼리성 공급물 용액을 이용하면 상당한 양의 G(1) 글리코폼이 얻어진다는 것을 알 수 있다. 산성 공급물 용액을 이용하면 G(1) 글리코폼의 양이 증대되었다.
실시예 3
혼합된 공급물 들의 거동
11.3 의 pH 값의 알칼리성 공급물 용액과 약 1.0 의 pH 값의 산성 공급물 용액이 약 pH 6.5 의 목표 pH 값을 얻기 위해 합성되었다. 개별 용액들의 혼합은 실온 및 4　℃ 에서 이 각각의 온도의 각각의 공급물 용액 10 ㎖ 를 합성함으로써 수행되었다.
실온에서 혼합되고 인큐베이팅된 공급물들에서 110 분의 정온 방치 (incubation) 후에 약간의 석출물이 발견되었다. 4 ℃ 에서 혼합되고 정온 방치된 공급물들에서는 석출물이 혼합이 수행된 직후에 이미 형성되었다.

Claims (16)

  1. 각각 비생리학적 pH 값을 가진 적어도 2 종의 공급물 용액을 세포 배양 용기에 첨가하기 위한 장치로서,
    상기 공급물 용액들을 위한 별개의 유입구들, 상기 공급물 용액들을 혼합하기 위한 챔버, 및 혼합된 공급물 용액들을 상기 세포 배양 용기에 첨가하기 위한 단일의 유출구를 포함하고,
    상기 배양 용기 내의 배양 매체의 체적에 대한 상기 공급물 용액들을 혼합하기 위한 상기 챔버의 체적의 비율이 0.8 ㎖/ℓ ~ 1.2 ㎖/ℓ 인, 공급물 용액을 세포 배양 용기에 첨가하기 위한 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 비율은 1 ㎖/ℓ 인 것을 특징으로 하는 공급물 용액을 세포 배양 용기에 첨가하기 위한 장치.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 장치는 상기 배양 용기로부터 분리되고, 상기 유출구는 상기 배양 용기의 내측으로 향하는 것을 특징으로 하는 공급물 용액을 세포 배양 용기에 첨가하기 위한 장치.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 장치는 상기 배양 용기의 외측 또는 상기 배양 용기의 내측에 있는 것을 특징으로 하는 공급물 용액을 세포 배양 용기에 첨가하기 위한 장치.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 공급물 용액들을 혼합하기 위한 상기 챔버는 0.5 ㎖ ~ 1,000 ㎖ 의 체적을 갖는 것을 특징으로 하는 공급물 용액을 세포 배양 용기에 첨가하기 위한 장치.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 장치는 살균 가능한 재료로 이루어진 것을 특징으로 하는 공급물 용액을 세포 배양 용기에 첨가하기 위한 장치.
  7. 세포 배양 기구로서,
    a) 세포 배양 용기,
    b) 가스 공급원,
    c) 각각 비생리학적 pH 값을 가진 공급물 용액들을 위한 적어도 2 개의 액체 보관 유닛들,
    d) 상기 세포 배양 용기 내의 pH 값을 결정하기 위한 적어도 하나의 센서, 및
    e) 제 1 항에 따른 장치를 포함하는, 세포 배양 기구.
  8. 세포의 유가 배양 또는 연속 배양에서의, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 장치의 사용 방법.
  9. 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
    - 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 장치를 포함하는 배양 용기를 이용하여 또는 제 7 항에 따른 기구를 이용하여 유가 배양 또는 연속 배양으로 상기 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 각각 비생리학적 pH 값을 가진 적어도 2 종의 공급물 용액들을 상기 배양 매체에 첨가하는, 세포 배양 단계, 및
    - 상기 배양 매체 또는 상기 세포로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    - 임의의 산성 공급물 용액은 pH 6.5 이하의 pH 값을 갖고, 그리고/또는 임의의 알칼리성 공급물 용액은 pH 8.0 이상의 pH 값을 갖고,
    - 혼합된 공급물 용액들은 pH 7 ~ pH 7.5 의 pH 값을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 혼합을 상기 배양 용기에의 상기 첨가 직전에 행하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법.
  12. 제 9 항에 있어서,
    임의의 산성 공급물 용액은 pH 4.5 이하의 pH 값을 갖고, 그리고/또는 임의의 알칼리성 공급물 용액은 pH 10.0 이상의 pH 값을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법.
  13. 제 9 항에 있어서,
    2 ~ 4 종의 별개의 공급물 용액들이 상기 배양 매체에 첨가되고, 상기 공급물 용액들 중, 적어도 하나의 공급물 용액은 산성 공급물 용액이고, 적어도 하나의 공급물 용액은 알칼리성 공급물 용액인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 알칼리성 또는 산성 공급물 용액의 각각은 아미노산, 당 (sugar), 비타민, 미량 원소, 젖산, 및 성장 인자로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법.
  15. 감소된 G(0) 글리코폼 및/또는 증가된 G(1) 글리코폼을 가진 폴리펩티드를 얻기 위한 방법으로서,
    - 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 장치를 포함하는 배양 용기를 이용하여 또는 제 7 항에 따른 기구를 이용하여 유가 배양 또는 연속 배양으로 상기 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 적어도 하나의 산성 공급물 용액 및 적어도 하나의 알칼리성 공급물 용액을 상기 배양 매체에 첨가하는, 세포 배양 단계, 및
    - 상기 배양 매체 또는 상기 세포로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하고,
    상기 혼합된 공급물 용액은, 상기 배양 용기에의 첨가 시에 pH 4.0 ~ pH 6.0 의 pH 값을 갖는, 감소된 G(0) 글리코폼 및/또는 증가된 G(1) 글리코폼을 가진 폴리펩티드를 얻기 위한 방법.
  16. 세포의 유가 배양 또는 연속 배양에서의, 제 7 항에 따른 기구의 사용 방법.
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