JPH11505411A - 組換えβ細胞およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御することができ、グルコース調節インスリンを産生する組換えβ細胞を提供する。また、本発明は、本発明の組換えβ細胞を用いて糖尿病患者を治療する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えβ細胞およびその使用 発明の背景 糖尿病は膵臓のβ細胞によるインスリンの不十分な産生により特徴づけられる 炭水化物代謝の慢性疾患である。米国では約１０００万人が糖尿病を患っており 、毎年２５０，０００件以上の症例が新たに診断されている。糖尿病には通常２ つの病型があり、インスリン依存型（Ｉ型糖尿病）と非インスリン依存型（II型 糖尿病）である。インスリン依存型糖尿病は一般的にインスリン産生の絶対的な 欠乏に特徴があり、一方非インスリン依存型糖尿病は相対的に不十分なインスリ ン産生に特徴がある。 正常な個体では、β細胞によるインスリンの分泌速度は血中のグルコース濃度 により調節されている。血中グルコース濃度が上昇すると、膵島細胞が刺激され て増加した量のインスリンを血中に放出し、細胞へのグルコース輸送およびグル コースのグリコーゲンへの変換を加速する。血中グルコース濃度が低下するとき は膵島細胞からのインスリン放出が減少する。糖尿病患者においてはインスリン の産生が異常に低いか不十分であって、異常に高い血中グルコース濃度（高血糖 症として知られる症状）をもたらす。 インスリン依存型糖尿病患者の現在の治療法としては、食餌および運動による 治療計画に加えて、インスリン注射と関連した血中グルコース濃度のモニターを 終生続けることが中心となる。しかし、多くの糖尿病患者にとって、現在の治療 法を用いて血中グルコース濃度をコントロールすることは難しく、その結果低血 糖（異常に低い血中グルコース濃度）と高血糖の副作用に自分自身を絶えずさら すことになる。 また、血中グルコース濃度を正確にコントロールできないということは長期の 合併症、例えば変性による血管の変化（例：アテローム硬化症、微小血管障害） 、神経障害（例：末梢神経変性、自律神経系および脳神経の障害）、眼の障害（ 例：視朦、白内障、糖尿病性網膜症）、腎疾患（例：再発性腎孟腎炎、ネフロパ シー）および感染症の問題を提起する。したがって、糖尿病患者の血中グルコー ス濃度をコントロールする代わりの方法を見つける必要がある。糖尿病治療の代 替法としてβ細胞の移植が提案されてきた。しかしながら、ヒトのβ細胞の大規 模移植はドナーが限られているため実現可能性がなく、同様に、移植用の動物の 小島(islets)を十分量で入手することに伴うコストと苦労（労力の点で）もその 使用を阻んでいる。ヒトや動物の小島を移植することに関連したこうした難点の ため、小島由来の細胞系の開発が十分量の移植用細胞を得る上での最良の方法と なる。特に、多数のβ細胞系がインスリンプロモーターの制御下でＳＶ４０のＴ 抗原(Tag)オンコジーンをコードするトランスジーン(RIP-Tag)を発現するマウス において発生する増殖性小島およびインスリノーマ（膵島細胞腺腫）から作製さ れている（１−６）。これらの細胞系のいくつかは、特に生理学的範囲のグルコ ース濃度（５〜１５mmol/l）に応答して、成人の無傷の小島で観察されたものと よく似たインスリン分泌特性を示した。 しかし、こうした細胞系のすべてが直面する共通した問題はそれらの表現型が 不安定であることである。組織培養で増殖させた後、これらの細胞は生理学的濃 度以下のグルコースに応答するようになり、そして／また、インスリン分泌量の 低下を示すようになる（４，６−９）。他の方法により誘導されたβ細胞系の場 合にも同様の不安定性が観察されている（１０−１２）。 本発明は、血中グルコース濃度を正常範囲に維持するばかりでなく調節不能な 増殖を防止するように制御することができるβ細胞系を提供することにより、こ れまでのβ細胞系が抱えていた問題を克服するものである。発明の概要 本発明は、テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御でき、グルコ ース調節インスリンを産生する組換えβ細胞を提供する。 本発明はまた、下記マイクロカプセルを移植された患者において生理的に許容 されるグルコース濃度を維持するのに十分な量の上記の組換えβ細胞を含有する マイクロカプセルを提供する。 本発明はさらに、（ａ）糖尿病患者に、テトラサイクリンまたはその誘導体に より増殖を制御できる組換えβ細胞を、生理的に許容される血中グルコース濃度 を達成しかつ維持するのに有効な量で移植し、そして（ｂ）移植した組換えβ細 胞の増殖を抑制するのに有効な量のテトラサイクリンまたはその誘導体を患者に 投与することにより移植した組換えβ細胞の増殖を抑制する、ことを含んでなる 糖尿病患者の治療方法を提供する。 本発明はまた、テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御でき、グ ルコース調節インスリンを産生する組換えβ細胞の作製方法であって、（ａ）第 １の非ヒト動物に、tetR-VP16 融合タンパク質をコードするＤＮＡおよびこの融 合タンパク質の発現を制御するインスリンプロモーターを含有する第１のプラス ミドを導入して、第１の遺伝的にコントロールされた非ヒト動物をつくり、（ｂ ）第２の非ヒト動物に、ＳＶ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡおよびテトラサイ クリン（Ｔｃ）オペレーター最小プロモーターを含有する第２のプラスミドを導 入して、第２の遺伝的に修飾された非ヒト動物をつくり、（ｃ）第１の遺伝的に 修飾された非ヒト動物またはその子孫を第２の遺伝的に修飾された非ヒト動物ま たはその子孫と交配させてその後代(progeny)をつくり、（ｄ）テトラサイクリ ンまたはその誘導体により増殖を制御できるβ細胞腫瘍を担持する二重トランス ジェニック非ヒト動物に関してその後代をスクリーニングし、そして（ｅ）その 後上記のβ細胞を単離する、各ステップを含んでなる方法を提供する。 本発明はまた、テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御でき、グ ルコース調節インスリンを産生する組換えβ細胞の作製方法であって、（ａ）β 細胞に、TetR-VP16 融合タンパク質をコードするＤＮＡおよびこの融合タンパク 質の発現を制御するインスリンプロモーターを含有する第１の遺伝子、およびＳ Ｖ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡおよびテトラサイクリンオペレーター最小プ ロモーターを含有する第２の遺伝子を導入して、両遺伝子の安定した組込みを達 成し、そして（ｂ）テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御できる β細胞に関してスクリーニングする、各ステップを含んでなる方法を提供する。 本発明はさらに、テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御できる 組換え細胞の作製方法であって、（ａ）第１の非ヒト動物に、tetR-VP16 融合タ ンパク質をコードするＤＮＡおよびこの融合タンパク質の発現を制御する上記細 胞に特異的なプロモーターを含有する第１のプラスミドを導入して、第１の遺伝 的に修飾された非ヒト動物をつくり、（ｂ）第２の非ヒト動物に、ＳＶ４０のＴ 抗原をコードするＤＮＡおよびテトラサイクリンオペレーター最小プロモーター を含有する第２のプラスミドを導入して、第２の遺伝的に修飾された非ヒト動物 をつくり、（ｃ）第１の遺伝的に修飾された非ヒト動物またはその子孫を第２の 遺伝的に修飾された非ヒト動物またはその子孫と交配させてその後代をつくり、 （ｄ）テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御できる腫瘍を担持す る二重トランスジェニック非ヒト動物に関してその後代をスクリーニングし、そ して（ｅ）上記の細胞を単離する、各ステップを含んでなる方法を提供する。 最後に、本発明は、テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御でき る組換え細胞の作製方法であって、（ａ）細胞に、TetR-VP16 融合タンパク質を コードするＤＮＡおよびこの融合タンパク質の発現を制御する上記細胞に特異的 なプロモーターを含有する第１の遺伝子、およびＳＶ４０のＴ抗原をコードする ＤＮＡおよびテトラサイクリンオペレーター最小プロモーターを含有する第２の 遺伝子を導入して両遺伝子の安定した組込みを達成し、そして（ｂ）テトラサイ クリンまたはその誘導体により増殖を制御できる細胞に関してスクリーニングす る、各ステップを含んでなる方法を提供する。図面の簡単な説明 図１は図１Ａおよび１Ｂから成り、条件的形質転換戦略において用いられる遺 伝子構築物を表す。図１Ａにはtet-Tag 構築物を示してある。Ｔｃオペレーター 配列の縦列配置および最小プロモーター（斜線を付けたボックス）の制御下にＳ Ｖ４０のTag 遺伝子を配置した。図１ＢにはRIP-tTA 構築物を示してある。tetR およびHSV VP16タンパク質の活性化ドメインをコードする融合遺伝子を、イント ロン要素(int)の下流でポリアデニル化シグナル(A_n)の上流に、RIP プロモータ ーの制御下に置いた。 図２は図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆから成り、βTC-tet細胞の 増殖およびTag 発現に及ぼすＴｃの影響を表す。同数のβTC-tet細胞を２列のウ ェルにまいた。これらの細胞を１flg/mlのＴｃの不在下（図２Ａ）または存在下 （図２Ｂ）で３週間増殖させ、位相差顕微鏡写真を撮った。類似の細胞を１６ウ ェルスライドにまき、１μg/mlのＴｃの不在下（図２Ｃおよび２Ｅ）または存在 下（図２Ｄおよび２Ｆ）で７日間インキュベートした。細胞をBrdU（図２Ｃおよ び２Ｄ）で１時間パルスし、抗BrdUモノクローナル抗体で染色した。別のウェル の細胞をTag 抗血清（図２Ｅおよび２Ｆ）で染色した。結合した抗体をホースラ ディッシュペルオキシダーゼと結合させた二次抗体により可視化した。示した細 胞は３つの独立した実験を表す。倍率はX200である。 図３はＴｃおよびアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）とともにインキュベ ーションした後のβTC-tet細胞の増殖停止を表す。４回の反復実験にてウェル中 の２×１０⁴個の細胞を表示濃度のＴｃ（円）またはＡＴｃ（四角）の存在下に ７日間インキュベートした。次にこれらの細胞を[³H]チミジンで６時間パルスし 、その後ＤＮＡに取り込まれた放射能を測定した。数値は薬剤の不在下でのカウ ント数（ウェルにつき平均４×１０⁴cpm）に対するパーセントを表す。 図４は図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄから成り、Tag 発現およびβTC-tet細胞 のin vivo 増殖に及ぼすＴｃの影響を表す。βTC-tet腫瘍を担持するマウスにい つもの飲料水（図４Ａおよび４Ｃ）またはＴｃ含有水（図４Ｂおよび４Ｄ）を７ 日間与えた。次にマウスをBrdU（図４Ａおよび４Ｂ）およびTag（図４Ｃおよび ４Ｄ）抗血清でパルスした。結合した抗体をホースラディッシュペルオキシダー ゼと結合させた二次抗体により可視化した。倍率はX230である。 図５は、βTC-tet細胞が糖尿病患者において正常な血中グルコース濃度を維持 することを示す。ストレプトゾトシンで処理して糖尿病を発症させたマウスに２ ×１０⁶個の細胞を腹腔内移植する（円、四角）かまたは細胞をまったく移植し なかった（三角）。細胞を移植した日を０日目として示してある。血中グルコー ス濃度を毎週測定した。血中グルコースが正常値に戻った時点で、１群のマウス （円）に徐放性Ｔｃペレットを移植した（矢印）。この群のマウスの血中グルコ ース濃度は安定したままであったが、Ｔｃで処理されなかったマウス群ではイン スリン分泌細胞の制御されない増殖のため血中グルコース濃度が低下し続けた。 この群の低血糖の結果として１匹の腫瘍担持マウスが３２日目に死亡し、２匹の マウスが５０日目に死亡した。数値は平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）である。３９日と ４６日の時点で細胞±Ｔｃを注射された２群の間にはｔ検定で有意差がある（ｐ ＜０．０１）。発明の詳細な説明 本発明は、ヒトまたは動物のグルコース調節インスリンを産生する組換えβ細 胞であって、その増殖が、該細胞をテトラサイクリンまたはその誘導体の１つと 共にインキュベーションすることにより制御されうる細胞を提供する。本発明の 好ましい実施態様では、該組換えβ細胞は、βTC-tetと称される細胞系内に含ま れており、該細胞系はブダペスト条約の条項に従いAmerican Type Culture Coll ection(ATCC)(Rockville，Maryland)に1995年3月31日に寄託されており、ATCC受 託番号CRL−11869が付与されている。該細胞系の生存性は1995年4月6日に確認さ れている。また、本発明は、受託番号CRL-11869としてATCCに寄託されているβ 細胞系を提供する。 本発明の組換えβ細胞は、２つの系統の非ヒト・トランスジェニック動物（例 えば、ウシ、ブタ、マウスなど、好ましくはマウス）を交配させることにより作 製することができる。一方の系統のβ細胞は、インスリンプロモーター制御下の tetRとHSV VP16タンパク質の活性化ドメインとからなる融合タンパク質を含有す る。tetRとHSV VP16配列との組み合わせは、tetRを転写アクチベーターに変換す る。トランスジェニックマウスのもう一方の系統は、Tcオペレーター配列の縦列 配置および最小プロモーターの制御下のTag遺伝子を含有する。該最小プロモー ター単独では、Tag遺伝子の発現を指令する能力がない。しかしながら、テトラ サイクリン制御トランスアクチベーター （tTA）と称されるtetR-VP16転写アク チベーターが存在すれば、Tag遺伝子発現が活性化される。二重トランスジェニ ックマウスでは、Tagが発現され、この発現によりβ細胞腫が生じる。ついで、 テトラサイクリンまたはその誘導体の１つにより増殖が抑制されるβ細胞腫を選 択して、本発明のβ細胞を得る。 本発明の組換えβ細胞はまた、インスリンプロモーター制御下のtetRとHSV VP 16タンパク質の活性化ドメインとからなる融合タンパク質をコードする第1遺伝 子、およびTcオペレーター配列の縦列配置および最小プロモーターの制御下のSV 40 T抗原をコードする第2遺伝子を組織培養中のβ細胞内に導入することにより 作製することができる。該β細胞は、ウシ、ブタ、マウスまたはヒト由来のも のがあり、好ましくはヒト由来のβ細胞であるが、これらに限定されるものでは ない。リン酸カルシウム沈殿、カチオンリポソーム融合、エレクトロポレーショ ンなどの当業者によく知られている方法によるβ細胞の安定トランスフェクショ ンにより、該遺伝子を導入することができる。あるいは、当業者によく知られて いる技術によりヘルペスウイルス、アデノウイルスまたはレトロウイルスに基づ くベクターなどのウイルスベクターを用いて、該遺伝子をβ細胞中に導入するこ とができる。ついで、テトラサイクリンまたはその誘導体の１つにより増殖が抑 制されるβ細胞を選択して、本発明のβ細胞を得る。 該組換えβ細胞はインスリン分泌および血中グルコース調節に関して正常なβ 細胞の特徴を保持するため、該組換えβ細胞は動物およびヒトの両方の糖尿病治 療におけるインスリン投与に代わる方法を提供する。したがって、本発明は、糖 尿病患者を治療する方法も提供する。該方法は、生理的に許容される血中グルコ ース濃度を達成し維持するのに有効な量の組換えβ細胞を糖尿病患者の体内に移 植し、ついで、該組換えβ細胞の増殖を抑制するのに十分な量のテトラサイクリ ンまたはその誘導体の１つを投与することにより該組換えβ細胞の増殖を抑制す ることを含んでなる。該β細胞は、それがレシピエントの血流と接触する体内の いずれの可能な位置に移植してもよい。適当な位置としては、腹膜腔、膵臓など が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の位置は当業者には明ら かであろう。該β細胞は、外科的手段、注射などの当業者に公知の方法により移 植してもよい。β細胞の有効量は、好ましくは、約１億〜３億個の細胞である。 しかしながら、β細胞の有効量は、移植方法、治療される患者の薬物動態的特性 および／または他の疾患または症状の存在に左右される。そのような量は、当業 者により容易に決定される。 移植されたβ細胞の拒絶は、シクロスポリン、アザチオプリンなどの免疫抑制 薬を投与することにより抑制することができる。あるいは、移植前に、該β細胞 をマイクロカプセル化してもよい。本発明で用いる「マイクロカプセル化」なる 語は、レシピエントの体内に導入された外来細胞を該レシピエントの免疫系によ る破壊から防御するために使用できる任意の方法を意味する。マイクロカプセル 化方法には、特許第5,389,535号、第5,334,640号に記載の方法、および米国特 許第5,344,471号および第5,344,454号に記載の組織移植系などが挙げられるが、 これらに限定されるものではない（上記特許を参考としてここに組み入れる）。 該β細胞をマイクロカプセル化するための他の手段や別の組織移植系は、当業者 には明らかであろう。 また本発明は、前記β細胞を含んでなるマイクロカプセルであって、該β細胞 の含有量が、該マイクロカプセルを用いて移植された患者において生理的に許容 されるグルコース濃度を維持するのに十分な量であることを特徴とするマイクロ カプセルを提供する。好ましくは、ベーター細胞は、受託番号CRL-11869としてA TCCに寄託されている細胞系から得られる。前記のとおり、β細胞の量は、１億 〜３億個の細胞であってもよい。ここでもまた、実際の量は、移植方法、治療対 象患者の薬物動態的特性および／または他の疾患または症状の存在に左右される 。そのような量は、当業者により容易に決定される。本発明で用いる「マイクロ カプセル」なる語は、患者体内へ移植するためのマイクロカプセル化方法で用い るいずれかのビヒクル、ポリマー組成物などの手段を意味する。 テトラサイクリンは、Sigma Chemical Co．(St．Louis，Missouri)から商業的 に入手可能である。テトラサイクリン誘導体としては、アンヒドロテトラサイク リン、7−クロロ−テトラサイクリン、4−エピ−7−クロロ−テトラサイクリン 、オキシ−テトラサイクリン、ドキシサイクリン、6−デオキシ−6−デメチル− テトラサイクリン、7−アジド−6−デオキシ−6−デメチル−テトラサイクリン などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらのおよび他の誘 導体は商業的に入手可能である。アンヒドロテトラサイクリンが好ましいが、そ の理由は、アンヒドロテトラサイクリンはテトラサイクリンより有効にtetRに結 合し、より低い抗生物質活性を有し、そのため長期投与が可能であることにある 。テトラサイクリンおよびその誘導体は、経口的に、あるいは静脈内または筋肉 内注射により投与することができる。他の投与方法は、当業者には明らかであろ う。テトラサイクリンの量は、β細胞の増殖を抑制するのに有効な量である。実 際の投与量は、投与経路、および治療対象患者の個々の薬物動態的パラメーター に依存する。実際の投与量は、当業者により容易に決定される。 また本発明は、β細胞に加え種々の細胞型から組換え細胞系を作製するための 一般的な方法を提供する。そのような細胞系は、既に記載されているいずれかの 組換えβ細胞作出方法により作製することができる。しかしながら、そのような 細胞を作製する場合には、該β細胞内でのTetR-VP16融合タンパク質の発現を制 御するために使用するインスリンプロモーターを、関心ある細胞型に特異的なプ ロモーターと置換する。そのような細胞特異的プロモーターは、当業者によく知 られている。例えば、本発明の組換え肝細胞を作製する場合には、アルブミンプ ロモーターなどの肝臓特異的プロモーターを使用してもよい。 以下、本発明の理解を助けるために記載する「実験詳細の部」において本発明 を説明するが、これは、その後に続く請求の範囲で定義される本発明を何ら限定 するものではない。実験詳細の部 Ａ．材料および方法 プラスミド構築物 プラスミドpUHD10-3およびpUHD15-1を、H．Bujard，Zentrum fur Molekulare Biologie der Universtat Heidelberg(Neuenheimer Feld 282，W-6900 Heidelbe rg，Germany)から入手した。tet-Tagプラスミドを構築するために、ｐRIP-Tag（ 14）からのRIPを含有するAat II-Xba I断片を欠失させ、Aat IIおよびXho I部位 を平滑末端に変換することにより、７コピーのTcオペレーター配列の縦列配置お よびCMV最小プロモーターを含有するpUHD10-3（13）からのXhoI−Xba I断片をpR IP-Tag中のＴ抗原遺伝子の前に配置した。 ｐRIP-tTAを得るために、pUHD15-1（13）からのEcoR I-BamH I tTa断片をKlen owで平滑末端にし、Pst I-Sma I CAT断片を除去した後、ｐMLSIS.CAT（15）のSm a I部位に連結した。これにより、ハイブリッドイントロン要素の下流でSV40後 期ポリアデニル化部位の上流にtTA遺伝子が配置された。合体された1630bpの断 片を、ラットインスリンIIプロモーターの下流のｐRIP-TagのXba I部位とSal I 部位との間に挿入した。トランスジェニックマウス 線状化プラスミドＤＮＡを、1-細胞C3HeB/FeJマウス胚中へマイクロインジェク ションした。確立されている方法（16）に従いトランスジェニックマウスを作製 し、飼育した。細胞培養 膵臓から腫瘍を摘出し、記載されているとおりに（２）、βTC-tetと称される β細胞系を樹立し、増殖させた。培地はすべて、GIBCOから入手した。25mMグル コースを含有し、15％ウマ血清、2.5％ウシ胎児血清、100U/mlペニシリンおよび 100μg/mlストレプトマイシンで補足されたDMEM中で細胞を増殖させた。テトラ サイクリン（United States Biochemical Corporation）およびアンヒドロテト ラサイクリン（ATc）（Lederle）を、示されている濃度で加えた。細胞移植 細胞をトリプシン処理し、PBS中で洗浄し、PBSに５×10⁶個の細胞／mlにて再 懸濁した。レシピエントC3Hマウスにそれぞれ10⁶個の細胞を腹腔内（I.P.）注射 し、通常の飲料水または１mg/ml Tcおよび2.5％スクロースを含有する水を与え て維持した。各群には４〜５匹のマウスが含まれていた。それらの血中グルコー スを、Glucometerストリップを用いて毎週モニターした。糖尿病マウスを作製す るために、12匹のC3H雄マウスに、体重１Kgあたり200mgのストレプトゾトシン(S igma)の１回量を腹腔内注射し、７日後に50mg/Kgの３回量を3日連続で投与した ところ、それから６〜９日以内に高血糖を起こした。ついで８匹のマウスに２× 10⁶個のβTC-tet細胞を腹腔内注射し、一方、4匹のマウスは糖尿病対照として残 した。マウスの血中グルコース濃度を毎週モニターした。細胞移植群で正常血糖 が得られたら、この群のマウスの4匹に、１日あたり3.3mgを放出するよう設計さ れた徐放性Tcペレット（Innovative Research of America）を皮下移植し、つい で血中グルコースを毎週調べた。40mg/dl以下のグルコース濃度を、Beckmanグル コース分析器を用いて測定した。免疫組織化学 TcまたはATcの不存在下または存在下、示されている期間、16ウェルスライド （Nunc）中に細胞をプレーティングした。BrdU取り込みアッセイでは、製造業者 の推奨に従い、細胞を10μM BrdU（Sigma）で60分間パルスし、抗BrdUモノクロ ーナル抗体（Becton-Dickinson）で染色した。該結合抗体を、ビオチン化抗マウ スIgGおよびホースラディッシュペルオキシダーゼ結合アビジン（Vector，ABC キット）およびジアミノベンジジン（DAB）基質で可視化した。別のウェル中の 細胞を、ウサギ抗Tag血清（17）で染色した。該結合抗体を、ホースラディッシ ュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体およびDABで可視化した。βTC-tet腫 瘍を有するマウスに、体重１gあたり100μgのBrdUを腹腔内注射した。１時間後 、それらを犠牲にし、腫瘍を摘出し、４％緩衝化ホルムアルデヒドで固定し、パ ラフィン包埋のために加工し、切片化した。腫瘍切片を抗Tag抗体および抗BrdU 抗体で前記のとおり染色した。チミジン取込みアッセイ ２×10⁴個の細胞を96ウェルプレートにまいた。示されているインキュベーシ ョンの後、それらを１μCi［メチル−³H］チミジン（Amersham，78Ci/mmol）で ６時間パルスした。ついで該細胞を水中で細胞ハーベスターを用いて溶解し、該 ＤＮＡをガラス繊維フィルター（Whittaker）上に保持した。該フィルターを乾 燥し、ＤＮＡに取り込まれた放射能をシンチレーション計数器で定量した。各状 態を４回の反復実験でアッセイした。 Ｂ．結果 tTa遺伝子をRIPの制御下に配置し（図１）、該構築物を用いて、tTAをβ細胞 内で特異的に構成的に発現するトランスジェニックマウスを作製した。別系統の トランスジェニックマウスでは、最小プロモーターおよびTcオペレーター配列の 縦列配置の制御下でTag遺伝子を導入した（図１）。このプロモーターは、単独 では該遺伝子を発現させない。したがって、予想されるとおり、これらのトラン スジェニックマウスには腫瘍が発生しなかった。その２つの系統のマウスを交配 して、二重トランスジェニックマウスを作製した。これらのマウスでは、β細胞 内でtTAタンパク質のtetR部分が標的Tcオペレーター配列に結合し、該分子のVP1 6部分がTag遺伝子の転写を活性化するのを可能にすると予想される。この結果、 ５〜６月齢までに多発性β細胞腫が発生した。他の器官では腫瘍は検出されなか ったが、これは、β細胞特異的腫瘍発生には、TagのtTA誘導発現が必要であるこ とを示すものである。 該腫瘍からの細胞を培養して、βTC-tetと称される安定な細胞系を誘導した。 該細胞を１μg/ml Tcの存在下でインキュベーションしたところ、コロニーの細 胞数およびサイズが図2Aと2Bとで相違することから示されるとおり、該細胞は増 殖停止を受けた。この効果は可逆的である。３週間のインキュベーションの後で Tcを除くと、細胞複製が回復した（示されていない）。βTC-tet細胞内のＤＮＡ 複製に対するTcの効果を、抗BrdUモノクローナル抗体でBrdU取込みを可視化する ことにより分析した。Tcの不存在下では、１時間のパルス中に多数の複製細胞が BrdUを取り込んだ（図2C）。１μg/ml Tc中で３日間インキュベーションした後 では、少数の細胞だけがBrdUを取り込んだ（データは示していない）。７日間の インキュベーションの後では、BrdUを取り込む細胞は認められなかった（図2D） 。Tag発現に対するTcの効果を、Tag抗血清を用いる免疫組織化学的方法により分 析した。１μg/ml Tc中での７日間のインキュベーションの後では、ほとんどの 細胞からTag免疫染色が消失した（図2F）。しかしながら、少数の細胞は検出可 能なTag染色を維持した。 細胞増殖に対する種々の濃度のTcの効果を、複製ＤＮＡへの³H−チミジン取込 みにより分析した（図３）。複製の完全な停止は、100ng/mlのTcの存在下で得ら れた。TetRに対するTc誘導体ATcの結合は、TetRに対するTcの結合より35倍強力 であることが示されている（18）。図３に示すように、ATc存在下でβTC-tet細 胞をインキュベーションしたところ、１ng/mlにおいて完全な増殖停止が起こっ た。 Tc調節に応答しないRIP-Tag遺伝子を発現するマウスに由来するもう１つのβ 細胞系であるβTC3（２）からの細胞を、これらの実験において対照として使用 した。TcまたはATcのいずれかの１μg/mlの存在下でβTC3細胞をインキュベーシ ョンしても、その増殖速度、BrdUおよび³H−チミジン取込み、およびTag染色は 影響されなかった（示されていない）。 Tcの細胞増殖調節能をin vivoで調べるために、同系C3Hマウウスに10⁶個のβT C-tet細胞を腹腔内注射した。βTC細胞系は腫瘍形成性であり、注射部位に良性 腫瘍を形成する（２）。腫瘍発生により低血糖が生じ、腫瘍発生は血中グルコー ス濃度をモニターすることにより検出できる。一群のマウスを、Tc含有飲料水で 維持した。血中グルコースの測定および注意深い剖検による評価では、それらは いずれも、14週以内に腫瘍を発生しなかった。長期のTc処理による異常は認め られなかった。Tcの不存在下で維持されたマウスには、８〜13週以内に低血糖お よび腫瘍が生じた。低血糖が検出されたら、１つの亜群に通常の水を飲ませ続け た。ついで該マウスをBrdUでパルスし、犠牲にし、腫瘍を摘出し、免疫組織化学 的分析のために加工した。Tcで処理していないマウスからの腫瘍は、BrdUおよび Tagに関して染色される多数の細胞を含有していた（図4Aおよび4C）。これに対 し、Tcで７日間処理したマウスからの腫瘍は、BrdUおよびTag染色を示さなかっ た（図4Bおよび4D）。これらの結果は、TcがTag発現およびβ細胞増殖をin vivo で有効に抑制することを示す。 βTC-tet細胞は、生理的濃度範囲のグルコースに対して正しい応答を示す（デ ータは示していない）。この細胞がグルコースの恒常性をin vivoで維持する能 力を評価するために、糖尿病のレシピエントにβTC-tet細胞を移植した（図５） 。該細胞移植は２週間以内に高血糖を矯正したが、このことは、βTC-tet細胞が in vivoで正常β細胞として機能しうることを示すものである。これまで他のβT C系で認められているように、該移植細胞はTcで処理していないマウス内で増殖 し続け、低血糖および早期死を引き起こした。これに対し、徐放性Tcペレットを 移植したマウスでは、血中グルコース濃度が正常範囲で安定した。マウスを追跡 したところ、Tc移植後４ヶ月もの長い間、正常血中グルコース濃度が維持された 。これらの結果から、Tag発現のTc誘導抑制により、該細胞は増殖停止を受ける が、生存能が維持され、該細胞は正常なグルコース感知能およびインスリン産生 ・分泌能を有することが示される。 Ｃ．考察 これらの結果は、Tcまたはその誘導体ATcの存在下、tetRがそれと関連のある オペレーター配列に結合するのを制御することにより、癌遺伝子発現および細胞 増殖を調節しうることを示す。細胞複製の完全抑制に必要なTcの濃度は、0.1μg /ml未満である。ATcはより高い親和性でtetRに結合し、100倍低い濃度でこの効 果を奏する。同時に、ATcはTcと比べてリボソームに対する結合が非常に低下し ているため（18）、抗生物質活性が非常に弱い。これらの性質のため、ATcはin vivoでの持続的治療のためのより魅力的なリガンドとなる。 βTC-tet細胞を１μg/ml Tcの存在下で７日間インキュベーションしても、免 疫組織化学的分析による評価では、Tagタンパク質はすべての細胞から完全には 除去されなかった。これに対し、in vivoで７日間Tc処理した後では、Tagは検出 されなかった。これは、培養中のTagタンパク質またはｍＲＮＡの持続的安定性 または調節系の漏出を表しているのかもしれない。しかしながら、Tagのトラン スフォーメーション活性には、化学量論的相互作用（例えば、癌抑制遺伝子産物 の滴定）に十分な癌タンパク質の閾値レベル（19）が必要であることを指摘しな ければならない。BrdUおよび[³H]チミジン取込みアッセイにより示されるとおり 、Tc処理により、Tagレベルがこの機能的閾値以下にダウンレギュレーションさ れたと考えられる。 これらの結果から、トランスフォームされたβ細胞の増殖は、Tag癌タンパク 質の連続的発現に依存することが明らかとなった。これらのマウスにおけるβ細 胞腫の発生は、該小島の１〜２％で生じる希有な事象である。これは、該細胞内 の追加的な遺伝的変化が関与していることを示唆する。しかしながら、本発明者 らの結果は、これらの変化は、十中八九、細胞周期を調節する遺伝子内に突然変 異を含まないことを示す。なぜなら、該細胞は、細胞周期を繰り返すためにはTa gの活性を必要とし続けるからである。 飲料水中のTcを投与したり徐放性ペレットを用いることによりin vivoで細胞 増殖を制御しうることや、Tcによる遺伝子発現の抑制が薬剤の除去後に逆転可能 であることから、腫瘍発生の種々の段階でのTag癌タンパク質の役割を研究する ための実験系が得られる。さらに、tet-Tagマウスを用いると、適当な細胞特異 的プロモーターによりtTA融合タンパク質の発現を標的化することにより、条件 的トランスフォーム化細胞系を他の細胞型から誘導することが可能となる。同様 に、β細胞内でtTAタンパク質を発現するマウスを用い、それを、Tcオペレータ ー最小プロモーター制御下でそのような遺伝子を発現するマウスと交配すること により、関心のある他の遺伝子をこれらの細胞内で可逆的に発現させることがで きる。 βTC-tet細胞系は、β細胞内での分化した機能の発現に対する細胞増殖の効果 に関する研究を可能にするだろう。糖尿病マウス内に移植された細胞の場合に得 られた結果から、増殖停止されたβTC-tet細胞からのインスリン分泌は依然とし て正しく調節され、これにより、それが血中グルコース濃度を生理的範囲内に維 持するのを可能とすることを示す。これらの細胞内でのグルコース誘導インスリ ン合成および分泌に対する細胞増殖の効果を判定するためには、培養下で増殖し 、Tcの存在下で増殖停止を受けるよう誘導された細胞を、Tcの不存在下で培養さ れている活発に増殖する細胞と比較して研究する。ここに記載した戦略は、糖尿 病の細胞療法のためのβ細胞系の開発、および治療的可能性を有する他の細胞型 からの条件的トランスフォーム化細胞系の作出に寄与するであろう。 以上挙げたすべての刊行物の全体を、本明細書中に組み入れるものとする。 以上、本発明の明瞭化および理解のためにある程度詳しく説明してきたが、当 業者であれば、添付の請求の範囲に記載の本発明の真の範囲から逸脱することな くその態様および詳細を種々変化させてもよいと該開示の解釈から理解されよう 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御することができ、グル コース調節インスリンを産生する組換えβ細胞。 ２．ＡＴＣＣに受託番号CRL-11869 として寄託された細胞系内に含まれる、請求 項１に記載のβ細胞。 ３．ＡＴＣＣに受託番号CRL-11869 として寄託されたβ細胞系。 ４．下記マイクロカプセルを移植された患者において生理的に許容されるグルコ ース濃度を維持するのに十分な量の請求項１に記載のβ細胞を含有するマイクロ カプセル。 ５．下記マイクロカプセルを移植された患者において生理的に許容されるグルコ ース濃度を維持するのに十分な量の請求項２に記載のβ細胞を含有するマイクロ カプセル。 ６．糖尿病患者の治療方法であって、 （ａ）糖尿病患者に、テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御 でき、グルコース調節インスリンを産生する組換えβ細胞を、該患者において生 理的に許容される血中グルコース濃度を達成しかつ維持するのに有効な量で移植 し、そして （ｂ）移植した組換えβ細胞の増殖を抑制するのに有効な量のテトラサイク リンまたはその誘導体を該患者に投与することにより、移植した組換えβ細胞の 増殖を抑制する、 ことを含んでなる方法。 ７．移植されるβ細胞がＡＴＣＣに受託番号CRL-11869 として寄託された細胞系 から得られる、請求項６に記載の方法。 ８．移植されるβ細胞がマイクロカプセル化されている、請求項６に記載の方法 。 ９．β細胞が前記患者の腹腔内に移植される、請求項６に記載の方法。 10．β細胞が前記患者の膵臓内に移植される、請求項６に記載の方法。 11．テトラサイクリンの誘導体がアンヒドロテトラサイクリン、７−クロロ−テ トラサイクリン、４−エピ−７−クロロ−テトラサイクリン、オキシ−テトラ サイクリン、ドキシサイクリン、６−デオキシ−６−デメチル−テトラサイクリ ンおよび７−アジド−６−デオキシ−６−デメチル−テトラサイクリンより成る 群から選ばれる、請求項６に記載の方法。 12．テトラサイクリンの誘導体がアンヒドロテトラサイクリンである、請求項11 に記載の方法。 13．テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御でき、グルコース調節 インスリンを産生する組換えβ細胞の作製方法であって、 （ａ）第１の非ヒト動物に、tetR-VP16 融合タンパク質をコードするＤＮＡ およびこの融合タンパク質の発現を制御するインスリンプロモーターを含有する 第１のプラスミドを導入して、第１の遺伝的に修飾された非ヒト動物をつくり、 （ｂ）第２の非ヒト動物に、ＳＶ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡおよびテ トラサイクリンオペレーター最小プロモーターを含有する第２のプラスミドを導 入して、第２の遺伝的に修飾された非ヒト動物をつくり、 （ｃ）上記の第１の遺伝的に修飾された非ヒト動物またはその子孫を上記の 第２の遺伝的に修飾された非ヒト動物またはその子孫と交配させてその後代をつ くり、 （ｄ）テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御できるβ細胞腫 瘍を担持する二重トランスジェニック非ヒト動物に関して上記の後代をスクリー ニングし、そして （ｅ）上記のβ細胞を単離する、 各ステップを含んでなる方法。 14．非ヒト動物がウシ、ブタまたはマウスである、請求項13に記載の方法。 15．請求項13に記載の方法により作製された組換えβ細胞。 16．テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御でき、グルコース調節 インスリンを産生する組換えβ細胞の作製方法であって、 （ａ）β細胞に、TetR-VP16 融合タンパク質をコードするＤＮＡおよびこの 融合タンパク質の発現を制御するインスリンプロモーターを含有する第１の遺伝 子、およびＳＶ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡおよびテトラサイクリンオ ペレーター最小プロモーターを含有する第２の遺伝子を導入して、両遺伝子の安 定した組込みを達成し、そして （ｂ）テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御できるβ細胞に 関してスクリーニングする、 各ステップを含んでなる方法。 17．β細胞がウシ、ブタ、マウスまたはヒト由来のものである、請求項16に記載 の方法。 18．前記の遺伝子がトランスフェクションにより導入される、請求項16に記載の 方法。 19．前記の遺伝子がウイルスベクターにより導入される、請求項16に記載の方法 。 20．請求項16に記載の方法により作製された組換えβ細胞。 21．テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御できる組換え細胞の作 製方法であって、 （ａ）第１の非ヒト動物に、tetR-VP16 融合タンパク質をコードするＤＮＡ およびこの融合タンパク質の発現を制御する上記細胞に対して特異的なプロモー ターを含有する第１のプラスミドを導入して、第１の遺伝的に修飾された非ヒト 動物をつくり、 （ｂ）第２の非ヒト動物に、ＳＶ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡおよびテ トラサイクリンオペレーター最小プロモーターを含有する第２のプラスミドを導 入して、第２の遺伝的に修飾された非ヒト動物をつくり、 （ｃ）第１の遺伝的に修飾された非ヒト動物またはその子孫を第２の遺伝的 に修飾された非ヒト動物またはその子孫と交配させてその後代をつくり、 （ｄ）テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御できる腫瘍を担 持する二重トランスジェニック非ヒト動物に関してその後代をスクリーニングし 、そして （ｅ）上記の細胞を単離する、 各ステップを含んでなる方法。 22．非ヒト動物がウシ、ブタまたはマウスである、請求項21に記載の方法。 23．請求項21に記載の方法により作製された組換え細胞。 24．テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御できる組換え細胞の作 製方法であって、 （ａ）細胞に、TetR-VP16 融合タンパク質をコードするＤＮＡおよびこの融 合タンパク質の発現を制御する上記細胞に特異的なプロモーターを含有する第１ の遺伝子、およびＳＶ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡおよびテトラサイクリン オペレーター最小プロモーターを含有する第２の遺伝子を導入して、両遺伝子の 安定した組込みを達成し、そして （ｂ）テトラサイクリンまたはその誘導体により増殖を制御できる細胞に関 してスクリーニングする、 各ステップを含んでなる方法。 25．前記の細胞がウシ、ブタ、マウスまたはヒト由来のものである、請求項24に 記載の方法。 26．前記の遺伝子がトランスフェクションにより導入される、請求項24に記載の 方法。 27．前記の遺伝子がウイルスベクターにより導入される、請求項24に記載の方法 。 28．請求項24に記載の方法により作製された組換え細胞。