JPWO2012105685A1 - キトサン誘導体から得られるヒドロゲル - Google Patents
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Abstract
Description
本発明に関連して用いるキトサンとは、特に言及しない限り、脱アセチル化度が50〜100%のものを意味し、したがって、脱アセチル化度が100%でないものも包含する。
アルドン酸導入率(%)=[Y/(X+Y)]×100 (A)
X=キトサン導入体中に含まれるグルコサミン単位の物質量(モル数)、Y=キトサン誘導体中に含まれるアルドン酸導入グルコサミン単位の物質量(モル数)。
以下、本発明の特徴をさらに具体的に説明するため、グルコン酸をはじめとして、幾つかのアルドン酸を用いた場合の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
2−モルホリノエタンスルホン酸を23.5mMの濃度で溶解させた蒸留水300ml(pH4.0)にキトサン3.0g(商品名「キトサンLL」、脱アセチル化度80%、焼津水産化学工業株式会社製)を溶解させ、1M塩酸水溶液を加えることによりpHを4.0に調整した。表1に示すとおり、この水溶液にグルコン酸ナトリウム(以下、GAと省略)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(以下、EDCと省略)およびN−ヒドロキシこはく酸イミド(以下、NHSと省略)を溶解させ、室温で24時間攪拌することで、キトサンのグルコサミン単位の2位のアミノ基にグルコン酸を導入した(図2参照)。
2−モルホリノエタンスルホン酸を50mMの濃度で溶解させた蒸留水50ml(pH4.0)にグルコン酸修飾キトサン乾燥粉末を0.5g溶解させ、1M塩酸水溶液を加えることによりpHを4.0に調整した。続いて、0.1Mまたは1.0M水酸化ナトリウム水溶液を加えることでpHを上昇させ、その際の溶液の濁度(波長600nm)を測定した。その結果、グルコン酸導入率が増加するにつれ、濁度が上昇しはじめるpHはアルカリ側にシフトし、導入率10.5%および18.7%のキトサン誘導体を溶解させた水溶液はpH7付近の中性領域においてもほとんど白濁せず、生理的pHにおいても溶解可能であることが示された(図4参照)。更に測定を行ったところ、導入率10〜30%において生理的pH域における白濁は認められず、キトサン誘導体(グルコン酸修飾キトサン)が水溶性を有することが明らかとなった。
L929繊維芽細胞を1.0×10−4cells/wellの密度で96wellプレートに播種し、24時間培養した。実施例1で合成したグルコン酸修飾キトサン誘導体を濃度を変えて溶解した最少必須培地(Minimum Essential Medium)(pH7.0)をwellに加え、さらに24時間培養した。続いて、cell counting kit 8(同仁化学)を用いて、細胞の生存率を測定した。なお、キトサン誘導体を含まない培地で培養した細胞の生存率を100%とした。
その結果を図9の(a)に示す。測定誤差の範囲内で、ほぼ100%を示しており、グルコン酸修飾キトサン誘導体は、キトサンと同様に、細胞毒性がきわめて低いことが理解される。
実施例1で合成したグルコン酸導入率18.7%のキトサン誘導体乾燥粉末0.1gを蒸留水10mlに加え、0.1M塩酸水溶液を加えることにより、粉末を完全に溶解させた。続いて、0.1Mまたは1.0M水酸化ナトリウム水溶液を加えることでpHを7.0に調整し、得られた水溶液を断面が星形状の金属鋳型に入れて、−20℃で12時間凍結した。その後、室温での静置により溶解させたところ、金属鋳型の形状に応じた星形状のゲルの生成が確認された(図5参照)。なお、対照として、グルコン酸を導入していないキトサンについても同様にゲル化を試みたが、ゲル化は起らなかった。
実施例1で合成したグルコン酸導入率18.7%のグルコン酸修飾キトサンの1%(w/v)水溶液(pH7.0)を48wellプレートに注ぎ、その底面の半分を当該キトサン誘導体から成るポリマー溶液で覆った。続いて、−20℃で凍結(24時間)後、室温で融解(2時間)することで、ポリマー溶液をゲル化させた。その48wellプレートにL929繊維芽細胞を播種し、培養24時間後に細胞形態を顕微鏡観察したところ、ゲルによる細胞接着性は非常に低いことが認められた。
グルコン酸導入率19.3%のキトサン誘導体乾燥粉末をpH4.0の生理食塩水に溶
解して2(重量/容量)%のキトサン誘導体溶液を得た。また、別の生理食塩水にポリビニルアルコール粉末(分子量1.5×105Da、シグマ・アルドリッチ製)を加えて加熱することで溶解して10(重量/容量)%のポリビニルアルコール溶液を得た。キトサン誘導体溶液とポリビニルアルコール溶液を1:1(体積比)で混合し、その中に0.1Mまたは1.0Mの水酸化ナトリウム水溶液を加えることで、水溶液のpHを7.0に調整し、得られた水溶液1mlを内径11mmの円筒容器に入れて−30℃で24時間凍結した。その後、室温(20℃)で2時間静置して融解させることにより、ポリビニルアルコールを混合したヒドロゲルの生成が確認された。
既述の実施例に従って調製したグルコン酸修飾キトサン(GC)由来のヒドロゲルおよびGCにポリビニルアルコール(PVA)を混合して得られたヒドロゲルについて、下記のように幾つかの特性を評価した。
(1)力学強度(圧縮強度)
円筒容器から円盤状となったゲルを取り出し、その圧縮強度を測定した。この円盤状ゲルを圧縮した際の歪み(%)と応力(mN/mm2)を測定した結果を図6(a)に示す。同図(a)に示すように、本発明に係るヒドロゲルは単独でも十分な圧縮強度を有するが、さらにポリビニルアルコールを混合することで、1(重量/容量)%GC(グルコン酸修飾キトサン)の5倍、2(重量/容量)%GCの3倍まで圧縮強度が飛躍的に向上することがわかった。さらに、ゲルの含水率(%)を(ゲル湿潤重量/ゲル乾燥重量)の比率として算出した結果を図6(b)に示す。一般にゲルの力学強度が高くなるほどゲルの含水率が低くなることから、同図(b)に示すように、本発明に係るヒドロゲルは単独でも十分に低いゲルの含水率を有するが、さらにポリビニルアルコールを混合することで、1(重量/容量)%GCに対して1/4まで、2(重量/容量)%GCに対して1/3までゲルの含水率が低下したことから、ゲルの力学強度が飛躍的に向上することがわかった。
50ml遠沈管の管口に、孔径40μmのメッシュで構成されるセルストレーナー(日本BD製)を設置し、このセルストレーナー内に上記の円盤状ゲル(体積:2ml)を入れ、1200rpmで15分間遠心した。遠心後に遠沈管内に溜まった水の重量から、離水率(%)を(遠心後に遠沈管内にたまった水重量/遠心前のゲル中の水重量)の比率として算出した結果を図7(a)に示す。同図(a)に示すように、本発明に係るヒドロゲルは単独でも十分に高い水分保持力を有するが、さらにポリビニルアルコールを混合することで、1(重量/容量)%GCに対して1/10まで、2(重量/容量)%GCに対して1/15まで離水率が抑えられたことから、水分保持力が飛躍的に向上することがわかった。
本発明に係るヒドロゲルの耐酵素分解性を確認するために、リゾチーム(ヒト体内にも存在するキトサン分解酵素)を含有するリゾチーム水溶液に、本発明に係るヒドロゲルを浸してゲル形状の経時的な変化を観察した。リゾチーム水溶液に浸した直後の写真と24時間後の写真を図7(b)および(c)に示す。特にポリビニルアルコールを混合したヒドロゲルは、同図(d)に示すように、リゾチーム水溶液に浸してから24時間後にも、リゾチーム水溶液に浸した直後と同じような明確なゲル形状を維持していた。このように、本発明に係るヒドロゲルは単独でも十分な耐酵素分解性を有するが、さらにポリビニルアルコールを混合することで、耐酵素分解性が飛躍的に向上することがわかった。
グルコン酸修飾キトサン(GC)にポリビニルアルコール(PVA)を混合した本発明に係るヒドロゲルの免疫賦活能(創傷治癒促進効果)を確認するために、マウス背部皮下にゲルを1週間埋植して経過観察した。本発明に係るヒドロゲルと、5(重量/容量)%のポリビニルアルコールゲル(対照)とを埋植したマウス背部皮下を撮影した写真を図8(a)に示す。同図(a)に示すように、1週間経過後には、本発明に係るヒドロゲルの近傍では、過剰な白血球(免疫細胞)が集積していたが、対照である5(重量/容量)%ポリビニルアルコールゲルの近傍では、白血球の集積は見られなかった。本発明に係るヒドロゲルは、ポリビニルアルコールを混合した後も、キトサンが本来的に有する免疫賦活能を維持していることがわかった。
実施例1に記載の方法と同様の方法により、アルドン酸としてトレオン酸およびキシロン酸を用いて、トレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンを合成した。反応結果を下記の表3に示す。それぞれのアルドン酸の導入率は、実施例1に記載の場合と同様に、キトサン誘導体(アルドン酸修飾キトサン)を塩酸水溶液に溶解させた水溶液に、その塩酸と当モル濃度の水酸化ナトリウム水溶液を加えた際の導電率の変化を測定することにより求めた。
さらに、合成したトレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンを実施例4と同様の手法により、−20℃で12時間凍結した後、室温で融解したところ、ゲル化していることが確認された。
L929繊維芽細胞を1.0×104cells/wellの密度で96wellプレートに播種し、24時間培養した。実施例9で合成したトレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンのそれぞれを溶解した最少必須培地(pH7.0)をwellに加え、さらに24時間培養した。続いて、cell counting kit 8(同仁化学)を用いて、細胞の生存率を測定した。キトサン誘導体を含まない培地で培養した細胞の生存率を100%とした。トレオン酸修飾キトサン誘導体の場合の測定結果を図9の(b)に示す。グルコン修飾キトサンと同様に、トレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンの細胞毒性は低いことが認められた。
実施例9で合成したトレオン酸修飾キトサンおよびキシロン酸修飾キトサンの1%(w/v)水溶液(pH7.0)を48wellプレートに注ぎ、その底面の半分をそれらのアルドン酸修飾キトサンから成るポリマー溶液で覆った。続いて−20℃で凍結(24時間)後、室温で融解(2時間)することで、ポリマー溶液をゲル化させた。その48wellプレートにL929繊維芽細胞を播種し、培養24時間後に細胞形態を顕微鏡観察した。トレオン酸修飾キトサン由来のゲルおよびキシロン酸由来のゲルのいずれの場合においても、ゲルによる細胞接着性は低かった。
Claims (8)
- キトサンのグルコサミン単位のアミノ基にアルドン酸が脱水縮合により結合して成るキトサン誘導体に由来するヒドロゲルの調製方法であって、前記キトサン誘導体を含有する水溶液を所定の形状の型に流し込む工程、前記型内で前記キトサン誘導体含有水溶液を凍結する工程、および、前記凍結したキトサン誘導体含有水溶液を融解して、前記所定の形状に応じた形状のゲルを得る工程、を含むことを特徴とするヒドロゲルの調製方法。
- キトサン誘導体として、脱アセチル化度75〜85%のキトサンを使用して、アルドン酸のキトサンへの導入率が10〜30%であるものを用いる請求項1に記載のヒドロゲルの調製方法。
- アルドン酸がグルコン酸である請求項2に記載のヒドロゲルの調製方法。
- アルドン酸がトレオン酸である請求項2に記載のヒドロゲルの調製方法。
- アルドン酸がキシロン酸である請求項2に記載のヒドロゲルの調製方法。
- 前記キトサン誘導体を含有する水溶液にポリビニルアルコールが混合されている請求項1に記載のヒドロゲルの調製方法。
- 請求項1の方法によって得られることを特徴とするキトサン誘導体由来のヒドロゲル。
- ポリビニルアルコールが混合されている請求項7に記載のキトサン誘導体由来のヒドロゲル。
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